Análisis optogenético del comportamiento en el mosquito Aedes aegypti

Resumen

Este protocolo describe el uso de la optogenética para comprender el comportamiento del mosquito Aedes aegypti. Se presentan métodos para el cría, preparación, ensayos y análisis para evaluar la función neuronal durante la atracción a animales huésped y la alimentación con sangre. Estas técnicas fundamentales permitirán estudios sobre circuitos neuronales y comportamiento de este importante vector de enfermedades humanas.

Resumen

El mosquito Aedes aegypti es un vector importante de patógenos virales y sirve como modelo para otras especies de vectores. La transmisión de patógenos ocurre cuando un mosquito pica a un animal huésped, pero aún se desconocen los circuitos neuronales que controlan el comportamiento de búsqueda y picadura. Este artículo detalla métodos para manipular la actividad neuronal en el mosquito mediante optogenética, una técnica clave para determinar la relación causal entre circuitos neuronales y comportamiento. Estos métodos incluyen el cultivo de mosquitos para optogenética y tres ensayos diseñados para medir diferentes etapas en la secuencia de activación, atracción, exploración con la probóscide e ingestión de sangre del huésped. Estos comportamientos ocurren a diferentes escalas espaciales y en respuesta a distintos estímulos sensoriales. Cada ensayo conductual está equipado con LEDs rojos (~625 nm) para la activación optogenética. Para detectar la activación en respuesta a estímulos olfativos, se cuantifican el vuelo y la locomoción. Para evaluar la atracción o el aterrizaje, se presenta a los mosquitos una comida sanguínea calentada en una arena grande. La exploración con la probóscide y la ingestión se analizan mediante video de mayor resolución, lo que permite medir apéndices y el tamaño del abdomen. El protocolo describe modelos de visión por computadora para permitir la cuantificación temporal de alta resolución del comportamiento y mediciones finales de la alimentación. Estos métodos pueden utilizarse para probar el papel de cualquier población genéticamente accesible de neuronas en el comportamiento de picadura del mosquito y pueden extenderse a otros comportamientos adicionales.

Introducción

El mosquito es uno de los animales más peligrosos del mundo, no por su ferocidad o fuerza, sino por su eficiencia como vector de enfermedades. Los parásitos que causan la malaria, transmitidos por mosquitos del género Anopheles, son responsables de cientos de miles de muertes anuales, mientras que Aedes aegypti y Aedes albopictus son responsables de la propagación de la fiebre amarilla, el dengue, la chikunguña, la fiebre Zika y muchas otras enfermedades potencialmente mortales¹. Los mosquitos están presentes en todos los continentes excepto en la Antártida y representan una gran preocupación para la salud pública². El comportamiento de alimentación con sangre transmite directamente patógenos, pero también constituye un paso esencial en el ciclo vital del mosquito , ya que se requiere una ingesta de sangre de un vertebrado para poner huevos. Por lo tanto, frenar la propagación de enfermedades transmitidas por mosquitos requiere comprender sus mecanismos de búsqueda de hospedadores.

Está bien establecido que las hembras de mosquito utilizan señales de larga y corta distancia para localizar a sus huéspedes.^3,4. Dióxido de carbono (CO₂) es un gas altamente volátil presente en la exhalación humana y suele ser la primera señal que percibe un mosquito. Se detecta en Aedes aegypti neuronas sensoriales olfativas mediante las proteínas Gr1, Gr2 y Gr3, que forman el CO₂ receptor⁵. Exposición al CO₂ provoca el despegue y el comportamiento de vuelo, también conocido como activación^6,7, que puede persistir hasta 10–15 minutos, incluso en ausencia de estímulos adicionales⁸. CO₂ se potencia con el olor de la piel para aumentar la activación y la atracción^5,9. Tras el CO₂ y la detección del olor de la piel, el mosquito queda preparado para percibir señales adicionales del huésped más cercanas, como el calor, el contraste visual y la humedad, que lo guían hacia un huésped viable para una comida de sangre^{5,10,11,12,13}La integración de múltiples señales sensoriales permite a los mosquitos perseguir y localizar eficazmente a su huésped.

Cuando un mosquito hembra aterriza sobre un huésped potencial, introduce su probóscide en la superficie hasta localizar un área de la piel, un proceso conocido como picadura exploratoria^14,15. Tras la picadura exploratoria, el estilete atraviesa la piel, localiza un vaso sanguíneo e ingiere sangre mientras inyecta saliva simultáneamente, lo que permite al mosquito duplicar su peso corporal en cuestión de minutos¹⁶. La sangre se dirige al intestino medio, donde las proteínas se digieren para la producción de huevos. Curiosamente, la ingestión abundante de sangre de un huésped no es necesaria para la diseminación de patógenos, ya que la simple picadura exploratoria puede transmitir enfermedades^16,17. Por lo tanto, comprender cada etapa del comportamiento de picadura podría permitir el desarrollo de estrategias para interrumpir la búsqueda de huéspedes y la picadura por parte de las hembras de mosquito, y en última instancia controlar la propagación de enfermedades transmitidas por mosquitos.

Se han desarrollado numerosas herramientas en organismos modelo para manipular la actividad neuronal. Las primeras herramientas funcionaban de manera constitutiva o mediante activación térmica^18,19,20,21. Aunque útiles, estos reactivos genéticos presentan ciertas desventajas. Las herramientas constitutivas pueden afectar el desarrollo, provocando fenotipos que no se deben únicamente a la función del circuito de las neuronas. Los mosquitos utilizan el calor corporal para identificar a los vertebrados huéspedes, lo que hace que los canales activados térmicamente sean especialmente inadecuados para estudios de su comportamiento^22,23. En estudios del comportamiento, la optogenética se refiere al uso de herramientas genéticas que responden a longitudes de onda específicas de luz para controlar la activación de neuronas de interés. Esta técnica ya se ha utilizado en múltiples sistemas, desde examinar la valencia de la sed en ratones hasta estudiar el comportamiento de cortejo en Drosophila, e incluso para restaurar la pérdida de visión causada por la retinosis pigmentaria en ensayos clínicos humanos^24,25,26. Los canales optogenéticos funcionan absorbiendo fotones y permitiendo el paso de tipos específicos de iones a través de la membrana plasmática, activando o inhibiendo la neurona. Al introducir genes transgénicos que codifican proteínas sensibles a la luz en un organismo, esta técnica puede utilizarse para activar o inhibir neuronas específicas que de otro modo serían imposibles de manipular. La optogenética ofrece ventajas en el control temporal y espacial, así como una variedad de controles que permiten inferencias experimentales.

Recientemente, los autores describieron el primer uso de herramientas optogenéticas para estudiar el comportamiento de los mosquitos⁸. Estas herramientas dependen del canal catiónico activado por luz roja CsChrimson, una canalrodopsina desplazada al rojo²⁷. Las opsinas microbianas, incluyendo CsChrimson, requieren un cofactor químico, el retinal trans-al, para absorber fotones²⁸. CsChrimson está fusionado al reportero fluorescente tdTomato y se encuentra bajo el control del sistema binario de expresión QF2/QUAS, lo que permite combinarlo flexiblemente con distintas líneas conductoras²⁹. Para dirigirse a las neuronas sensoriales de CO₂ , se utilizó una línea conductora que expresa el factor de transcripción QF2 en neuronas que expresan la subunidad Gr3 del receptor de CO₂ ³⁰. Los mosquitos mostraron una respuesta conductual mínima tras la exposición a luz roja sola⁸; además, la luz roja es la más eficaz para penetrar los tejidos biológicos, lo que hace que una opsinas activada por luz roja sea ideal para la optogenética²⁵.

Este artículo describe protocolos para tres ensayos que miden diferentes aspectos del comportamiento de búsqueda de huésped y alimentación con sangre combinados con estimulación optogenética (Figura 1A). En primer lugar, se proporciona un protocolo para el cultivo de líneas de mosquitos optogenéticos. La segunda sección describe el opto-termociclador, un termociclador PCR modificado que puede utilizarse para rastrear la activación y la prospección cuando los mosquitos están expuestos a estímulos de temperatura y luz. El ensayo con el opto-termociclador está diseñado para medir estos comportamientos de búsqueda durante escalas de tiempo prolongadas, utilizando cepas conductoras para controlar la actividad neuronal mediante optogenética. La tercera sección describe el ensayo de la manta de sangre, en el cual los mosquitos tienen acceso constante a una comida artificial delgada de sangre en la base de un termociclador modificado, permitiendo el seguimiento del vuelo, la prospección y la ingurgitación bajo condiciones variables de luz y temperatura. El ensayo de la manta de sangre, basado en el opto-termociclador, proporciona un medio para cuantificar la ingurgitación con una comida artificial de sangre, posibilitando el estudio de los comportamientos de alimentación de los mosquitos con estímulos optogenéticos y térmicos precisamente temporizados. La sección final describe el alimentador de membrana optogenético, en el cual se presenta a los mosquitos una comida de sangre caliente en un recipiente, permitiendo el seguimiento tanto de la atracción hacia una fuente de sangre como de la ingurgitación bajo exposición a estímulos luminosos. El ensayo con el alimentador de membrana optogenético se utiliza para investigar la secuencia completa del comportamiento de búsqueda de huésped y alimentación con sangre en un sistema de vuelo libre. Además de los resultados esperados para cada ensayo, se describen modelos de visión por computadora para rastrear partes del cuerpo del mosquito e identificar comportamientos durante los ensayos. Los ensayos con el opto-termociclador, la manta de sangre y el alimentador de membrana optogenético permiten medir etapas distintas del comportamiento de alimentación con sangre en mosquitos mientras se manipula la actividad neuronal con luz. Estas técnicas innovadoras permiten estudiar cómo los circuitos neuronales de los mosquitos controlan comportamientos que representan una amenaza para la salud pública.

