Aislamiento, purificación y caracterización de mitocondrias funcionales derivadas del músculo esquelético de ratón para trasplante mitocondrial

Summary

Se estableció un protocolo estandarizado que combinaba la digestión de tripsina y la centrifugación diferencial para el aislamiento, purificación y caracterización funcional de mitocondrias a partir del músculo esquelético del ratón, así como para evaluar su aplicación en trasplantes mitocondriales.

Abstract

Las mitocondrias son orgánulos esenciales que regulan el metabolismo energético, la transducción de señales y la homeostasis celular en las células eucariotas. La disfunción mitocondrial contribuye a la patogénesis de numerosas enfermedades y ha impulsado el desarrollo del trasplante mitocondrial como estrategia terapéutica regenerativa. La aplicación exitosa del trasplante mitocondrial depende de la disponibilidad de mitocondrias altamente purificadas y funcionalmente intactas. El músculo esquelético es una fuente donante adecuada debido a su alto contenido mitocondrial, actividad metabólica y accesibilidad. Este estudio estableció un protocolo estandarizado y reproducible para el aislamiento, purificación y caracterización de mitocondrias funcionales del músculo esquelético del ratón y evaluó su uso en el trasplante mitocondrial. El procedimiento constaba de dos etapas principales. Primero, se aislaron mitocondrias del músculo esquelético de ratones C57BL/6 mediante digestión de tripsina seguida de centrifugación diferencial. En segundo lugar, se caracterizaron las mitocondrias aisladas para evaluar la pureza, ultraestructura y actividad funcional. La pureza mitocondrial fue evaluada mediante cuantificación de proteínas con ácido bicincônico (BCA) y análisis por Western blot. La integridad ultraestructural fue examinada mediante microscopía electrónica de transmisión. La actividad funcional se evaluó utilizando JC-1 y marcaje fluorescente mitocondrial junto con mediciones del consumo de oxígeno, la capacidad de producción de ATP y la razón de control respiratorio mediante un sistema de respirometría de alta resolución. Las mitocondrias aisladas mostraron potencial de membrana preservado, ultraestructura intacta y actividad respiratoria estable, lo que indica idoneidad para estudios funcionales posteriores y aplicaciones de trasplante mitocondrial.

Introduction

Las mitocondrias son los principales lugares de producción de trifosfato de adenosina (ATP) y desempeñan un papel central en la apoptosis, la homeostasis del calcio y el metabolismo de especies reactivas de oxígeno (ROS). Por tanto, la integridad funcional de las mitocondrias es fundamental para mantener la homeostasis celular y determinar el destino celular ^1,2. La disfunción mitocondrial, incluidas mutaciones en el ADN mitocondrial (ADNmt) y anomalías en la cadena de transporte de electrones (ETC), conduce a un metabolismo energético alterado, estrés oxidativo y apoptosis^{desregulada 3,4}. Estas anomalías están asociadas a una amplia gama de enfermedades, incluyendo trastornos mitocondriales hereditarios, enfermedades neurodegenerativas y enfermedades^{cardiovasculares 5,6}. Las estrategias terapéuticas convencionales para la disfunción mitocondrial, como los antioxidantes y los cofactores metabólicos, generalmente ofrecen una eficacia limitada porque alivian los síntomas sin restaurar directamente la función^{mitocondrial 7,8}. En consecuencia, el trasplante mitocondrial ha surgido como un enfoque terapéutico prometedor en medicina regenerativa. Esta estrategia implica la entrega de mitocondrias exógenas intactas a células dañadas o disfuncionales para restaurar la actividad mitocondrial y el metabolismo energético celular ^9,10. Estudios previos han demostrado que las mitocondrias exógenas pueden ser internalizadas por las células receptoras e incorporadas a la red mitocondrial endógena, lo que resulta en una mejor función bioenergética y una mayor supervivencia^celular 11,12,13.

El músculo esquelético se considera un donante adecuado para el aislamiento mitocondrial debido a su alto contenido mitocondrial, actividad metabólica y^{accesibilidad} 14,15,16. El trasplante mitocondrial requiere varios pasos críticos, incluyendo el aislamiento mitocondrial, la purificación, la caracterización funcional y la administración eficiente en las células receptoras. Sin embargo, persiste una variabilidad metodológica considerable entre los protocolos reportados hasta la fecha, especialmente en procedimientos que implican homogeneización tisular, digestión enzimática, control de temperatura y purificación. Esta variabilidad puede afectar al rendimiento, pureza y integridad funcional mitocondrial, limitando así la reproducibilidad experimental.

Para mejorar la consistencia metodológica y la reproducibilidad, este estudio presenta un protocolo estandarizado para aislar y caracterizar mitocondrias funcionales del músculo esquelético del ratón mediante digestión de tripsina y centrifugación diferencial. Las mitocondrias aisladas fueron evaluadas en cuanto a pureza, integridad ultraestructural y actividad funcional mediante cuantificación de proteínas con ácido bicinconínico (BCA), Western bloting, microscopía electrónica de transmisión, ensayos de potencial de membrana basados en fluorescencia y respirometría de alta resolución. Además, se evaluó la captación de mitocondrias aisladas por las células receptoras para evaluar su idoneidad para aplicaciones de trasplante mitocondrial. Este protocolo proporciona un flujo de trabajo reproducible para obtener mitocondrias funcionales derivadas del músculo esquelético para estudios experimentales posteriores.

Protocol

Todos los experimentos con animales se realizaron en una instalación específica libre de patógenos (SPF) y fueron aprobados por el Comité de Ética y Uso Animal del Tercer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de la Fuerza Aérea (Nº de Aprobación: IACUC-2024kq-065).

Los ratones machos C57BL/6 (6-8 semanas, 18-20 g) fueron adquiridos en el Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad Médica de la Fuerza Aérea (Licencia de producción: SCXK (Shaanxi) 2024-002). Los ratones se alojaron en jaulas ventiladas individualmente (IVC) bajo presión positiva y condiciones limpias, con una temperatura de 20-26 °C, humedad relativa del 40%-70%, un ciclo de 12 horas de luz a oscuridad y al menos 15 cambios de aire por hora. Se proporcionaban dieta esterilizada, agua potable y enriquecimiento ambiental.

