Artículo de método

Un modelo de ratones cardio-oncológicos de cardiotoxicidad inducida por antraciclinas en ratones inmunocompetentes portadores de tumores mamarios

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DOI:

10.3791/71633

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1 de octubre de 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1INSERM UMR-S 942 MASCOT, Cardiovascular Biomarkers, Pathophysiology, and Therapeutic Strategies - CIRCUS, Paris Cité University, 2Medical and Surgical Intensive Care Unit, University Hospital Avicenne, AP-HP

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Los modelos de ratón clínicamente relevantes de cardiotoxicidad inducida por antraciclinas son escasos. Aquí se propone un modelo que utiliza ratones inmunocompetentes portadores de un tumor que reciben tratamiento anticancerígeno, imitando los protocolos clínicos de pacientes con cáncer.

Resumen

La actualización reciente de la Sociedad Europea de Cardiología sobre modelos preclínicos de disfunción cardíaca relacionada con la terapia contra el cáncer destaca la necesidad crítica de modelos in vivo más representativos y traslacionales. Se señala la necesidad de desarrollar modelos que utilicen animales inmunocompetentes con tumores, incorporando múltiples cepas y ambos sexos, para recapitular con mayor precisión la heterogeneidad observada en las poblaciones clínicas. Por lo tanto, se desarrolló un modelo clínicamente relevante de cardiotoxicidad inducida por antraciclinas (AIC) en animales con tumores mamarios. Según el fondo genético de los ratones, se inyectaron células 4T1Luc (200 000 células) o células PY8119 (200 000 células) en ratones Balb/c o C57Bl/6J, respectivamente, por vía subcutánea en la glándula mamaria inferior de machos y hembras. El crecimiento tumoral se controló mediante bioluminiscencia y palpación. Una vez que la masa tumoral fue detectable por palpación, dos semanas después de la inyección de células tumorales, los animales recibieron tratamiento con doxorrubicina como agente anticancerígeno. La tolerancia de los ratones a la doxorrubicina dependió de la cepa. La función cardíaca se evaluó antes del inicio del protocolo (línea base) y semanalmente después mediante ecocardiografía en ratones anestesiados con ketamina. Se definió cardiotoxicidad como una disminución en el acortamiento fraccional del ventrículo izquierdo de al menos un 10 % respecto a la línea base, un valor absoluto <50 %, y una frecuencia cardíaca >300 latidos por minuto (BPM). El protocolo fue reproducible, con un 99 % de éxito en el desarrollo tumoral y una tasa de supervivencia de ratones >80 %. Se observó cardiotoxicidad en >90 % de los ratones tratados con tumor y doxorrubicina.

Introducción

La cardio-oncología tiene como objetivo mejorar los resultados cardiovasculares en pacientes con cáncer antes, durante y después de la quimioterapia. Los modelos preclínicos han desempeñado un papel fundamental para comprender mejor la interacción entre estas dos enfermedades. Recientemente, un estudio que marcó un cambio de paradigma observó que los ratones predispuestos de forma natural a desarrollar pólipos intestinales espontáneos desarrollaron un mayor número de estos tumores tras un infarto de miocardio y un período con insuficiencia cardíaca (HF), lo que demuestra el impacto directo de un evento cardiovascular sobre el crecimiento tumoral1. Desde entonces, numerosos estudios han informado hallazgos consistentes en diversos tipos de tumores y cepas murinas, implicando frecuentemente vías moleculares o proteínas específicas, reforzando así el concepto de que la progresión del cáncer es precipitada por enfermedades cardiovasculares (CVDs)2,3,4,5.

Por el contrario, el impacto del cáncer en el riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares (ECV) ha sido estudiado durante varias décadas. Los datos epidemiológicos muestran que los sobrevivientes de cáncer padecen más ECV, tanto debido a los factores de riesgo compartidos entre estas dos enfermedades como a las diversas toxicidades conocidas de los tratamientos anticancerígenos. tratamientos6,7,8,9,10. Los estudios preclínicos han utilizado comúnmente modelos de caquexia inducida por cáncer para identificar dianas específicas que podrían modularse en humanos para mejorar los resultados cardiovasculares a largo plazo11,12,13,14Sin embargo, se podría argumentar que estos modelos reflejan apenas una situación clínica común, ya que los pacientes suelen recibir tratamiento antes de alcanzar este síndrome de cáncer avanzado, pero se sospecha aún que la caquexia global contribuye en gran medida a la mortalidad general por cáncer.15.

En las primeras guías de cardio-oncología de la Sociedad Europea de Cardiología (ESC), se concluye que se necesita más investigación para comprender mejor la relación entre el cáncer y las enfermedades cardiovasculares16. Más concretamente, en una actualización reciente del grupo de trabajo de cardio-oncología de la ESC, se afirmó que la investigación preclínica es de suma importancia para abordar esta brecha de conocimiento, especialmente con modelos que utilizan animales portadores de tumores17. Además, se requiere una mejor correlación entre los estudios preclínicos y clínicos, ya que la mayoría de los estudios clínicos actuales se realizan con tratamientos anticancerígenos que están poco estudiados en entornos preclínicos18.

Las antraciclinas (AC), como la doxorrubicina (Dox), se utilizan comúnmente en la quimioterapia para un gran número de tumores sólidos y hematológicos. Aunque hoy en día existen terapias más modernas, su bajo costo, efectos secundarios bien documentados y eficacia evidente harán que estas drogas sigan utilizándose durante muchos años más19,20. Una gran cantidad de evidencia sugiere que las AC provocan una cardiotoxicidad dependiente de la dosis, observada principalmente como una disfunción del ventrículo izquierdo, lo cual es uno de los principales factores limitantes para su uso clínico actual y a menudo constituye un motivo de preocupación para el cardio-oncólogo21,22. Esta literatura proviene principalmente de estudios sobre cáncer de mama debido a su alta incidencia en humanos, pero estudios clínicos sobre linfomas, cáncer de pulmón y leucemias proporcionan observaciones similares23. Por tanto, durante varias décadas se ha llevado a cabo investigación preclínica para comprender los mecanismos fisiopatológicos subyacentes de la cardiotoxicidad inducida por antraciclinas (AIC), lo que ha demostrado que el estrés oxidativo, el daño directo e indirecto al ADN, la ferroptosis y el daño mitocondrial están comúnmente implicados23,24.

Sin embargo, en realidad hay evidencia limitada sobre cómo prevenir o tratar la CIA. Se han probado medicamentos habituales para la IC en ensayos clínicos con resultados mixtos, y ha sido difícil determinar el momento adecuado para usar los pocos candidatos potenciales21,23,25,26,27,28. La dexrazoxana, un fármaco modulador del hierro, ha mostrado resultados prometedores para prevenir la CIA, pero actualmente no se utiliza de forma sistemática21. Administrar AC en formas distintas a la libre en sangre, por ejemplo, encapsulados en liposomas, también ha mostrado resultados prometedores, pero aún tiene dificultades para reemplazar a los AC convencionales, en parte debido a su costo21.