Protocolo

Los mosquitos utilizados en este protocolo contienen transgenes y, según las regulaciones del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, deben criarse en instalaciones de contención de artrópodos de nivel II.³². Los mosquitos se mantienen confinados para evitar su escape y se desechan en residuos biopeligrosos. Los protocolos de seguridad biológica y contención de artrópodos fueron revisados y aprobados por Salud Ambiental de Yale & Seguridad. Este trabajo no utiliza sujetos humanos ni animales. El genotipo del mosquito puede confirmarse mediante marcadores fluorescentes (3xP3-dsRed para Gr3-QF2 y 3xP3-CFP para QUAS-CsChrimson) o mediante PCR para el constructo insertado⁸. Todos los materiales utilizados en este estudio se enumeran en el Tabla de materiales.

1. Cría optogenética

1. Criar mosquitos según el protocolo estándar³¹ con las siguientes excepciones para maximizar la respuesta de las líneas optogenéticas durante el experimento.
2. Realizar cruces utilizando cepas homocigóticas de Gr3-QF2, QUAS-CsChrimson y cepas silvestres de Liverpool para generar las líneas experimentales heterocigóticas Gr3-QF2/+, QUAS-CsChrimson/+ y Gr3>CsChrimson.
3. Elevar a los mosquitos dentro de un incubador hermético a la luz ajustado a 28 °C y 80 % de humedad, con un ciclo de 14 h de luz azul (450 nm) y 10 h de oscuridad (Figura 1B).
   NOTA: El uso de luz azul minimiza la activación de canales activados por luz roja, como CsChrimson. Todos los pasos de cría realizados fuera del incubador deben llevarse a cabo en condiciones de poca luz.
4. Iniciar los experimentos con mosquitos adultos al menos una semana después de la eclosión.
   NOTA: Aunque la edad ideal para los experimentos conductuales es de 2–3 semanas, pueden utilizarse mosquitos hasta 4 semanas después de la eclosión. Los genotipos de control y experimentales deben tener la misma edad, registrada como días posteriores a la eclosión. Para estandarizar las edades de los animales, todos los huevos deben eclosionar el mismo día.
5. Dos días antes del experimento, aspirar suavemente hembras apareadas y no alimentadas con sangre desde las jaulas y anestesiarlas a 4 °C. Utilizando una pluma o un aspirador, transferirlas cuidadosamente a los recipientes experimentales según el ensayo que se vaya a utilizar.
6. Preparar una alícuota de 0,2 M de retinal todo-trans (ATR) en dimetilsulfóxido (DMSO), almacenada a -20 °C. Proporcionar sacarosa al 10 % y 400 µM de ATR mediante mechas de algodón empapadas sobre la malla del recipiente. Los animales pueden alimentarse de esta dieta durante 1–3 días en la oscuridad.
   NOTA: Alimentar en la oscuridad, en lugar de bajo luz azul, evita el blanqueamiento del ATR (Figura 1B). Además, en todos los pasos del protocolo, los mosquitos se anestesiaron mediante exposición a 4 °C durante 5–10 min, hasta que dejaron de moverse. Al final de cada experimento, los mosquitos se sacrificaron mediante exposición a -20 °C durante 24 h.
   ADVERTENCIA: El retinal todo-trans puede causar irritación severa al entrar en contacto con la piel y los ojos. Usar equipo de protección personal adecuado, como bata de laboratorio, guantes y protección ocular al manipularlo. El dimetilsulfóxido es un líquido combustible que puede absorberse a través de la piel al contacto y debe manipularse en un ambiente seco con equipo de protección personal adecuado y protección ocular. El DMSO también debe almacenarse en recipientes químicos ignífugos.
7. Un día (20–24 h) antes del experimento, reemplazar los comederos de sacarosa con nuevos comederos que contengan agua destilada y 400 µM de ATR. Los animales permanecen en la oscuridad hasta el momento del experimento (Figura 1B). Continuar con la sección 2, 3 o 4.
   NOTA: Los experimentos deben realizarse durante el fotoperiodo diurno de los mosquitos para maximizar la tasa de respuesta.

2. Optotermociclador

1. Ensamblaje de los componentes del ensayo
   1. Prepare las placas de acrílico para contener los mosquitos (Figura 2). Consulte Figura 2A para un diagrama, Figura 2B para los componentes electrónicos, y Figura 2C para una imagen de la placa de acrílico. Consulte los archivos en (https://github.com/sorrellslab/opto-thermocycler/releases/tag/v1.0.0) para obtener las plantillas.
      1. Para crear las paredes, corte con láser una lámina de acrílico de 3 mm en cuatro rectángulos de 10 cm por 1 cm y seis rectángulos de 7 cm por 1 cm. Fije los rectángulos con pegamento acrílico en una matriz de cinco por tres, donde cada unidad sea una cámara de 17 mm por 17 mm por 10 mm. La plantilla para estas piezas se encuentra en el archivo “14_animal_thick_v3.ai”.
         ​PRECAUCIÓN: El pegamento acrílico es inflamable y puede causar irritación respiratoria y ocular. Debe usarse el equipo de protección personal (EPP) adecuado al manipular el pegamento acrílico, como guantes, bata de laboratorio y gafas, y este solvente debe usarse en un área bien ventilada, lejos de llamas abiertas.
      2. Para el fondo de la cámara, corte una lámina de acrílico de 1,5 mm de espesor a 6,985 cm por 10,16 cm, eliminando el orificio inferior derecho. Corte una lámina de acrílico de 1,5 mm de espesor en un rectángulo de 6,985 cm por 10,16 cm para la tapa. La plantilla para estas piezas es “14_animal_thin_v3.ai”.
   2. Corte una lámina negra de malla resistente a los rayos UV al mismo tamaño que la pieza de acrílico inferior (Figura 2C). Coloque la malla entre las paredes de la placa y la pieza inferior, luego péguelas con pegamento acrílico. Retire la malla del orificio inferior derecho para que el agujero quede sin obstrucciones.
2. Construya un marco que sostendrá la cámara y los LED (Figura 2A).
   1. Construya un marco con cuatro pilares en cada esquina del termociclador usando rieles ópticos de construcción cuadrados de 25 mm y 60,96 cm. Use dos rieles de construcción de 22,86 cm y 25 mm para conectar el pilar delantero derecho con el trasero derecho y el pilar delantero izquierdo con el trasero izquierdo, a 30 cm sobre la mesa.
   2. Conecte los pilares derecho e izquierdo en la parte delantera con un riel de construcción óptico de 30,48 cm y 25 mm, elevado 24 cm sobre la mesa, y en la parte trasera con un riel de construcción óptico de 30,48 cm y 25 mm, elevado 42 cm sobre la mesa.
   3. Coloque postes ópticos de 30,48 cm de largo en los rieles de construcción a los lados izquierdo y derecho del marco. Sujete seis LED rojos de 627 nm conectados en serie, a 24 cm por encima del bloque PCR del termociclador, a cada poste.
      NOTA: Aunque la longitud de onda de luz que produce la actividad máxima de CsChrimson es de ~590 nm, longitudes de onda cercanas a ~625 nm equilibran la necesidad de activar CsChrimson y evitar respuestas conductuales a la luz en los controles genéticos²⁷. Coloque un disipador de calor y una lente en cada LED para enfocar la luz hacia el bloque del termociclador.
   4. Sujete un poste óptico de 30,48 cm en la parte superior de los dos pilares delanteros del riel de construcción. Use una abrazadera en ángulo recto en el centro del poste óptico para fijar un poste óptico de 15,24 cm orientado hacia adentro sobre el bloque del termociclador. Fije una cámara con un filtro infrarrojo de paso largo en el extremo, apuntando hacia abajo, a 40 cm sobre el bloque.
   5. Usando postes ópticos, cree un marco que se extienda desde el riel de construcción en forma de rectángulo alrededor del bloque PCR, elevado ligeramente por encima de la superficie. Fije una tira de LED infrarrojos, orientada hacia el bloque PCR, para iluminar los mosquitos en ángulo recto respecto a la cámara.
      NOTA: La iluminación infrarroja utilizada para la grabación de video no calienta de forma medible la arena, ya que la superficie del termociclador se mantiene a 24 °C durante todo el experimento.
   6. Cubra la estructura con una cortina opaca para evitar interferencias de la luz ambiental.
   7. Cubra la superficie y los lados del bloque PCR con una capa simple de cinta opaca para crear una superficie plana y uniforme con fondo oscuro.
   8. Coloque el sensor del termopar en la esquina inferior derecha del bloque PCR y fíjelo con cinta opaca. Verifique la distribución uniforme de la luz sobre el bloque PCR usando un medidor de potencia. Ajuste el voltaje o la corriente de la fuente de alimentación para entregar luz a 12 µW/mm².
   9. En el borde del bloque PCR, coloque un LED infrarrojo para sincronizar el video con la salida de entrega del estímulo (Figura 2C). Cubra la superficie con cinta negra para permitir que la luz sea detectada sin crear reflejos en la cámara.
   10. Conecte el termopar, el LED de sincronización y los LED de luz roja según el diagrama en Figura 2B. Descargue el software requerido (SpinView (versión 1.27.0.48), CoolTerm (versión 2.0.1), Arduino IDE (versión 1.8.12)). Descargue el código de Arduino y el programa del termociclador desde el repositorio de GitHub.
       ​NOTA: El código de Arduino está programado para entregar luz roja, calor a temperatura corporal y la combinación de ambos estímulos. Hay siete programas de estímulo, con el orden de estímulos aleatorizado entre ellos, proporcionados como recursos. Estos pueden modificarse para entregar diferentes estímulos. Hay nueve estímulos por experimento: tres de solo calor, tres de solo luz y tres de calor y luz simultáneamente. La entrega del estímulo opera mediante el Arduino detectando cambios en la temperatura superficial del bloque PCR a través del termopar, y luego entrega los estímulos lumínicos en los tiempos especificados. Se pueden encontrar más detalles en los comentarios dentro de los programas de estímulo.
3. Preparación del ensayo
   1. Criar los mosquitos según el protocolo de cría optogenética; consulte la sección 1 y Figura 1B.
   2. Dos días antes del experimento, transfiera 14 mosquitos hembras con un aspirador a un recipiente separado. Proporcione ATR a los mosquitos según el paso 1.6. Si se comparan múltiples genotipos, manténgalos ciegos al experimentador.
      ​NOTA: Una vez que los mosquitos reciben ATR, deben manipularse en luz tenue.
   3. Un día antes del experimento (20–24 h), aspire 14 mosquitos hembras por placa de acrílico y anestésielos a 4 °C. Coloque cuidadosamente un mosquito a la vez en cada uno de los orificios con una pluma o un aspirador.
   4. Cubra los lados de la placa de acrílico con cinta adhesiva para mantener la tapa en su lugar. No doble la cinta sobre la parte superior ni inferior de la placa de acrílico, ya que esto obstruiría la vista de la cámara.
   5. Coloque la placa de acrílico sobre tres mechas de algodón empapadas con ATR 400 µM en agua destilada (consulte el paso 1.6), colocadas en paralelo. Alinee cada una de las tres filas con una mecha para que todos los mosquitos tengan acceso a la solución de ATR en agua. Coloque la placa de acrílico en un incubador oscuro durante la noche.
4. Realización del ensayo
   1. Conecte la cámara, los LED y el Arduino al ordenador. Encienda la fuente de alimentación. Limpie la superficie del opto-termociclador con etanol al 70 % y déjelo secar.
      ​PRECAUCIÓN: El etanol es inflamable y puede causar irritación grave en los ojos. Debe usarse el equipo de protección personal adecuado al manipular etanol. Además, evite cualquier llama abierta.
   2. Usando un recipiente oscuro, transfiera la placa de acrílico con mosquitos al centro del bloque PCR. Cubra el opto-termociclador con una cortina opaca.
   3. Abra SpinView en el ordenador. Haga clic en el nombre de la cámara para abrir la vista de la cámara. Conecte las luces infrarrojas y asegúrese de que el bloque PCR y la placa de acrílico sean visibles en la vista de la cámara.
   4. Si es necesario, ajuste la posición de la placa de acrílico para que esté alineada, centrada y el termopar sea visible en la esquina inferior derecha de la placa. Asegúrese de que la luz de sincronización esté dentro del encuadre (Figura 2C).
   5. Ajuste los parámetros de la cámara y de SpinView para garantizar un video nítido y recortado que muestre la placa de acrílico. En la pestaña Formato de imagen, ajuste las opciones Ancho, Alto, Desplazamiento X y Desplazamiento Y para asegurar que la placa de acrílico y la luz de sincronización sean visibles. En la pestaña Configuración, establezca Frecuencia de cuadros de adquisición Habilitar en verdadero y Frecuencia de cuadros de adquisición en 30 fps.
   6. Desactive Exposición automática y Ganancia automática. Ajuste los valores de Tiempo de exposición y Ganancia para crear un contraste claro entre el fondo negro y los mosquitos. Haga clic en el botón rojo de grabación en la esquina superior derecha para abrir una ventana separada para guardar el archivo de video.
   7. En la ventana emergente, establezca la ruta del archivo en la parte superior: haga clic en Examinar, navegue hasta la carpeta del experimento, haga clic en Nueva carpeta y asígnele el nombre del ensayo. Establezca el número de cuadros a grabar según el número adecuado para el experimento (por ejemplo, 43.500) o en 0 para detener manualmente la grabación.
   8. En la pestaña Videos, configure los siguientes campos: Tipo de grabación de video: MJPG, Tamaño de división de archivo de video: 1000 MB, Calidad de compresión JPEG: 65. Abra el programa ‘optothermo_lightheat_random1’ en el termociclador e inícielo. El termociclador debe comenzar en un paso de espera a 25 °C.
   9. Abra el programa correspondiente, ‘TC_optothermo_lightheat_random1.ino’, en el Arduino IDE y cárguelo en la placa. Abra el monitor serial y asegúrese de que la temperatura sea aproximadamente 25 °C.
   10. Cierre el monitor serial en el Arduino IDE. Abra CoolTerm para comenzar a adquirir la salida del monitor serial de Arduino. Asegúrese de que el puerto serial y el canal coincidan con los del Arduino IDE. La salida comienza a mostrarse en la ventana de CoolTerm.
   11. Comience la grabación de la salida de Arduino en un archivo de texto/binario. Inicie la grabación de video en Spinview. Haga clic en Reanudar para finalizar el paso de espera del termociclador. Observe la salida de Arduino en CoolTerm para verificar si la temperatura desciende a 18 °C y el contador de estímulos aumenta a 1, iniciando así el ensayo. Permita que el ensayo continúe hasta que finalice.
5. Limpieza
   1. Detenga la grabación de video y la adquisición de salida de CoolTerm. Cierre ambos programas. Finalice el programa del termociclador. Retire la placa de acrílico con mosquitos del termociclador y colóquela en un congelador a -20 °C durante la noche para eutanizar a los mosquitos.
      ​PRECAUCIÓN: Al eutanizar mosquitos transgénicos, asegúrese de que permanezcan en un entorno de -20 °C durante al menos 24 h antes de desecharlos en un contenedor de riesgo biológico para garantizar la muerte.
   2. Si va a iniciar otro ensayo, repita la sección 2.3. Desconecte los cables de la cámara y del Arduino. Apague la fuente de alimentación. Desconecte los LED infrarrojos. Limpie las placas de acrílico retirando la cinta adhesiva y descartando los mosquitos muertos.
   3. Spray la tapa y la placa de acrílico con etanol al 70 % y limpie cuidadosamente todos los lados de los orificios y la malla con un dedo enguantado. Enjuague bien con agua desionizada, luego apile las placas de acrílico para su almacenamiento, separando las tapas con una toalla de papel para evitar rayones.