Los reactivos, productos químicos e instrumentos experimentales utilizados en el protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Sacrificio animal y recogida de tejidos

1. Colocar al ratón en una cámara hermética de eutanasia y eutanasiar mediante inhalación gradual de dióxido de carbono (CO₂), entre el 30% y el 70% del volumen de la cámara por minuto.
2. Confirmar la muerte por cesación espontánea de la respiración y el latido cardíaco, pérdida de reflejos pupilares y ausencia de respuesta a la estimulación mecánica.
3. Sumerge los ratones C57BL/6 eutanasiados en etanol al 75% durante 5 minutos para desinfectarlos.
   NOTA: Para evitar la fijación tisular inducida por el alcohol y daños celulares, limita el tiempo de inmersión a 10 minutos. Utiliza tejido fresco durante todo el protocolo porque la congelación compromete la viabilidad mitocondrial y la integridad funcional.
4. Coloca al ratón en una placa de Petri estéril dentro de un capuchón de flujo laminar con el abdomen hacia arriba para exponer completamente las regiones abdominal y de las extremidades posteriores.
5. Levanta la piel de la parte baja del abdomen cerca de la zona genital usando pinzas y haz una pequeña incisión. Realiza una disección contundente para separar la piel del tejido subyacente. Extiende la incisión hacia arriba a lo largo de la línea media hasta el tobillo y lateralmente hacia ambas extremidades posteriores para exponer completamente los grupos musculares de la extremidad posterior.
6. Identifica el músculo cuádriceps femoral en la parte anterior del muslo y separa cuidadosamente el músculo en la dirección de las fibras musculares mediante una disección roma. Seccionar el ligamento rotuliano distal y el tendón proximal para aislar completamente el tejido muscular.
   NOTA: Lava el tejido tres veces con solución fisiológica prefría amortiguada con fosfato (PBS) suplementada con penicilina-estreptomicina al 2% utilizando una placa de Petri fresca para cada lavado para minimizar la contaminación.
7. Coloca el tejido muscular aislado inmediatamente en PBS preenfriado y enjuaga bien para eliminar el pelo y la sangre de la superficie del tejido.
8. Seca suavemente el exceso de humedad del tejido usando gasas estériles. Divide el tejido en tubos microcentrífugas de 1,5 mL y pesa las muestras. Utiliza aproximadamente 100 mg de tejido por muestra para mantener la consistencia entre preparaciones.

2. Reducción de tejidos y homogeneización

1. Coloca el tubo de la microcentrífuga que contiene el tejido del Paso 1.8 sobre hielo. Tritura el tejido en pequeños fragmentos de aproximadamente 1-2 mm³ de tamaño usando tijeras estériles.
2. Añade 8 volúmenes de tripsina al 0,25% preenfriada y digiera los fragmentos de tejido sobre hielo durante 15 minutos.
   NOTA: Calcular el volumen de tripsina requerido según la masa tisular (1 mg ≈ 1 μL). Por ejemplo, añadir 640 μL de tripsina al 0,25% a 80 mg de tejido.
3. Centrifuga la mezcla a 1.000 × g durante 5 minutos a 4 °C. Descarta el sobrenadante y conserva la pellet de tejido. Resuspende el pellet en 1 mL de tampón mitocondrial preenfriado que contiene D-manitol (215 mM), sacarosa (75 mM), HEPES (20 mM), EGTA (1 mM) y albúmina sérica bovina libre de ácidos grasos (0,5% p/v).
4. Transfiere la suspensión a un homogeneizador de cristal que se mantiene sobre hielo. Homogeneiza el tejido usando 10-12 suaves movimientos de arriba y abajo hasta que la suspensión se vuelva turbia.
   NOTA: Evite girar el mano de vidrio lateralmente en la parte inferior del homogeneizador porque una fuerza mecánica excesiva puede dañar las membranas mitocondriales y afectar su función.

3. Centrifugación diferencial

1. Transfiere el homogenado a un tubo microcentrífuga de 1,5 mL y centrifuga a 1.000 × g durante 5 minutos a 4 °C.
2. Transfiere el sobrenadante a un tubo microcentrífugo fresco de 1,5 mL y centrifuga a 12.000 × g durante 5 minutos a 4 °C para obtener la pelota mitocondrial en bruto.
   NOTA: Recoger cuidadosamente el sobrenadante con una jeringuilla de 1 mL evitando la perturbación del pellet y los restos residuales de tejido.

4. Purificación y almacenamiento mitocondrial

1. Resuspende suavemente el pellet mitocondrial bruto en un tampón de lavado preenfriado que contenga sacarosa (250 mM), HEPES (10 mM, pH 7,4), EGTA (1 mM) y albúmina sérica bovina (0,15% p/v). Centrifuga la suspensión a 1.000 × g durante 5 minutos a 4 °C.
2. Transfiere el sobrenadante a un tubo centrifugador nuevo y centrifuga a 12.000 × g durante 10 minutos a 4 °C para obtener la pelota mitocondrial purificada.
   NOTA: Utiliza mitocondrias recién aisladas inmediatamente siempre que sea posible. Es factible almacenar a corto plazo a 4 °C o almacenamiento a largo plazo a −80 °C en un tampón mitocondrial que contiene sacarosa (0,25 M), Tris-MOPS (10 mM, pH 7,4) y EGTA (0,1 mM). Sin embargo, la congelación puede afectar la actividad enzimática mitocondrial y la función respiratoria. Utiliza muestras congeladas principalmente para análisis de proteínas.

