Este estudio investigó la interacción entre FGD5-AS1 y miR-93-5p en modelos experimentales de hemorragia intracerebral y encontró que el knockdown de FGD5-AS1 se asoció con una reducción de lesiones neurológicas, inflamación y estrés oxidativo.
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Artículo de investigación
* These authors contributed equally
Este estudio investigó la interacción entre FGD5-AS1 y miR-93-5p en modelos experimentales de hemorragia intracerebral y encontró que el knockdown de FGD5-AS1 se asoció con una reducción de lesiones neurológicas, inflamación y estrés oxidativo.
La hemorragia intracerebral (CHI) es un trastorno neurológico asociado a altas tasas de mortalidad y discapacidad, que puede provocar lesiones neurológicas graves. Este estudio investigó el papel y el mecanismo subyacente de FGD5-AS1 en la ICH. Se establecieron modelos in vitro e in vivo de ICH. Se utilizó la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa por transcripción inversa (RT-qPCR) para medir la expresión de FGD5-AS1 y miR-93-5p. Los déficits neurológicos se evaluaron utilizando la Puntuación de Severidad Neurológica modificada (mNSS), y el edema cerebral se evaluó mediante el método del peso seco-húmedo. Se utilizó el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para medir citocinas inflamatorias y marcadores de estrés oxidativo. La viabilidad celular se evaluó utilizando un kit de ensayo de viabilidad y proliferación celular. La interacción entre FGD5-AS1 y miR-93-5p se examinó mediante ensayos de reporteros de doble luciferasa y análisis de correlación Pearson. La ICH experimental estuvo acompañada de una expresión elevada de FGD5-AS1 tanto en modelos animales como celulares. La supresión de FGD5-AS1 alivió la inflamación cerebral, mejoró el rendimiento neurológico, redujo la lesión inflamatoria y oxidativa, y mejoró la supervivencia de las células endoteliales. La inhibición de miR-93-5p disminuyó estos efectos protectores, apoyando una interacción reguladora entre ambas moléculas. FGD5-AS1 reguló negativamente la expresión de miR-93-5p y la inhibición de miR-93-5p atenuaron los efectos observados tras el knockdown de FGD5-AS1. Estos resultados indican que FGD5-AS1 podría contribuir a la lesión cerebral asociada a la ICH mediante la regulación de miR-93-5p y que el eje FGD5-AS1/miR-93-5p podría representar un objetivo potencial para una investigación adicional en la CHI experimental.
La hemorragia intracerebral (IC) es un trastorno neurológico con altas tasas de mortalidad e incapacidad, que representa entre el 10% y el 20% de todos los casos deictus 1,2. Debido a la falta de objetivos terapéuticos efectivos, el tratamiento de la CHI se limita actualmente a cirugía y cuidados de apoyo3. Pinho et al. validaron las predicciones de mortalidad por ICH, resultados funcionales y fracción de crecimiento de hematomas, ofreciendo una nueva perspectiva para los profesionalessanitarios 4. A pesar de los avances en el tratamiento de la PCI, los resultados para los pacientes siguen siendo pobres. Por ello, identificar nuevos objetivos terapéuticos para la PCI es importante para mejorar el pronóstico a largo plazo.
Los ARN largos no codificantes (lncRNAs) comprenden una clase de transcritos no codificantes para proteínas que superan los 200 nucleótidos de longitud y que regulan la expresión génica mediante diversos mecanismos, incluyendo procesos transcripcionales, post-transcripcionales yepigenéticos 5. La evidencia acumulada ha demostrado que la expresión aberrante de ARNnc está implicada en la patogénesis de una variedad de trastornos neurológicos, como el ictus, la lesión cerebral traumática, la hemorragia intracerebral (IC) y la hemorragiasubaracnoidea 6. Entre estas moléculas reguladoras, FGD5-AS1 se ha relacionado con varios procesos celulares, incluyendo proliferación, apoptosis, señalización inflamatoria y respuestas al estrés oxidativo. A través de mecanismos como la actividad endógena de ARN competidor, la regulación transcripcional y la modificación epigenética, FGD5-AS1 influye en la expresión de múltiples objetivos aguas abajo. Se ha reportado una expresión desregulada de FGD5-AS1 en diversas condiciones patológicas, incluyendo malignidades, trastornos cardiovasculares y enfermedadesmetabólicas 7,8,9,10,11. No obstante, su importancia biológica en las enfermedades neurológicas sigue siendo incompletamente comprendida. Estudios previos han demostrado que FGD5-AS1 participa en la progresión de glioma y glioblastoma 12,13 y contribuye a la lesión neuronal bajo condiciones de privación/reperfusión de oxígeno-glucosa14. Estas observaciones sugieren que FGD5-AS1 podría desempeñar un papel regulador en la lesión neural; sin embargo, su contribución al daño cerebral tras la PCI no ha sido completamente aclarada.
