Este protocolo describe un método LAMP basado en un chip microfluídico completamente integrado que permite la detección, en un punto de atención, de 15 patógenos que causan infecciones del tracto respiratorio inferior en pacientes de UCI dentro de una hora.
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Artículo de método
Detección rápida en el punto de atención de patógenos causantes de infecciones del tracto respiratorio inferior en pacientes de la UCI
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Resumen
Resumen
Las infecciones del tracto respiratorio inferior (ITRI) son una de las principales causas de deterioro clínico y muerte en pacientes críticos. En la unidad de cuidados intensivos (UCI), la identificación oportuna del patógeno causal es esencial para una terapia antimicrobiana adecuada; sin embargo, los métodos convencionales de cultivo tardan de 3 a 5 días y presentan tasas de positividad subóptimas, particularmente para hongos. Los enfoques moleculares como la PCR acortan el tiempo de respuesta, pero aún dependen de la extracción manual de ácidos nucleicos y del termociclado, lo que limita su idoneidad para uso en el punto de atención. Este protocolo describe un flujo de trabajo para el punto de atención basado en un chip microfluídico completamente integrado con forma de disco (chip CD) que combina la purificación de ácidos nucleicos mediante perlas magnéticas con la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP). Tras un paso simplificado de licuefacción y lisis manual, la muestra procesada se carga en el chip junto con dos viales de reactivos preempaquetados. El instrumento realiza entonces de forma autónoma la extracción, la amplificación a 65 °C y la lectura en tiempo real de fluorescencia, proporcionando resultados cualitativos para 15 dianas, específicamente 11 bacterias, 3 hongos y 1 patógeno atípico, en 45 minutos de tiempo de funcionamiento del instrumento (aproximadamente 1 hora para todo el flujo de trabajo de muestra a resultado, incluido el paso manual de preprocesamiento). Presentamos datos de detección obtenidos de 10 muestras de UCI, incluyendo esputo, aspirados bronquiales y líquido de lavado broncoalveolar, que abarcan tanto infecciones por un solo patógeno como coinfecciones polimicrobianas que involucran hasta 7 organismos en un solo chip. El diseño cerrado del cartucho minimiza el riesgo de contaminación por aerosoles, y el único paso de carga no requiere formación especializada, lo que posiciona a este sistema como una herramienta diagnóstica práctica para su uso en la cabecera del paciente por parte de los equipos de UCI.
Introducción
Entre los pacientes críticamente enfermos en la UCI, las infecciones del tracto respiratorio inferior, siendo la neumonía asociada al ventilador (NAV) la principal de ellas, siguen siendo un factor persistente de morbilidad, ventilación mecánica prolongada y mortalidad excesiva1,4. El panorama microbiológico de las infecciones adquiridas en la UCI del tracto respiratorio inferior (ITRI) difiere notablemente del de las enfermedades adquiridas en la comunidad. Predominan los gramnegativos multirresistentes (Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii), a menudo en constelaciones polimicrobianas que dificultan los regímenes empíricos3,4. Los hongos oportunistas añaden una complejidad adicional. La aspergilosis pulmonar invasiva, antes considerada una característica distintiva de la inmunosupresión profunda, ahora se reconoce con frecuencia creciente en pacientes de la UCI sin neutropenia, especialmente tras la gripe grave y la COVID-195. Los algoritmos diagnósticos actuales para la aspergilosis combinan cultivos de bajo rendimiento con pruebas del antígeno galactomanano (GM), aunque el ensayo de GM tiene limitaciones debido a ventanas diagnósticas bien documentadas y sensibilidad variable en huéspedes no neutropénicos6. Cada hora de retraso en iniciar un tratamiento antimicrobiano adecuado para la sepsis se asocia con un aumento medible de la mortalidad7. En conjunto, la rapidez y complejidad de las infecciones en la UCI exigen herramientas diagnósticas que puedan hacer frente a la urgencia clínica.