5. Extracción de proteínas mitocondriales y citosólicas y cuantificación de BCA

1. Extracción de proteínas mitocondriales
   1. Suspende la pellet mitocondrial purificada en 50 μL de buffer de lisis RIPA por cada 100 mg de tejido inicial e incuba la suspensión sobre hielo durante 15 minutos.
   2. Centrifugar el lisado a aproximadamente 14.000 × g durante 15 minutos a 4 °C. Transfiere el sobrenadante a un tubo microcentrífuga fresco de 1,5 mL para obtener la fracción de proteína mitocondrial.
2. Extracción de proteínas citosólicas
   1. Centrifugar el sobrenadante citosólico obtenido en el Paso 4.2 a 12.000 × g durante 15 minutos a 4 °C. Descarta el sobrenadante y conserva el pellet como fracción citosólica enriquecida.
   2. Resuspende el pellet citosólico en 50 μL de tampón de lisis RIPA y procesa la muestra según se describe en los pasos 5.1.1-5.1.2.
      NOTA: Preparar el tampón de lisis con inhibidores de proteasas y realizar todos los procedimientos sobre hielo para minimizar la degradación de proteínas. Las mitocondrias utilizadas en este paso pueden ser frescas o congeladas.
3. Cuantificación de proteínas BCA
   1. Prepara la solución de trabajo BCA mezclando el reactivo A y el reactivo B en una proporción de 50:1 (v/v). Añade 200 μL de solución de trabajo a cada pozo de una placa de 96 pozos.
      NOTA: Prepara la solución de trabajo BCA inmediatamente antes de usarla y úsala en menos de 1 hora a temperatura ambiente.
   2. Diluye la solución de albúmina sérica bovina (BSA) (2 mg/mL) a 0,5 mg/mL y mantén la solución en hielo hasta su uso.
   3. Prepara la curva estándar añadiendo 20, 19, 18, 16, 12, 8, 4 o 0 μL de solución BSA a pozos separados. Ajusta el volumen final a 20 μL usando solución de NaCl.
   4. Añade 4 μL de proteína mitocondrial y 16 μL de solución de NaCl a un conjunto de pozos. Añadir 4 μL de proteína citosólica y 16 μL de solución de NaCl a otro conjunto de pozos.
   5. Añade 200 μL de solución de trabajo BCA a cada pozo e incuba la placa a 37 °C en la oscuridad durante 30 minutos. Mide la absorbancia a 562 nm usando un lector de microplacas.
   6. Construye una curva estándar de proteínas con un coeficiente de correlación (R²) ≥ 0,999. Calcula las concentraciones de proteínas (μg/μL) interpolando los valores de absorbancia de la curva estándar.

6. Evaluación de la pureza de mitocondrias derivadas del músculo esquelético

1. Diluir muestras de proteínas mitocondriales y citosólicas hasta una concentración final de 1,5 μg/μL. Preparar mezclas de reacción de 20 μL que contengan 30 μg de proteína y 4 × tampón de carga. Ajusta el volumen restante con solución de NaCl. Hervir las muestras durante 10 minutos y guárdalas a −80 °C hasta su uso.
2. Separar muestras de proteínas usando geles prefabricados con gradiente del 4%-20%. Realiza electroforesis a 140-150 V durante 50 minutos.
3. Activa la membrana PVDF (0,22 μm) en metanol durante 1 minuto. Transfiere proteínas usando el tampón de transferencia rápida a 400 mA durante 30 minutos.
4. Quita la membrana PVDF del sándwich de transferencia y lávala en TBST durante 5 minutos. Bloquea la membrana con leche desnatada al 5% a temperatura ambiente durante 1 hora con agitaciones suaves.
5. Diluir anticuerpos primarios (COX IV, citocromo c, β-actina) 1:1.000 en buffer de dilución de anticuerpos. Incubar la membrana con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C.
6. Lava la membrana tres veces con TBST durante 10 minutos por lavado.
7. Incubar la membrana con anticuerpo secundario diluido 1:10.000 a temperatura ambiente durante 1 hora.
8. Lava la membrana tres veces con TBST durante 10 minutos cada una. Revela la mancha y captura las imágenes.

7. Tinción MitoTracker de mitocondrias derivadas del músculo esquelético

1. Diluye la solución de trabajo de tinción a una concentración final de 200 nM en un medio precalentado justo antes de su uso.
2. Resuspende el pellet mitocondrial en 100 μL de la solución de trabajo e incuba a 37 °C en la oscuridad durante 20 minutos.
3. Añade cinco volúmenes de buffer de almacenamiento preenfriado tras la incubación. Centrifugar la suspensión a 12.000 × g durante 10 minutos a 4 °C y descartar el sobrenadante que contiene el tinte no ligado.
4. Transfiere una alitería de la suspensión mitocondrial teñida a una lámina de vidrio y cubre la muestra con una capa de cobertura.
5. Capturar imágenes de fluorescencia utilizando un microscopio confocal de barrido láser con los ajustes adecuados de excitación y emisión para la detección de colorantes mitocondriales fluorescentes rojos.

8. Evaluación del potencial de membrana mitocondrial mediante tinción con JC-1

1. Grupo de tratamiento CCCP (cianuro de carbonilo m-clorofenilhidrazona)
   1. Tratar la suspensión mitocondrial con CCCP a una concentración final de 10 μM e incubar durante 20 minutos para disipar el potencial de la membrana mitocondrial.
   2. Incubar la suspensión mitocondrial tratada con CCCP con 250 μL de solución de tinción de JC-1 a 37 °C durante 20 minutos con agitación suave.
2. Grupo de tratamiento JC-1
   1. Resuspende el pellet mitocondrial en 100 μL de solución de trabajo JC-1 e incuba a 37 °C durante 20 minutos protegido de la luz.
   2. Prepara el tampón de tinción 1× JC-1 diluyendo la solución de 5× con agua destilada en una proporción de 2:8 (v/v) y mantén el tampón sobre hielo.
   3. Retira la solución de tinción y lava el pellet mitocondrial dos veces con un tampón de tinción JC-1 previamente enfriado 1×.
   4. Resuspende las mitocondrias teñidas en PBS e imagínalas usando un microscopio confocal de escaneo láser. Utilice los ajustes adecuados de excitación y emisión para la detección de monómeros fluorescentes verdes JC-1 y agregados fluorescentes rojos de JC-1.