3. Ensayo de manta sanguínea

1. Ensamblaje de los componentes del ensayo (Figura 3)
   1. Construya el ensayo del optotermostato como se describe en la sección 2.1. Consulte las figuras para el ensayo (Figura 3A), el estímulo térmico (Figura 3B) y la placa de aluminio (Figura 3C).
   2. Construya una placa de aluminio para la alimentación con sangre como se muestra en la Figura 3C.
      1. Utilice un cortador láser o un cortador por chorro de agua para construir la parte superior e inferior de la placa. Construya la base de la placa cortando una lámina de aluminio de 0,8 mm de espesor a 90 mm por 134 mm. Construya la parte superior cortando una lámina de aluminio de 1,6 mm de espesor a 90 mm por 134 mm. Corte 15 orificios rectangulares (17,2 mm por 18,6 mm) en la placa superior. Los archivos de plantilla están disponibles en el repositorio de GitHub de blood blanket (https://github.com/sorrellslab/bloodblanket) bajo "Plantillas de placa de aluminio".
      2. Coloque entre las piezas de aluminio una junta delgada de silicona (0,5 mm de espesor) para evitar fugas. Córtela con un láser para que coincida con la forma de la placa superior de aluminio.
      3. Fije las capas mediante ocho tornillos hexagonales estándar de cabeza redonda de 4-40 de 0,47625 cm. Utilice una broca de roscar para crear roscas para los tornillos en las piezas metálicas. Conéctelos a través de arandelas redondas y en forma de “W” en la parte inferior de la placa para mayor seguridad cuando se coloque sobre el bloque del termociclador.
   3. Descargue el código de Arduino y el programa del termociclador para el ensayo de blood blanket desde el repositorio de GitHub (https://github.com/sorrellslab/bloodblanket).
   4. Prepare alícuotas de ATP 20 mM en NaHCO₃ 25 mM y almacénelas a -20 ˚C hasta su uso.
      ​NOTA: Prepare una solución fresca de ATP cada seis meses. Evite ciclos repetidos de congelación y descongelación. Prepare soluciones de NaHCO₃ 1 M y NaCl 5 M (almacene cada una a temperatura ambiente). El NaHCO₃ solo es estable en solución durante 7 días.
2. Preparación del experimento
   1. Criar los mosquitos y transfiéralos a placas acrílicas como se describe en las secciones 1 y 2.2. Si se van a realizar comparaciones entre diferentes genotipos, enmascárelos al experimentador.
   2. El día del experimento, prepare una comida artificial mínima de sangre de 10 mL (NaCl 110 mM, NaHCO₃ 20 mM y ATP 1,5 mM) agregando 750 µL de ATP 20 mM, 220 µL de NaCl 5 M y 200 µL de NaHCO₃ 1 M a 8,83 mL de agua desionizada. Mezcle bien invirtiendo el recipiente.
      NOTA: Prepare la comida artificial de sangre fresca antes de cada experimento.
   3. Configure la grabación en SpinView según los pasos 2.3.4 a 2.3.8.
   4. Abra el archivo de Arduino “Red-light-Only__BB_.ino” (o el archivo de estímulo deseado) para el experimento.
3. Realización de los ensayos
   1. Pipete 650 µL de la comida artificial mínima de sangre en cada pocillo de la placa, asegurándose de que la comida llene completamente cada pocillo sin desbordamiento.
   2. Estire un cuadrado de parafilm de 10,2 cm por 10,2 cm sobre un anillo de 20,3 cm de diámetro. Coloque el parafilm sobre la placa, presionando los bordes hasta que se adhiera. Con un bisturí, recorte un borde de 1,3 cm alrededor de la placa y doble el exceso de parafilm por debajo para sellar la comida.
   3. Coloque la placa directamente sobre el bloque de PCR para permitir una transferencia de calor máxima (Figura 3A).
      NOTA: Se utiliza cinta opaca en la superficie del bloque de PCR para el optotermostato, pero no para el blood blanket.
   4. Coloque el termopar sobre la superficie del parafilm en la esquina inferior derecha de la placa de aluminio. Conecte la cámara, los LED y el Arduino al ordenador. Encienda la fuente de alimentación. Inicie el programa “BB_thermocycler_program.x50prog” en el termociclador.
      NOTA: La velocidad de cambio de temperatura es la velocidad máxima de rampa del termociclador, elegida para imitar lo mejor posible el aterrizaje de un mosquito sobre un huésped para alimentarse.
   5. Utilizando un recipiente oscuro y luces tenues en la habitación para minimizar la exposición a la luz, transfiera la placa acrílica de mosquitos a la placa de aluminio, asegurándose de que cada pocillo esté alineado con los mosquitos. Asegúrese de que el termopar esté en la esquina inferior derecha de la placa y en contacto con el parafilm para medir la temperatura de la comida artificial de sangre.
   6. Inicie el programa volviendo a subir el programa “Red-light-Only__BB_.ino” en el entorno de desarrollo integrado (IDE) de Arduino. Cierre el monitor serial. En CoolTerm, pulse Conectar para ver la temperatura actual. A partir de esta temperatura inicial, ajuste la temperatura de activación en el script de Arduino a aproximadamente 0,6 °C por debajo.
   7. En la ventana de CoolTerm, seleccione Capturar en archivo de texto/binario y comience la recopilación de datos. Inicie la grabación de video en la ventana de grabación de SpinView. Haga clic en Reanudar para finalizar la espera del termociclador. Observe la salida de Arduino en CoolTerm para asegurarse de que se detectó el descenso térmico y que el ensayo ha comenzado.
   8. Después de la duración del ensayo, haga clic en Detener grabación. En CoolTerm, en la pestaña Capturar en archivo de texto/binario, seleccione Detener la escritura de la salida serial.
   9. Retire la placa de mosquitos de la placa del blood blanket y trasládelos a la cámara fría para anestesiarlos. Cuente el número de mosquitos con abdomen agrandado que contienen la comida artificial de sangre como saciados, incluyendo aquellos que se alimentaron parcialmente.
   10. Entre ensayos, limpie la superficie del bloque de PCR pasando una toallita Kimwipe humedecida con etanol al 70 %. Retire el parafilm y enjuague la placa de aluminio con agua desionizada. Repita la sección 3.3 para ensayos posteriores. Alterne el orden de los ensayos entre días para minimizar el efecto de los ciclos de actividad circadiana.
4. Limpieza
   1. Detenga la grabación de todos los programas y salga. Desconecte los cables USB de la cámara, Arduino y luces infrarrojas. Apague el ordenador. Detenga el programa “thermocycler_program.x50prog” que se está ejecutando en el termociclador.
   2. Coloque las placas de mosquitos en un congelador a -20 °C durante la noche para matarlos. Lave la placa de aluminio con agua desionizada. Sumerja la placa acrílica en etanol al 70 %, luego enjuáguela con agua desionizada y déjela secar durante la noche antes de cargar más mosquitos.
      NOTA: Las placas deben secarse durante la noche después del lavado para asegurar que no quede humedad. Si queda humedad, se producirá condensación en la tapa y se interferirá con el video.

