Este protocolo demuestra la ablación láser transvesical Ho:YAG para crear un modelo reproducible en rata de fibrosis del cuello de la vejiga para estudiar la remodelación fibrótica inducida por lesión térmica y las intervenciones terapéuticas.
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Artículo de método
Inducción asistida por láser de la contractura del cuello de la vejiga en un modelo de rata
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Resumen
Resumen
La contractura del cuello de la vejiga (BNC) es un estrechamiento fibrótico de la salida de la vejiga y una complicación desafiante tras la resección transuretral de la próstata (RTUP). Los modelos animales existentes suelen depender de la ligadura extravesical o la cauterización química, que no reproducen adecuadamente la fibrosis causada por lesión térmica que se desarrolla tras la cirugía endoscópica y pueden mostrar una reproducibilidad limitada. Aquí describimos un modelo en rata de fibrosis del cuello de la vejiga inducida por la ablación transvesical con láser Holmium:YAG (láser Ho:YAG) del cuello de la vejiga. Tras una pequeña laparotomía de la línea media inferior y una cistotomía, se introduce una fibra láser Ho:YAG de 200 μm en la luz de la vejiga bajo visualización directa. La energía láser se entrega en modo contacto a 1,0 J y 10 Hz durante 5 s por punto en las posiciones 3 y 9 en punto del cuello de la vejiga, lo que corresponde a 50 J por punto y 100 J por animal. Cuatro semanas después, los animales tratados presentan un agrandamiento macroscópico de la vejiga, estrechamiento del cuello, engrosamiento de la pared de la vejiga y evidencia histológica de remodelación fibrótica, incluyendo aumento de la deposición de colágeno y mayor expresión de colágeno tipo I y III. Este protocolo proporciona un modelo práctico que imita las cicatrices localizadas inducidas por lesión térmica en la salida de la vejiga. Dado que se utilizan ratas hembras y no se realizaron pruebas urodinámicas funcionales en el estudio actual, el modelo es más adecuado para estudiar la fibrosis del cuello y la remodelación estructural de la vejiga, en lugar de reproducir completamente la BNC en machos tras cirugía prostática. El modelo puede ser útil para estudiar los mecanismos fibróticos de la CNB y para la evaluación preclínica de intervenciones antifibróticas o reconstructivas.
Introducción
La contractura del cuello de la vejiga (BNC) es un estrechamiento fibrótico del cuello de la vejiga que suele ocurrir tras procedimientos transuretrales, especialmente la RTUP 1,2,3. Su base patológica es la formación excesiva de cicatrices y la deposición de colágeno tras una lesión tisular y una cicatrización anormal de heridas 4,5,6. Dado que la BNC puede provocar disfunción urinaria persistente, intervenciones recurrentes y morbilidad sustancial, se necesita un modelo experimental reproducible para investigar su patogénesis ytratamiento 7.
Se han utilizado varios modelos animales para estudiar la obstrucción de la salida de la vejiga o la fibrosis periuretral, incluyendo la ligadura extravesical de la uretraproximal 8 y otros enfoques quirúrgicosabiertos 9. Aunque estos modelos pueden inducir obstrucción urinaria e hipertrofia del detrusor, no reproducen específicamente la lesión térmica localizada que se cree que inicia la CNB postoperatoria tras la cirugía endoscópica. Además, el objetivo anatómico y el grado de lesión suelen ser difíciles de estandarizar, lo que puede aumentar la variabilidad entre animales.
Un modelo ideal relacionado con BNC debe cumplir tres criterios: debe dirigirse al cuello anatómico de la vejiga, reproducir lesiones térmicas controladas similares a las producidas por dispositivos energéticos endoscópicos y generar estrechamiento fibrótico con una complejidad quirúrgica aceptable. Para atender estas necesidades, desarrollamos un protocolo transvesical basado en láser Ho:YAG en ratas hembras. Se seleccionaron animales hembras para facilitar la exposición quirúrgica y aislar la lesión térmica específica del cuello y la remodelación fibrótica de la vejiga sin interferencia del tejido prostático. Mediante visualización intravesical directa, este método permite la entrega precisa de energía láser a la vejiga, cuello, mucosa y submucosa y produce un estrechamiento fibrótico reproducible de la salida de la vejiga.