Una explicación para esta situación es la falta de modelos animales clínicamente relevantes para estudiar la cardiotoxicidad inducida por antraciclinas (AIC)17. En humanos, la doxorrubicina (Dox) se administra a lo largo del tiempo mediante inyecciones repetidas, y la mayor parte de la AIC se observa durante el primer año tras el tratamiento. Sin embargo, se observa una gran variabilidad en los protocolos animales en la literatura, como se muestra en una revisión publicada recientemente29. Un ejemplo clásico de un modelo de cardiotoxicidad aguda es el uso de ratones libres de tumores que reciben una única inyección de 20 mg/kg de Dox30. En un modelo típico de cardiotoxicidad crónica, muchos estudios describen ratones libres de tumores que reciben una inyección semanal de 5 mg/kg de doxorrubicina durante una dosis acumulada total de 20 mg/kg29,31. Esta cardiotoxicidad crónica también puede observarse en animales con tumores a la misma dosis de Dox; sin embargo, esto sigue siendo muy poco común en la literatura29,32.

Para contribuir a reducir esta brecha de conocimiento, se desarrolló un modelo pragmático y clínicamente relevante de ratones inmunocompetentes portadores de tumores mamarios para estudiar la cardiotoxicidad inducida por antraciclinas (AIC), específicamente en ratones Balb/c portadores de 4T1, y se confirmó su solidez en ratones C57Bl/6J portadores de PY8119, siendo este último, según el conocimiento de los autores, la primera vez que se establece un modelo cardio-oncológico con un cáncer de mama triple negativo en una cepa C57Bl/6J. Se logró una buena cuantificación del crecimiento tumoral mediante la bioluminiscencia antes de tratar a los animales con Dox, la cual demostró cardiotoxicidad, y se implementó un protocolo de recolección de órganos para estudiar el microambiente tumoral simultáneamente con el experimento cardio-oncológico. Además, se observaron resultados similares a los descritos en la literatura respecto a la sensibilidad de la cepa y del sexo. Se espera que este trabajo contribuya a la estandarización y mejora de los protocolos animales en futuros estudios cardio-oncológicos, ya que los ratones C57Bl/6J son altamente valiosos por su elevada tasa de supervivencia en experimentos de AIC29.

La ventaja del método propuesto es el uso de la cepa C57Bl/6J, que es fácil de manipular genéticamente, tiene un genoma bien caracterizado, es económica de obtener y es tolerante a dosis acumulativas altas de ACs29,33,34. Si se necesita la eliminación de un gen para un estudio específico con ACs, este modelo es muy adecuado para dicho propósito. Además, el uso de un cáncer de mama triple negativo derivado de esta cepa tiene interés traslacional, ya que las mujeres con cáncer de mama triple negativo son las pacientes que con mayor probabilidad reciben ACs y que tienen el peor pronóstico35. El uso de este modelo probablemente mejore el conocimiento sobre la cardiotoxicidad inducida por antraciclinas (AIC) específicamente para estas pacientes.

La fortaleza de este modelo radica también en el hecho de que los ratones se encuentran previamente acondicionados con un tumor, lo cual puede afectar verdaderamente el remodelado cardiovascular36,37. Asimismo, este modelo se sitúa entre los modelos agudos y los crónicos completos de IAC, con la posibilidad de prolongar la duración del monitoreo de los animales debido a su alta tasa de supervivencia, lo cual puede ser de gran valor si se consideran otros ciclos de AC.

Sin embargo, este modelo probablemente no sea el más adecuado para la caracterización específica del tumor al final del protocolo, debido a su enfoque pragmático de la inoculación tumoral. Se debería realizar una versión adaptada de la inyección del tumor si esto es fundamental para la hipótesis científica. Además, la inyección de células 4T1 en ratones Balb/c es un modelo bien establecido para un enfoque más oncológico, por ejemplo, para estudiar metástasis, lo cual no se describe aquí y debería tenerse en cuenta si la metástasis es esencial para la pregunta científica38. Este modelo se realiza en ratones adultos; sin embargo, si el objetivo es estudiar la CIA en un contexto pediátrico, se deberían considerar ratones más jóvenes, cuya respuesta al protocolo no se ha estudiado en este trabajo.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con el comité local de ética animal (Lariboisière-Villemin) y fueron aprobados por el Ministerio francés de Educación Superior e Investigación (MESRI) bajo el número de protocolo APAFIS 46086. Las reglas de los 3R se tuvieron en cuenta durante el diseño del protocolo. Los ratones Balb/c y C57Bl/6J se adquirieron de un proveedor de animales como Janvier Labs o Envigo. Para este protocolo, los ratones tenían entre 10 y 18 semanas de edad al momento de la inclusión, lo que corresponde a adultos jóvenes, similares a las mujeres que padecen cáncer de mama triple negativo. Los animales se mantuvieron en grupos de 2 a 5 individuos en una sala con ciclos de luz/oscuridad de 12 horas, temperatura ambiente entre 20 °C y 24 °C, y humedad entre 30% y 70%. Se proporcionaron agua y alimento ad libitum. Durante el protocolo, se tuvo especial cuidado en seguir los puntos finales humanitarios predefinidos antes del inicio del mismo, como se describe en la Tabla Suplementaria 1. Asegúrese de utilizar un filtro de isoflurano para recoger los gases residuales, por la seguridad del usuario de isoflurano. Manipule los animales con cuidado, utilizando guantes y gafas en cada paso de este protocolo. Todos los materiales peligrosos deben seguir las regulaciones institucionales locales; en este caso, todas las muestras contaminadas (sangre, agujas, viales que contienen dox, etc.) se desechaban en contenedores de residuos sanitarios biopeligrosos. La descripción general del protocolo se muestra en la Figura 1A. Los reactivos y el equipo utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Semana 0: Preparación de células e inyección en el animal

NOTA: Los siguientes pasos se describen para células 4T1Luc y fueron idénticos para el uso de células PY8119. Sin embargo, esto debe adaptarse para cada línea celular, según las recomendaciones del fabricante. Para optimizar el protocolo, una persona puede encargarse de la preparación de las células, mientras que la otra maneja la preparación de los animales.

