Ensayo de unidad formadora de colonias adaptado para células mononucleares de médula ósea y sangre periférica derivadas del paciente

Resumen

Este protocolo describe un procedimiento para inducir la diferenciación de células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas derivadas de células mononucleares de médula ósea y sangre periférica del paciente. El ensayo utiliza un medio de cultivo semisólido que apoya el compromiso de linaje eritroide y mieloide e incorpora métricas estandarizadas para la clasificación de colonias reproducibles para la caracterización preclínica de fármacos.

Resumen

El ensayo de unidad formadora de colonias (UFC) es una técnica fundamental para estudiar enfermedades hematológicas, incluyendo los síndromes mielodisplásicos (MDS) y la leucemia mieloide aguda (LMA). Este ensayo emplea medios semisólidos complementados con combinaciones definidas de citocinas para apoyar el crecimiento tridimensional y la diferenciación específica de linaje de células progenitoras eritroides y mieloides. Sin embargo, las muestras de sangre periférica y médula ósea derivadas del paciente presentan desafíos técnicos debido a la reducción de la viabilidad, mayor sensibilidad al manejo y variabilidad en el crecimiento de las colonias. Además, las directrices existentes para identificar y contar colonias muestran una variabilidad considerable en la definición del tamaño y los tipos de linaje de la colonia, limitando la reproducibilidad entre estudios. El protocolo descrito aquí está optimizado para el crecimiento y diferenciación de células madre y progenitoras hematopoyéticas aisladas de muestras de pacientes con MDS y LMA. El protocolo enfatiza el manejo suave de las células, el procesamiento estéril de muestras de pacientes, condiciones optimizadas de cultivo y duraciones de crecimiento adaptadas a células derivadas del paciente. Este protocolo proporciona un marco práctico para los ensayos de UFC utilizando muestras derivadas del paciente y establece una métrica estándar para el recuento y análisis consistente de colonias en la investigación hematológica de malignidades.

Introducción

La hematopoyesis es un proceso estrictamente regulado en el que las células madre hematopoyéticas (HSC) que residen en nichos de médula ósea dan lugar a todas las líneas celulares maduras de células sanguíneas. A través de una serie jerárquica de eventos de diferenciación, las HSCs generan progenitores multipotentes que se comprometen progresivamente con linajes eritroides, mieloides y linfoides antes de experimentar la maduración terminal en células sanguíneas circulantes funcionales. Este proceso está regulado por la señalización coordinada dentro del microambiente de la médula ósea y por mecanismos intrínsecos de regulación transcripcional y epigenética. Las alteraciones en estas vías reguladoras, especialmente por la acumulación de mutaciones genéticas o somáticas en los HSC, pueden afectar la diferenciación normal y conducir a la expansión clonal de progenitores anormales. Estas alteraciones pueden dar lugar a trastornos hematológicos caracterizados por hematopoyesis y citopenias ineficaces, incluyendo síndromes mielodisplásicos (MDS) y leucemia mieloide aguda (^LMA)1,2,3,4,5.

El ensayo de unidad formadora de colonias (UFC) es una técnica in vitro bien establecida para evaluar el potencial de diferenciación de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPCs). Originalmente desarrollado como un ensayo a corto plazo para medir la capacidad proliferativa y de diferenciación de progenitores hematopoyéticos ^6,7,8, el ensayo CFU se ha convertido desde entonces en una herramienta ampliamente utilizada tanto en hematología clínica como^{experimental 9}. En entornos de laboratorio preclínico, el ensayo se utiliza frecuentemente para evaluar el impacto de perturbaciones genéticas o terapias candidatas en la diferenciación hematopoyética. En el contexto de la investigación sobre MDS y LMA, los ensayos CFU proporcionan una lectura funcional para entender cómo las alteraciones moleculares y genéticas influyen en la capacidad de diferenciación de la médula ósea o de las células sanguíneas periféricas derivadas del paciente.