9. Análisis ultraestructural de mitocondrias aisladas del músculo esquelético mediante microscopía electrónica de transmisión

1. Fijar mitocondrias recién aisladas en glutaraldehído al 2,5% preparado en tampón fosfato de 0,2 M (pH 7,4) e incubar las muestras durante la noche a 4 °C.
2. Lava las muestras con solución salina tamponada fosfato (PBS, pH 7,4) de 0,1 M y fija las muestras con tetróxido de osmio al 1% durante 1 hora a temperatura ambiente.
3. Deshidrata las muestras mediante una serie de etanol graduada seguida de infiltración, incrustación y polimerización en resina epoxi.
4. Seccionar las muestras incrustadas a un espesor de 50-70 nm usando un ultramicrotomo.
5. Tinte dos veces las secciones con acetato de uranilo y citrato de plomo. Observa e imagina las muestras usando un microscopio electrónico de transmisión.

10. Captación celular de mitocondrias derivadas del músculo esquelético

1. Clon 929 de la NCTC de la Cultura (L929; RRID: CVCL_0462) de células obtenidas de un proveedor comercial en un medio completo que contiene MEM Alfa suplementado con suero fetal bovino al 10% y 1% penicilina-estreptomicina.
2. Cuando las células alcancen una confluencia del 80%-90%, aspira el medio y lava las células dos veces con PBS precalentado. Añade tripsina-EDTA e incuba hasta que las células se desprendan.
3. Añade medio completo para terminar la digestión y genera una suspensión de célula única mediante pipeteo suave. Centrifuga la suspensión a 1.000 × g durante 5 minutos y descarta el sobrenadante.
4. Resuspende el pellet celular en un medio fresco y completo y siembra las células en nuevos recipientes de cultivo a una densidad adecuada. Incubar las células a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenga un 5% de CO₂.
5. Pasar 5 células de semilla (P5) en recipientes de fondo de cristal de 35 mm y cultivar las células durante la noche.
6. Etiqueta mitocondrias aisladas con un colorante fluorescente rojo específico para mitocondrias a 37 °C en la oscuridad durante 20 minutos y lava las mitocondrias con PBS para eliminar el colorante no unido.
7. Añadir mitocondrias marcadas con colorantes fluorescentes rojos (20 μg de proteína mitocondrial por plato) a las células e incubar durante 24 horas a 37 °C en una atmósfera humidificada que contiene un 5% de CO₂.
8. Tiñe las células con una sonda fluorescente de actina durante 30 minutos para visualizar el citoesqueleto de actina y contra-tinción de los núcleos con un colorante nuclear fluorescente.
   NOTA: Controla cuidadosamente la concentración sérica durante la coincubación porque un exceso de suero puede reducir la eficiencia de la captación mitocondrial. Las mitocondrias utilizadas en este paso son recientes.

11. Medición de la función respiratoria mitocondrial mediante respirometría de alta resolución

1. Preparación de instrumentos
   1. Limpia las cámaras respiratorias, los compartimentos de electrodos y los tapones.
   2. Coloca una barra magnética de agitación en cada cámara y verifica la integridad de la membrana del electrodo de oxígeno.
2. Calibración de instrumentos
   1. Añade 2,1 mL de buffer de respiración mitocondrial (MiR05, pH 7,10) en cada cámara respiratoria y asegúrate de que no haya burbujas de aire.
   2. Equilibrar el sistema de respirometría de alta resolución a 37 °C durante 30 minutos y realizar la calibración diaria del aire tras estabilizar la línea base de oxígeno.
      NOTA: Evita introducir burbujas de aire en la cámara respiratoria, ya que interfieren con las señales del electrodo de osígeno y comprometen la calidad de los datos. Las mitocondrias utilizadas en este paso son recientes.
3. Carga y equilibrio de muestras
   1. Añade mitocondrias recién aisladas que contengan aproximadamente 30 μg de proteína en la cámara respiratoria y sella la cámara.
   2. Equilibra la cámara durante 5-8 minutos y registra el consumo basal de oxígeno.
      NOTA: Mantener las mitocondrias sobre hielo y realizar mediciones de respiración inmediatamente después del aislamiento para preservar la actividad.
4. Protocolo SUIT
   1. Añadir 5 μL de piruvato (2 M), 10 μL de glutamato (2 M) y 10 μL de malato (400 mM) de forma secuencial. Estabiliza la reacción durante 5 minutos y registra la respiración de la fuga de coches de coclear.
   2. Añadir 10 μL de ADP (500 mM) para inducir la fosforilación oxidativa y registrar la respiración de CI OXPHOS. Añade 10 μL de cloruro de magnesio (0,3 M).
   3. Añadir 20 μL de succinato (1 M) y registrar la respiración CI+CII OXPHOS tras la estabilización.
   4. Añade 2 μL de inhibidor de ATP sintasa (0,01 mM) y registra la respiración por fuga de protones.
   5. Añadir CCCP (1 mM) de forma incremental en tres adiciones de 2 μL cada 2 minutos hasta que el consumo de oxígeno alcance un estancamiento. Registrar la máxima capacidad del sistema de transferencia de electrones.
   6. Añade 1 μL de rotenona (1 mM) para inhibir la actividad del I complejo.
   7. Añadir 1 μL de antimicina A (5 mM) para inhibir la actividad del complejo III y registrar el consumo residual de oxígeno.
   8. Añadir 5 μL de ascorbato (800 mM) y 5 μL N,N,N',N'-tetrametil-p-fenilendiamina (200 mM). Registrar la máxima actividad respiratoria intravenosa compleja tras la estabilización.
      NOTA: Alicuota todos los reactivos antes de congelar para evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación. Añade CCCP gradualmente, ya que el desacoplamiento excesivo inhibe la respiración mitocondrial.
5. Análisis de datos
   1. Obtener parámetros de respiración mitocondrial, incluyendo Fuga CI, CI OXPHOS, CI+CII OXPHOS, Fuga CI+CII, CI+CII ET, CII ET y CIV, utilizando el software de análisis de datos.
   2. Calcular la razón de control respiratorio (RCR; Estado 3 respiración/Estado 4 respiración) y capacidad de producción de ATP. Mantener todos los valores a tres cifras significativas para el análisis estadístico. El software utilizado para el análisis de datos fue Oroboros Datlab 8 (Oroboros Instruments).

