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Artículo de investigación
La fragmentación del ADN espermatozoide aumentó y la motilidad disminuyó significativamente con la exposición prolongada al semen tras la eyaculación. En 14 muestras normales, la fragmentación del ADN aumentó un 5,5%, 11,5% y 16,1% a 1 hora, 2 horas y 4 horas, respectivamente, mientras que la motilidad disminuyó. Estos hallazgos apoyan la minimización de los retrasos en la recogida y procesamiento del semen fuera del lugar.
Se sabe que la fragmentación del ADN espermatozoide es perjudicial para la calidad del esperma, lo que puede afectar negativamente los ciclos de la tecnología de reproducción asistida (TAR). Examinar la fragmentación del ADN espermática (SDF) en el fluido seminal a lo largo del tiempo puede aportar información sobre los efectos de la exposición prolongada al semen en la integridad del ADN espermática. En este estudio preliminar, se realizó un ensayo SDF en varios momentos para simular las condiciones de recogida de semen fuera del lugar utilizando el ensayo de dispersión de cromatina espermática en 14 muestras normales de semen. El análisis estadístico de los porcentajes de fragmentación del ADN durante la duración del ensayo mostró que la prolongada estancación del fluido seminal desde la eyaculación hasta el análisis de semen aumentó significativamente la fragmentación del ADN. La motilidad media de los espermatozoides se redujo significativamente en un 7,4% a 1 hora, un 14,5 % a 2 horas y un 18,7 % a 4 horas, y la FDS media aumentó significativamente un 5,5 % a 1 hora, un 11,5% a las 2 horas y un 16,1% a las 4 horas después de la recogida de semen. Esta disminución en la calidad del esperma con el tiempo puede influir en los protocolos de las clínicas de fertilidad a la hora de considerar la preparación del esperma para ciclos de ART, especialmente cuando la recogida de semen se realiza fuera del laboratorio de andrología. Los laboratorios pueden considerar establecer un umbral de tiempo aceptable para recibir semen de la recogida fuera del lugar.
La Organización Mundial de la Salud (OMS) identifica que una de cada seis personas, o el 17,5% de la población mundial, experimenta infertilidad en algún momento de suvida 1. Aproximadamente el 20% de los casos de infertilidad tienen un único diagnóstico de infertilidad por factor masculino, con un 30–40% adicional de los casos con factor masculino como diagnósticosecundario 2. Incluso en hombres sanos, los parámetros seminales pueden variar mucho de un individuo a otro, incluyendo fluctuaciones en concentración, motilidad, morfología yvitalidad 3. Por tanto, es importante comprender los factores específicos que comprometen la fertilidad masculina para proporcionar un tratamiento adecuado en un entorno clínico.
Un área de investigación en desarrollo es el efecto de la integridad del ADN espermatozoide en los ciclos 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. El manual de laboratorio de la OMS para el examen y procesamiento del semen humano, 5ª edición, indica que la fragmentación del ADN espermatozoide (SDF) (ya sea por fracturas de cadena simple o doble) puede afectar al desarrollo, implantación y resultados del embarazoembrional 14. Muriel et al. realizaron un análisis de SDF y encontraron que un aumento de SDF produjo tasas de fertilización, calidad embrionaria y tasas de implantación deterioradas en los ciclosART 10. Sin embargo, es necesario comprender mejor qué causa la fragmentación del ADN.
Estudios previos informan que el estrés oxidativo puede provocar una disminución de la motilidad espermática, una producción y función enzimática deterioradas y, lo más importante, daños en elADN 8. Este daño al ADN puede incluir, pero no se limita a, deleciones génicas, traducciones erróneas y SDF. Actualmente, se utilizan ensayos SDF para evaluar la integridad del ADN espermatozoide. Aunque los estudios han correlacionado la criopreservación, el manejo de medios y el estrés oxidativo con SDF, se sabe poco sobre SDF en el periodo desde la eyaculación hastael análisis 4,5. Este es un momento crítico en la vida útil del esperma, dado el aumento de la prevalencia de colecciones caseras de esperma para la preparación en los ciclosART 15. Las colecciones en casa se han vuelto cada vez más populares durante la pandemia de COVID-19, ya que limitan el contacto directo con el paciente y aumentan la comodidad y la conveniencia. Sin embargo, no existen directrices específicas que sugieran un momento óptimo desde la eyaculación hasta el análisis para las colecciones en casa. Por tanto, el objetivo principal de nuestro estudio fue entender si la SDF cambia con el tiempo en el fluido seminal estancado y si tales cambios pueden ser relevantes para el manejo de muestras ART.