El ensayo de UFC consiste en cultivar HSPCs en un medio semisólido a base de metilcelulosa, complementado con factores de crecimiento definidos que apoyan la expansión y diferenciación específicas de la línea de linaje. Bajo estas condiciones, las células progenitoras proliferan y dan lugar a colonias discretas, que pueden clasificarse morfológicamente según la identidad del linaje. En este protocolo se utiliza un medio semisólido a base de metilcelulosa disponible comercialmente optimizado para la diferenciación eritroide y mieloide. El medio contiene una combinación de citocinas, incluyendo interleucina-3 (IL-3), interleucina-6 (IL-6), factor de células madre (SCF), eritropoyetina (EPO), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF). En conjunto, estos factores apoyan el crecimiento de progenitores eritroides como los eritroides unitarios formadores de colonias (CFU-E) y los eritroides unitarios formadores de estallido (BFU-E), los progenitores de granulocitos mieloides y macrófagos (CFU-GM) y progenitores multipotentes como los progenitores de granulocitos, eritrocitos, monocitos y megacariocitos (CFU-GEMM^)10,11.

A pesar de su amplia utilidad, el medio semisólido mencionado anteriormente tiene una capacidad de diferenciación limitada, ya que no soporta adecuadamente la diferenciación de megacariocitos y plaquetas. Para estas aplicaciones, son más apropiadas formulaciones más especializadas que contengan factores de crecimiento plaquetario; Sin embargo, están fuera del alcance del protocolo describido. En general, mediante una selección cuidadosa de la formulación del medio combinada con evaluación morfológica y análisis posteriores como la citometría de flujo, los investigadores pueden evaluar eficazmente la sensibilidad de los fármacos mediante el análisis del compromiso de linaje y el potencial^{de diferenciación 12}.

En este estudio, el ensayo de la UFC se utiliza para investigar el potencial terapéutico de terapias combinadas para el tratamiento de la enfermedad de alto riesgo recaída/refractaria. La pirimetamina es un antifolato clínicamente aprobado utilizado para tratar la toxoplasmosis y la malaria parasitaria, y recientemente se ha estudiado como agente^{anticancerígeno} 13,14,15. Estudios recientes han demostrado que el tratamiento con pirimetamina puede actuar mediante la inhibición de vías clave que regulan la síntesis de pirimidina de novo¹⁶. Aquí, en este protocolo, se utilizan ensayos de CFU para investigar la eficacia clínica de la pirimetamina como terapia de agente único y como terapia combinada con Venetoclax, que es una terapia de primera línea actual para el tratamiento de MDS y^{LMA 17,18}.

A pesar de su amplia utilidad, el ensayo CFU presenta varias limitaciones técnicas. La identificación y clasificación de colonias dependen en gran medida de criterios morfológicos, que pueden introducir variabilidad entre observadores y entre centros^{de investigación} 6,19,20,21. Además, las muestras derivadas de pacientes de individuos con MDS o LMA suelen mostrar una viabilidad celular reducida, mayor fragilidad y heterogeneidad, lo que puede complicar la formación de colonias y los análisis^posteriores. La preparación de las colonias para una caracterización posterior, incluida la citometría de flujo, puede requerir un manejo cuidadoso para preservar la integridad celular. La ausencia de procedimientos estandarizados para la identificación, el recuento y el análisis posterior de colonias contribuye aún más a la variabilidad entre estudios. Estas consideraciones técnicas ponen de manifiesto la necesidad de procedimientos estandarizados optimizados específicamente para muestras hematopoyéticas derivadas del paciente.

Este protocolo describe un flujo de trabajo optimizado para realizar ensayos de UFC utilizando células mononucleares derivadas de muestras primarias de médula ósea o sangre periférica de pacientes con malignidades hematológicas. El enfoque se centra en estrategias prácticas para manejar células sensibles derivadas de pacientes, establecer condiciones de cultivo fiables e implementar criterios consistentes para la identificación y cuantificación de colonias. Al proporcionar una orientación metodológica detallada y enfatizar las prácticas de análisis reproducibles, este protocolo pretende facilitar una evaluación más fiable de la diferenciación hematopoyética y la respuesta terapéutica en estudios preclínicos de MDS y LMA.