Los microARN (miARN) son ARN cortos no codificantes que regulan la expresión génica interactuando con secuencias complementarias dentro de los ARN mensajerosobjetivo 15. Los estudios han demostrado que los miARN también desempeñan un papel importante en la ICH. Específicamente, miR-143-3p promueve la migración transendotelial de neutrófilos tras una lesión cerebral aguda al dirigirse a ATP6V1A16. miR-195-5p ejerce un efecto protector contra la lesión cerebral inducida por ICH al inhibir la expresión de MMP-9 yMMP-217. También se ha identificado MiR-93-5p como un objetivo terapéutico para mejorar los resultados tras la ICH18. Aunque los estudios han confirmado la expresión anormal de FGD5-AS1 y miR-93-5p en la PCI y su implicación en la progresión de la disfunción neurológica tras la PCI, investigaciones previas se han centrado principalmente en sus efectos biológicos individuales. La relación regulatoria competitiva entre FGD5-AS1 y miR-93-5p como ARN endógenos aún no ha sido claramente establecida.
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1. Animales experimentales
Esta investigación fue aprobada por el Comité de Ética Animal del Hospital Popular de Ganzhou (Aprobación nº 20230789) y se llevó a cabo en estricta conformidad con la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. En este estudio se utilizaron ratas hembras SD de grado SPF (6–8 semanas, 180–230 g). Las ratas fueron alojadas con libre acceso a comida y agua bajo condiciones controladas de 22 °C ± 3 °C y un ciclo de 12 horas luz/oscuridad. Se dejó que los animales se aclimataran durante 7 días antes del experimento. Los productos químicos, reactivos y equipos utilizados en el protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales.
2. Establecimiento del modelo in vivo de PCI
Para generar el modelo experimental de hemorragia intracerebral (ICH), se disolvió 0,23 U de colágenosa tipo VII en 1 μL de solución fisiológica estéril. Las ratas fueron anestesiadas con pentobarbital sódico intraperitoneal (50 mg/kg), tras lo cual la solución de colagénasa se infundió estereotácticamente en el estriado a 0,5 μL/min (0,2 mm detrás del punto frontal, 3,0 mm lateralmente a la línea media y 6 mm de profundidad en la superficie del cráneo). Los animales del grupo control se sometieron al mismo procedimiento pero recibieron un volumen igual de suero fisiológico en lugar de colagénasa. Una visión esquemática del diseño experimental se ofrece en la Figura Suplementaria 1.
Figura suplementaria 1: Diagrama de diseño de experimentos con animales. Las ratas se dividieron aleatoriamente en dos grupos: un grupo utilizó colagenasa tipo VII 0,23U para construir un modelo ICH; Un grupo utilizó solución fisiológica salina como grupo de control. Las ratas del grupo modelo se dividieron aleatoriamente en dos lotes para analizar el papel de FGD5-AS1 en el ICH y el efecto sinérgico del eje FGD5-AS1/miR-93-5p. Una hora después de la inducción del ICH, se inyectó el reactivo transfector en el cerebro de la rata. Evaluar la función neurológica de ratas que utilizan mNSS en los días 0, 1, 3 y 7; Recoge tejido cerebral después de inducir la CHI durante 7 días. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.
Las ratas se dividieron aleatoriamente en dos grupos. Un grupo se utilizó para analizar el papel de FGD5-AS1 en el ICH y se dividió a su vez en cuatro subgrupos: Control, ICH, ICH + lentivirus (LV)-shNC e ICH + LV-shFGD5-AS1. El otro grupo se utilizó para analizar los efectos sinérgicos del eje FGD5-AS1/miR-93-5p y se dividió en cinco subgrupos: ICH, ICH + LV-shNC, ICH + LV-shFGD5-AS1, ICH + LV-shFGD5-AS1 + antagomiro NC, e ICH + LV-shFGD5-AS1 + miR-93-5p antagomiro. Cada grupo incluía 12 ratas. Una hora después de la inducción de la ICH, el reactivo transfector se inyectó en el cerebro de la rata con una dosis de 2 mg/kg.