Results

Una visión esquemática del flujo de trabajo de aislamiento y purificación mitocondrial se muestra en la Figura 1. Todos los procedimientos se realizaron a 4 °C para preservar la integridad mitocondrial y la actividad funcional. El tejido muscular esquelético recién aislado fue picado y digerido con tripsina para facilitar la disociación tisular, y luego homogeneizado en un tampón de aislamiento isotónico usando un homogeneizador de vidrio. Posteriormente se realizó centrifugación diferencial para separar las mitocondrias de los residuos tisulares y los contaminantes citosólicos. La centrifugación inicial a 1.000 × g eliminó núcleos y grandes restos, mientras que la centrifugación posterior a 12.000 × g produjo un pellet mitocondrial tosco. Pasos adicionales de lavado y centrifugación redujeron aún más la contaminación citosólica, dando lugar a mitocondrias purificadas adecuadas para análisis estructurales y funcionales posteriores (Figura 1).

Figura 1: Diagrama esquemático del aislamiento y purificación mitocondrial. Las mitocondrias de alta pureza se aislaron mediante un enfoque combinado de digestión controlada de tripsina y centrifugación diferencial. Todos los procedimientos se realizaron a 4 °C para preservar la integridad estructural y funcional mitocondrial. El tejido muscular esquelético recién aislado fue sometido a digestión enzimática, homogeneización y pasos secuenciales de centrifugación para obtener mitocondrias purificadas adecuadas para análisis funcionales y estructurales posteriores. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

La actividad funcional de las mitocondrias aisladas se evaluó mediante tinción con JC-1 y marcaje mitocondrial fluorescente (Figura 2). La tinción con JC-1 demostró una fuerte fluorescencia roja en mitocondrias recién aisladas bajo condiciones basales, lo que indica la preservación del potencial de la membrana mitocondrial. Tras el tratamiento con cianuro de carbonilo m-clorofenilhidrazona (CCCP), la fluorescencia roja disminuyó y la fluorescencia verde aumentó, lo que es compatible con la despolarización de la membrana mitocondrial. Estos hallazgos confirmaron que las mitocondrias aisladas conservaron la capacidad de respuesta potencial de la membrana y permanecieron funcionalmente activas tras el aislamiento. El marcaje fluorescente demostró además que las mitocondrias aparecían como estructuras puntuales discretas y uniformemente distribuidas en todo el campo, sin agregación evidente ni precipitación de colorantes. La baja fluorescencia de fondo y el patrón uniforme de tinción sugerían la preservación de la integridad mitocondrial y el potencial de membrana tras el aislamiento.

Figura 2: Caracterización de la actividad funcional de mitocondrias aisladas. (A) Evaluación del potencial de membrana mitocondrial mediante tinción con JC-1. Las mitocondrias purificadas se teñieron con JC-1 y se observaron bajo microscopía de fluorescencia. Se observaron agregados fluorescentes rojos distintos en el grupo de control de las mitocondrias, lo que indica un potencial de membrana mitocondrial preservado. Tras el tratamiento con el desacoplador CCCP, la fluorescencia se desplazó predominantemente hacia monómeros verdes de JC-1, lo que indica despolarización de membrana y colapso del potencial de membrana (barra de escala = 50 μm). (B) Marcado mitocondrial fluorescente de mitocondrias purificadas. Las mitocondrias marcadas con fluorescencia aparecían como estructuras dispersas y puntuadas, sin agregación evidente y con fluorescencia de fondo mínima, lo que indica integridad mitocondrial preservada y un potencial membranario estable (barra de escala = 100 μm). (C) Análisis cuantitativo de las relaciones de intensidad de fluorescencia de JC-1 en diferentes grupos tras la tinción con JC-1. Los datos se presentan como media ± SEM (n = 3). La significación estadística se analizó utilizando una prueba t no emparejada (****P < 0,0001). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

La integridad ultraestructural de las mitocondrias aisladas se examinó mediante microscopía electrónica de transmisión (Figura 3). La imagen de bajo aumento reveló mitocondrias purificadas con morfología predominantemente ovalada, mientras que la imagen de alta magnificación mostró membranas externas intactas y estructuras de cristas claramente definidas. No se observó hinchazón, rotura ni alteración estructural evidente. Para la evaluación cuantitativa, se analizaron cinco campos seleccionados aleatoriamente que contenían aproximadamente entre 40 y 60 mitocondrias por campo. Estas observaciones demostraron que el procedimiento de aislamiento preservó eficazmente la ultraestructura mitocondrial y generó mitocondrias adecuadas para estudios funcionales posteriores.

Figura 3: Integridad ultraestructural de mitocondrias musculares esqueléticas aisladas evaluada mediante microscopía electrónica de transmisión. (Izquierda) Imagen representativa de TEM a baja magnificación (4.000×; barra de escala = 2 μm) que muestra mitocondrias purificadas con morfología predominantemente ovalada. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

(Derecha) Imagen TEM de alta magnificación (40.000×; barra a escala = 200 nm) que muestra membranas mitocondriales externas suaves y continuas y estructuras de cristas claramente definidas. Las flechas amarillas indican membranas mitocondriales externas intactas, mientras que las flechas blancas indican cristas mitocondriales bien organizadas. No se observaron indicios de inflamación, rotura o alteración estructural. Se analizaron cinco campos seleccionados al azar que contenían aproximadamente entre 40 y 60 mitocondrias por campo. Estos hallazgos demuestran que el protocolo de aislamiento preservó la integridad ultraestructural mitocondrial y proporcionó una base estructural fiable para los ensayos funcionales posteriores.