4. Ensayo de alimentación con optomembrana

1. Ensamblaje de los componentes del ensayo (Figura 4)
   1. Monte un marco utilizando componentes optomecánicos y una dimensión de 30,48 cm por Plataforma de acrílico de 30,48 cm, negra, con un grosor de 0,635 cm. Cree un orificio en el centro del acrílico con un diámetro de 11,43 cm utilizando un cortador láser. Corte orificios a 2,54 cm de cada esquina para permitir que el acrílico descanse sobre los soportes del marco, aproximadamente a 23,495 cm por encima de la base.
   2. En el centro, fije un anillo de acrílico negro con un diámetro interno de 19,05 cm y un diámetro externo de 20,32 cm (Figura 4A). Las plantillas para todos los componentes acrílicos se encuentran en el repositorio de GitHub del alimentador opto-membranal (https://github.com/sorrellslab/opto-membranefeeder/releases/tag/v1.0.0), junto con los programas de Arduino. Consulte la figura para ver la configuración general (Figura 4A), estímulo (Figura 4B), diagrama de circuito (Figura 4C) e imagen fija de video (Figura 4D).
      ​NOTA: Los materiales específicos utilizados para armar esta plataforma no son críticos, por lo que pueden estar disponibles opciones más económicas.
   3. Coloque una cámara con un filtro de paso largo infrarrojo debajo del orificio central, orientada hacia arriba en dirección al cartucho para mosquitos. Ajuste la abertura para que esté completamente abierta, permitiendo enfocar selectivamente la malla superior del cartuchoFigura 4A).
   4. Para fabricar los cartuchos, corte un tubo transparente de policarbonato con un diámetro de 11,43 cm en segmentos cilíndricos de 12,7 cm.
      1. Construya las bases para los recipientes cortando con láser círculos de 11,43 cm de diámetro en acrílico de 0,3175 cm de espesor. Los bordes de los círculos están grabados con láser para que queden encajados dentro del tubo. Fije las bases a los tubos con epoxi plástico.
      2. Cree una tapa empotrada utilizando acrílico negro de 0,635 cm y 0,3175 cm y una malla negra resistente a los rayos UV. El anillo interior tiene un diámetro de 10,795 cm, mientras que el anillo exterior tiene un diámetro de 12,065 cm, con la malla negra extendida sobre el anillo más pequeño. La malla debe coserse a través de orificios cortados con láser utilizando hilo encerado.
         ​NOTA: Los cartuchos siempre deben colocarse sobre toallas de papel para evitar rayar los fondos de acrílico a través de los cuales se registra el video.
   5. Construya recipientes de acrílico para la entrega de la comida sanguínea (Figura 4A).
      1. Corte un anillo con un diámetro interno de 5,08 cm y un diámetro externo de 6,6 cm de acrílico transparente de 0,15875 cm de espesor. Sujete este anillo a otro anillo transparente de acrílico con un diámetro interno de 5,842 cm y un diámetro externo de 6,604 cm utilizando pegamento para acrílico.
      2. Coloque un cilindro de malla metálica con una altura de 13,97 cm y un diámetro de 19,05 cm dentro del anillo de acrílico negro en el centro de la plataforma.
      3. Dentro de la malla metálica, sujete una bobina de luces LED RGB espaciadas 3,81 cm desde el exterior del recipiente, las cuales serán controladas por una placa Arduino Uno que descansa sobre la plataforma de acrílico negro.Figura 4C).
      4. Utilizando un medidor de potencia, mida la intensidad luminosa en toda la parte interna del cilindro y ajuste la posición de las luces para que la arena quede iluminada entre 3,5 y 6 µW/mm². En el exterior de la malla metálica, sujete un anillo de LED infrarrojos de 850 nm al marco utilizando bridas de plástico, orientados hacia el interior.
   6. Conecte un cable USB al Arduino Uno y conéctelo a la computadora. Conecte un cable USB desde la cámara a la computadora. Desactive la conexión a internet.
   7. Coloque la estructura de membrana óptica en un incubador oscuro o en una sala ambiental a 26 °C y 80 % de humedad relativa durante toda la duración de los experimentos.
2. Preparación de los cilindros para mosquitos
   1. Antes del experimento, lave los contenedores para mosquitos rociándolos con etanol al 70 % y limpiándolos suavemente con una esponja blanda. Enjuague los contenedores con agua desionizada y deje secar al aire durante la noche.
   2. Dos días antes del experimento, separen los mosquitos machos y hembras bajo anestesia fría y coloquen 20 hembras en cada recipiente. Proporcione acceso a ATR según el paso 1.6.
   3. En este momento, los genotipos deben enmascararse para el experimentador. El orden de los ensayos debe rotarse entre días para minimizar las diferencias en los resultados conductuales debidas al momento experimental.
3. Ejecución de ensayos
   1. Para preparar la comida sanguínea, coloque botellas de 119 mL de agua en un 45 °baño de agua a 37 °C, uno para cada ensayo. Este volumen y temperatura mantienen la comida sanguínea cerca de la temperatura corporal durante todo el experimento.
   2. Preparar alícuotas de 5 mL de sangre de oveja desfibrinada. Almacenar a 4 °C e invierta antes de usar para evitar la separación. Prepare la comida de sangre fresca antes de cada experimento.
      PRECAUCIÓN: Manipule la sangre de oveja desfibrinada llevando el EPP adecuado para minimizar la exposición a patógenos. Los materiales reutilizables que hayan tenido contacto con sangre deben remojarse en lejía al 10 % y enjuagarse con agua desionizada. Dado que la lejía puede causar irritación grave de la piel y los ojos, debe usarse el EPP adecuado durante toda la manipulación.
   3. Coloque la primera alícuota de sangre en un 45 °baño de agua a 37 °C durante al menos 20 min antes del ensayo. Descongele el ATP en hielo. Estire un fragmento de 5,08 cm por 5.08 cm² de parafilm sobre la tapa de acrílico en el lado con el círculo grande y plano, creando un recipiente para la comida sanguínea (Figura 4A).
   4. Limpie la computadora con etanol al 70 % para eliminar olores humanos. Conecte la computadora a un disco duro externo. Conecte la cámara y el Arduino. Conecte las luces RGB e infrarrojas a una fuente de alimentación.
   5. Abra el software SpinView y el archivo de Arduino para el estímulo adecuado. Cree una carpeta en el disco duro externo para contener los datos del experimento. Suba el “blue_only.ioArchivo Arduino para proporcionar una luz azul tenue de 471 nm desde los LED RGB hacia la arena (siguiendo Figura 4B).
   6. Sin exponer a los mosquitos a un exceso de CO₂ a partir del aliento, examine el cartucho para el ensayo y registre cualquier muerte previa al experimento. Coloque el cartucho en el centro y permita un periodo de aclimatación bajo luz azul tenue durante 10 a 20 minutos antes de la exposición al estímulo.
      ​NOTA: El paso de aclimatación y el experimento se realizan bajo luz azul tenue porque la oscuridad completa inhibe el vuelo del mosquito.
   7. Habilitar la captura de video
      1. En el programa SpinView, seleccione la cámara. En el Configuración ajuste la exposición y la ganancia según sea necesario para mantener un alto contraste entre los insectos de color claro y el fondo oscuro (Figura 4D).
      2. Haga clic en el botón rojo de grabación en la barra superior para ajustar la configuración de captura de video. Establezca la ruta del archivo haciendo clic Explorar, luego diríjase al disco duro externo. Cree una nueva carpeta con un nombre descriptivo para cada ensayo. No incluya espacios en el nombre de la carpeta.
      3. En el Opciones de guardado pestaña, seleccionar Capturar 0 cuadros, lo que permitirá que el video se grabe hasta que se detenga manualmente. Bajo Modo de grabación, seleccione Tamponado. En la pestaña Videos, configure los siguientes campos: Tipo de grabación de video: MJPG, Tamaño de división del archivo de video: 1000 MB, y Calidad de Compresión JPEG: 65.
   8. Inmediatamente antes de la exposición al estímulo, pipetee 500 µL de ATP 20 mM, para una concentración final de 2 mM de ATP, en la alícuota de sangre de 5 mL preparada. Invertir el tubo varias veces para mezclar.
   9. Vierta la solución de ATP-sangre en el recipiente de la comida de sangre. Encima de la comida de sangre, coloque un frasco de 119 mL invertido lleno con 45 °C agua para mantener la temperatura de la sangre cercana a la temperatura corporal humana durante todo el experimento.
   10. En el software SpinView, seleccione Iniciar grabación. Sin estimular a los mosquitos con el aliento, coloque la comida sanguínea encima de la tapa de malla del recipiente para que los mosquitos puedan atravesar la membrana de parafilm a través de la malla.
   11. Subir el Arduino programa para 1sON_10sOFF.io (Figura 4B), o el estímulo deseado. Esto emitirá 1 s de luz roja de 624 nm cada 10 s, hasta que el "blue_only.io” archivo se carga manualmente. La longitud de onda de 624 nm es suficiente para activar optogenéticamente CsChrimson.
   12. Coloque la alícuota de sangre en el baño de agua para el siguiente ensayo. Después de que el ensayo haya transcurrido durante 15 min, seleccione Detener la grabación. Subir el “blue_only.io” archivo para detener el estímulo de luz roja.
   13. Retire el soporte de la comida sanguínea y la botella de agua. Retire el recipiente y anestesie los mosquitos a 4 °C. Para realizar ensayos adicionales, regrese a la sección 4.3. Examine visualmente los mosquitos anestesiados para determinar y registrar el número de aquellos que se alimentaron de sangre, buscando un abdomen lleno de sangre.
4. Limpiar
   1. Cierre todos los programas. Extraiga el disco duro externo y desconéctelo de la computadora. Apague la computadora.
   2. Limpie los recipientes para mosquitos como se describió previamente en el paso 4.2.1. Limpie los soportes de acrílico para las comidas sanguíneas. Llene un recipiente de policarbonato de tamaño mediano hasta dos tercios con agua y luego agregue 100 mL de lejía.
   3. Agregue soportes de harina de sangre acrílicos y botellas de plástico a la bandeja. Cúbralos con una tapa y déjelos en remojo durante 10 min. Enjuague la lejía y retire el parafilm. Frote suavemente y enjuague para eliminar cualquier residuo de sangre.