  1. Cuando se obtenga un frasco de cultivo celular confluyente (80%–90% de confluencia), aplique 3 mL de tripsina durante 5 min a 37 °C y 5% CO2.
  2. Toque suavemente el frasco para desprender todas las células, evite grumos celulares y resuspenda en medio de cultivo celular.
  3. Contar las células utilizando una cámara de Malassez (o cualquier otra técnica, según la disponibilidad).
  4. Centrifugue las células a 300 × g durante 5 min, luego resuspenda en un volumen igual de PBS para inyectar 200.000 células en 100 µL.
    NOTA: El número de células se eligió tras una revisión bibliográfica (véase Tabla Suplementaria 2).
  5. Aspire suavemente con una jeringa de 26 G un volumen de 500 µL de la suspensión celular. Para evitar un tiempo excesivo con la suspensión celular en la jeringa, se recomienda llenar la jeringa con un volumen menor al necesario para 5 animales.
  6. Simultáneamente (si es posible), coloque los ratones en una cámara de isoflurano e induzca rápidamente la anestesia con 3% de isoflurano a 1 L/min en aire ambiente. Tan pronto como el animal esté dormido, colóquelo en posición supina con el hocico en un cono que contenga isoflurano al 1%.
  7. Aplique una crema depilatoria suave con un hisopo de algodón sobre la pared torácica y la región abdominal inferior izquierda del animal durante 1 min. Retire el vello y la crema con agua, luego seque la piel con un tejido.
  8. Verifique una anestesia adecuada mediante el pellizco del dedo del pie.
  9. Identifique el pezón mamario izquierdo del abdomen superior. Agárrelo suavemente con pinzas y levántelo hacia arriba (véase Figura 1B).
  10. Introduzca la aguja de la jeringa subcutáneamente e insértela hasta que la aguja quede debajo de la glándula mamaria.
  11. Injecte 100 µL de la suspensión celular. Debe formarse una burbuja subcutánea bajo el pezón (véase Figura 1C). Los animales de control deben recibir PBS. La aleatorización puede realizarse mediante software de aleatorización (como RandoMice, una herramienta gratuita en línea) o asignando el tratamiento a los ratones según una proporción predeterminada de 1 a 1 o 2 a 2 (o superior).
  12. Retire suavemente la aguja y suelte el pezón que estaba agarrado con las pinzas.
  13. Pese al animal para obtener un peso basal para el protocolo.
  14. Deje que el animal despierte en aire ambiente antes de devolverlo a su jaula.

2. Semana 1: Control del crecimiento tumoral mediante bioluminiscencia

NOTA: Esto puede hacerse cualquier día después de la inyección para controlar el crecimiento. Además, podría realizarse en múltiples puntos temporales si interesa la tasa de crecimiento tumoral. Sin embargo, después de 10–14 días, la señal puede desvanecerse debido a la selección natural de células tumorales durante el crecimiento del cáncer. Asimismo, la reaparición del vello no debería ser un problema para la captura adecuada de fotones si el protocolo se realiza correctamente desde el inicio. Véanse Figura 2A,B para ver resultados representativos de la cuantificación de bioluminiscencia en los días 2, 5, 8 y 11 posteriores a la inyección del tumor.

  1. Coloque los animales en una cámara de isoflurano e induzca rápidamente la anestesia con 3% de isoflurano.
  2. Una vez que los animales estén dormidos, inyecte 10 µL/g de peso corporal de luciferina por vía intraperitoneal (IP) utilizando una jeringa de 26 G. Evite inyectar luciferina en el lado izquierdo debido a la presencia del tumor, que a veces ya puede ser palpable después de unos días.
  3. Coloque los ratones en el imagenador de fotones en posición supina para optimizar la captura de fotones, ya que el tumor se encuentra en el lado abdominal. Introduzca el hocico en el cono nasal y reduzca el isoflurano al 1%.
    NOTA: Colocar correctamente 5 animales en un capturador de fotones lleva cierto tiempo; comience a colocarlos al menos 2 min antes de que deba iniciarse la adquisición.
  4. Inicie la adquisición de la actividad de luminiscencia 10 min después de la inyección de luciferina y continúe durante 5 min (ver Figura 2A). El modo de adquisición para el dispositivo utilizado aquí fue BLI a 89 ms por cuadro, con un tamaño de imagen de 220 mm x 165 mm y un tamaño de píxel BVR de 153 µm.
  5. Una vez finalizada la adquisición, permita que el animal despierte en aire ambiente antes de devolverlo a su jaula.
  6. Utilice un software de cuantificación adaptado para el imagenador de fotones, siguiendo las recomendaciones del fabricante.

3. Semana 2: Tratamiento con doxorrubicina

NOTA: La evaluación ecocardiográfica debe realizarse antes de comenzar las inyecciones de Dox. Por lo tanto, utilice la anestesia inducida tras la ecocardiografía para administrar la inyección mientras el animal está dormido, con el fin de minimizar el estrés provocado por la primera inyección de Dox. Además, la dosis acumulativa debe adaptarse a cada cepa de ratón. Aquí se utilizaron 16 mg/kg para ratones Balb/c y 24 mg/kg para ratones C57Bl/6J, basándose en datos previos internos y en la literatura29 (véase Figura 3A–C).

  1. ReSuspender y diluir el polvo de doxorrubicina con solución salina. La dilución debe prepararse de modo que 4 mg/kg de Dox correspondan a un volumen de 240–360 µL. Por lo tanto, se sugiere preparar una solución a 2 mg/mL y luego realizar una dilución 6 veces con solución salina (concentración final 0,33 mg/mL).
  2. Dos semanas después de la inyección del tumor, asegúrese de que el tumor sea palpable en la parte inferior izquierda del abdomen, pero que mida menos de 1 cm.
  3. Pese al animal para controlar la pérdida de peso tras el tratamiento con Dox.
  4. Utilizando una jeringa de 26 G, inyecte el volumen correspondiente para alcanzar 4 mg/kg por vía intraperitoneal en la parte inferior derecha del abdomen. Los animales de control deben recibir solución salina. La aleatorización puede realizarse como en el paso 1.11.
  5. Repita este procedimiento diariamente durante 4 días para alcanzar una dosis acumulada de 16 mg/kg (agregue 2 días para alcanzar 24 mg/kg en ratones C57Bl/6J).

4. Semanas 2–5: Monitoreo de cardiotoxicidad

NOTA: Esto puede realizarse de forma semanal. Una evaluación más frecuente requerirá precaución, ya que los animales suelen ser más vulnerables durante las semanas 3 y 4 del protocolo, y porque algunas cepas de ratones son sensibles a la anestesia general, lo que podría provocar una mayor mortalidad. La ecocardiografía se realiza bajo anestesia con ketamina para optimizar las posibilidades de registrar disfunción cardíaca, ya que el isoflurano induce depresión miocárdica, utilizando 40 mg/kg para ratones Balb/c y 80 mg/kg para ratones C57Bl/6J39. Se recomienda realizar un ultrasonido antes de iniciar la inyección del tumor para cuantificar el posible efecto del crecimiento tumoral sobre la función cardíaca antes de comenzar la quimioterapia.