El rendimiento y la pureza mitocondrial fueron evaluados posteriormente mediante cuantificación de proteínas y análisis de inmunoblot (Figura 4). La comparación entre los métodos de digestión de tripsina (TD) y de extracción normal (NE) mostró que el método TD arrojó aproximadamente 2,3-2,4 μg de proteína mitocondrial por mg de tejido, mientras que el método NE proporcionó aproximadamente 1,7-1,8 μg/mg de tejido. El análisis inmunoblot demostró un fuerte enriquecimiento de marcadores mitocondriales, citocromo c oxidasa y COX IV, en fracciones mitocondriales, con una detección mínima en fracciones citosólicas. En cambio, el marcador citosólico β-actina solo mostró señales débiles en fracciones mitocondriales, lo que indica una contaminación citosólica limitada. La comparación entre los grupos TD y NE sugirió que la digestión de tripsina mejoró el rendimiento y la pureza mitocondrial. En conjunto, estos hallazgos demostraron que el protocolo generaba mitocondrias adecuadas para análisis moleculares y funcionales posteriores.

Figura 4: Comparación de rendimiento y pureza de mitocondrias purificadas. (A) Comparación del rendimiento de proteínas mitocondriales por unidad de masa tisular obtenida mediante los métodos de digestión de tripsina (TD) y extracción normal (NE). El grupo TD produjo aproximadamente 2,3-2,4 μg/mg de tejido, mientras que el grupo NE produjo aproximadamente 1,7-1,8 μg/mg de tejido. Los datos se presentan como media ± SEM (n = 3). La significación estadística se analizó utilizando una prueba t no emparejada (*P < 0,05). (B) Análisis inmunoblot de proteínas marcadoras mitocondriales y citosólicas en fracciones mitocondriales aisladas mediante los métodos TD y NE. (C-D) Análisis cuantitativo de las proteínas marcadoras mitocondriales, citocromo c oxidasa y COX IV. Los marcadores mitocondriales estaban fuertemente enriquecidos en fracciones mitocondriales, pero mostraron una expresión mínima en fracciones citosólicas. El marcador citosólico β-actina mostró solo una expresión débil en fracciones mitocondriales, lo que indica una eliminación eficiente de contaminantes citosólicos. En comparación con el grupo NE, el grupo TD mostró una mayor pureza mitocondrial. Los datos se presentan como media ± SEM (n = 3). La significación estadística se analizó utilizando una prueba t no apareada (*P < 0,05; **P < 0,01). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Para evaluar más a fondo la función respiratoria mitocondrial, se midió el consumo de oxígeno mediante respirometría de alta resolución (Figura 5). Las mitocondrias aisladas mediante el método TD presentaron valores de la razón de control respiratorio (RCR) de aproximadamente 9-10, mientras que las mitocondrias aisladas con el método NE mostraron valores de RCR de aproximadamente 8-9. Dado que los valores de RCR superiores a 4 generalmente se consideran indicativos de actividad respiratoria mitocondrial preservada, estos resultados demostraron que las mitocondrias aisladas mediante ambos métodos mantuvieron integridad funcional. Los valores más altos de RCR observados en el grupo de TD sugirieron una mejor preservación de la función respiratoria mitocondrial que en el grupo NE. La eficiencia del acoplamiento bioquímico también se evaluó usando la ecuación 1 − (tasa de respiración por fuga/tasa de transferencia electrónica), con valores cercanos a 1 que indican un acoplamiento respiratorio más estrecho y una producción de ATP más eficiente. Ambos grupos mostraron eficiencias de acoplamiento cercanas a 1, lo que indica que la función bioenergética mitocondrial se mantuvo tras el aislamiento.

Figura 5: Ensayo de la función respiratoria en mitocondrias purificadas. (A) Comparación de la razón de control respiratorio mitocondrial (RCR) entre los grupos de digestión con tripsina (TD) y de extracción normal (NE). Los valores de RCR en ambos grupos fueron superiores a 4, lo que indica la preservación de la actividad respiratoria mitocondrial tras el aislamiento. El grupo TD mostró valores de RCR ligeramente más altos que el grupo NE, lo que sugiere una mejor preservación de la función respiratoria. Los datos se presentan como media ± SEM (n = 3). La significación estadística se analizó utilizando una prueba t no emparejada (**P < 0,01). (B) Comparación de la eficiencia de acoplamiento bioquímico mitocondrial y la capacidad de síntesis de ATP entre los grupos TD y NE. Los valores de eficiencia de acoplamiento se aproximaron a 1 en ambos grupos, lo que indica una respiración altamente acoplada y una producción eficiente de ATP. Los datos se presentan como media ± SEM (n = 3). La significación estadística se analizó utilizando una prueba t no emparejada (*P < 0,05). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

La captación de mitocondrias aisladas por las células receptoras se evaluó utilizando células L929 (Figura 6). Las células fueron coincubadas con mitocondrias derivadas del músculo esquelético marcado con colorante rojo, y el citoesqueleto de actina se visualizó mediante una sonda fluorescente de actina. La microscopía confocal reveló estructuras fluorescentes rojas punteadas distribuidas por todo el citoplasma, lo que indica que las células L929 habían absorbido mitocondrias exógenas. El análisis cuantitativo demostró un aumento dependiente del tiempo en la absorción mitocondrial a las 12, 24 y 48 horas. Sin embargo, solo se observó un aumento modesto entre 24 h y 48 h, lo que sugiere que la eficiencia de captación se acercó a la saturación tras 24 h. Además, las células L929 receptoras mostraron un aumento del potencial de membrana mitocondrial tras la absorción mitocondrial, lo que indica una mejor función mitocondrial. Estos hallazgos demostraron que las mitocondrias derivadas del músculo esquelético aisladas mediante este protocolo podían ser internalizadas eficazmente por las células receptoras manteniendo la actividad funcional.