3. Cultivo celular y procesamiento
Las células endoteliales microvasculares cerebrales (BMEC) sirven como un modelo clave para estudiar la barrera hematoencefálica, los mecanismos subyacentes a los trastornos neurológicos y la administraciónde fármacos 20. Se estableció un modelo in vitro de ICH utilizando el tratamiento de privación de oxígeno-glucosa (OGD)/hemin en losCMEC 3. Los BMEC se cultivaron en DMEM libre de glucosa y suero bajo una mezcla gaseosa del 5% deCO2 y 95% deN2 durante 10 minutos. Las células fueron tratadas con hemin (10μM) y transferidas a una cámara anaeróbia que contenía 5% deCO2 y 95% deN2 durante 2 horas. La OGD se terminó devolviendo las células a condiciones normales de cultivo. El grupo control fue tratado con PBS bajo las mismas condiciones.
Las células se transfectaron según las instrucciones del fabricante. Las células fueron transfectadas con siRNA FGD5-AS1 de 20 nM (si-FGD5-AS1), siRNA control negativo (si-NC), inhibidor de miR-93-5p o inhibidor de control en blanco (inhibidor NC).
4. Prueba de puntuación de severidad neurológica modificada
Tras el establecimiento del modelo in vivo de ICH, la función neurológica se evaluó utilizando la Puntuación de Severidad Neurológica modificada (mNSS) en los días 0, 1, 3 y 7. Las puntuaciones se cuantificaron en función de cuatro dominios: función motora, función sensorial, equilibrio y función refleja. Las puntuaciones de 1–4 indicaron deterioro leve, 5–9 indicaron deterioro moderado y 10–14 indicaron deterioro severo.
5. Recogida de muestras
7 días después de la inducción de la ICH, las ratas fueron anestesiadas con una inyección intraperitoneal de 50 mg/kg de pentobarbital sodio, seguida de la eutanasia mediante dislocación cervical y recogida de tejido cerebral.
6. Evaluación del edema cerebral
El edema cerebral se evaluó utilizando el método de pesoseco-húmedo 19. El cerebro se pesaba inmediatamente después de la extracción para obtener el peso húmedo. El tejido se secó después en un horno a 100 °C durante 24 horas y se volvió a pesar para obtener el peso seco. El contenido de agua del tejido se calculó de la siguiente manera:
[(peso mojado - peso seco) / peso mojado] × 100%
7. PCR cuantitativa en tiempo real
El ARN total se aisló de muestras de tejido y células utilizando un reactivo de extracción de ARN según el protocolo del fabricante. Posteriormente, el ADN complementario se sintetizó utilizando un kit de transcripción inversa. Posteriormente se realizó un análisis cuantitativo por PCR utilizando una plataforma de PCR en tiempo real, con GAPDH y U6 como genes de referencia endógenos. El protocolo de amplificación consistía en un paso inicial de desnaturalización a 95 °C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 15 s y recocido/extensión a 60 °C durante 60 s. Los niveles relativos de expresión génica se calcularon utilizando el método 2−ΔΔCt . Las secuencias de cebación utilizadas en este estudio se proporcionan en la Tabla Suplementaria 1.
Tabla suplementaria 1: Las secuencias cebadoras y las secuencias de reactivos relacionadas utilizadas en este estudio. Las secuencias involucradas en experimentos qPCR en tiempo real y las secuencias relevantes de los reactivos utilizados en experimentos in vitro . Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.
8. Ensayo de proliferación celular
Las células transfectadas se sembraron en placas de 96 pozos. Tras cultivar durante 0, 24, 48 y 72 horas, se añadieron 10 μL de reactivo CCK-8 a cada pozo. Las células se incubaron a 37 °C durante 2 horas, y la densidad óptica se midió a 450 nm usando un lector de microplacas.
9. Ensayo de reportero con doble luciferasa
Los 3′-UTR de tipo salvaje (WT) y mutantes (MUT) de FGD5-AS1 que contenían el sitio de unión miR-93-5p fueron clonados en el vector pGL3. El vector fue co-transfectado con un miR-93-5p mimetizado utilizando un reactivo de transfección. La actividad relativa de la luciferasa se midió utilizando un sistema de reportero de doble luciferasa.
