Protocolo para la evaluación estandarizada de la función microvascular sistémica en la microcirculación cutánea humana mediante imagen láser de contraste de speckles

Summary

Este protocolo describe un método estandarizado y no invasivo para evaluar la función microvascular sistémica en la microcirculación cutánea humana utilizando imágenes láser de contraste de moteas combinadas con iontoforesis farmacológica y estímulos fisiológicos para evaluar la reactividad microvascular en entornos de investigación clínica.

Abstract

La imagen de contraste con moteas láser (LSCI) es una técnica óptica de alta resolución y no invasiva que permite la visualización en tiempo real y de campo completo de la perfusión sanguínea microvascular. Este protocolo presenta una metodología estandarizada para evaluar la función microvascular sistémica en la microcirculación cutánea humana utilizando LSCI. Dado que las mediciones obtenidas con esta técnica son muy sensibles a factores de confusión ambientales y fisiológicas, el protocolo enfatiza procedimientos estrictos de estandarización para mejorar la reproducibilidad y la fiabilidad experimental. El protocolo detalla controles ambientales esenciales, incluyendo la estabilización a temperatura ambiente a 23°C ± 1°C, la posición de los participantes, los procedimientos de aclimatación y la minimización de interferencias externas durante la adquisición de imágenes. La metodología integra la LSCI con dos maniobras provocativas complementarias para evaluar la reactividad microvascular cutánea. La hiperemia reactiva postoclusiva se utiliza para evaluar la reactividad microvascular integrada, mientras que los desafíos farmacológicos impulsados por iontoforesis se emplean para evaluar la función endotelial. Específicamente, se administra acetilcolina para evaluar la vasodilatación dependiente del endotelio, y se administra nitroprusido sódico para evaluar la vasodilatación independiente del endotelio. Este protocolo visualizado paso a paso está diseñado para facilitar la adopción de metodologías estandarizadas de LSCI en entornos de investigación clínica y traslacional. El enfoque se ha aplicado con éxito para identificar el deterioro microvascular en varias condiciones clínicas, incluyendo hipertensión resistente, diabetes y enfermedad de las arterias coronarias. Al permitir la evaluación reproducible y no invasiva de la reactividad microvascular, esta metodología proporciona una herramienta valiosa para investigar la salud vascular sistémica, monitorizar la progresión de la enfermedad y evaluar la eficacia de intervenciones dirigidas a la microvasculatura.

Introduction

El objetivo principal de este protocolo es proporcionar una metodología estandarizada y reproducible para evaluar la función y reactividad microvascular sistémica utilizando imagen láser con contraste de speckles (LSCI) junto con maniobras provocativas fisiológicas y farmacológicas. La microcirculación, compuesta por vasos sanguíneos terminales —arteríolas, capilares y vénulas— de aproximadamente 100 μm de diámetro¹, es el principal sitio de intercambio metabólico y un determinante crítico de la resistencia vascular^{periférica 2}. La disfunción endotelial en estos pequeños vasos suele preceder a las alteraciones macrovasculares y actúa como biomarcador temprano para enfermedades cardiovasculares, incluyendo hipertensión, diabetes y enfermedad de las arterias^{coronarias 3}. Es importante destacar que, aunque el deterioro microvascular contribuye significativamente al daño en los órganos terminales, actúa junto con la aterosclerosis macrovascular y la inflamación crónica sistémica dentro de un proceso patológico multifactorial. Por lo tanto, la evaluación no invasiva de la reactividad microvascular es esencial tanto para el diagnóstico precoz como para el seguimiento de la eficacia terapéutica en la investigación^{traslacional.}

La razón de ser para utilizar la microcirculación cutánea como sustituto de la salud vascular sistémica radica en su accesibilidad y su papel como ventana representativa de la función endotelial^{global 5,6}. Tradicionalmente, la fluidmetría Doppler láser (LDF) se ha considerado el estándar de oro para la evaluación cutánea^{no invasiva 7}. Sin embargo, la LDF está limitada por una baja resolución espacial porque proporciona mediciones puntuales que son altamente sensibles a la heterogeneidad inherente de la perfusión^{cutánea 8}. En cambio, el LSCI ofrece ventajas significativas al proporcionar visualización en tiempo real y de campo completo de la perfusión tisular con alta resolución temporal y espacial⁹. Al analizar el patrón de interferencia generado por la dispersión de luz láser, el LSCI permite la evaluación simultánea de múltiples regiones vasculares sin necesidad de contacto físico ni tintes^{exógenos 10,11}.