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El estudio se llevó a cabo conforme a la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Consejo de Revisión Institucional de los Hospitales Universitarios (STUDY20201371). Se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos implicados en el estudio. Se seleccionaron catorce muestras de semen de pacientes en un único centro académico de fertilidad en el noreste de Ohio. Todas las muestras analizadas en este experimento se recogieron en nuestras instalaciones. La prueba de dispersión de cromatina espermática se realizó en muestras de semen por un andrólogo totalmente formado, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, para minimizar la variación interpersonal. Con este kit, los espermatozoides frescos intactos y sin fijar se sumergieron en un microgel inerte de agarosa sobre una lámina pretratada y luego se enfriaron a 4 °C durante 5 minutos para solidificar el microgel. Se utilizó un tratamiento inicial con ácido para desnaturalizar el ADN de espermatozoides con ADN fragmentado, y se aplicó una solución tampón de lisis para eliminar proteínas nucleares. Tras lavarse con agua destilada, los portaobjetos se deshidrataban en soluciones de etanol clasificados y se secaban al aire. Cuando se visualizó en microscopía óptica tras teñir con las soluciones de tinción proporcionadas por el kit, el esperma sin fragmentación mostró nucleoides con un gran halo de dispersión (mayor que un tercio del diámetro del núcleo), mientras que el espermatozoide con fragmentación mostró un halo pequeño (menos de un tercio del diámetro del núcleo) o la ausencia de halo. El porcentaje de esperma con fragmentación del ADN se calculó como el número de espermatozoides fragmentados y degradados y se expresó como porcentaje. Un total de 300 espermatozoides se contaron en una lámina y se clasificaron como con un halo de dispersión grande o media, o como ausencia de un halo de dispersión. Este recuento se replicó dos veces para evaluar la variabilidad técnica, y los dos conteos se promediaron. La sensibilidad y especificidad diagnóstica del kit es del 93%, y en cada experimento se incluyeron controles tanto positivos como negativos. Las muestras de semen se evaluaron a 0, 1, 2 y 4 horas (0 h se definió como 15 minutos después del periodo de licuefacción a 37 °C) y se mantuvieron a temperatura ambiente (22–25 °C).
Se realizó un análisis adicional de motilidad en cada muestra a 0, 1, 2 y 4 horas. La evaluación de motilidad fue realizada por un andrólogo experimentado mediante un protocolo de conteo utilizando una cámara de conteo desechable. Se contaron trescientos espermatozoides móviles por cuadrícula y el recuento se replicó dos veces. Se calculó una concentración media de espermatozoides móviles basándose en los dos recuentos replicados.
Se realizaron análisis estadísticos utilizando ANOVA de medidas repetidas para comparar cada grupo temporal. Cuando se detectó un efecto global significativo, se aplicó la prueba de diferencia honestamente significativa (HSD) de Tukey para comparaciones post hoc por pares. Se consideró estadísticamente significativo un valor p < 0,05. La información detallada sobre los materiales se resume en la Tabla de Materiales.
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Para evaluar el impacto de la exposición prolongada al semen en la motilidad espermática y la fragmentación del ADN, se analizaron un total de 14 muestras de pacientes normozozospermicos en cuatro puntos temporales desde la recogida. Las muestras analizadas se consideraron "normales" según los parámetros de análisis de semen según la5ª edición14 de la OMS. Todas las muestras se recogieron in situ en nuestro Centro de Fertilidad para optimizar la precisi...
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En las muestras incluidas en este experimento, la SDF aumentó con el tiempo, mientras que la motilidad disminuyó en el mismo periodo. Esto sugiere que la integridad del ADN espermatozoide puede disminuir cuando el líquido seminal permanece estancado durante más tiempo entre la eyaculación y el análisis o procesamiento. Aumentar el tiempo que las muestras permanecieron estancadas antes del análisis puede haber incrementado la exposición a condiciones asociadas al estrés oxidativo. Como se...
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Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Calculadora de ANOVA | Statistics Kingdom | Análisis estadístico https://www.statskingdom.com/anova_manova.html | |
| Halosperm G2 | Halotech | HT-HSG2 | Kit de diagnóstico in vitro para medir la fragmentación del ADN del esperma https://halotechdna.com/es/producto/halosperm-g2/ |
| Microcell | Vitrolife | 15423 | Cámara de conteo desechable para el análisis del semen https://www.vitrolife.com/products/sperm-processing/microcell--accessories/ |
| Control de calidad para tiras de prueba de WBC/pH | Sistemas Electrónicos Médicos | A-CA-01752-00 | Control positivo y negativo para las tiras de prueba QwikCheck WBC https://mes-global.com/products/semen-analysis-validation-kits/qwikcheck-test-kits/qwikcheck-wbc-ph-test-strips-quality-control/ |
| Tiras de reactivo de prueba de WBC/pH QwikCheck | Sistemas Electrónicos Médicos | 0700 | Determinar leucocitos (WBC) en el semen https://mes-global.com/products/semen-analysis-validation-kits/qwikcheck-test-kits/ |
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