El cultivo microbiológico convencional, aunque indispensable para las pruebas de susceptibilidad, está fundamentalmente limitado por la velocidad: el tiempo de respuesta abarca de 3 a 5 días, se pasan por alto organismos exigentes y la positividad del cultivo fúngico sigue siendo baja8. La secuenciación metagenómica de nueva generación (mNGS) ofrece una alternativa imparcial, pero su adopción clínica se ve limitada por el costo, tiempos de procesamiento de 24 a 48 horas, dependencia de tuberías de bioinformática y viabilidad reducida en el punto de atención9. Los paneles basados en PCR han reducido la brecha temporal, pero aún requieren extracción de ácidos nucleicos en múltiples pasos, instrumentación para ciclado térmico y, en formatos convencionales, electroforesis posterior a la amplificación10. Ninguna de estas plataformas satisface completamente las demandas convergentes de la UCI: rapidez inferior a una hora, tiempo mínimo de manipulación manual, cobertura multiplex de patógenos que incluya hongos y simplicidad operativa suficiente para personal no especializado en laboratorio.
La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) aborda varias de estas limitaciones. Descrito por primera vez por Notomi et al., el método amplifica el ADN diana a una temperatura constante de 65 °C utilizando un conjunto de cuatro a seis cebadores que reconocen seis regiones distintas, impulsado por una polimerasa desplazadora de cadenas11. La reacción genera estructuras características de amplicones en forma de horquilla y similares a coliflor, detectables mediante fluorescencia en tiempo real, produciendo curvas en forma de S en cuestión de minutos tras superar el umbral. La sensibilidad a bajas concentraciones de molde es alta, y el diseño con múltiples cebadores confiere selectividad que limita los falsos positivos12,13. Cuando se combina con plataformas de chips microfluídicos, LAMP puede paralelizarse para múltiples dianas a partir de una sola carga de muestra14. Trabajos previos demostraron que los sistemas de chip LAMP detectan patógenos respiratorios con un tiempo de respuesta muy inferior a tres horas15. Una limitación clave de esos sistemas, sin embargo, es su dependencia de una extracción manual separada del ADN, lo cual añade tiempo, complejidad operativa y riesgo de contaminación.
El sistema descrito aquí elimina ese cuello de botella. Diseñado alrededor de un chip microfluídico desechable con forma de disco (86 mm de diámetro), integra en un solo cartucho sellado la carga de la muestra, la purificación de ácidos nucleicos basada en perlas magnéticas y la amplificación LAMP en plex de 16 (Figura 1). El operador realiza únicamente un breve paso manual de licuefacción-lisis utilizando un tubo de procesamiento diseñado específicamente, luego carga el lisado y dos viales de reactivos sobre el chip (Figura 2). A partir de ese momento, el instrumento realiza de forma autónoma la extracción, la amplificación isotérmica a 65 °C y la adquisición de fluorescencia, proporcionando resultados cualitativos para 15 dianas clínicamente relevantes, a saber, 11 bacterias, 3 hongos (Aspergillus spp., Candida albicans, Pneumocystis jirovecii) y 1 patógeno atípico (Mycoplasma pneumoniae), en 45 minutos. Un gen de la familia del punto de ruptura del neuroblastoma (NBPF), utilizado como control interno, valida la adecuación de la muestra y la integridad de la reacción en cada ensayo. Este protocolo proporciona instrucciones paso a paso para todo el flujo de trabajo, desde la recolección de la muestra en la UCI hasta el preprocesamiento, la carga del chip, la detección automatizada y la interpretación de resultados, destinado tanto al personal del laboratorio clínico como a los equipos de atención en la cama del paciente en la UCI.
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Protocolo
Todas las muestras se recolectaron siguiendo un protocolo aprobado por el Comité de Revisión de Ética del Hospital Peking Union Medical College, Academia China de Ciencias Médicas (Número de aprobación: I-24PJ1778). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada participante o de su representante legal autorizado antes de la recolección de las muestras. El panel de patógenos diana y la asignación de pozos de reacción se enumeran en la Tabla 1, y los consumibles utilizados durante el preprocesamiento de las muestras se enumeran en la Tabla 2.