5. Análisis del comportamiento

1. Prepare los videos para el análisis comprimiéndolos en archivos .mp4 utilizando ffmpeg (versión 8.0.1). Si los archivos de video están divididos, combínelos en un solo video usando cualquier software de edición de video. Abra los videos de entrenamiento en SLEAP (versión 1.4.1) en escala de grises.
   ​NOTA: Si la configuración de grabación de video es adecuada, todo debería estar dentro del encuadre y los mosquitos en movimiento no deberían verse borrosos. Puede utilizarse otro software de seguimiento de partes corporales. La versión de SLEAP utilizada en este artículo es la 1.4.1. Consulte la documentación de SLEAP para obtener protocolos actualizados.
2. Cree un esqueleto que etiquete las partes relevantes de los animales según los comportamientos que se estén evaluando (Figura 2D, Figura 3D y Figura 4E).
3. Utilizando la opción “Marco aleatorio” en la pestaña Marco sugerido, seleccione aleatoriamente 10 marcos y etiquete a cada mosquito como una instancia. Si ciertas partes del mosquito están obstruidas (por ejemplo, la punta de la probóscide está insertada en la malla durante la exploración), marque la ubicación aproximada de la parte corporal. Entrene un modelo con los marcos etiquetados utilizando esta configuración:
   1. Para un modelo multi-animales de arriba hacia abajo (utilizado para el opto-termociclador y el cobertor de sangre): En la pestaña Canal de entrenamiento, establezca Máx. instancias en 14. En la pestaña Configuración del modelo de centroides, establezca Tamaño del recorte en Automático, Plataforma Mín. Delta en 1e-04, Plataforma Paciencia en 10, Estrategia en 8 y la Parte de anclaje como tórax.
   2. Para un modelo multi-animales de abajo hacia arriba (utilizado para el alimentador con membrana óptica): En la pestaña Canal de entrenamiento, establezca Máx. instancias en sin máximo. En la pestaña Configuración del modelo de abajo hacia arriba, establezca Tamaño del recorte en Automático, Plataforma Mín. Delta en 1e-04, Plataforma Paciencia en 10 y Estrategia en 16.
4. Prediga un número determinado de marcos con esta configuración: En la pestaña Canal de inferencia, para el opto-termociclador y el cobertor de sangre, establezca Máx. instancias en 14, Rastreador en Sencillo, Número máximo de rastros en 14 y Conectar interrupciones de rastro único en Verdadero.
5. Para el alimentador con membrana óptica, establezca Sin máximo para Máx. instancias y Número máximo de rastros, Rastreador en Sencillo y Conectar interrupciones de rastro único en Verdadero. Corrija los marcos predichos y vuelva a entrenar. Repita ciclos de predicción, etiquetado y entrenamiento sobre el conjunto de datos de entrenamiento.
   NOTA: La validación se realizó mediante revisión aleatoria de marcos etiquetados e identificación de errores consistentes (por ejemplo, detecciones falsas de mosquitos, predicciones duplicadas, orientación incorrecta o asignaciones erróneas de partes corporales), centrándose en los marcos que contienen estos casos límite. Pueden requerirse hasta 150 marcos etiquetados, dependiendo de la frecuencia de errores. SLEAP también proporciona métricas de evaluación basadas en interfaz gráfica (GUI) para validación adicional del modelo. Una vez que la inspección visual confirme una precisión y exactitud suficientes, aplique el modelo a los videos experimentales y exporte los resultados como .csv o .h5 para el análisis de comportamiento. Luego, pueden entrenarse clasificadores de comportamiento utilizando las salidas de estimación de postura, como se describió previamente⁸. Los comportamientos se definen de la siguiente manera: caminar, movimiento corporal traslacional con movimiento de las patas; volar, movimiento traslacional rápido con las alas extendidas; aseo, movimientos repetitivos de las patas sobre partes del cuerpo (antenas, probóscide, alas o patas); y exploración, inserción de la probóscide a través de la malla en la parte inferior del recipiente. Los clasificadores de comportamiento deben alcanzar una exactitud de >90% en comparación con las anotaciones humanas.
6. Realice análisis estadístico eligiendo pruebas no paramétricas, ya que los datos normalmente no siguen una distribución normal. Realice las pruebas post hoc apropiadas con corrección por comparaciones múltiples. Para los datos de ingurgitación, los réplicas experimentales son grupos de mosquitos, mientras que para los datos de comportamiento, las réplicas son mosquitos individuales.

Resultados

Se utilizaron tres ensayos de comportamiento para observar los comportamientos de búsqueda de hospedador y alimentación con sangre en mosquitos, como se muestra en la Figura 1A. Los mosquitos se criaron bajo un ciclo luz oscuridad azul (14:10 LD; Figura 1B) para sincronizar los ritmos circadianos, lo que permitió realizar los experimentos durante los periodos de vigilia. Dos días antes de los experimentos, los mosquitos se transfirieron a oscuridad total y se les proporcionó el cofactor de opsina ATR. Si los mosquitos no están sincronizados o no se les administra ATR, mostrarán una actividad baja en los ensayos conductuales. Los genotipos utilizados en cada ensayo fueron Gr3>CsChrimson y dos controles genéticos: la línea conductora Gr3-QF2 y la línea efectora QUAS-CsChrimson.