  1. Pese el animal. Si se observa una pérdida significativa de peso, siga la Tabla Suplementaria 1.
  2. Anestesie los animales mediante una inyección IP con una jeringa de 26 G de ketamina a 40 mg/kg (ratones Balb/c) o 80 mg/kg (ratones C57Bl/6J) para obtener una anestesia ligera.
  3. Coloque al animal sobre una almohadilla calefactora para evitar la hipotermia.
  4. Una vez que el animal esté dormido, afeite al animal como se describe en el punto 1.7 para obtener una zona torácica libre de pelo.
  5. Diez minutos después de la inyección de ketamina, realice ecocardiografía durante un máximo de 5 min. Utilice gel de ultrasonido precalentado. Dependiendo del dispositivo utilizado, enfoque en modo M y/o realice cuantificación de deformación.
  6. Si se utiliza el modo M, registre secciones mediocavitarias en vista paraesternal longitudinal, grabando al menos durante 4 s, al menos 3 veces para obtener una media representativa de la función cardíaca del ratón (véase la Figura 4A,B). En este caso, la velocidad de cuadros se estableció en 100 cuadros/s, la frecuencia de transmisión en 38,4 MHz al 100 % de potencia, la frecuencia de recepción en 96 MHz, la velocidad del sonido en 1538 m/s y la velocidad de barrido en 1200 Hz.
  7. Después de aproximadamente 5 min, el animal estará demasiado despierto para permitir la ecocardiografía. Devuélvalo a su jaula tras limpiar el gel utilizado para la ecografía.
  8. Cuantifique de forma ciega la función cardíaca39,40. La disfunción relevante en este modelo se define como un 10 % por debajo del valor basal y un valor absoluto <50 % de la fracción de acortamiento del ventrículo izquierdo (FS), mientras que la frecuencia cardíaca permanece >300 latidos por minuto (BPM). Si el valor de FS previo al tratamiento es demasiado bajo, considere excluir al animal del análisis.
    NOTA: Se necesitan al menos 3 ciclos cardíacos para cada cuantificación a partir de fragmentos de 4 s, aunque se pueden utilizar más ciclos cuando sea posible. Si es posible, utilice al mismo experimentador para toda la ecocardiografía y una persona diferente para la cuantificación, con el fin de cegar el análisis. Las recomendaciones sobre el control de calidad de la ecocardiografía se han publicado en otro lugar40.
  9. Realice el análisis estadístico (véase el paso 6). La prueba recomendada para analizar dos grupos a lo largo de todo el protocolo es un ANOVA de dos vías, ya que se comparan dos factores: tiempo y tratamiento.
  10. Realice esto semanalmente. La disfunción aparece tras solo 1 semana de tratamiento con doxorrubicina.
    NOTA: Si se requiere una muestra de sangre en algún momento después de la Dox, por ejemplo, para medir biomarcadores cardíacos, tome la muestra inmediatamente después de la ecocardiografía para evitar otra inyección de anestesia, minimizar el estrés en el animal y optimizar el tiempo.

5. Semana 5: Procedimiento de sacrificio

NOTA: Idealmente, este protocolo de recolección de órganos debe realizarse con dos personas.

  1. Después de la última ecocardiografía en la semana 5, vuelva a inyectar a los animales con ketamina IP a 100 mg/kg. Aplique anestesia local con una gota de tetracaína al 1 % en el ojo que se utilizará para la extracción de sangre.
  2. Mediante un capilar heparinizado, realice sangrado retro-orbitario para recoger toda la sangre posible en un tubo con heparina (o un capilar con EDTA en un tubo con EDTA).
  3. Cuando ya no se pueda obtener más sangre, realice la dislocación cervical de acuerdo con los protocolos aprobados institucionalmente. Coloque inmediatamente la sangre recolectada sobre hielo hasta su posterior manipulación, mientras continúa con el protocolo de sacrificio descrito en el paso 5.5.
  4. Centrifugue la sangre a 2000 x g durante 10 min a 4 °C para separar las células sanguíneas y el plasma. Congele rápidamente el tubo de plasma con nitrógeno líquido y almacénelo a -80 °C hasta su posterior análisis.
  5. Coloque al animal sobre una tapa de espuma de poliestireno cubierta con papel absorbente y sujete las cuatro patas con alfileres.
  6. El tumor debe tener un tamaño considerable (al menos 2 cm). Corte con un margen amplio alrededor del tumor para separarlo. Puede realizarse una disección adicional después de la recolección de los órganos restantes descrita en el paso 5.15.
  7. En un área separada, disecte suavemente el tumor con tijeras pequeñas y afiladas mientras lo sostiene con pinzas. Para aumentar la tensión sin dañar el tumor, clave la piel sobrante a la tapa. Esto facilitará la disección.
  8. Una vez que el tumor esté bien diseccionado, límpielo suavemente con PBS para eliminar sangre, pelo y otros desechos sueltos. Pese el tumor.
  9. Coloque una malla de nailon de 22 µm en un tubo cónico de 5 mL, coloque el tumor suavemente sobre ella y manténgalo en hielo hasta la centrifugación.
  10. Centrifugue el tubo a 100 x g durante 10 min a 4 °C para recolectar el líquido intersticial (véase Figura 5A). El volumen obtenido oscila entre 1 y 20 µL, y suele tener un color rojizo (Figura 5B). Transfiera el líquido a un tubo microcónico de 200 µL y almacénelo a -80 °C hasta su posterior análisis.
    NOTA: El resto del tumor puede cortarse en trozos más pequeños, colocarse en tubos de almacenamiento, congelarse rápidamente en nitrógeno líquido y almacenarse a –80 °C hasta su posterior análisis.
  11. Para recolectar la médula ósea, corte la pata derecha con tijeras, diseccione con bisturí y pinzas el fémur y la tibia hasta eliminar todo el músculo, tejido conectivo y grasa. Corte las epífisis en ambos extremos de los dos huesos con un bisturí. Coloque los huesos limpios en PBS en placas de cultivo de 12 pocillos mientras termina la recolección de órganos de los ratones según se describe en el paso 5.15.
    NOTA: Se han publicado en otras partes detalles más exhaustivos sobre el aislamiento de médula ósea41.
  12. Perfore el fondo de tubos microcónicos de 500 µL con una aguja de 18 G, coloque los dos huesos dentro y coloque este tubo dentro de un tubo cónico de 1,5 mL que contenga 400 µL de PBS.
  13. Centrifugue los tubos a 10 000 x g durante 1 min a 4 °C. Se observará un sedimento celular en el fondo del tubo de 1,5 mL; todas estas células corresponden a la médula ósea, mientras que el estroma de la médula ósea queda mezclado en el PBS. Aspire todo el sobrenadante (estroma de la médula ósea) a un tubo de almacenamiento separado, congele rápidamente el material en nitrógeno líquido y almacénelo a -80 °C.
  14. Con tijeras, realice una incisión transversal por debajo del tórax a nivel diafragmático y corte el esternón a lo largo de su eje longitudinal para exponer los pulmones y el corazón.
    NOTA: Si es necesario para análisis posteriores, aquí puede realizarse una extracción completa de sangre con solución salina.
  15. Recolecte todos los órganos necesarios para análisis biomoleculares e histológicos. Péselos y córtelos en trozos más pequeños para facilitar futuros análisis biomoleculares. Congele rápidamente todos los tubos en nitrógeno líquido tan pronto como el órgano sea cortado en trozos más pequeños, y luego almacénelos a -80 °C.
  16. Para el corazón, separe el ápice de la parte superior del corazón y colóquelo en moldes de plástico llenos con OCT. Una vez en OCT, colóquelo en isopentano frío antes de congelarlo rápidamente con nitrógeno líquido y almacenarlo a -80 °C.