Protocolo

Este estudio utiliza biomuestras humanas desidentificadas obtenidas de un biobanco bajo un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional, "Biología Molecular de Trastornos Hematológicos Benignos y Malignos" (Protocolo IRB #200536), en el Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center. Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices éticas institucionales. Todos los reactivos y equipos están listados en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de células mononucleares de médula ósea o sangre periférica derivadas del paciente

NOTA: Según las directrices comunes de manejo de muestras de pacientes, se recomienda llevar bata de laboratorio larga y guantes desechables de laboratorio resistentes a desgarros, y trabajar bajo una capucha de cultivo celular de laboratorio para protección personal frente a la exposición a patógenos transmitidos por la sangre. Todas las puntas de la pipeta y las pipetas serológicas que entren en contacto con las células del paciente deben remojarse en una solución de lejía al 10% durante al menos 30 minutos antes de su eliminación en residuos de riesgo biológicos.

1. Preparación experimental
   1. Medios IMDM tibios, suero bovino fetal (FBS) y antibióticos penicilina-estreptocina (Pen-streptococo) a 37 °C durante al menos 30 minutos.
   2. Descongelar medios semisólidos a 4 °C durante la noche. El día del emplatado, calienta el biberón a temperatura ambiente (RT) durante al menos 30 minutos.
   3. Esteriliza la campana de cultivo celular con esterilización UV durante 15 minutos, luego rocía las superficies de la campanilla, las pipetas y los estantes de tubos con etanol al 70% (EtOH).
   4. Prepara un vaso de precipitados con una solución de lejía al 10% lo suficientemente grande para recoger las puntas de pipetas y pipetas serológicas contaminadas.
   5. Obtener células mononucleares de médula ósea o sangre periférica aisladas mediante métodos de centrifugación con gradiente de densidad. Las células pueden usarse el mismo día de la recogida o a partir de muestras congeladas en biobancos.
2. Si las muestras se congelan, descongelarlas rápidamente en un baño María a 37 °C hasta que la mayor parte del hielo se haya derretido y solo quede un pequeño cristal de hielo. Coloca inmediatamente las muestras sobre hielo tras descongelarlas.
   NOTA: Las muestras de pacientes son muy sensibles al descongelamiento. Es importante descongelar las muestras lo antes posible y en lotes para minimizar la muerte celular.
3. Suspender células en 5 mL de medio de crecimiento completo calentado (medios IMDM suplementados con 4% FBS y 1% Pen-Streptocócico).
4. Determina la concentración y viabilidad de las células usando tinte AO/PI y un contador celular automatizado.
5. Centrifuga las celdas a 350 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente para pelletarlas. Descarta el sobrenadante.
6. Resuspende las células en una solución fisiológica estéril de Dulbecco (DPBS) estéril de 5 mL. Repite la centrifugación para las celdas de pellet y descarta el sobrenadante.
7. Suspende las células en un medio de crecimiento completo hasta una concentración de 2 millones de células vivas/mL. Prepara suficientes celdas para 100K celdas por pozo de una placa de 6 pozos.

2. Preparación y administración de tratamientos farmacológicos.

NOTA: La pirimetamina se obtiene en polvo liofilizado y se reconstituye internamente en dimetilsulfóxido (DMSO) a una concentración de 100 mM; las alicuotas se almacenan a −80 °C. Venetoclax se compra predisuelto en DMSO a una concentración de 10 mM y se almacena a -20 °C. Para este experimento, venetoclax y pirimetamina se administran en una sola dosis mediante absorción libre en paralelo con una condición de tratamiento DMSO controlada por vehículo.
PRECAUCIÓN: La pirimetamina, venetoclax y DMSO son agentes biopeligrosos. Maneja solo debajo de la capucha, lleva EPI y úsala con extra precaución.