En la literatura más amplia, la integración de LSCI con provocaciones farmacológicas impulsadas por iontoforesis, como la acetilcolina (ACh) y el nitroprusido sódico (SNP), ha sido validada como un enfoque robusto para evaluar vías vasodilatatorias dependientes e independientes del endotelio^12,13. Además, la hiperemia reactiva postoclusiva (PORH) proporciona una evaluación integrada de la reactividad microvascular que involucra mediadores endoteliales, nervios sensoriales neurogénicos y función del músculo liso^{vascular 12}. A pesar de sus ventajas, la alta sensibilidad de las LSCI a la variabilidad ambiental y fisiológica requiere procedimientos estrictos de normalización. Este protocolo aborda estos desafíos detallando controles ambientales críticos, incluyendo la estabilización a temperatura ambiente a 23°C ± 1°C y la posición estandarizada de los participantes, para mejorar la reproducibilidad intrasujeto e^{intersujeto 10}. Esta metodología es adecuada para investigadores clínicos y traslacionales que buscan un enfoque metodológicamente fundamentado y no invasivo para investigar la fisiopatología microvascular en diversas poblaciones de pacientes.

Protocol

Todos los procedimientos que involucraron a participantes humanos se realizaron conforme a los estándares éticos del Instituto Nacional de Cardiología (Ministerio de Sanidad de Brasil), en cumplimiento de la normativa nacional (Comité Nacional de Ética para la Investigación – INAEP – según la Ley Nº 14.874, mayo de 2024) y la Declaración de Helsinki (revisada en 2024).

1. Preparación de los participantes y control ambiental

1. Estabilizar el entorno de examen
   1. Estabilizar la temperatura de la sala de examen (RT; 23°C ± 1°C) utilizando un termostato dedicado para mantener un entorno térmico estable.
   2. Monitoriza el RT cada 10 minutos usando un termómetro digital calibrado (precisión de ±0,1°C).
      NOTA: La función microvascular cutánea es muy sensible a las fluctuaciones de temperatura.
2. Prepara al participante antes de la evaluación
   1. Instruye a los participantes a abstenerse de fumar, consumir cafeína o alcohol y realizar ejercicio vigoroso durante 24 horas antes de la evaluación.
   2. Instruye a los participantes a ayunar al menos 2 horas antes de la evaluación permitiendo la ingesta de agua.
      NOTA: La abstinencia de cafeína y el ejercicio vigoroso minimizan la interferencia externa con el tono vascular cutáneo. La cafeína, como antagonista de los receptores de adenosina, y el ejercicio, a través de los efectos sobre el impulso simpático y la termorregulación, pueden inducir alteraciones sostenidas en la reactividad microvascular que persisten durante varias horas tras la exposición ^4,14.
3. Posiciona al participante para la adquisición de imágenes
   1. Coloca el brazo no dominante del participante a la altura del corazón usando cojines corporales para mantener el antebrazo en una posición horizontal y estable.
   2. Utiliza la superficie ventral del antebrazo como lugar de evaluación.
      NOTA: El antebrazo no dominante minimiza la influencia de la remodelación vascular lateralizada asociada a las actividades diarias. El antebrazo ventral proporciona características anatómicas favorables para la imagen óptica, incluyendo menor densidad de vello y menor grosor de la piel, minimizando así artefactos de señal y mejorando la reproducibilidad de la administración de fármacos iontoforéticos.
4. Permitir la estabilización cardiovascular
   1. Mantener al participante en reposo durante al menos 20 minutos antes de comenzar los registros microvasculares.
   2. Restringir al participante de hablar, mover la extremidad evaluada o usar dispositivos electrónicos durante el descanso.
      NOTA: El periodo de estabilización minimiza las fluctuaciones autonómicas y cardiovasculares antes de la adquisición basal.
5. Minimizar artefactos de movimiento
   1. Coloca el antebrazo no dominante del participante sobre un sistema de cojín de vacío.
   2. Ajusta el colchón para mantener la superficie ventral del antebrazo en una posición horizontal estable durante toda la adquisición de la imagen.
6. Prepara la superficie de la piel
   1. Selecciona zonas de piel sin vello visible para todas las medidas.
   2. Elimina el vello con una máquina de cortar el pelo quirúrgico 24 horas antes de la evaluación cuando sea necesario.
      PRECAUCIÓN: No uses una maquinilla para la depilación porque la irritación de la piel puede interferir con las mediciones microvasculares.
7. Mide la presión arterial arterial
   1. Selecciona el tamaño del puño según la circunferencia del brazo del participante.
   2. Realizar tres mediciones consecutivas de presión arterial utilizando un dispositivo oscilométrico automático calibrado con un intervalo de 1 minuto entre mediciones.
   3. Descarta la primera medición y calcula la media de las dos últimas mediciones para determinar la presión arterial media (MAP), según las directrices cardiovasculares de ESC/ESH y AHA.