Figura 6: Captación celular de mitocondrias derivadas del músculo esquelético por células L929. (A) Captación de mitocondrias purificadas por células L929 en diferentes tiempos de incubación (12 h, 24 h y 48 h). Se detectaron mitocondrias marcadas con colorantes fluorescentes (rojo) en el citoplasma de las células receptoras, mientras que se utilizó tinción con faloidina (verde) para visualizar el citoesqueleto de actina. La tinción nuclear se realizó usando DAPI (azul). La microscopía confocal confirmó la internalización de mitocondrias exógenas por células L929 (barra de escala = 50 μm). (B) Análisis cuantitativo de la eficiencia de captación mitocondrial por células L929 en diferentes momentos temporales. (C) Análisis de coloración de JC-1 del potencial de membrana mitocondrial en células L929 tras la captación de mitocondrias derivadas del músculo esquelético. (D) Análisis cuantitativo de las relaciones de fluorescencia agregado a monómeros de JC-1 en células receptoras de L929 tras la absorción mitocondrial. El potencial de la membrana mitocondrial aumentó significativamente tras la internalización de mitocondrias activas derivadas del músculo esquelético. Los datos se presentan como media ± SEM (n = 3). La significación estadística se analizó utilizando ANOVA unidireccional (*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Discussion

El trasplante mitocondrial es una estrategia emergente en la terapia celular y la medicina regenerativa que restaura la función fisiológica en células con metabolismo energético deteriorado mediante la entrega de mitocondrias funcionalmente intactas. Además de regular el metabolismo energético celular, esta técnica puede modular procesos biológicos clave como la apoptosis y el estrés oxidativo, proporcionando así nuevas oportunidades terapéuticas para una variedad de enfermedades ^4,17,18,19. Sin embargo, la traducción clínica del trasplante mitocondrial sigue enfrentándose a varios desafíos, entre ellos la falta de protocolos de aislamiento mitocondrial estandarizados, eficientes y reproducibles, que sigue siendo un importante cuello de botella.

Para abordar este problema, el presente estudio estableció un protocolo experimental estandarizado y visualizado basado en la centrifugación diferencial para el aislamiento eficiente de mitocondrias libres funcionales del músculo esquelético de ratones C57BL/6. Al optimizar el procedimiento de purificación e incorporar los pasos de predigestión, lavado y purificación de tripsina, este método mejora eficazmente la disociación tisular, preserva la integridad estructural mitocondrial y reduce la contaminación por componentes celulares no objetivo.

El protocolo propuesto logra un equilibrio favorable entre la pureza mitocondrial y el rendimiento. En comparación con los métodos convencionales de extracción basados en molienda, el método actual es más rápido, práctico y rentable, lo que lo hace adecuado para aplicaciones rutinarias en laboratorio y preparación mitocondrial donante. Los enfoques de aislamiento mitocondrial existentes presentan ciertas limitaciones. Por ejemplo, la centrifugación por gradiente de densidad y la purificación por inmunoafinidad pueden alcanzar una mayor pureza pero son costosas y tardadas, mientras que los enfoques basados en sondas a nanoescala siguen siendo insuficientes para su uso^{rutinario 20,21}. Para tejidos densos como el músculo esquelético, el paso optimizado de pre-digestión de tripsina (0,25% de tripsina a 37 °C durante 10-15 minutos), combinado con una homogeneización suave, preserva mejor la integridad mitocondrial que la centrifugación diferencial convencional por sí sola.

En este estudio, se utilizó un kit de centrifugación diferencial disponible comercialmente bajo condiciones de baja temperatura durante todo el procedimiento y siguiendo un flujo de trabajo estandarizado, lo que permitió la adquisición rápida de mitocondrias estructuralmente intactas. Para abordar posibles problemas encontrados durante el proceso de extracción, incluyendo bajo rendimiento, contaminación proteica y potencial anormal de membrana, se proponen varias estrategias de solución de problemas.

El bajo rendimiento mitocondrial suele ser causado por una homogeneización insuficiente, una cantidad insuficiente de tejido o pérdida centrífuga. Estos problemas pueden minimizarse asegurando una predigestión adecuada, realizando una homogeneización suave (10-15 pasadas con un homogeneizador ajustado), utilizando al menos 100-150 mg de tejido muscular esquelético fresco, controlando estrictamente las condiciones de centrifugación (1.000 × g para la eliminación de restos y 10.000-12.000 × g para pelleteo mitocondrial), y resuspendiendo muestras con puntas de pipeta de gran calibre. La contaminación por proteínas se debe principalmente a la eliminación incompleta de residuos o a interferencias lipídicas; Por lo tanto, se recomienda repetir el paso de centrifugación de 1.000 × g, incorporar dos pasos adicionales de lavado de 12.000 × g y retirar cuidadosamente el tejido adiposo. El potencial anormal de la membrana mitocondrial suele estar asociado a daños mecánicos o fluctuaciones de temperatura. Por tanto, debe evitarse una homogeneización excesiva, realizar todo el procedimiento sobre hielo y completarse en 60-90 minutos, y los tampones de aislamiento deben complementarse con EGTA y 0,5% de BSA. La homogeneización incompleta puede mejorarse asegurando una digestión enzimática adecuada, seleccionando un homogeneizador adecuado y realizando filtraciones posteriores a la homogeneización.

Aunque el protocolo actual mejora significativamente la eficiencia y pureza del aislamiento mitocondrial, persisten varias limitaciones. En primer lugar, el procedimiento depende mucho de la frescura del tejido; Idealmente, las muestras de tejido deben procesarse en un plazo de 1 hora tras la autopsia. En segundo lugar, la tripsina residual puede degradar proteínas superficiales mitocondriales, incluidas las relacionadas con la translocasa, si no se elimina adecuadamente durante el lavado, lo que podría afectar la eficiencia de captación celular posterior. Tercero, el tiempo de almacenamiento mitocondrial sigue siendo limitado, ya que el almacenamiento prolongado a 4 °C o la criopreservación reducen sustancialmente la actividad mitocondrial.