1. El día del emplatado, descongela la droga aliquot sobre hielo, vórtice y centrifuga a máxima velocidad en una mini centrífuga de mesa durante 30 s.
2. Vierte el vórtice y mezcla vigorosamente una botella de medio semisólido hasta que todos los componentes estén homogeneizados. Déjalo intacto en la campana a temperatura ambiente durante 30 minutos para permitir que las burbujas suban a la superficie.
3. Prepara 3 mL de alícuotas de medios semisólidos en tubos cónicos estériles de 15 mL. Deja que los tubos permanezcan intactos durante 30 minutos para que las burbujas suban a la superficie. Las alicuotas de medios semisólidos extra pueden volver a congelarse y almacenarse a -20 °C para su uso posterior.
4. No añadir más de 10 μL de volumen de fármaco al medio semisólido. Para este experimento, las concentraciones de venetoclax y pirimetamina se ajustan según condiciones sinérgicas determinadas empíricamente. A un grupo de control de vehículo, añade volúmenes equivalentes de DMSO. Prepara alicuotas duplicadas de 3 mL para cada condición.
   NOTA: Es importante mantener el volumen añadido de fármaco despreciable para que no afecte a la concentración final del fármaco en el medio semisólido.
5. Medios vórtices en ráfagas cortas de 4 a 5 para incorporar completamente la droga en el medio.
   NOTA: No mantenga la mezcla celular en el vórtice durante largos periodos de tiempo, ya que esto podría causar muerte celular.
6. Añadir 100 μL de celdas o un volumen equivalente de 200.000 celdas a los 3 mL de alícuotas de medios semisólidos. Mezcla de vórtices en ráfagas cortas hasta que está completamente incorporada/homogeneizada.
7. Coloca una aguja roma de 16 g en una jeringuilla de 3 mL y deja caer la aguja y la jeringuilla en la mezcla celular. Déjalo sin molestar durante 30 minutos para que las burbujas suban a la superficie.

3. Placado de la suspensión celular tratada con fármacos.

1. Usando una aguja sumergida y una jeringuilla, toma la mezcla de células y fármacos, teniendo cuidado de no aspirar burbujas de aire. Espera 3–5 minutos y luego recoge la mezcla restante que se ha acumulado en los laterales del tubo cónico de 15 mL.
2. En una placa estéril de 6 pozos, se añade la mezcla de la celda gota a gota, alternando grandes gotas entre 2 pozos de una columna exterior de la placa. Extiende la mezcla inclinando suavemente la placa en círculos para cubrir uniformemente todo el fondo de los pozos. Estos dos pozos constituyen réplicas técnicas.
   NOTA: Si se forman burbujas o se añaden accidentalmente a los pozos, utiliza una punta de filtro de la pipeta para hacer reventar o mover suavemente las burbujas hasta el borde de la placa. Cualquier burbuja grande que quede en la placa puede afectar el crecimiento de las colonias.
3. Añadir la mezcla de ensayo de colonia solo a las columnas exteriores de la placa de 6 pozos. En la columna central, añade 5 mL de agua estéril a cada pozo. Añadir agua a los pozos asegurará que haya suficiente humedad para evitar que el medio semisólido se seque.
4. Incubar la placa en una incubadora a 37 °C con un 5% de CO₂. Monitoriza el crecimiento celular y los niveles de agua dos veces por semana. Las células deberían formar colonias visibles a simple vista alrededor de los 7 días después del placaje, y las placas deberían alcanzar una confluencia del 75%–80% entre 14 y 21 días después del placaje.

4. Imagen y conteo de colonias

NOTA: Este protocolo describe parámetros que están validados para su uso en el sistema de imagen EVOS M7000. Estos ajustes pueden necesitar optimizarse o adaptarse para ser compatibles con otros sistemas de imagen de placas.