2. Configuración del sistema LSCI y configuración de software

1. Preparar el sistema LSCI
   1. Encienda el sistema LSCI al menos 10 minutos antes de la adquisición de imagen para permitir la estabilización de la fuente láser.
   2. Verifica la estabilización láser usando el indicador de estado del software antes de iniciar la grabación.
2. Posiciona la cabeza láser
   1. Coloca la cabeza láser directamente sobre el antebrazo del participante.
   2. Ajusta la cabeza láser a una distancia exacta de 15 cm de la superficie de la piel usando la herramienta de medición de distancia proporcionada por el fabricante (Figura 1A)
      NOTA: Mantener una distancia fija de adquisición garantiza un enfoque óptimo de la imagen y un campo de visión consistente entre los participantes.
3. Configurar el software de adquisición
   1. Inicia el software de adquisición de imágenes y crea un nuevo archivo de estudio.
   2. Introduce la información demográfica del participante y el MAP calculado previamente.
      NOTA: Incluye instrucciones detalladas de funcionamiento del software y capturas de pantalla representativas como material complementario cuando corresponda.
4. Configurar los parámetros de adquisición
   1. Establece la tasa de muestreo de adquisición a 1 imagen/s (1 Hz).
   2. Ajusta la resolución espacial a aproximadamente 0,1 mm/píxel para el área de adquisición del objetivo.
      NOTA: Una frecuencia de muestreo de 1 Hz proporciona un equilibrio adecuado entre la resolución temporal y la relación señal-ruido, capturando adecuadamente la cinética de respuesta hiperémica y farmacológica.
5. Minimizar la interferencia de la luz ambiental
   1. Realiza una comprobación de ruido de fondo o una resta de fotograma oscuro según los requisitos del sistema antes de adquirir la imagen.
   2. Atenua las luces de la habitación y bloquea la luz solar externa usando cortinas opacas durante todas las grabaciones cuando no haya rescesta de fotograma oscuro.
      NOTA: La iluminación ambiental estandarizada minimiza las interferencias ópticas y mejora la reproducibilidad de la señal.
6. Definir las regiones de interés (ROI)
   1. Crea al menos tres retornos de inversión circulares de aproximadamente 80^mm2 en la pantalla de vista previa en vivo dentro del software de adquisición.
   2. Coloca dos ROI sobre los sitios de electrodos de iontoforesis y un ROI sobre el sitio de evaluación PORH.
   3. Colocar todos los ROI en el antebrazo ventral, aproximadamente 5 cm distales a la fosa antecubital, evitando venas superficiales visibles.
      NOTA: Estandarizar el área ROI minimiza la influencia de la heterogeneidad espacial en la perfusión cutánea y reduce los artefactos de borde asociados a las cámaras de administración de fármacos.
7. Obtener el registro base de perfusión
   1. Registrar perfusión sanguínea cutánea en reposo de forma continua durante 5 minutos antes de la estimulación vascular.
   2. Monitorizar la señal de perfusión en tiempo real y confirmar la ausencia de picos inducidos por el movimiento durante la adquisición basal.
   3. Defina la estabilidad de línea base como una variación de la señal de perfusión del <10% durante un intervalo continuo de 2 minutos.
8. Permitir el análisis de conductancia vascular cutánea (CVC)
   1. Introduce el MAP del participante en el software de adquisición.
   2. Activa el cálculo automático de CVC dentro de la configuración del software.
9. Registrar datos de perfusión y conductancia
   1. Configura el software para calcular CVC automáticamente dividiendo los valores de perfusión en tiempo real (APU) entre MAP.
   2. Registrar simultáneamente ambas unidades de perfusión bruta (PU) y los valores calculados de CVC a lo largo del protocolo.
      
      NOTA: Expresar perfusión microvascular como CVC minimiza la influencia confusa de las fluctuaciones sistémicas de la presión arterial y permite comparaciones más fiables entre participantes con diferentes perfiles hemodinámicos.

Figura 1. Montaje experimental para la evaluación de la perfusión microvascular cutánea utilizando imagen láser de contraste de moteas (LSCI) combinada con iontoforesis. (A) Montaje experimental representativo utilizado para la evaluación microvascular cutánea mediante imagen láser de contraste de motas y iontoforesis de agentes vasodilatadores. (B) Respuesta representativa de perfusión microvascular durante la administración iontoforética transdérmica de dosis acumuladas de acetilcolina (ACh). (C) Imagen representativa de la iontoforesis ACh. (D) Imagen representativa de un electrodo de control que contiene vehículo. Las etiquetas indican los siguientes componentes: (1) cabeza del imerador; (2) electrodos de administración de fármacos por iontoforesis; y (3) electrodo dispersivo. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