6. Análisis estadístico

NOTA: Todos los análisis estadísticos y gráficos se realizaron utilizando software estadístico y de graficación y siguen las recomendaciones del manual de estadística42.

  1. Los datos presentados se expresan como media ± EE.
  2. Utilice la misma escala para todos los gráficos de acortamiento fraccional.
  3. Muestre cada unidad experimental individual (ratón) en todos los gráficos.
  4. Realice la prueba de Shapiro-Wilk para evaluar la normalidad de las distribuciones de cada grupo experimental, con un nivel de significancia alfa establecido en p = 0,05.
  5. Para la comparación entre dos grupos, utilice las pruebas de Welch o de Mann-Whitney según la normalidad de la distribución (prueba de Welch para distribuciones normales en ambos grupos, prueba de Mann-Whitney si uno o ambos grupos presentan distribuciones no normales). Elija las opciones bilaterales, con un nivel de confianza establecido en 95 %.
  6. Para la comparación entre más de dos grupos en un punto temporal específico, determine nuevamente si las distribuciones de los grupos son normales como en el paso 6.4. Realice un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de la corrección de Holm-Sidak para comparaciones múltiples si la distribución es normal.
    NOTA: Si la distribución no es normal, se debe realizar en su lugar la prueba de Kruskal-Wallis con corrección de Dunn para comparaciones múltiples. El umbral alfa global se establece en 0,05 para determinar la significancia.
  7. Para datos longitudinales, se utilizó un ANOVA bidireccional de medidas repetidas seguido de la corrección de Sidak para comparaciones múltiples con el fin de examinar las diferencias entre grupos en un punto temporal específico. El umbral alfa global se establece en 0,05 para determinar la significancia.

Resultados

Este protocolo, como se muestra en Figura 1A, es un protocolo de 5 semanas que da lugar a los siguientes grupos experimentales: ratones sin tumor y sin doxiciclina, ratones sin tumor y con doxiciclina, ratones con tumor y sin doxiciclina, y ratones con tumor y con doxiciclina. Estos grupos pueden duplicarse dependiendo de si se utilizan ambos sexos. Las primeras 2 semanas de crecimiento tumoral, antes de iniciar el tratamiento con doxiciclina, son suficientes para que el tumor crezca tras la inyección de 200.000 células en el 4th glándula mamaria izquierda de los animales (Figura 1B). La confirmación de la inyección subcutánea se debe obtener mediante la aparición de una burbuja bajo el pezón al inyectar suavemente la suspensión de células tumorales (Figura 1C). Tabla 1 resume brevemente los parámetros clave del protocolo para cada cepa de ratón, junto con los resultados principales que se discutirán a continuación.

Figura 2A es una imagen representativa de la señal bioluminiscente obtenida cuando se inyecta luciferina en un ratón sin tumor (izquierda) y un ratón con tumor (derecha), y se recopilan fotones durante 5 min. Este análisis requiere que los tumores expresen el gen luciferasa para generar fotones tras la inyección de luciferina. En total, se monitorearon durante 11 días mediante bioluminiscencia 33 ratones Balb/c con inyecciones de células 4T1Luc, mientras que se utilizaron 9 controles. Figura 2B confirma que el tumor crece rápidamente, pero que la intensidad de la señal comienza a estabilizarse después del día 8, y parece haber un crecimiento inicialmente más rápido del tumor en ratones hembra en comparación con ratones macho Balb/c, como se muestra en Figura 2C. Solo 1 de cada 45 ratones Balb/c no presentó tumor después de 5 semanas, mientras que todos los ratones C57Bl/6J tenían tumor tras 5 semanas (Figura 2D).

Figura 3A  y Figura 3B demuestran que la reducción acumulativa de la dosis de Dox conduce a una mayor supervivencia a las 3 semanas tras el inicio del tratamiento con Dox: mientras que ningún ratón Balb/c portador de tumor sobrevivió a la dosis de 24 mg/kg, el 50 % sobrevivió a 16 mg/kg. Sin embargo, los ratones C57Bl/6J portadores de tumor son más resistentes, incluso a 24 mg/kg de Dox, ya que >el 80 % sobreviven 3 semanas después del inicio de la quimioterapia (Figura 3D). El sexo tuvo un impacto importante en el resultado: las hembras mostraron una supervivencia mucho mejor que los machos en ratones Balb/c (16 de 29 hembras sobrevivieron en comparación con 3 de 16 machos). Figura 3C demuestra las diferencias sexuales en ratones Balb/c que recibieron 16 mg/kg de Dox (no se realizó ninguna prueba estadística debido al reducido número de machos). En ratones C57Bl/6J, no hubo diferencias estadísticamente significativas en la supervivencia entre ambos sexos (véase Figura 3E).

Se muestra una imagen representativa de la función cardíaca normal en ratones, evaluada mediante ecocardiografía antes del tratamiento con Dox, en la Figura 4A, y una de un ratón con disfunción cardíaca después de Dox en la Figura 4B. La fracción de acortamiento cuantificada en modo M en 17 ratones C57Bl/6J con tumor tratados con 24 mg/kg de Dox muestra una disminución significativa dos semanas después (59,3 % antes de Dox frente a 44,3 % después de Dox, p < 0,0001, Figura 4C). Solo 1 de los 12 ratones sobrevivientes (8 %) no cumplió los criterios predefinidos de cardiotoxicidad. La frecuencia cardíaca disminuye ligeramente pero significativamente de 623 latidos por minuto antes de Dox a 569 latidos por minuto después de Dox (p < 0,05, Figura 4D). Todos los parámetros cuantificados mediante modo M se encuentran en la Tabla Suplementaria 3.

La confirmación del efecto cardiotoxico de la doxorrubicina se obtiene mediante análisis macroscópico y microscópico. Figura 6A,B demuestra que el peso absoluto del corazón disminuye significativamente tras el tratamiento con Dox en las pocas ratonas Balb/c portadoras de tumor que sobreviven, aunque la normalización del peso cardíaco respecto al peso corporal total solo muestra una tendencia. En un experimento realizado con ratones C57Bl/6 no portadores de tumor, 24 mg/kg de Dox indujeron los cambios esperados en el ARNm cardíaco de los siguientes genes una semana después del inicio del tratamiento con Dox: Atrogin y Murf1 aumentaron, favoreciendo la atrofia; NQO1 aumentó, indicativo de estrés oxidativo; y Bax aumentó, favoreciendo una situación proapoptótica (Figura 6C–F).