El ensayo con el termociclador óptico (Sección 2) permite evaluar el estado de alerta y el comportamiento de picado de los mosquitos durante largos períodos, en respuesta a estímulos de calor y luz. La aplicación de calor simula la aproximación del mosquito a un huésped de sangre caliente, mientras que la emisión de luz de cinco segundos simula una exhalación prolongada del aliento.³³. El uso de un termociclador permite un calentamiento y enfriamiento superficiales rápidos que se sincronizan con la activación optogenética mediante un termopar y un microcontrolador (Figura 2A, B). Los tres genotipos de mosquitos se colocaron en placas de acrílico con pozos aislados con fondos de malla en los que muestran comportamientos de caminata, vuelo y picadura (Figura 2C). La posición de las partes del cuerpo del mosquito se detectó mediante algoritmos de seguimiento de postura, como SLEAP³⁴  y DeepLabCUT³⁵ (Figura 2D, E). Se pueden utilizar algoritmos de clasificación de comportamiento a partir del seguimiento de la postura (por ejemplo, SimBA36, A-SOiD37) o del video (por ejemplo, FERAL³⁸) entrada. Figura 2E muestra las etiquetas de SLEAP durante el vuelo, la marcha y la prospección, comportamientos esenciales relacionados con la búsqueda de huéspedes y la alimentación. Estos comportamientos pueden clasificarse según la velocidad del tórax y la distancia entre la base y la punta del probóscide. Aquí se muestra la salida del seguimiento de comportamiento utilizando APT y JAABA³⁹. Los mosquitos fueron expuestos ya sea a un aumento de temperatura, a un estímulo luminoso, o a ambos estímulos (térmico y luminoso) simultáneamente, seguido de un descanso de 20 minutos antes del siguiente estímulo⁸. (Figura 2F). Cuando se exponen al calor, los tres genotipos exhiben un breve período de sondeo (Figura 2G). Importante: cuando se expusieron a un estímulo lumínico de 5 segundos, los Gr3>CsChrimson los mosquitos se activan o "excitan", mostrando un aumento en el comportamiento de caminata y vuelo que dura hasta 10–15 min. Los mosquitos también exhiben sondeo, definido como la inserción repetida del probóscide en la malla inferior de las placas. Los datos se representaron como el comportamiento individual del mosquito (Figura 2G) y proporción de todos los mosquitos que exhiben cada comportamiento a lo largo del tiempo (Figura 2H). El optotermociclador permite estimulaciones óptogenéticas y térmicas precisas y repetidas en múltiples individuos, lo que lo convierte en una herramienta útil para estudiar la activación y analizar el comportamiento.

El ensayo de manta sanguínea (sección 3) se basa en el ensayo del optotermociclador, pero proporciona una comida sanguínea artificial mínima y apetitosa para que se pueda cuantificar la ingurgitación de mosquitos (Figura 3A). Se administró un pulso de 5 segundos de luz roja (~627 nm) para activar optogenéticamente las neuronas sensoriales de CO₂, y la capa delgada de comida sanguínea artificial se calentó de 25 °C a ~35 °C (medido en la superficie mediante un termopar; Figura 3B). A cada uno de los tres genotipos se les presentó una comida sanguínea artificial en una placa de alimentación de aluminio (Figura 3C). Mosquitos Gr3-QF2, QUAS-CsChrimson y Gr3>CsChrimson (n = 10 ensayos por grupo genético, 14 mosquitos cada uno) recibieron una comida sanguínea artificial en una placa de alimentación de aluminio (Figura 3C). Para medir la ingurgitación de los mosquitos a lo largo del tiempo durante todo el experimento, se utilizó SLEAP para rastrear puntos en el cuerpo del mosquito. Esto se realizó creando un esqueleto que incluía 5 nodos en el abdomen del mosquito (Figura 3D). Al final de cada ensayo, se contó manualmente el número de mosquitos ingurgitados. Las líneas de mosquitos control, Gr3-QF2 y QUAS-CsChrimson, mostraron una ingurgitación promedio similar (Figura 3E, p = 0,401). En contraste, la línea Gr3>CsChrimson mostró tasas significativamente más altas de alimentación, con una tasa promedio de ingurgitación del 53 % (Figura 3E, p = 0,00078 frente a Gr3-QF2 y p = 0,00097 frente a QUAS-CsChrimson). Los datos se representaron mediante diagramas de violín y diagramas de caja (mediana, rango intercuartílico y rango) y se analizaron utilizando la prueba de Kruskal-Wallis y la prueba de Dunn con corrección de Holm a un umbral de significancia de p < 0,05. La ingurgitación individual de cada animal a lo largo del tiempo se identificó como el cambio en el área abdominal delimitada por 5 nodos (Figura 3F). Estos resultados demuestran que el ensayo de manta sanguínea puede utilizarse para evaluar los efectos de la activación optogenética de poblaciones neuronales sensibles al CO₂ sobre el comportamiento de ingurgitación de mosquitos con una comida sanguínea artificial.

El ensayo de alimentación con membrana óptica (Sección 4), en el que se permite a los mosquitos acceder a una comida de sangre caliente en una arena cilíndrica, permite estudiar la atracción del mosquito hacia una fuente de sangre y su saciedad. Para determinar si la activación optogenética de las neuronas sensoriales de CO₂ es suficiente para provocar la atracción y la alimentación en una fuente de sangre, se ofreció a mosquitos Gr3>CsChrimson y controles (n = 10 para cada genotipo, donde n se refiere al número de ensayos realizados, con 20 mosquitos por recipiente por ensayo) acceso a una comida de sangre caliente en el alimentador de membrana óptica, expuestos a un pulso repetido de luz roja intensa de 1 segundo cada 10 s durante 15 min (Figura 4B). Para medir la atracción hacia el alimentador de membrana, se utilizó un modelo SLEAP con tres puntos para rastrear la cabeza, el tórax y el abdomen de los mosquitos posados, contando aquellos dentro de la región de interés (Figura 4D, Figura 4E). Los mosquitos Gr3>CsChrimson mostraron una atracción incrementada a la región de la comida de sangre a lo largo del tiempo en comparación con el control Gr3-QF2 (Figura 4F, p = 0.027). Los mosquitos Gr3>CsChrimson no mostraron una atracción estadísticamente mayor que el control QUAS-CsChrimson (Figura 4F, p = 0.310). Los grupos de significancia se determinaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis, seguida por la prueba de Dunn con corrección de Holm. El umbral de significancia se estableció en p < 0,05. Los datos se representaron como el porcentaje promedio de mosquitos atraídos hacia la comida de sangre, con la región sombreada mostrando el error estándar. Los genotipos control Gr3-QF2 y QUAS-CsChrimson mostraron una saciedad similar del 26 % y 29 %, respectivamente, puntuados manualmente según lo descrito (Figura 4G, p = 0,351). En contraste, los mosquitos Gr3>CsChrimson demostraron una tasa de saciedad significativamente mayor que cualquiera de los controles, con un promedio del 61 % (Figura 4G, p < 0,001 frente a Gr3-QF2 y p = 0,002 frente a QUAS-CsChrimson). Los datos se representaron mediante diagramas de violín y diagramas de caja (mediana, rango intercuartílico y rango) y se analizaron utilizando la prueba de Kruskal-Wallis y la prueba de Dunn con corrección de Holm, con un umbral de significancia de p < 0,05. Estos resultados indican que el ensayo de alimentación con membrana óptica es un método viable para evaluar los efectos de la activación optogenética de las neuronas de CO₂ sobre la atracción y saciedad de los mosquitos respecto a una comida de sangre.