3. Iontoforesis y provocación farmacológica

1. Prepara la piel para la iontoforesis
   1. Limpia las zonas ventrales seleccionadas de la piel del antebrazo usando una solución salina sin alcohol o un limpiador suave para la piel.
   2. Seca suavemente la piel antes de colocar el electrodo.
      NOTA: Evitar una estimulación mecánica excesiva durante la preparación de la piel porque la vasodilatación inducida mecánicamente puede interferir con las mediciones basales.
2. Posicionar los electrodos de administración del fármaco
   1. Fije dos electrodos de administración de fármacos en los sitios cutáneos preparados utilizando discos adhesivos de doble cara (Figura 1A).
   2. Mantener una distancia entre electrodos de aproximadamente 5 cm para evitar interferencias de corriente eléctrica.
3. Prepara la solución ACh
   1. Llenar la primera cámara de electrodos con 200 μL de una solución al 2% de ACh preparada en solución al 0,9%^{de solución salina 14,15}.
   2. Utiliza el electrodo ACh para evaluar la vasodilatación dependiente de endotelio.
      NOTA: La concentración seleccionada del fármaco se optimizó para inducir una respuesta microvascular robusta y dependiente de la dosis, minimizando la irritación inespecífica y los artefactos galvánicos.
4. Preparar la solución SNP
   1. Llenar la segunda cámara de electrodos con 200 μL de una solución de SNP al 2% preparada en solución salina al 0,9%.
   2. Utiliza el electrodo SNP para evaluar la vasodilatación independiente del endotelio.
      PRECAUCIÓN: SNP es fotosensible. Protege la solución de la exposición a la luz con papel de aluminio y utiliza la solución en un plazo de 4 horas tras la preparación para mantener la estabilidad farmacológica.
      NOTA: La concentración seleccionada de SNP facilita una vasodilatación estable de la meseta minimizando los efectos eléctricos inespecíficos.
5. Eliminar las burbujas de aire atrapadas
   1. Inspecciona las cámaras de electrodos en busca de burbujas de aire atrapadas antes de la fijación de la piel.
   2. Elimina las burbujas de aire visibles tocando suavemente la cámara del electrodo o usando una punta de jeringuilla de plástico estéril.
      NOTA: Las burbujas de aire pueden obstruir el flujo de corriente y producir una administración no homogénea de fármacos.
6. Posiciona el electrodo de referencia
   1. Fije el electrodo de referencia (neutro) aproximadamente a 15 cm proximal de los electrodos de administración del fármaco utilizando gel conductor o adhesivo (Figura 1A).
   2. Confirma el contacto estable del electrodo antes de iniciar la iontoforesis.
      NOTA: La separación espacial entre las regiones farmacológicas y las de evaluación de PORH minimiza las interacciones de confusión y evita la superposición del brote reflejo axónico inducido por ACh con el área de medición de PORH.
7. Conecta el sistema de iontoforesis
   1. Conecte todos los electrodos a la unidad de administración de iontoforesis antes de la aplicación actual.
   2. Confirma la polaridad del electrodo antes de iniciar el protocolo (anodal para ACh; cátodo para SNP).
      PRECAUCIÓN: Una polaridad incorrecta del electrodo puede afectar la eficiencia de la administración del fármaco y alterar las respuestas vasculares.
8. Administrar el protocolo actual de iontoforesis
   1. Administrar seis dosis incrementales de corriente de 30, 60, 90, 120, 150 y 180 μA para ambos agentes farmacológicos.
   2. Aplica cada dosis actual durante 10 segundos.
      NOTA: El protocolo de corriente incremental permite la construcción de una curva dosis-respuesta y facilita la evaluación de la sensibilidad microvascular y las respuestas al^{estancamiento 11}. La combinación de bajas amplitudes de corriente e intervalos de estimulación cortos minimiza la vasodilatación galvánica inespecífica.
9. Mantén el intervalo entre estimulaciones
   1. Mantén un intervalo de 60 s entre aplicaciones de corriente consecutivas.
   2. Monitoriza la señal de perfusión durante el periodo de estabilización entre dosis.
      NOTA: El intervalo seleccionado permite estabilizar la respuesta microvascular manteniendo la administración local del fármaco sin efectos sistémicos.
10. Registrar la respuesta microvascular
    1. Registra la señal de perfusión microvascular de forma continua durante todas las estimulaciones de iontoforesis.
    2. Continúa la grabación durante al menos 10 minutos después de la última aplicación actual para capturar la respuesta máxima de meseta. Una respuesta representativa dependiente de la dosis se muestra en la Figura 2A.