Figura 5A es una representación esquemática del protocolo de líquido intersticial tumoral. En la Figura 5B se muestra una imagen representativa del líquido recogido: el volumen obtenido es pequeño.

figure-results-1
Figura 1: Ilustraciones representativas del protocolo experimental. (A) Esquema general del protocolo experimental. Creado con BioRender (licencia n.º JE29USE7LU). (B) Representación esquemática de la inoculación subcutánea de tumor. Creado con BioRender (licencia n.º SO29JHW7R6). (C) Representación esquemática del implante tumoral subcutáneo exitoso. Creado con BioRender (licencia n.º SO29JHW7R6). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Imagen de bioluminiscencia y tasa de implantación tumoral. (A) Imágenes representativas de bioluminiscencia de un ratón control (izquierda) y un ratón con tumor (derecha). (B) Señal de bioluminiscencia a lo largo del tiempo (media ± EE; análisis de varianza [ANOVA] de dos vías con medidas repetidas; *P < 0,05). (C) Comparación de las señales de bioluminiscencia entre ratones Balb/c machos y hembras (media ± EE). (D) Tasas de éxito de implantación tumoral en ambas cepas de ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Análisis de supervivencia de ratones con tumores. (A) Curva de supervivencia de Kaplan-Meier de ratones Balb/c tratados con doxorrubicina (Dox) a 24 mg/kg. (B) Curva de supervivencia de Kaplan-Meier de ratones Balb/c tratados con Dox a 16 mg/kg. (C) Curva de supervivencia de Kaplan-Meier que compara ratones Balb/c macho y hembra tratados con Dox a 16 mg/kg. No se realizó análisis estadístico debido al número limitado de ratones macho. (D) Curva de supervivencia de Kaplan-Meier de ratones C57BL/6J tratados con Dox a 24 mg/kg. (E) Curva de supervivencia de Kaplan-Meier que compara ratones C57BL/6J macho y hembra tratados con Dox a 24 mg/kg (prueba de log-rank, P = 0,86). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Evaluación ecocardiográfica de la cardiotoxicidad inducida por doxorrubicina. (A) Ecocardiograma representativo en modo M de un ratón sano. (B) Ecocardiograma representativo en modo M de un ratón con cardiotoxicidad inducida por doxorrubicina. (C) Acortamiento fraccional (FS) en ratones C57BL/6J antes y 14 días después del tratamiento con doxorrubicina. (D) Frecuencia cardíaca (HR) en ratones C57BL/6J antes y 14 días después del tratamiento con doxorrubicina. Los datos se presentan para n = 17 ratones. Las comparaciones estadísticas se realizaron utilizando la prueba t de Welch. *P < 0,05; ****P ≤ 0,0001. Abreviaturas: FS, acortamiento fraccional; HR, frecuencia cardíaca. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 5: Protocolo de muestreo de órganos. (A) Representación esquemática del protocolo de recogida de líquido intersticial tumoral. Creado con BioRender (licencia n.º HV29USD91R). (B) Imagen representativa que muestra la recogida de líquido intersticial tumoral durante el muestreo de órganos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Cardiotoxicidad inducida por doxorrubicina. (A) Peso del corazón medido a las 3 semanas después del inicio del tratamiento con 16 mg/kg de doxorrubicina en ratones Balb/c con tumor. (B) Peso del corazón normalizado respecto al peso corporal total, medido a las 3 semanas después del inicio del tratamiento con 16 mg/kg de doxorrubicina en ratones Balb/c con tumor. (C) Expresión de ARNm de Atrogin en el miocardio de ratones C57BL/6J una semana después del inicio del tratamiento con 24 mg/kg de doxorrubicina. (D) Expresión de ARNm de Murf1 en el miocardio de ratones C57BL/6J una semana después del inicio del tratamiento con 24 mg/kg de doxorrubicina. (E) Expresión de ARNm de NQO1 en el miocardio de ratones C57BL/6J una semana después del inicio del tratamiento con 24 mg/kg de doxorrubicina. (F) Expresión de ARNm de BAX en el miocardio de ratones C57BL/6J una semana después del inicio del tratamiento con 24 mg/kg de doxorrubicina. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando la t-test de Welch o la prueba U de Mann-Whitney, según correspondiera según la distribución de los datos. ns, P > 0,05; *P < 0,05; **P < 0,01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Raza de ratonesBalb/cC57Bl/6J
Línea celular utilizada4T1LucPY8119
Cantidad de células inyectadas200 000200 000
Sexo utilizadoMacho y hembraMacho y hembra
Número de días de inyección46
Dosis diaria4 mg/kg4 mg/kg
Dosis acumulada de doxorrubicina16 mg/kg24 mg/kg
Dosis de ketamina40 mg/kg80 mg/kg
Incidencia de cardiotoxicidad>90%>90%
Tasa de supervivencia19/4516/19

Tabla 1: Parámetros clave del protocolo para cada cepa de ratón. Comparación de las variables experimentales principales y las concentraciones de reactivos utilizadas en los protocolos con ratones Balb/c y C57BL/6J.

Tabla suplementaria 1: Puntos finales del bienestar animal. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 2: Resumen de la literatura sobre protocolos experimentales con 4T1. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 3: Parámetros ecocardiográficos medidos mediante modo M en 17 ratones C57BL/6J con tumor tratados con 24 mg/kg de doxorrubicina. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Aquí se desarrolló un modelo de cardiotoxicidad inducida por doxorrubicina en ratones con tumores mamarios, el cual se considera de gran relevancia clínica para futuros estudios en cardio-oncología. El objetivo fue imitar la situación clínica del trayecto de un paciente desde su llegada al hospital con un cáncer diagnosticado hasta el tratamiento con una quimioterapia potencialmente cardiotoxica. El protocolo sigue un diseño pragmático y utiliza ratones inmunocompetentes disponibles a nivel mundial, lo que permite a otros equipos reproducirlo en otros laboratorios. Su alta tasa de éxito en la implantación tumoral lo convierte en un candidato sólido para futuros estudios de toxicidad cardio-oncológica.

Entre las dificultades comunes de este protocolo se incluye realizar ecocardiografía en ratones con frecuencia cardíaca baja, lo cual puede provocar una fracción de acortamiento (FS) artificialmente baja. Permitir que los ratones se recuperen de los efectos cronotrópicos negativos iniciales de los anestésicos antes de la evaluación ecocardiográfica ayuda a garantizar mediciones precisas de FS. En ratones Balb/c, puede ser necesario reducir aún más la dosis de anestésico si la mortalidad sigue siendo alta. El mismo experimentador debe realizar todas las evaluaciones ecocardiográficas durante todo el estudio, ya que la variabilidad entre observadores puede ser significativa43. En cuanto a la implantación del tumor, retirar la jeringa durante la inyección puede producir un tumor con forma de línea, que podría crecer más que los tumores generados mediante una inyección adecuada. También es fundamental inyectar en el pezón mamario correcto, ya que la colocación en el pezón abdominal superior puede interferir con la evaluación ecocardiográfica en las etapas posteriores del desarrollo tumoral. Se recomienda el conteo manual de células en la suspensión y una mezcla exhaustiva antes de la inyección para asegurar que cada ratón reciba un número comparable de células, minimizando así la variación en el tamaño del tumor al final del protocolo. Cuando se requiere muestreo sanguíneo semanal, debe controlarse cuidadosamente el volumen recolectado, ya que los ratones se vuelven más frágiles tras el tratamiento con doxorrubicina. Se recomienda un volumen máximo total de sangre de 50 µL en cada punto de muestreo, ya que volúmenes mayores pueden aumentar la mortalidad durante el protocolo. La frecuencia y el volumen de la recolección de sangre también deben cumplir con los requisitos locales de ética animal y las directrices del comité institucional de manejo de animales. Reemplazar el volumen sanguíneo muestreado con un volumen equivalente de solución salina administrada por vía subcutánea puede ayudar a compensar la pérdida de líquidos tras la extracción de sangre.