Figura 1: Ensayos y cría para optogenética en mosquitos. (A) Esquema de los comportamientos de búsqueda de huésped en mosquitos, con las características de los ensayos de comportamiento presentados. Los pasos de la búsqueda de huésped medidos por cada ensayo de comportamiento se indican mediante barras grises. (B) Cronograma de cría de mosquitos para experimentos de optogenética. La figura 1 fue creada por los autores para esta publicación utilizando Adobe Illustrator, y no se requiere licencia para su uso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: El optotermociclador cuantifica los comportamientos de activación y búsqueda durante la activación optogenética. (A) Esquema del ensayo de optotermociclador que consiste en una placa de mosquitos sobre el bloque de un termociclador de PCR con LEDs superiores y una cámara. (B) Diagrama del circuito para el microcontrolador que detecta la temperatura del termociclador y controla los LEDs. El diagrama del circuito fue creado con Fritzing bajo licencia CC-BY-SA 3.0 (https://github.com/fritzing/fritzing-app/blob/develop/README.md). Esta licencia también permite la reutilización completa de la imagen, siempre que se dé el crédito adecuado. (C) Imagen fija del ensayo que muestra la placa de acrílico que sostiene hasta 14 mosquitos. El termopar está en el pocillo inferior derecho. (D) Esqueleto del mosquito utilizado en el modelo SLEAP para estimar las posturas. Los puntos etiquetados en el cuerpo incluyen: la punta y la base de la probóscide, utilizados para detectar el comportamiento de sondeo (mostrado en rojo); las patas delanteras, donde se conectan al tórax, donde el fémur se une a la tibia, y donde la tibia se une al tarso (mostrado en azul); y la punta del abdomen (mostrado en amarillo). Se utilizó un modelo de múltiples animales desde una vista superior. Los estimadores de postura y los clasificadores de comportamiento se usaron para cuantificar la activación y el comportamiento de sondeo en los mosquitos. (E) Ejemplos de caminata, vuelo y sondeo de mosquitos, con predicciones de SLEAP superpuestas. La caminata y el vuelo se utilizan como métricas conductuales para la activación. (F) Salida de la entrega de estímulos. Las líneas onduladas amarillas indican estímulos térmicos de temperatura corporal, y los LEDs rojos indican estímulos de luz roja. (G) Etogramas de comportamiento de caminata, vuelo y sondeo en mosquitos Gr3-QF2, QUAS-CsChrimson y Gr3>CsChrimson (n = 22–23 mosquitos individuales por genotipo) tras la entrega de estímulos. (H) Comportamiento prolongado tras la activación optogenética en mosquitos Gr3>CsChrimson (n = 68–70 mosquitos individuales). Los paneles de la figura A–E fueron creados por los autores para esta publicación utilizando Adobe Illustrator, y no se requiere licencia de derechos de autor para su uso. Los datos en (F–H) se reproducen de Sorrells et al, 2022, con licencia CC BY 4.0⁸. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: El ensayo de manta sanguínea cuantifica la ingurgitación mediante activación optogenética. (A) Esquema del ensayo de manta sanguínea. El mosquito se encuentra dentro de una jaula de acrílico donde se presenta una sangre artificial accesible debajo de una malla. (B) Registro de la temperatura y del estímulo de luz roja del ensayo. (C) Esquema del ensamblaje de la placa de alimentación de manta sanguínea de aluminio. (D) El esqueleto SLEAP utilizado para la estimación de postura incluía los puntos descritos en la Figura 2D, además de cuatro puntos a lo largo de los lados del abdomen donde este se une al tórax y en los bordes de la parte más gruesa del abdomen. La ingurgitación se midió como el área comprendida entre los cinco puntos del perímetro abdominal, utilizando predicciones de un modelo multi-animales visto desde arriba. (E) Gráfico de violín que muestra el porcentaje medio de ingurgitación en la comida sanguínea artificial por genotipo (n = 10 ensayos de 14 mosquitos por ensayo para cada genotipo). La significancia se determinó mediante la prueba de Kruskal-Wallis, seguida por la prueba de Dunn con corrección de Holm. Letras diferentes indican una significancia de p < 0,05 entre grupos, donde los grupos con la misma letra no son significativamente diferentes entre sí. (F) Ingurgitación a lo largo del tiempo en un animal Gr3>CsChrimson, medida por el área abdominal. La línea de tendencia roja muestra una ventana móvil de 30 segundos durante ocho minutos del ensayo, con x = 0 marcando el momento en que comienza la ingurgitación. Todos los esquemas de la Figura 3 fueron creados por los autores para esta publicación utilizando Adobe Illustrator, y no se requirió una licencia de copyright para su uso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: El ensayo con alimentador óptico-membranal mide la atracción y la alimentación con sangre. (A) Esquema del alimentador óptico-membranal con sus componentes individuales. (B) Línea de tiempo de los ensayos experimentales. La línea azul representa una luz azul tenue durante todo el período de aclimatación y el experimento. Se muestra un segmento del estímulo experimental, que representa pulsos de luz roja de 1 segundo separados por 10 s. (C) Diagrama que ilustra el cableado del alimentador óptico-membranal. El diagrama del circuito fue creado con Fritzing bajo licencia CC-BY por los autores. (D) Ejemplo de un fotograma del video del alimentador óptico-membranal. Los mosquitos dentro del círculo rojo se cuentan para determinar el porcentaje de atracción. (E) Ejemplos de un mosquito sin alimentar y un mosquito saciado, con la cabeza, tórax y abdomen etiquetados por el modelo de seguimiento SLEAP para el alimentador óptico-membranal. Se utilizó un modelo SLEAP multi-animales de abajo hacia arriba para medir la atracción hacia la región de interés donde se coloca la comida con sangre. (F) Gráfico de líneas que muestra el porcentaje medio de ocupación en la región de la comida con sangre (que se utiliza como métrica conductual para el aterrizaje) a lo largo del tiempo, según el genotipo (n = 10 ensayos de 20 mosquitos por genotipo). La media se representa cada 30 s. Las regiones sombreadas indican el error estándar. La significancia estadística se determinó mediante la prueba de Kruskal-Wallis, seguida de la prueba de Dunn con corrección de Holm. Letras diferentes representan grupos significativamente distintos; el umbral se definió como p < 0,05. (G) Gráfico de violín que muestra el porcentaje medio de saciedad con la comida con sangre según el genotipo. En (F, G), la significancia estadística se determinó mediante la prueba de Kruskal-Wallis, seguida de la prueba de Dunn con corrección de Holm. Los genotipos indicados con la misma letra no son significativamente diferentes entre sí. El umbral de significancia se define como p < 0,05. La Figura 4 fue creada utilizando Adobe Illustrator, sus datos fueron recopilados por los autores para esta publicación, y no se requirió licencia de copyright para su uso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Este artículo describe protocolos detallados para evaluar la suficiencia de tipos celulares neuronales para impulsar etapas en la atracción del huésped y la picadura. El comportamiento de picadura consiste en una serie de pasos conductuales, desde la detección a larga distancia hasta la atracción a corta distancia, la penetración de la piel y la ingurgitación. En principio, los tipos neuronales podrían controlar acciones o etapas específicas, sesgar el comportamiento hacia secuencias específicas, aumentar la duración de toda la conducta o desempeñar muchas otras funciones. Por lo tanto, los múltiples ensayos presentados son necesarios para desentrañar la función neuronal en este proceso.

Varios errores comunes pueden provocar respuestas deficientes de los mosquitos en estos ensayos. La baja actividad y alimentación se pueden evitar realizando los experimentos durante el período de mayor actividad de los mosquitos, cerca de los momentos de transición entre los ciclos de luz y oscuridad en sus cámaras de incubación. Las tasas deficientes de alimentación en la manta de sangre y en el alimentador óptico-membranal podrían deberse a una mala calidad de la comida artificial o a una temperatura incorrecta. Asegúrese de que todos los reactivos (NaHCO₃, ATP, sangre de oveja desfibrinada) no estén caducados y se hayan almacenado adecuadamente. Se recomienda que todas las soluciones se preparen el día del experimento para garantizar la máxima frescura. Asegúrese de que la placa de la manta de sangre haga contacto directo con la superficie del bloque del termociclador PCR. Las placas del termociclador óptico y de la manta de sangre pueden acumular condensación si hay humedad residual. Antes de los experimentos, coloque las placas sobre toallas de papel para absorber cualquier humedad. Cuando se observe una respuesta optogenética deficiente, asegúrese de que los mosquitos tengan al menos una semana de edad y de que dispongan de suficiente tiempo para alimentarse con ATR, ya que este es un cofactor químico necesario para los canales CsChrimson.

Herramientas optogenéticas han sido creadas que son sensibles a longitudes de onda desde el azul (~450 nm) hasta el rojo (~650 nm), abarcando todo el espectro visible. La luz roja es particularmente útil en insectos, ya que generalmente tienen baja sensibilidad y/o respuestas conductuales a estas longitudes de onda.⁴⁰Curiosamente, los mosquitos muestran atracción durante el vuelo hacia manchas de estímulos visuales con longitudes de onda largas presentes en los tonos de la piel humana.⁴¹. Por lo tanto, el uso de luz roja podría ser una limitación que dificulta la interpretación de la activación optogenética en ensayos de atracción a huéspedes en mosquitos. Sin embargo, genéticamente control los mosquitos mostraron respuestas mínimas a la luz roja aplicada de forma amplia, incluso a intensidades elevadas (Figuras 2–4). Se recomiendan controles genéticos que carezcan de cualquiera de los constructos, el conductor o el efector, así como controles sin luz, para asegurar una interpretación precisa de los efectos conductuales. Un control que carezca del cofactor de rodopsina ATR suele utilizarse en experimentos de optogenética en otras especies; sin embargo, el alimento para peces utilizado para alimentar a las larvas de mosquito contiene vitamina A, el precursor de ATR, por lo que este control es menos efectivo en este sistema.

Los estímulos optogenéticos presentados aquí se limitan a estímulos continuos de intensidad luminosa ajustable. Es más probable que los estímulos optogenéticos que reproducen fielmente los patrones naturales de actividad neuronal desencadenen el comportamiento de interés. Por lo tanto, si se dispone de grabaciones neuronales, el estímulo puede diseñarse para que coincida con la intensidad y la dinámica temporal observadas. Cuando esta información no está disponible, la función de las neuronas puede evaluarse mediante diferentes estímulos y contextos conductuales, con la salvedad de que los resultados podrían no reflejar la función de las neuronas durante un comportamiento naturalista. No obstante, inducir actividad neuronal fuera del rango natural puede utilizarse para explorar circuitos o propiedades conductuales de formas únicas, de la misma manera que la electrofisiología puede emplearse para investigar propiedades celulares. Hasta ahora, las herramientas optogenéticas solo se han utilizado en neuronas sensoriales del mosquito, una aplicación que ofrece ciertas ventajas frente a la administración de estímulos naturales. Las estrategias tradicionales para medir la búsqueda de huésped en mosquitos dependen de la administración de gas CO₂ real. El uso de CO₂ real requiere un flujo de aire filtrado y humidificado, lo que exige montajes experimentales complejos capaces de entregar y eliminar el gas con precisión en intervalos de tiempo breves^9,10,42,43. Tanto el flujo de aire como la humedad son señales que atraen al mosquito y guían su navegación, lo que hace que la administración optogenética resulte atractiva como método para estudiar los efectos de los estímulos olfativos por separado de estos otros estímulos. Las herramientas optogenéticas también se han utilizado previamente para estudiar el efecto del sexo y del estado fisiológico sobre el comportamiento⁸, aportando información valiosa sobre estas cuestiones importantes en la biología del mosquito.

Además de la optogenética, estos protocolos utilizan ensayos estándar que se han empleado para evaluar el comportamiento de los mosquitos y que presentan algunas limitaciones. Para facilitar la limpieza, la manta de sangre utiliza una comida artificial que contiene únicamente los sustancias sapidíferas necesarias para que los mosquitos se llenen. Esta limitación podría superarse mediante el uso de sangre (como en el alimentador opto-membrana) o materiales biomiméticos que reproduzcan aspectos del tejido del huésped. El calor en el opto-termociclador y la manta de sangre se entrega a mosquitos que caminan o están en reposo, en lugar de a mosquitos en vuelo, y está limitado por la velocidad de rampa del termociclador PCR. Por lo tanto, estos ensayos pueden detectar el comportamiento de sondeo y saciedad, pero no la atracción. Otra limitación de los ensayos en laboratorio es que, para comprender el efecto conductual de señales específicas, se excluyen otras señales que los mosquitos utilizan. Podrían desarrollarse ensayos en laboratorio cada vez más complejos y ensayos semicampestres para estudiar aspectos adicionales de los entornos naturalistas en los que los mosquitos se alimentan de sus huéspedes.