Figura 2. Registros representativos de la perfusión microvascular cutánea durante la iontoforesis y la hiperemia reactiva postoclusiva (PORH). (A) Registro representativo del flujo sanguíneo microvascular cutáneo obtenido usando LSCI durante la iontoforesis del 2% de ACh administrado mediante corrientes anodales crecientes de 30, 60, 90, 120, 150 y 180 μA durante intervalos de 10 s separados por 1 min. (B) Registro representativo obtenido durante la evaluación de PORH. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

4. Hiperemia reactiva postoclusiva (PORH)

1. Coloca el manguito de oclusión
   1. Colocar un manguito neumático estándar (de aproximadamente 12 cm de ancho) en la parte superior del brazo de la misma extremidad utilizada para la grabación LSCI.
   2. Coloca el manguito proximal al lugar de evaluación microvascular seleccionado.
2. Definir la región de evaluación PORH
   1. Crea un tercer ROI en el antebrazo ventral, adyacente a los sitios del electrodo de iontoforesis.
   2. Coloca el ROI dentro de una zona cutánea libre de tratamiento para evitar interferencias farmacológicas.
      NOTA: Mantener la separación espacial entre los sitios de estimulación farmacológica y la región de evaluación PORH para preservar respuestas vasculares independientes.
3. Adquirir la grabación de la línea base del PORH
   1. Registrar perfusión cutánea en reposo de forma continua durante 5 minutos antes de la oclusión arterial.
   2. Monitoriza la señal de perfusión basal para confirmar la estabilidad antes de inflar el manguito.
4. Inducir oclusión arterial
   1. Infla el manguito neumático rápidamente en < 5 segundos usando un inflador automático o una bombilla de inflado manual.
   2. Aumentar la presión en el manguito a 50 mmHg por encima de la presión arterial sistólica (SBP) previamente medida por el participante.
      PRECAUCIÓN: Confirme la oclusión arterial completa antes de iniciar el periodo de oclusión, ya que la oclusión incompleta puede comprometer la respuesta hiperémica.
5. Mantener el periodo de oclusión
   1. Mantén la oclusión arterial de forma continua durante exactamente 3 minutos.
   2. Verifica la oclusión completa confirmando que la señal LSCI disminuye hasta un estancamiento biológico cero (< 10 APU).
      NOTA: La señal biológica cero refleja el movimiento residual de las células sanguíneas independientemente del flujo sanguíneo dirigido, incluido el movimiento browniano.
6. Suelta el manguito de oclusión
   1. Libera la presión del manguito instantáneamente usando la válvula de escape rápido.
   2. Permite la restauración inmediata del flujo sanguíneo para iniciar la respuesta hiperémica reactiva.
7. Registrar la respuesta hiperémica
   1. Continúa la grabación LSCI durante al menos 5 minutos después de soltar el manguito.
   2. Capturar la respuesta máxima a la perfusión y el posterior retorno a los niveles basales de perfusión. Una respuesta representativa de PORH se muestra en la Figura 2B.
8. Cuantificar la respuesta PORH
   1. Calcula el pico de CVC dentro del software de adquisición de imágenes.
   2. Calcula el área bajo la curva (AUC) de la señal de respuesta hiperémica utilizando el software de análisis.