Para comparar este procedimiento con doxorrubicina, una revisión publicada recientemente sobre modelos animales de cardiotoxicidad inducida por antraciclinas observó que la mayoría de los modelos preclínicos (88 %) utilizaron inyecciones repetidas de doxorrubicina y mediciones de los resultados (a menudo mediante ecocardiografía) varias semanas después29. La mayoría de los artículos informaron el uso de la cepa C57Bl/6J (73,8 %), probablemente debido a su robustez y bajo costo29. Desafortunadamente, un número significativo de estudios ignoró el impacto de un tumor sobre la biología del animal antes de inyectar las antraciclinas17,29. Solo 46 de los 736 estudios informaron modelos con tumores, 12 de ellos utilizaron la línea celular 4T1 (cáncer de mama tipo triple negativo) en ratones Balb/c, y solo uno fue un modelo de cáncer de mama en ratones C57Bl/6J (más específicamente cáncer de mama tipo positivo para EGFR2)29. Otro estudio utilizó C57Bl/6J con un cáncer de mama tipo positivo para EGFR-2, pero no permitió el crecimiento tumoral antes del inicio de la quimioterapia, lo que limita el aspecto traslacional de este modelo32.

Los modelos de xenoinjertos que utilizan ratones inmunodeficientes permiten el uso de líneas celulares tumorales humanas, pero carecen de un sistema inmunitario funcional, lo que limita el estudio de los mecanismos de cardiotoxicidad mediada por el sistema inmunitario y representa una limitación importante dada la creciente relevancia de la cardiotoxicidad relacionada con los inhibidores de puntos de control inmunitario. Los modelos de animales grandes están emergiendo en el campo de la cardio-oncología, pero siempre tendrán las desventajas de un alto costo y una capacidad limitada de ingeniería genética44. Los sistemas basados en células humanas in vitro y en 2D/3D (por ejemplo, cardiomiocitos derivados de iPSC humanas, organoides cardíacos) permiten cribados mecanicistas y toxicológicos de alto rendimiento, pero no pueden reproducir la fisiología integrada del organismo completo (hemodinámica, regulación neurohormonal, comunicación inmunitaria) que capturan los modelos in vivo. En comparación con estos enfoques, este modelo síngeo, inmunocompetente y portador de tumor ofrece un contexto más clínicamente relevante para estudiar la interacción entre la carga tumoral y la cardiotoxicidad inducida por la quimioterapia, a costa de una mayor variabilidad biológica, una mayor mortalidad en algunas cepas y un rendimiento inferior al de los modelos in vitro más simples o los modelos in vivo sin carga tumoral.

Los modelos de cardiotoxicidad sin tumor en AC, utilizados principalmente hasta la fecha, ofrecen alta reproducibilidad, bajo costo y evaluaciones más sencillas mediante ecocardiografía y supervivencia, pero no capturan los efectos sistémicos de la carga tumoral, la inflamación asociada al cáncer y la caquexia sobre el corazón, factores que se reconocen cada vez más como confundidores relevantes en la cardiotoxicidad de los pacientes17,45. Además, el reprogramamiento metabólico del corazón, y por tanto su función contráctil, puede alterarse por oncometabolitos secretados, como el D-2-hidroxiglutarato o el succinato14. Por lo tanto, si se desea construir un modelo cardio-oncológico para el análisis bioquímico cardíaco mediante diversas ómicas (por ejemplo, proteómica y metabolómica), la presencia del tumor antes de la quimioterapia es esencial. También existe cierta evidencia de que el tumor por sí solo puede inducir una disfunción cardíaca manifiesta, aunque esto no es consistente en la literatura. Mientras que algunos modelos han demostrado un efecto perjudicial de la inoculación tumoral sobre la fracción de acortamiento (FS) o los parámetros de conducción eléctrica, otros han encontrado que la presencia del tumor protege a los ratones del remodelado inducido por una constricción aórtica transversal11,13,46. También se requieren animales sin tumor, dependiendo de la hipótesis preliminar. Estos constituyen el único escenario en el que puede aislarse el efecto cardiotoxico directo del agente quimioterapéutico de la influencia confundidora del tumor mismo, un requisito esencial para establecer la causalidad y elucidar los mecanismos de acción específicos del fármaco. Estos animales servirán como controles para evaluar el efecto de la terapia anticancerígena y su interacción con el tumor en la cardiotoxicidad. Sin este comparador, sería imposible desentrañar qué componente del fenotipo cardíaco observado se debe al fármaco, al tumor o a su interacción. Esta distinción es crítica no solo para la comprensión mecanicista, sino también para el diseño racional de estrategias cardioprotectoras. Por lo tanto, es importante reconocer que cada uno de estos modelos aborda preguntas científicas distintas y complementarias, y que ninguno de los modelos por sí solo es suficiente para recapitular completamente la complejidad de la cardio-oncología clínica; a menudo se requiere un uso combinado o secuencial de ambos para obtener conclusiones mecanicistas y traslacionales sólidas.

En este protocolo, la cardiotoxicidad se definió según las Guías de la ESC de 2022 en cardio-oncología, que establecen la disfunción cardíaca relacionada con el tratamiento contra el cáncer moderada y asintomática como una reducción de la fracción de eyección del ventrículo izquierdo (LVEF) de >10% con una LVEF entre 40% y 49%16. Sin embargo, la cuantificación precisa de la LVEF requiere un módulo 3D en el ultrasonido39. Para evitar una evaluación incorrecta de la función cardíaca sistólica y mantener un protocolo sencillo que pueda implementarse en laboratorios que utilizan equipos de ultrasonido menos recientes, se prefirió utilizar la fracción de acortamiento (FS) como marcador de disfunción cardíaca, que se obtiene correctamente y con facilidad mediante análisis en modo M en ratones, con los mismos criterios establecidos por la ESC. Utilizando este protocolo, el 90% de los ratones supervivientes cumplen los criterios de cardiotoxicidad, lo que lo convierte en un fuerte candidato para futuros estudios traslacionales. El efecto cardiotoxico de la Dox se confirmó mediante evaluación macroscópica (disminución del peso cardíaco) en ratones Balb/c. En este estudio no se incluyó un grupo con solo tumor en ratones C57Bl/6; por lo tanto, aún no está disponible ninguna comparación en esta cepa. Además, en ratones C57Bl/6 sin tumor, la dosis de Dox indujo cambios consistentes con la literatura previa sobre los mecanismos de la cardiotoxicidad por antraciclinas: aumento de la atrofia, estrés oxidativo y apoptosis19,20.