A nivel traslacional, persisten desafíos adicionales, como la mejora de la eficiencia de la entrega in vivo , la comprensión de los mecanismos a largo plazo de integración mitocondrial y la clarificación de posibles interacciones entre las mitocondrias trasplantadas y el genoma del huésped. Con los continuos avances en tecnologías de aislamiento y purificación mitocondrial, se espera que nuevas innovaciones metodológicas aceleren la traducción clínica de la terapia de trasplante mitocondrial.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Cytochrome C antibody	Abcam	EPR1327	Caracterización mitocondrial
Anti-fade mounting medium	PlantChemMed	PC-90016	Reducir la fotoblanqueamiento de los tintes fluorescentes
BCA Protein Assay Kit	Zhonghui Hecai Biotechnology Co., Ltd.	PQ003	Ensayo de concentración de proteínas
Beta-actin antibody	Cell Signaling technology	3700s	El anticuerpo de beta-actina se utilizó para detectar la pureza de las mitocondrias aisladas
BSA	Sigma	A6003	Durante el aislamiento, se une a los ácidos grasos libres para proteger la actividad mitocondrial.
Centrifuge	Eppendorf	5418R	Centrifugación a 4 °C
CCCP	Solarbio	C6700	para desacoplar la fosforilación oxidativa mitocondrial e inducir la máxima fuga de protones
Confocal Laser Scanning Microscope	Olympus Corporation	FV4000	Observación de tinción por inmunofluorescencia
COX IV polyclonal antibody	Proteintech	11242-1-AP	Caracterización mitocondrial
DAPI	Plant Chem Medicine	PC-90004	Para la contra tinción nuclear
D-mannitol	Solarbio	IM00402	mantener el equilibrio osmótico y prevenir la hinchazón mitocondrial durante el aislamiento
EGTA	Sigma	E4378	Comúnmente se usa en tampones de aislamiento mitocondrial para proteger la función mitocondrial al unirse específicamente a Ca2+
Fetal bovine serum	Every Green	11011-08611	Cultivo de células L929
Forceps	RWD Life Science Co., Ltd.	F11003-11	Se utiliza para agarrar, sostener y levantar tejidos
Glass homogenizer	Beyotime	FGH005	Se utiliza para la homogeneización de tejidos y el aislamiento de mitocondrias
Glutaraldehyde	LEAGENE	DF0151	Fija y estabiliza rápidamente la ultraestructura celular mediante la unión de proteínas por reticulación, evitando la autolisis para preservar la morfología natural de los orgánulos.
HEPES	Thermo Fisher	J67485	Proporciona un entorno de pH estable.
Incubator	Thermo Fisher	51032874	Cultivo de células L929
JC-1	Solarbio	M8650	Detectando cambios en el potencial de membrana de mitocondrias purificadas.
L929 cell line	Procell	CL-0137	Para el ensayo de endocitosis mitocondrial
Lead citrate	Sigma	15326	para teñir secciones ultrafinas para la observación de la estructura subcelular fina.
MEM Alpha basic (1x)	Gibco	6125510	Cultivo de células L929
Methanol	Fuyu Chemical (China)	67-56-1	Como componente del tampón de transferencia, se utiliza para eliminar SDS y facilitar la transferencia de proteínas del gel a la membrana de fase sólida.
Microplate Reader	Thermo Fisher	Varioskan LUX	Medir la absorbancia de las mitocondrias teñidas con JC-1
Mitochondrial Membrane Potential Detection Kit	Solarbio	M8650	Detección del potencial de membrana mitocondrial en músculo esquelético
Mitochondrial isolation Buffer	Solarbio	SM0020	Kits para la extracción basada en centrifugación diferencial
Mitochondria Storage Buffer	Solarbio	SM0020	Para la preservación de mitocondrias
Mito Tracker  Red CMXRos	Yeasen Biotechnology	40741ES50	Caracterización mitocondrial
MOPS	MedChemExpress	HY-D0859	Como tampón en la preparación de soluciones
Multi-rAb HRP-Goat Anti-Mouse Recombinant Secondary Antibody (H+L)	Proteintech	RGAM001	RGAM001 se dirige a IgG de ratón (H+L) en Western blot
Multi-rAb HRP-Goat Anti-Rabbit Recombinant Secondary Antibody (H+L)	Proteintech	RGAR001	RGAR001 se dirige a IgG de conejo (H+L) en ELISA y Western blot
Non-fat dry milk	NCM Biotech	WB6503	Se utiliza principalmente como agente de bloqueo para reducir la señal de fondo al ocupar los sitios de unión no específicos en la membrana.
O2k-FluoRespirometer	Oroboros Instruments	O2K	Determinar la función respiratoria mitocondrial y el metabolismo de oxígeno.
Osmium tetroxide	Sigma	75633	o postfijación para preservar los lípidos y mejorar el contraste de membrana en muestras TEM.
PBS (1x)	Plant Chem Medicine	PC-00003	Limpieza de tejido muscular
Penicillin-Streptomycin	Procell	PB180120	Cultivo de células L929
Phalloidin-488	Beyotime	C1035	Etiquetar F-actina citoesquelética para imágenes microscópicas de fluorescencia
Polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane	Millipore (Merck)	IPVH00010	Western blotting
PowerPac Basic	BIO-RAD	164-5050	Para la separación de proteínas por electroforesis SDS-PAGE
Precast gradient polyacrylamide gel (4–12%)	ACE Bioscience	ET12412LGel	Utilizado para la separación SDS-PAGE de proteínas mitocondriales y celulares totales
Protease inhibitor	Shaanxi Zhonghui Hecai Biomedical Technology	PL032	Inhibe la actividad de proteasas endógenas y exógenas, previniendo la degradación de proteínas diana durante el procesamiento de muestras.
RIPA lysis buffer	Zhonghui Hecai Biotechnology Co., Ltd.	PL001-2A	Utilizado para la extracción total de proteínas de tejidos animales y celulares
Sodium Chloride Injection (0.9%)	Xi’an Jingshuang Shuanghe Pharmaceutical Co., Ltd.	Número de aprobación H61020014	Amortiguamiento, enjuague y mantenimiento de la presión osmótica de células/tejidos experimentales
Sterile gloves	Jiangsu Yangzi Lide Medical Devices Co., Ltd.	YMZ000-1	Aislar la contaminación y proteger a los operadores y muestras experimentales
Sucrose	Sucrose	S818048	Proporciona soporte osmótico y mantiene la morfología y la integridad funcional mitocondrial.
TBST	NCM Biotech	WB20500	Lavado para reducir el fondo, sirve como diluyente para anticuerpos y soluciones de bloqueo, al tiempo que protege la estabilidad de la unión antígeno-anticuerpo al mantener un pH y un entorno iónico estables