10. Ensayo inmunoenzimático ligado a enzimas
Las muestras de tejido cerebral (20–50 mg) se homogeneizaron en un tampón de lisis RIPA helado con una proporción tejido-tampón de 1:9. Tras la homogeneización, las muestras se centrifugaron a 12.000 × g durante 20 minutos a 4 °C, y se recogieron los sobrenadantes resultantes para su análisis. Los CMEC de cada grupo experimental fueron cosechados y centrifugados a 12.000 × g durante 10 minutos a 4 °C, tras lo cual se conservaron los sobrenacionantes. Las concentraciones de MDA, IL-1β, IL-6 y TNF-α se determinaron posteriormente utilizando los correspondientes kits de ensayo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
11. Análisis estadístico
Todos los datos se presentan como la media ± SD. Los datos se visualizaron mediante software estadístico. Cada experimento se repitió al menos tres veces. Se utilizó el test At para comparar dos grupos, y el análisis unidireccional de la varianza seguido de la prueba post hoc de Tukey se empleó para comparar más de dos grupos. Se consideró estadísticamente significativo un valor de P < 0,05.
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Efecto de FGD5-AS1 en ratas ICH
La expresión de FGD5-AS1 fue significativamente mayor en el grupo ICH que en el grupo control (P < 0,0001; Figura 1A). Tras la transfección con LV-shFGD5-AS1, la expresión de FGD5-AS1 se redujo notablemente en comparación con la del grupo LV-shNC (Figura 1B). La evaluación del edema cerebral reveló un edema cerebral más grave en ratas ICH que en ratas c...
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El daño cerebral tras una hemorragia intracerebral resulta no solo del evento inicial de sangrado, sino también de una serie de respuestas patológicas secundarias que evolucionan con eltiempo 21. Aunque el hematoma primario provoca una alteración mecánica directa del tejido circundante, la lesión posterior está mediada por procesos como la activación inflamatoria, el daño oxidativo y la muerte celular programada. Estos mecanismos secundarios contribuyen sustancial...
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Los autores no tienen intereses financieros o no financieros relevantes que revelar.
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Antagomir NC | GenePharma, China | B04007 | Antagomir de control negativo |
| BMECs | ATCC, USA | CRL-8270 | Células endoteliales microvasculares cerebrales humanas |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | Beyotime, China | C0038 | Kit de ensayo de viabilidad celular |
| DMEM medium | Gibco, USA | 12430054 | Medio libre de glucosa y suero |
| Dual-Glo Luciferase Assay System | Promega, USA | E2920 | Detección de actividad de luciferasa |
| Báscula electrónica | Sartorius | Secura224-1CN | Báscula de precisión para pesaje de tejidos |
| GAPDH y U6 primers | Sangon Biotech | Servicio de síntesis de primer personalizado | Primers de referencia interna |
| Graphpad Prism 8.0 | GraphPad Software, USA | —— | Software de análisis estadístico |
| Hemin | MCE, China | HY-19424 | Reactivo de hemina para inducción de lesión celular |
| Kits ELISA de IL-1 beta | Abcam, UK | ab197742 | Cuantificación de citocinas inflamatorias |
| Kits ELISA de IL-6 | Abcam, UK | ab222503 | Cuantificación de citocinas inflamatorias |
| Sistema PCR LightCycler 96 | Roche, Suiza | 5815916001 | Instrumento de PCR en tiempo real |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen, USA | L3000001 | Reactivos de transfección |
| Kit de ensayo MDA | Beyotime, China | S0131 | Ensayo de peroxidación lipídica |
| Lector de microplacas | BioTek | Synergy H1 | Medición de absorbancia OD450 |
| MiR-93-5p antagomir | GenePharma, China | B05001 | Inhibidor de miR-93-5p para experimentos in vivo |
| PBS | Solarbio, China | P1020 | Solución salina tamponada con fosfato |
| Pentobarbital sódico | Sigma, Merck KGaA | 11715 | Agente anestésico |
| pGL3-Promoter | NovoPro, China | V011541 | Vector reportador de luciferasa |
| Kit PrimeScript RT Mix | Takara, Japón | RR037A | Kit de transcripción inversa |
| RIPA | Beyotime, China | P0013B | Tampon de lisis de proteínas/tejidos |
| Lentivirus ShFGD5-AS1 | GenePharma, China | D02001 | Vector de supresión de FGD5-AS1 |
| Rata SD hembra de grado SPF | Vital River | —— | 6–8 semanas de edad, grado SPF |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | Takara, Japón | RR420A | Reactivo de PCR cuantitativa |
| Kits ELISA de TNF-α | Abcam, UK | ab208348 | Cuantificación de citocinas inflamatorias |
| Reactivo TRIzol | Invitrogen, USA | 15596026 | Reactivo para extracción de ARN total |
| Colagenasa tipo VII | Sigma, Merck KGaA | C0773 | De Clostridium histolyticum; inducción de ICH |
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