1. Quita la tapa protectora del filtro de luz de la plataforma del microscopio. Enciende el microscopio y abre el programa de software asociado.
2. Inserta un difusor de luz en la lente superior del aparato del microscopio.
3. Inserta la posición de la placa en la plataforma de modo que el pozo A1 quede en la esquina superior izquierda.
4. En el software de imagen, introduce los siguientes ajustes de enfoque:
   1. Selecciona el recipiente que vas a imaginar. En este protocolo, se utiliza una placa de 6 pozos.
   2. Pon el objetivo en 4X.
   3. Selecciona la fuente de luz como Trans o cambia el microscopio a modo campo claro.
   4. Enciende la luz del microscopio y ajusta manualmente la intensidad de la luz usando el deslizador grueso. Para el instrumento utilizado en este protocolo, el rango óptimo para las colonias de imagen es alrededor de 0,03.
   5. Si el instrumento tiene una función de autoenfoque, úsala para ajustar el enfoque. Si es necesario, ajusta el enfoque más usando los ajustes manuales de enfoque fino.
5. Introduce los siguientes ajustes automáticos de captura de imagen:
   1. Selecciona toda la zona del pozo que se va a visualizar en cada pozo.
   2. Selecciona la captura automática de imagen para comenzar desde el centro del pozo y espiralar hacia los bordes del pozo.
   3. Selecciona los ajustes de enfoque automático para que el instrumento vuelva a enfocar en cada pozo.
   4. Selecciona que las imágenes raw de cada pozo se mezclen o encasellaron.
   5. Selecciona que las imágenes estén invertidas horizontal y verticalmente.
   6. Selecciona la configuración de guardado de datos para recopilar "imagen en mosaico" y "imagen fusionada"
   7. Haz el escaneo automático de matrículas. El instrumento utilizado en este protocolo funcionará a una velocidad de 1,5 min/pozo.
   8. Retira la placa, coloca la tapa protectora del filtro sobre la plataforma del microscopio, apaga el microscopio y cierra el software.
   9. Tras la imagen, se cuentan manualmente las colonias individuales totales, así como los subtipos mieloides y eritroides en cada pozo utilizando las imágenes de pozos fusionados en mosaicos.
6. Definan las colonias según la siguiente caracterización morfológica:
   1. Consideremos una colonia individual o un grupo de colonias distinto cuando está lo suficientemente lejos de otra población celular, a una distancia igual a su propia longitud. Las poblaciones que se encuentran dentro de este límite de distancia se agrupan en un solo recuento de colonias.
   2. Asegúrate de que las colonias eritroides estén profundamente pigmentadas y tengan un color rojo oscuro. Estas colonias aparecen como poblaciones o racimos únicos de crecimiento denso con bordes claramente definidos. Las colonias eritróides más pequeñas que consisten en poblaciones celulares inmaduras de crecimiento lento se clasifican como CFU-E. Las colonias más grandes con poblaciones más maduras se clasifican como BFU-E.
   3. Comprueba que las colonias mieloides contengan células que parezcan más translúcidas y sean de color más claro. Las colonias mieloides están más dispersas y no presentan bordes claramente definidos. Las colonias mieloides tienden a crecer más a menudo como poblaciones individuales que en racimos, aunque ocasionalmente pueden verse grupos. En ambos casos, las colonias mieloides se clasifican como CFU-GM.
   4. Clasificar las colonias mixtas que contienen subtipos eritroides y mieloides como CFU-GEMM.