5. Extracción de datos y análisis estadístico

1. Abrir y verificar los datos registrados
   1. Abre los archivos de adquisición grabados usando el software de análisis de imágenes.
   2. Verifica que todos los ROI predefinidos permanezcan correctamente posicionados sobre los sitios de medición correspondientes.
      NOTA: Los ROI de reposición solo cuando los artefactos de movimiento o la deriva de adquisición comprometen la colocación original.
2. Definamos los intervalos de análisis
   1. Identificar los intervalos de análisis específicos en los gráficos de tendencia de perfusión y CVC.
   2. Seleccione un intervalo base continuo de 60 s inmediatamente antes del primer estímulo vascular.
   3. Selecciona los últimos 30 segundos de cada intervalo de 60 segundos tras la estimulación por iontoforesis para capturar la respuesta microvascular de la meseta.
      NOTA: Defina la estabilidad de la línea base como un coeficiente de variación (CV) < 5% en la señal de perfusión para minimizar la influencia de oscilaciones vasomotoras y artefactos de movimiento antes del análisis de datos.
3. Identificar variables de respuesta PORH
   1. Identificar la señal biológica cero durante la fase de oclusión arterial del protocolo PORH.
   2. Identifica el valor máximo de CVC inmediatamente después de la liberación del manguito.
4. Calcular los valores medios de los intervalos
   1. Calcula el valor medio de CVC para cada intervalo de análisis predefinido utilizando el software de análisis de imágenes.
   2. Verifica la ausencia de artefactos de movimiento antes de confirmar los valores calculados finalmente.
5. Organizar los datos extraídos
   1. Exporta o transcribe manualmente la media de la PU en bruto y la media de valores CVC a una hoja de cálculo estructurada.
   2. Organizar el conjunto de datos según grupos de estudio y estímulos vasculares, incluyendo acetilcolina, nitroprusido sódico y respuestas a PORH.
      NOTA: Mantener la coherencia de nombres de archivos y códigos de identificación de participantes durante el procesamiento de datos para minimizar errores de transcripción.
6. Calcular los resultados vasculares secundarios
   1. Calcular el porcentaje de aumento respecto a los valores basales de perfusión o CVC para determinar la reactividad vascular.
   2. Calcular el AUC cuando sea necesario para el análisis de puntos finales secundarios.
7. Realizar análisis estadísticos
   1. Analiza los datos utilizando un software de análisis estadístico.
      NOTA: Incluir capturas de pantalla representativas o instrucciones de flujo de trabajo para análisis basados en software como material complementario cuando sea aplicable.
   2. Evaluar la distribución de los datos
      1. Evalúa la normalidad de los datos usando la prueba de Shapiro-Wilk.
      2. Expresa los datos distribuidos normalmente como media ± desviación estándar (SD).
      3. Expresa los datos no distribuidos normalmente como rango mediano e intercuartílico (IQR).
   3. Comparar las respuestas microvasculares
      1. Comparar conjuntos de datos de dos grupos utilizando una prueba t independiente cuando se cumplen las suposiciones de normalidad.
      2. Compara varios grupos usando ANOVA unidireccional seguida de la prueba post-hoc de Tukey.
   4. Definir criterios de significación estadística
      1. Define la significación estadística como p < 0,05.
      2. Gestiona los datos faltantes causados por artefactos de movimiento usando eliminación por pares o exclusión del análisis afectado.
         NOTA: Aplicar la misma estrategia de datos faltantes de forma coherente en todos los grupos de estudio para preservar la integridad analítica.

Results

La aplicación exitosa de este protocolo produce una línea base estable seguida de respuestas microvasculares claras y distinguibles a cada estímulo vascular. En un experimento técnicamente exitoso, el registro de referencia demuestra una señal de perfusión estable con fluctuaciones mínimas, definida como un DE de < 10% de la señal media. Durante la iontoforesis de ACh y SNP, se espera un aumento progresivo de la APU, reflejando vasodilatación dependiente de la dosis. Una respuesta exitosa de PORH se caracteriza por una rápida reducción de la perfusión hasta un cero biológico estable durante la oclusión arterial, seguida de un pico hiperémico agudo inmediatamente después de la liberación del manguito, que normalmente alcanza valores varias veces superiores a los niveles basales en sujetos sanos. La Figura 1A ilustra el montaje experimental utilizado para la evaluación microvascular cutánea mediante LSCI e iontoforesis. Las figuras 1B–1D muestran respuestas representativas de iontoforesis y posicionamiento de electrodos. La Figura 2A presenta una respuesta microvascular representativa dependiente de la dosis durante la iontoforesis ACh, mientras que la Figura 2B demuestra una respuesta representativa de PORH.

Las grabaciones subóptimas o técnicamente fallidas suelen caracterizarse por inestabilidad de señales o artefactos relacionados con el movimiento. Los picos de alta frecuencia o las fluctuaciones abruptas de la línea base suelen indicar movimiento del participante o una estabilización insuficiente del sistema de soporte de cojín de vacío. Una respuesta vasodilatora reducida o ausente durante la iontoforesis en un participante sano suele indicar un mal contacto electrodo-piel o burbujas de aire atrapadas dentro de la cámara del electrodo, lo que provoca una entrega de corriente eléctrica deteriorada. La Figura 3 presenta un ejemplo representativo de una grabación inaceptable caracterizada por inestabilidad de señal relacionada con el movimiento.

Figura 3. Ejemplo representativo de un registro inaceptable de perfusión microvascular durante la iontoforesis. Registro representativo del flujo sanguíneo microvascular cutáneo obtenido mediante LSCI durante la iontoforesis ACh que demuestra inestabilidad de señal y artefactos relacionados con el movimiento no aptos para análisis cuantitativo. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

No lograr un cero biológico estable durante la fase de oclusión de PORH indica oclusión arterial incompleta, comúnmente causada por una posición incorrecta del manguito o una presión insuficiente de inflado del manguito. Bajo estas condiciones, la respuesta hiperémica resultante se atenua y no es adecuada para una interpretación fiable.