1. Recolección de muestras clínicas del tracto respiratorio inferior en la UCI
- Recolección de esputo
- Enjuagar la cavidad oral con agua limpia o solución salina fisiológica estéril tres veces para eliminar restos de alimentos y la flora oral comensal.
- Indicar al paciente que realice dos o tres respiraciones profundas, luego que tosa con fuerza para expulsar esputo respiratorio profundo directamente en un recipiente estéril de recolección.
NOTA: Un espécimen aceptable consiste en material viscoso, purulento o con estrías de sangre proveniente de debajo de la tráquea; la saliva clara o el goteo posnasal son inadecuados y pueden comprometer la detección posterior.
- Recolección de aspirado bronquial (BAS)
- En pacientes no intubados, insertar un catéter de succión estéril (un catéter de 10–12 Fr, con la fuente de succión ajustada a una presión de −0.0267 MPa, equivalente a −200 mmHg) por vía nasal u oral hasta una profundidad de aproximadamente 30 cm.
- Aplicar succión mientras se gira el catéter y retirarlo lentamente. Recoger las secreciones aspiradas en una trampa de muestra estéril.
NOTA: Si las secreciones son escasas, instilar aproximadamente 5 mL de solución salina estéril a través del catéter antes de la succión. - En pacientes con ventilación mecánica, seleccionar el catéter de succión según el tamaño del tubo endotraqueal: usar un catéter de 10 Fr para un tubo de 7,0–7,5 mm y un catéter de 12 Fr para un tubo de 8,0 mm.
- Preoxigenar al paciente con oxígeno al 100 % durante 30–60 s antes de la succión. Desconectar el circuito del ventilador e insertar el catéter seleccionado a través de la vía aérea artificial hasta encontrar resistencia.
- Aplicar una presión negativa de −0.0267 MPa (equivalente a −200 mmHg), limitando cada pasada de succión, y por tanto el tiempo de desconexión del ventilador, a no más de 15 s para minimizar la dereclutación y la hipoxemia, y reoxigenar al paciente con oxígeno al 100 % durante 30–60 s tras la succión.
- Instilar 1–2 mL de solución salina estéril a través del catéter y esperar 3 s.
- Aplicar succión y retirar el catéter. Recoger las secreciones aspiradas en una trampa de muestra estéril. Reconectar inmediatamente el circuito del ventilador tras la recolección de la muestra.
NOTA: Es esencial mantener una técnica estrictamente aséptica durante todo el procedimiento para evitar la contaminación nosocomial de la muestra.
- Recolección de líquido de lavado broncoalveolar (BALF)
- Identificar el segmento objetivo mediante imágenes torácicas. Avanzar el broncoscopio e introducirlo en el bronquio segmentario o subsegmentario adecuado hasta lograr una oclusión.
- Instilar rápidamente alícuotas de 20–50 mL de solución salina estéril, de 3 a 5 alícuotas (60–120 mL en total). Aplicar succión suave tras cada alícuota y recoger el líquido recuperado en un recipiente estéril hermético.
ADVERTENCIA: Es obligatorio el monitoreo continuo hemodinámico y ventilatorio durante el BAL en pacientes de la UCI. Ajustar los parámetros del ventilador según sea necesario en sujetos con ventilación mecánica.
NOTA: La recuperación típica es del 40–60 % del volumen instilado. Una recuperación baja puede requerir reposicionar la punta del broncoscopio.
2. Licuefacción y lisis de patógenos
- Usando la pipeta desechable #2, aspire la muestra hasta la línea marcada (aproximadamente 1 mL) y dispénsela en el tubo de licuefacción. Presione repetidamente el bulbo de la pipeta para transferir todo el material viscoso, luego tape el tubo.