Otra limitación de la optogenética en el mosquito es que se han creado pocas líneas de conductores más allá de las destinadas a neuronas sensoriales. Por lo tanto, su potencial completo se alcanzará cuando se combine con conductores expresados en interneuronas que no pueden estimularse directamente mediante otros enfoques. Recursos recientemente emergentes, como el Atlas de Células del Mosquito Aedes aegypti, abren la puerta a avances en neurogenética de mosquitos⁴⁴. Será necesario un trabajo futuro para desarrollar dichos conductores y así explorar los circuitos neuronales de los mosquitos. De forma similar, se necesitan herramientas optogenéticas adicionales para la inhibición, con el fin de determinar si un tipo de neurona es necesario para un comportamiento particular. Aunque los ensayos presentados en este artículo están diseñados para medir la atracción al huésped y la alimentación con sangre, estos enfoques podrían ampliarse para estudiar otras etapas de la búsqueda de huéspedes y comportamientos como el apareamiento, la oviposición y la alimentación con néctar. Los estudios optogenéticos proporcionarán nuevas perspectivas sobre cómo se controla el comportamiento del mosquito a nivel de circuito neuronal y podrían conducir a nuevos enfoques para prevenir la propagación de enfermedades transmitidas por mosquitos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1⁄Acrílico negro de 8 pulgadas	McMaster-Carr	8650K32	Estructura de alimentador óptico-membranal
1⁄Acrílico transparente de 8 pulgadas	McMaster-Carr	8536K134	Cartucho óptico de alimentación por membrana
¼ Acrílico negro de una pulgada	McMaster-Carr	8560K259	Estructura de alimentador ópto-membrana
Adaptador de corriente alterna	Jameco ReliaPro	2197581	Estructura de alimentador óptico-membranal
Pegamento acrílico	United States Plastic Corp	97562	Cartucho alimentador óptico-membranal, jaula con manta de sangre
Adenosina 5′sal hidratada de trifosfato de disodio	Sigma-Aldrich	A6419-1G	Comida sanguínea artificial
Todo trans-retiniano	Spectrum Chemical	R3041-1GM	Crianza optogenética
Plataforma de aluminio	Thorlabs	MB12	Estructura de alimentador ópto-membranal
Lámina de aluminio 0,03125 in	McMaster-Carr	89015K11	Placa de alimentación con manta de sangre
Lámina de aluminio de 0,0625 in	McMaster-Carr	89015K37	Placa de alimentación con manta de sangre
Rastreador de Partes Animales (APT)	Laboratorio Branson en HHMI Janelia Farm	N/A	Versión 3.0, datos reproducidos del Opto-thermocycler (Figura 2), descargado el 9 de julio de 2020
Arduino IDE	Arduino	N/A	Versión 1.8.12, utilizada para el control de estímulos del opto-termociclador, manta térmica para sangre, & alimentador óptico de membrana
Placa de microcontrolador Arduino Uno Rev3	Arduino	A000066	Programación del alimentador óptico-membranal
Pantalla para ventana de fibra de vidrio negra	Productos Premium de Breakthrough	IHLRS3684BL	Jaula con manta de sangre
Cinta negra	Thorlabs	T137-2.0	Opto-termociclador
Cableties negros con cierre	Cable Ties y más	ct242	Estructura de alimentador ópto-membranal
Barrera de aislamiento lumínico	Establecer tienda	6520SF	Opto-termociclador y manta térmica para sangre
Luces LED azules	21LEDUSA	RB5730BLWP	Crianza de mosquitos
Botella	Botella SKS &y empaquetado	0604-07	Calentador de sangre ópto-membranal
Pellets para peces de fondo	API	5352983	Alimentación de larvas
Cámara	Mosca negra	U3-13S2M-CS, FLI	Grabación de video para ensayos
Contador de clics	ULine	H-7350	Larvas de aclareo
Computadora	Asus	X1407Q	Realización de ensayos
Bleach Concentrado (8,25% Hipoclorito de Sodio)	VWR	89501-620	Limpieza del alimentador de membrana óptica
CoolTerm	El software gratuito de Roger Meier	N/A	Versión 2.0.1, utilizada para la grabación del puerto serial del opto-termociclador, manta térmica para sangre, &y alimentador óptico-membrana
Sangre de oveja desfibrinada	Laboratorios Hemostat	DSB100	Comida sanguínea para alimentador opto-membranal
Tornillo hexagonal de cabeza redondeada 4-40	McMaster-Carr	92949A105	Placa de alimentación con manta de sangre
Epoxi	Loctite	1363118	Placa de acrílico del termociclador óptico, estructura alimentadora de membrana óptica
Etanol	Decon Labs	2716	Sanitización
Unidad externa de disco duro	LaCie	LAC9000298	Almacenamiento de video
ffmpeg	FFmpeg	N/A	Versión 8.0.1, preprocesamiento de video
Mecha de algodón de cuatro pulgadas	Richmond Dental	201226	Alimentación de mosquitos adultos
GitHub	GitHub, Inc	N/A	Repositorios para código, archivos de piezas y modelos SLEAP para el opto-termociclador (v1.0.0, https://github.com/sorrellslab/opto-thermocycler/releases/tag/v1.0.0), manta de sangre (v1.0.0, https://github.com/sorrellslab/bloodblanket/releases/tag/v1.0.0) y alimentador óptico de membrana (v1.0.0, https://github.com/sorrellslab/opto-membranefeeder/releases/tag/v1.0.0)
Gr3>CsChrimson	N/A	N/A	Creado para este estudio, descrito en el paso 1.2
Mosquitos Gr3-QF2	N/A	N/A	Reactivo genético, DOI: 10.1016/j.cell.2013.12.044
Incubadora con puerta opaca	Caron	7340-25	Cría de mosquitos
Luz LED infrarroja	Adafruit	387	Opto-termociclador y manta térmica para sangre
Tira de LED infrarrojos	Iluminación de forma de onda	7031.85	Opto-termociclador, manta sanguínea y estructura opto-membranal
Filtro de paso infrarrojo	Edmund Optics	65-796	Grabación de video para ensayos
Jaula para insectos	Bugdorm	DP1000	Recinto para mosquitos adultos
Anotador Automático de Comportamiento Animal Janelia (JAABA)	Laboratorio Branson en HHMI Janelia Farm	N/A	Opto-thermociclador reprodujo datos (Figura 2); Versión 0.5.0
Taza grande para sopa	WebstaurantStore	50016SOUPPLA	Crianza de mosquitos
Disipador de calor para LED	Luxeon Star	N25-15B	Opto-termociclador y manta térmica para sangre
Lente LED	Luxeon Star	10209	Opto-termociclador y manta térmica para sangre
Soporte para lente LED	Luxeon Star	10235	Opto-termociclador y manta térmica para sangre
Cinta para lente LED	Luxeon Star	LT-01	Opto-termociclador y manta para sangre
Luz LED	Luxeon Star	SP-01-D9	Estímulo de luz roja para Opto-thermocycler y manta térmica para sangre
Cinta térmica LED	Luxeon Star	LXT-S-12	Opto-termociclador y manta sanguínea
Rieles de Construcción Óptica	Thorlabs	XE25L12, XE25L24, XE25L09, XE25T4, RA90, TRA6, TR12	Opto-termociclador y estructura de manta sanguínea
Poste óptico	Thorlabs	TR12	Estructura de alimentador óptico-membranal
Toallas de papel	Pacific Blue	27385	Limpieza del recipiente
Parafilm	Amcor	PM-996	Manta de sangre, contenedor óptico para membrana de comida
termociclador para PCR	Eppendorf	2231001196	Opto-termociclador y manta de sangre
Vaso plástico para porciones	Elección	999P2C	Alimentación de mosquitos adultos
Tapa para vaso desechable de plástico	Elección	999PL2	Alimentación de mosquitos adultos
Bandeja de policarbonato	Cambro	21410CWCHCL	Crianza de larvas
Mitad de bandeja de policarbonato	Cambro	24CW135	Limpieza óptica de membranas
Tapa de tamaño reducido para bandeja de policarbonato	Cambro	20CWCH135	Limpieza de membranas ópticas
Tapa de bandeja de policarbonato	Cambro	10CWCH135	Crianza de larvas
Tubo de policarbonato	McMaster-Carr	8585K56	Cartucho alimentador ópto-membranal
Medidor de potencia	Coherente	1299161	Todos los ensayos
Mosquitos QUAS-CsChrimson	N/A	N/A	Reactivo genético, DOI: 10.7554/eLife.76663
Luces RGB	Digikey	289-1189-ND	Entrega de estímulo mediante alimentador óptico-membranal
Abrazadera de ángulo recto	Thorlabs	RA90	Estructura de alimentador óptico-membranal
Cinta adhesiva Scotch Magic	3M	104	Opto-termociclador y tapa acrílica de manta térmica para sangre
Junta de silicona, 0,5 mm	McMaster-Carr	1460N22	Placa de alimentación con manta de sangre
SLEAP	Laboratorio Talmo	N/A	Versión 1.4.1a2, seguimiento de la postura de mosquitos en cada uno de los ensayos
Bicarbonato de sodio, solución tampón 1 M, pH 8,0	Thermo Scientific	J62495.AP	Comida artificial para sangre
Solución de cloruro de sodio	Sigma-Aldrich	S5150-1L 100 3532552	Comida sanguínea artificial
SpinView	Teledyne Vision Solutions	N/A	Versión 1.27.0.48, software de grabación de video para los tres ensayos
Botella de pulverización	Uline	S-11686	Sanitización
Sacarosa	Sigma Aldrich	S0389-500G	Alimentación de mosquitos adultos
Termopar (tipo T)	Harold G Schaevitz Industries LLC	CPTC-120-X-N	Opto-termociclador y manta sanguínea
Amplificador de termopar	Adafruit	MAX31856	Opto-termociclador y manta térmica para sangre
Temporizador	EnduraLight	RAC-MT	Control del ciclo de luz para el cría de mosquitos
Pipeta de transferencia	Thermo Scientific	SAM-225	Larvas delgadas
Bolsa de basura	Uline	S-23040	Transporte de insectos
Malla resistente a los rayos UV	McMaster-Carr	87655K13	Opto-membrana alimentadora de cartucho
Agua	Sigma Aldrich	W4502-1L	Comida artificial de sangre para manta de sangre
Hilo encerado	McMaster-Carr	6356K91	Tapa de cartucho óptico-membrana
Malla metálica	McMaster-Carr	9322T65	Estructura de alimentador óptico-membranal