Los protocolos ejecutados con éxito generan curvas reproducibles de perfusión y CVC. La meseta máxima del CVC observada durante la iontoforesis SNP refleja la capacidad vasodilatora total y la integridad estructural vascular, mientras que la respuesta mediada por ACh refleja principalmente la función microvascular dependiente del endotelial. La comparación estandarizada de estas respuestas vasculares permite diferenciar entre patrones compatibles con la función microvascular preservada y deteriorada. En la Tabla 1 se presentan parámetros microvasculares cuantitativos representativos obtenidos de sujetos jóvenes sanos y pacientes con hipertensión arterial resistente.

Parámetro microvascular	Unidad	Controles Jóvenes Saludables (n = 25)	Pacientes con hipertensión arterial resistente (n = 50)	valor p
CVC base	APU/mmHg	0,37 ± 0,13	0,29 ± 0,12	0.01
CVC pico inducido por ACh	APU/mmHg	0,67 ± 0,23	0,51 ± 0,19	0.004
CVC pico inducido por SNP	APU/mmHg	0,60 ± 0,21	0,41 ± 0,17	0.0003
PORH Peak CVC	APU/mmHg	0,87 ± 0,18	0,60 ± 0,16	< 0,0001

Tabla 1: Parámetros representativos de reactividad microvascular en sujetos jóvenes sanos y pacientes con hipertensión arterial resistente. Los valores se expresan como media ± desviación estándar (DE). Los valores p se calcularon mediante una prueba t independiente para comparaciones entre grupos. Abreviaturas: ACh, acetilcolina; SNP, nitroprusido sódico; PORH, hiperemia reactiva post-oclusiva; CVC, conductancia vascular cutánea; APU, unidades arbitrarias de perfusión. Los datos representan resultados no publicados del laboratorio de los autores.

Discussion

La LSCI ofrece un enfoque estandarizado y no invasivo para evaluar la función microvascular sistémica con alta resolución espacial y temporal. En comparación con el LDF, que se limita a mediciones puntuales y es muy sensible a la heterogeneidad espacial de la perfusión cutánea, el LSCI permite la obtención de imágenes de campo completo y la evaluación simultánea de múltiples ROIs. Esta característica mejora sustancialmente la reproducibilidad de la medición y reduce el coeficiente de variación en los estudios clínicos microvasculares. Además, la naturaleza libre de contacto de la LSCI minimiza los artefactos de presión local comúnmente asociados a técnicas basadas en sondas, mejorando su idoneidad para evaluaciones repetidas en entornos de investigación traslacional y clínica.

Un componente crítico de este protocolo es la normalización de los datos de perfusión a MAP para calcular CVC. Dado que la perfusión cutánea de sangre está fuertemente influenciada por la presión sistémica de perfusión, la interpretación de la UPA sin tratar sola puede provocar una confusión significativa, especialmente en poblaciones con perfiles hemodinámicos alterados como hipertensión o dislipidemia. Por esta razón, el protocolo recomienda informar tanto de PU bruta como de valores CVC normalizados para mejorar la interpretación de la función microvascular bajo diferentes condiciones fisiológicas y patológicas. Otro aspecto crítico del protocolo es la estricta estabilización ambiental y del participante, incluyendo el control de la temperatura ambiente, la minimización de artefactos de movimiento y la posición estandarizada de los participantes, todos ellos esenciales para lograr grabaciones reproducibles.

También deben considerarse varias limitaciones de la LSCI. La técnica evalúa principalmente la microcirculación cutánea superficial a una profundidad de aproximadamente 0,5–1 mm y, por tanto, puede no representar completamente lechos vasculares más profundos. Además, la pigmentación de la piel y la interferencia de la luz ambiental pueden afectar la relación señal-ruido, reforzando la importancia de los controles ambientales descritos en este protocolo. Otra limitación es el uso de una única medición base de MAP para el cálculo de CVC durante todo el procedimiento. Aunque la presión arterial sistémica puede fluctuar durante el periodo de grabación de aproximadamente 40 minutos, se evitó intencionadamente la inflación repetida de los manguitos porque las mediciones recurrentes de la presión arterial pueden inducir la activación simpática y artefactos de movimiento que interfieren con la señal del speckle. Futuros estudios que integren el seguimiento hemodinámico continuo y no invasivo podrían mejorar aún más la interpretación fisiológica de las mediciones de conductancia microvascular.

Los pasos críticos del protocolo incluyen estabilización ambiental, control de movimiento, posicionamiento de electrodos y oclusión arterial completa durante la PORH. Los registros inestables de la línea base suelen ser causados por movimientos de los participantes o periodos de reposo insuficientes y pueden minimizarse reestabilizando el sistema de cojín de vacío y prolongando el periodo de aclimatación. Las respuestas iontoforéticas embotadas a menudo indican un mal contacto electrodo-piel o burbujas de aire atrapadas dentro de la cámara de entrega; El relleno cuidadoso de la cámara y el reposicionamiento de electrodos generalmente resuelven estos problemas. El fracaso en alcanzar cero biológico durante la fase de oclusión de PORH suele reflejar una oclusión arterial incompleta causada por una inflación inadecuada del manguito o una posición incorrecta del manguito. Bajo estas condiciones, la respuesta hiperémica resultante se atenua y resulta inadecuada para una interpretación fiable.