NOTA: Para LBA o esputo acuoso, cargue dos volúmenes de pipeta para asegurar una entrada suficiente de patógenos. - Agite vigorosamente el tubo de licuefacción a mano durante 1 min. Inspeccione visualmente la muestra y continúe agitando hasta que no queden grumos visibles de moco y la muestra fluya libremente a través de la pipeta desechable #1 sin resistencia (una consistencia uniforme, similar al agua). Agite durante al menos 1 min, prolongando el tiempo según sea necesario para muestras altamente viscosas hasta cumplir con estos criterios.
- Abra la tapa sellante del tubo de lisis.
- Aspire aproximadamente 0,5 mL de la muestra homogeneizada utilizando la pipeta desechable #1 y dispense la muestra en el tubo de lisis.
- Cierre la tapa sellante y verifique que la tapa del extremo esté bien apretada.
- Coloque el tubo de lisis en el dispositivo de preprocesamiento de muestras (dispositivo SP), presionando hacia abajo hasta que quede fijo. Presione Inicio.
- Permita que el dispositivo SP complete el ciclo automatizado de licuefacción-lisis (parámetros en Tabla 3) que dura aproximadamente 15 min.
NOTA: No abra ni retire el tubo durante el procesamiento.
3. Carga del chip y detección automatizada
- Carga de reactivos y muestras
- Retire el chip de CD del almacenamiento a 4 °C y equilibre a temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C) durante 10 min.
NOTA: Los viales de reactivos O y B y el lisado previamente procesado se utilizan a temperatura ambiente; la amplificación LAMP en el chip se realiza a 65 °C (véase el paso 3.2.3 y Tabla 3). - Abra la bolsa de aluminio y coloque el chip sobre una superficie plana.
- Gire la tapa en sentido antihorario para abrir el chip.
- Agite ligeramente el vial O para reunir el líquido en la parte inferior del vial.
- Retire la tapa del vial O, inserte la boquilla en el puerto O y vierta todo su contenido en el puerto.
- Deseche el vial O. Repita el procedimiento utilizando el vial B y el puerto B.
- Retire el tubo de lisis procesado del dispositivo SP y quite la tapa del extremo.
- Alinee la punta del tubo con el puerto S y vierta todo el volumen de lisado en el chip.
- Deseche el tubo de lisis usado.
- Gire la tapa del chip en sentido horario hasta que dos clics audibles confirmen un sellado completo.
NOTA: Una carga incompleta de cualquier puerto puede provocar fallos en canales individuales. Confirme la dispensación completa antes de sellar. Para evitar un sellado incompleto y riesgos de contaminación, no use guantes de PE al sellar la tapa; se recomiendan guantes de látex o nitrilo.
- Retire el chip de CD del almacenamiento a 4 °C y equilibre a temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C) durante 10 min.
- Operación del instrumento
- Encienda el analizador automático de ácidos nucleicos. Pulse Detectar, escanee el código de barras en la bolsa de aluminio del chip e introduzca los datos demográficos del paciente y el ID de la muestra.
- Coloque el chip en el eje giratorio y presione hacia abajo hasta que un clic confirme el acoplamiento.
- Pulse Iniciar. El instrumento realiza de forma autónoma la distribución centrífuga de reactivos, la extracción con perlas magnéticas, la amplificación LAMP a 65 °C y la adquisición de fluorescencia. El tiempo de ejecución es de aproximadamente 45 min (la carga de reactivos/muestras y el flujo de trabajo del instrumento se resumen en Figura 3).
NOTA: No abra la tapa durante la ejecución.
- Interpretación de resultados
- El software identifica el punto de inflexión de cada curva de amplificación en forma de S mediante análisis del máximo de la segunda derivada y reporta el valor TP correspondiente (tiempo hasta la positividad).
- Compare cada valor TP con el umbral correspondiente indicado en Tabla 4. Clasifique los canales con valores TP iguales o inferiores al umbral como positivos y los canales con valores TP superiores al umbral como negativos.
- Verifique que el canal del control interno (pozo 16) muestre una curva de amplificación en forma de S con un valor TP inferior a 12 min.