Sin embargo, aquí no se cuantificaron, por razones técnicas, variables más modernas utilizadas en pacientes, como la deformación longitudinal global mediante seguimiento de puntos (GLS, por sus siglas en inglés). Si es factible localmente, sería de valor añadido cuantificar el GLS, ya que en general se considera más sensible para detectar daño cardíaco temprano23. También se pueden evaluar biomarcadores cardíacos circulantes, como la troponina, para mejorar la certeza en la detección de cardiotoxicidad; sin embargo, la cantidad de plasma tradicionalmente requerida para estos análisis en ratones puede ser un factor limitante debido al bajo volumen sanguíneo total que poseen estos animales. Además, la fragilidad de estos animales tras el tratamiento con Dox puede aumentar las tasas de mortalidad durante o después de la extracción de sangre. Un último factor limitante es la sensibilidad de estos ensayos para dichos biomarcadores, lo cual a menudo puede dificultar la interpretación.

Aunque el mismo experimentador experimentado realizó todas las adquisiciones de ultrasonido, se observó una alta variación de semana a semana en los mismos ratones Balb/c, incluso sin tratamiento. Esto puede explicarse por la sensibilidad de esta cepa a la anestesia con ketamina47. De hecho, inicialmente se observaron altas tasas de mortalidad durante los procedimientos con anestesia, lo que provocó que un número reducido de animales llegara al final del protocolo, lo cual condujo a una disminución de la dosis de ketamina utilizada, de 80 mg/kg a 40 mg/kg en ratones Balb/c. Al observar las gráficas de supervivencia de los ratones Balb/c con Dox, se aprecia que ocurre algo de mortalidad en el momento de la anestesia (ecocardiografía semanal), pero la mayoría de las muertes ocurren en el animalario sin ningún procedimiento activo, lo que destaca que la Dox es el principal factor contribuyente a la mortalidad en estos ratones. No obstante, es importante tener en cuenta la muerte relacionada con la anestesia al interpretar las gráficas de supervivencia de este modelo al comparar dos o más cepas. Para reducir el riesgo de fatalidad relacionada con la anestesia, también se podría realizar ecocardiografía en ratones conscientes, aunque esto requiere entrenamiento y aclimatación previa antes de incluir a los ratones en el protocolo. En cuanto a la Dox, incluso con dosis reducidas, casi la mitad de los ratones Balb/c no llegaron al final del protocolo. Se podría intentar inducir cardiotoxicidad con dosis aún más bajas de Dox, con el riesgo de reducir el número de animales que cumplan los criterios de cardiotoxicidad. Otra estrategia podría ser permitir más tiempo para que el animal se recupere después de cada inyección de Dox, lo cual no se realizó aquí, pero que cuenta con evidencia de mejora en la supervivencia en la literatura29.

Las observaciones realizadas al desarrollar este modelo, de que los ratones Balb/c son más sensibles a la doxorrubicina que los ratones C57Bl/6J, y de que las hembras son más resistentes a la doxorrubicina que los machos, están en concordancia con estudios previos29. Además, los resultados similares y reproducibles obtenidos en ambas cepas de ratones confirman aún más la robustez de este modelo propuesto. Al alcanzar dosis acumuladas altas mediante dosis diarias moderadamente elevadas durante un período corto de tiempo, se obtuvieron altas tasas de cardiotoxicidad con una elevada supervivencia. Desarrollar un modelo de cáncer de mama (PY8119 es un cáncer de mama similar al triple negativo) en C57Bl/6J será muy útil para estudios futuros, ya que estos ratones representan uno de los principales fondos genéticos para modelos transgénicos34. La alta tasa de éxito de las inoculaciones tumorales, que respalda la eficacia del método de inyección elegido, también es prometedora para este modelo. Asimismo, la alta tolerancia a la doxorrubicina de estos ratones abre la posibilidad de realizar estudios más prolongados con reexposiciones a doxorrubicina, para imitar la situación clínica frecuente de cáncer secundario o metástasis. Por último, el protocolo de muestreo de órganos permite la recolección de todos los órganos sólidos, tumores y su líquido intersticial, así como de médula ósea y su estroma, lo que posibilita un análisis muy exhaustivo del modelo.

Este modelo tiene algunas limitaciones. Debido a su diseño pragmático y para evitar cirugías invasivas, la ubicación precisa del tumor (es decir, la glándula mamaria correcta en lugar de la grasa subcutánea) no puede controlarse con exactitud mediante una inyección subcutánea, lo cual puede ser de gran importancia dependiendo de la pregunta científica que se esté estudiando48. Si se requiere una inyección en el sitio específico del cáncer, una cirugía más extensa podría ser más adecuada para realizar una inyección ortotópica, aunque esto parece tener verdadera relevancia principalmente si se planea un análisis bioquímico del tumor, ya que el volumen, la latencia y la incidencia presentan resultados similares independientemente del método de inyección48. También podría argumentarse que el uso exclusivo de AC no se correlaciona perfectamente con la situación clínica, en la que los pacientes a menudo reciben regímenes combinados, por ejemplo, ciclofosfamida o cisplatino. Esto podría ser efectivamente el siguiente diseño para este protocolo; sin embargo, la adaptación de la dosis para cada quimioterápico utilizado debería realizarse cuidadosamente. Además, una mortalidad superior al 50 % en ratones Balb/c tres semanas después del inicio del tratamiento con Dox sigue siendo muy alta; una reducción de la dosis podría mejorar la supervivencia, quizás a costa de una cardiotoxicidad menos pronunciada. Asimismo, respecto a las dosis utilizadas en este modelo, debe tenerse en cuenta que son más altas que las comúnmente utilizadas en humanos actualmente, lo cual podría limitar el potencial traslacional de este modelo.

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses con el manuscrito.

Agradecimientos

Agradecemos al equipo de la instalación de animales por su ayuda en el monitoreo diario del bienestar animal. Agradecemos a Léanne Borges, Elias Ait Assa y Clémence Chabaud por su ayuda en la elaboración del protocolo con animales. Por el obsequio de las células PY8119, agradecemos a la Dra. Julie Helft de la Unidad INSERM 932. Un agradecimiento especial al Dr. Sylvain Provost y a su estudiante Mel Gavens por su ayuda con la bioluminiscencia.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Células 4T1LucATCCCRL-2539
Polvo de doxorrubicinaCliniscience23214-92-8
EcocardiógrafoVisual SonicsVEVO LT-200
LuciferinaPerkin Elmer E1605
Malla de nailonMerckNY2002500
PhotonImager OptimaBioSpace Lab
Células PY8119Regalo del Dr. Julie Helft

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