La integración de provocaciones fisiológicas y farmacológicas representa una fortaleza importante de este protocolo, ya que estos enfoques evalúan aspectos complementarios de la regulación microvascular. PORH proporciona una evaluación fisiológica integrada de la reactividad microvascular que involucra los mecanismos del músculo liso endotelial, neurogénico y vascular desencadenados por isquemia transitoria y esfuerzo^{cortante 16}. En cambio, la iontoforesis permite la evaluación selectiva de vías vasodilatorias endotelial y endoteliales^{independientes 15}. La ACh evalúa la vasodilatación mediada por óxido nítrico dependiente de endotelial, mientras que SNP, un donante directo de óxido nítrico, evalúa la respuesta del músculo liso vascular independientemente de la señalización^{endotelial 15}. La interpretación comparativa de estas respuestas permite diferenciar entre el deterioro endotelial funcional y la remodelación microvascular estructural. Esta distinción es especialmente relevante en envejecimiento, hipertensión resistente, diabetes y enfermedades metabólicas crónicas, donde la señalización endotelial deteriorada y la rarefacción microvascular pueden^{coexistir 14,17}.

En resumen, este protocolo estandarizado de LSCI proporciona un método reproducible y relevante para la traducción para la evaluación no invasiva de la salud microvascular humana. La combinación de iontoforesis farmacológica con pruebas fisiológicas de isquemia-reperfusión permite caracterizar detalladamente la función endotelial y vascular estructural, minimizando la variabilidad experimental mediante una rigurosa estandarización ambiental y hemodinámica. Dada su sensibilidad para detectar la disfunción microvascular temprana en diversos trastornos cardiovasculares y metabólicos, este enfoque representa una herramienta valiosa para la investigación clínica, el seguimiento longitudinal y la evaluación terapéutica en medicina vascular traslacional.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipo
Monitor Oscilométrico Automático de BP	Omron Healthcare	HEM-7120	Utilizado para la evaluación de la presión arterial media (MAP) de referencia (3 mediciones)
Termómetro Digital Calibrado	Delta OHM	HD2301.0	Precisión y plusmn; 0,1 y grado; C para monitorización de la temperatura ambiente
Electrodo dispersivo (Referencia)	Perimed AB	PF 384	Gran electrodo neutro de área superficial
Electrodos de administración de fármacos	Perimed AB	PF 383 / LI 611	Cámaras de iontoforesis no invasivas (aproximadamente 80 mm²)
Controlador de Potencia por Iontoforesis	Perimed AB	Sistema de diagnóstico microvascular PeriOntal	Controlador de corriente de doble canal (hasta 200 y micro; A)
Sistema de Imagen de Contraste por Láser de Speckles (LSCI)	Perimed AB	PeriCam PSI NR	Sensor de perfusión sanguínea de alta resolución
Cojín de vacío de grado médico	AB Germa	N/A	Utilizado para una posición estable del antebrazo a nivel del corazón
Bomba de vacío manual	AB Germa	N/A	Utilizado para la evacuación de cojines de vacío
Inflador rápido de manguito	D.E. Hokanson, Inc.	Inflador rápido de puño E20	Usado para oclusión arterial estandarizada de 3 minutos
fuertes
Cloruro de acetilcolina (ACh)	Sigma-Aldrich	A6625	Vasodilatador dependiente de endotelio preparado al 2%
Pads para preparar alcohol	Becton Dickinson	326895	Almohadillas de alcohol isopropílico al 70% para la preparación de la piel
Agua desionizada	Sigma-Aldrich	38796	Utilizado para el enjuague final de electrodos
Cloruro de sodio (0,9% solución salina)	Proveedor local	N/A	Disolvente para la preparación de fármacos y limpieza de la piel
Nitroprusia Sódica (SNP)	Sigma-Aldrich	S0501	Vasodilatador independiente del endotelio preparado al 2%
Gasa estéril	Proveedor local	N/A	Se utiliza para secar la superficie de la piel tras la limpieza
Software
Software de análisis de perfusión	Perimed AB	PIMSoft	Software para adquisición de datos LSCI y análisis de ROI
Software de Análisis Estadístico	GraphPad Software	Prisma 10	Utilizado para el ajuste de la curva dosis-respuesta y el cálculo de área bajo la curva (AUC)