- Rechace la corrida si falla el control interno. Repita la prueba utilizando un chip nuevo o recolecte nuevamente la muestra.
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Resultados
Tras la finalización de un ensayo válido, el instrumento mostró trazas de fluorescencia en tiempo real para todos los 16 canales. Los canales positivos exhibieron la cinética de amplificación en forma de S esperada, con valores de TP anotados automáticamente, mientras que los canales negativos permanecieron en la línea base. El canal IC (pozo 16) produjo una curva en forma de S con un TP < 12 min en todos los ensayos válidos.
Como demostración piloto y de prueba de concepto del protocolo, ...
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Discusión
La identificación rápida de patógenos es fundamental en el manejo de infecciones en la UCI. El sistema descrito aquí reduce el tiempo necesario para la identificación del patógeno, pasando de los 3 a 5 días que normalmente requiere el cultivo, a menos de 1 hora, un período en el que frecuentemente se toman decisiones sobre antimicrobianos de primera línea7. Al integrar la extracción y purificación de ácidos nucleicos, junto con la amplificación LAMP en plex de 16, dentro de un único chip sellado, ...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.
Agradecimientos
Enfermedades Crónicas No Transmisibles - Proyecto Nacional Clave de Ciencia y Tecnología (No. 2023ZD0516500), Financiamiento para Investigación Clínica de Hospitales de Alto Nivel Nacional (2026-PUMCH-A-103) y Programa de Competencia Abierta CMB (24-561) y Programa de Formación de Talentos del Hospital de la Universidad Médica de Pekín (No. UGG11571).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Analizador Automatizado de Ácidos Nucleicos | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | THE-T80-01 | TurboFlow T; realiza distribución centrífuga de reactivos, extracción con perlas magnéticas, LAMP a 65 °C y detección de fluorescencia en tiempo real (tiempo de ejecución de ~45 min) |
| Pipeta Pasteur desechable #1 | Fábrica de Equipos Experimentales Zhongtai (Haimen) | Hecho a medida | Material de consumo desechable; 0,5 mL; transfiere la muestra homogeneizada al tubo de lisis |
| Pipeta Pasteur desechable #2 | Fábrica de Equipos Experimentales Zhongtai (Haimen) | Hecho a medida | Material de consumo desechable; 2 mL; aspira la muestra hasta la línea marcada hacia el tubo de licuefacción |
| Chip de CD | Beijing Hongyang Chensheng Technology Co., Ltd | Hecho a medida | Material de consumo desechable; disco de 86 mm con zona central de carga (puertos O, B, S), zona de purificación con perlas magnéticas y anillo exterior con 16 pocillos de reacción (15 dianas patógenas + control interno NBPF) |
| Reactivos para reacción LAMP | Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd | 16730ES80 | Reactivos para reacción LAMP almacenados previamente en el chip de CD como perlas liofilizadas |
| Tubo de licuefacción | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | Hecho a medida | Material de consumo desechable; 2 mL/tubo; recibe la muestra para homogeneización manual |
| Tubo de lisis | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | Hecho a medida | Material de consumo desechable; 0,5 mL/tubo; cuerpo de silicona compresible con membrana de filtro de 200 µm; reactivos de lisis precargados |
| Primeros | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | Hecho a medida | Mezcla de cebadores integrada en la cámara de reacción del chip de CD |
| Dispositivo de Preprocesamiento de Muestras | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | THE-R10-02 | TS-2000; ciclo automatizado de licuefacción–lisis (~15 min) |
| Vial de dosis única “B” | Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., Ltd | Hecho a medida | Material de consumo desechable; reactivo precargado en el chip; uno por prueba; almacenado a 4 °C y equilibrado a temperatura ambiente (~25 °C) antes de la carga |
| Vial de dosis única “O” | Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., Ltd | Hecho a medida | Material de consumo desechable; reactivo precargado en el chip; uno por prueba; almacenado a 4 °C y equilibrado a temperatura ambiente (~25 °C) antes de la carga |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