5. Recolección y congelación celular para análisis aguas abajo mediante citometría de flujo

1. Realiza los siguientes pasos antes de empezar:
   1. a. Preparar y calentar el tampón de clasificación de celdas activado por fluorescencia (tampón FACS, compuesto por DPBS/4% FBS) y el medio congelante (FBS/10% DMSO) en un baño maria a 37 °C durante al menos 30 minutos.
2. Añade 5 mL de buffer FACS calentado a la superficie de cada pozo. Incubar las placas durante al menos 30 minutos en una incubadora a 37 °C para disolver el medio semisólido.
3. Resuspende completamente las células usando una pipeta de 5 mL y transfiere a un tubo cónico estéril de 50 mL.
4. Usando 5 mL de tampón FACS calentado, lava cada pozo 3 veces y transfiere todo el volumen al tubo cónico de 50 mL.
5. Resuspende bien las células mediante vórtices en ráfagas cortas de 4–5 veces, luego centrifuga a 400 x g durante 10 minutos en RT para las celdas de pellet. Si el pellet no es visible tras la centrifugación, las celdas permanecen suspendidas en un medio semisólido. Sin aspirar, añade 10–15 mL DPBS extra al tubo para diluir aún más el medio semisólido y resuspender bien. Si es necesario, incubar a 37 °C durante 10–15 minutos para disolver completamente el medio, y luego volver a aplicar las células en pellet.
6. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células en un tampón FACS de 10 mL. Centrifugar a 400 x g durante 10 minutos en RT a las celdas de pellet.
7. Resuspender células en medios congelantes y 3 millones de células/criovial. Congela los viales en un recipiente de congelación a tasa controlada a -80 °C durante 24 horas para lograr una tasa de refrigeración de 1 °C / min.
8. Transfiere los crioviales al almacenamiento de nitrógeno líquido lo antes posible.
   NOTA: Las muestras que se mantienen a -20 °C durante largos periodos de tiempo tendrán una viabilidad reducida. Es importante trasladar las células a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.

Resultados

La Figura 1 ilustra la línea de análisis de colonias desde el aislamiento de muestras de pacientes hasta el análisis del recuento y morfología de las colonias. La Figura 2 muestra los ajustes clave para la imagen de colonias en un microscopio de campo claro. Las Figuras 3 y 4 muestran imágenes representativas de la formación de la colonia a part...

Discusión

El protocolo descrito aquí describe un flujo de trabajo optimizado para realizar ensayos de UFC utilizando muestras primarias de médula ósea y sangre periférica de los pacientes, con especial atención al mantenimiento de la viabilidad celular y a la garantía del crecimiento reproducible de colonias. Varios pasos del protocolo son fundamentales para lograr una formación fiable de colonias al trabajar con muestras derivadas del paciente. El descongelamiento rápido de las células mononuclea...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Blunt-End 16 G needles	STEMCELL Technologies	28110	para dispensar y sembrar medios MethoCult
Cellometer Auto 2000	Nexelcom Bioscience	26407	contador de células
CHT4 Counting Chambers (cell counter slides)	Revvity	CHT4-SD100-002	diapositivas para contador de células
Dimethyl sulfoxide	Fisher Bioreagents	BP231-100	usado para reconstitución de medicamentos y medios de congelación celular
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537	para cultivo celular
Ethanol 200 proof	Decon Laboratories, Inc.	2701	para la esterilización de superficies de cultivo celular
EVOS M7000 imaging system	ThermoFisher Scientific	AMF7000	para imágenes de colonias y placas
Fetal bovine serum	BenchMark	100-106	suplemento de medios para cultivo celular y congelación
IMDM Modified Culture media	Cytiva	SH30228.01	medios de cultivo enriquecidos adecuados para el manejo de muestras de pacientes
LuerLok Tip 3 mL Syringes	BD	309657	para dispensar y sembrar medios MethoCult
MethoCult H4435 Enriched	STEMCELL Technologies	04435	medios semisólidos basados en metilcelulosa para ensayo de colonias
Multiwell 6-well plate	FALCON	353046	para sembrar ensayos de colonias
Nikon Eclipse TS2FL Inverted Trinocular Phase Contrast Fluorescence Microscope	Coastal Microscopes	51623	Para imágenes y caracterización de morfología de colonias
Pen Strep	Gibco	15140-122	suplemento antibiótico para cultivo celular
pyrimethamine	Sigma-Aldrich	46706	antifolato aprobado por la FDA
UltraPure Distilled water	Invitrogen	10977-015	para sembrar ensayos de colonias
venetoclax	Selleck Chemical LLC	50-136-6419	quimioterapia aprobada por la FDA
ViaStain AOPI Staining Solution	Revvity	CS2-0106	tinción de viabilidad para conteo de células vivas