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Protocolo
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal del Comité de Ética en Bienestar Animal Experimental del Instituto de Medicina Tradicional China de Pekín (Número de Aprobación). BJTCM-R-2025-03-02). Los animales se alojaban bajo condiciones estándar con acceso ad libitum a comida y agua. En el protocolo actual, se utilizaron un total de 16 ratas, incluyendo 8 ratas en el grupo de control sin cirugía y 8 en el grupo tratado con láser Ho:YAG. Dos animales del grupo tratado con láser Ho:YAG murieron postoperatoriamente. No se excluyeron animales adicionales debido a perforación, sangrado severo o fallida inducción del modelo.
1. Preparación preoperatoria
- Prepara meloxicam de grado farmacéutico para analgesia perioperatoria (Figura 1A), el sistema de anestesia inhalada para pequeños animales (Figura 1B), el sistema láser Ho:YAG con fibra láser de 200 μm (Figura 1C), instrumentos microquirúrgicos estériles (Figura 1D), 8-0 Suturas trenzadas absorbibles (ácido poliglicólico recubierto, PGA) para cierre de cistotomías, suturas de poliglactina 910 trenzadas absorbibles 4-0 para cierre de la piel, solución fisiológica estéril, colchóns estériles y lubricante estéril (Figura 1E).
- Inducir anestesia con isoflurano al 3%–4% en oxígeno en una cámara de inducción, y mantener la anestesia con 1,5%–2,5% isoflurano a través de un cono nasal durante la cirugía.
- Ajusta la concentración según la frecuencia respiratoria y el protocolo institucional aprobado para animales. Confirma la profundidad anestésica adecuada ausente del reflejo de pellizco del dedo antes de la incisión y vuelve a evaluar la profundidad de la anestesia durante todo el procedimiento.
- Corta el pelaje ampliamente desde la parte baja del abdomen para que el cajiente cubra cualquier pelaje restante y evite el contacto entre instrumentos y el pelo sin pinzar.
- Desinfectar el campo quirúrgico con exfoliantes alternados de povidona-yodo y alcohol isopropílico al 70%; realiza tres aplicaciones de cada solución antes de drapear.
- Coloque al animal en posición supina sobre una almohadilla térmica a 37 °C y mantenga condiciones estériles durante todo el procedimiento.
- Si es necesario llenar la vejiga o identificar intraoperatoriamente el cuello de la vejiga, lubricar un pequeño catéter o cánula uretral estéril con lubricante estéril, insértalo suavemente a través del meato uretral hasta la vejiga e inyectar lentamente solución salina estéril. Evita la inserción forzada o el sobrelleno. Retira o asegura el catéter según la exposición quirúrgica prevista.
2. Exposición de la vejiga
- Realizar una incisión cutánea de 3–4 cm en la línea media inferior en condiciones estériles (Figura 2A).
- Utilizando pinzas de punta fina y microtijeras, divide el tejido subcutáneo y abre la línea blanca para entrar en la cavidad peritoneal.
- Exteriorizar suavemente la vejiga urinaria con pinzas no traumáticas (Figura 2B).
- Identifica el cuello de la vejiga como la unión entre la base de la vejiga y la uretra proximal.
- Coloque una sonda roma bajo el cuello de la vejiga para proporcionar un soporte suave y estabilizar la zona objetivo (Figura 2C).
3. Ablación láser transvesical Ho:YAG
- Distiendo la vejiga con solución salina estéril hasta que la pared de la vejiga se tense moderadamente. Evita la sobredistensión, que puede ocultar los puntos anatómicos o aumentar la tensión en el sitio de la cistotomía.
- Realiza una cistotomía longitudinal de 0,5 cm en la cúpula anterior de la vejiga usando tijeras finas (Figura 2D).
- Introduce la fibra láser Ho:YAG preparada de 200 μm a través de la cistotomía hasta la luz de la vejiga.
- Avanza la fibra bajo visualización directa hacia el cuello de la vejiga.
- Coloca suavemente la punta de la fibra en contacto directo con la mucosa del cuello de la vejiga. Mantener el modo contacto sin hendiduras visibles en el tejido; Asegúrate de que la distancia entre la punta y el tejido sea aproximadamente de 0 mm durante toda la entrega de energía.
- Suministrar energía láser a 1,0 J y 10 Hz durante 5 s en la posición de las 9 en punto (Figura 3A) y repetir en la posición de las 3 en punto (Figura 3B). Esta configuración entrega 50 J por punto y 100 J por animal, con la potencia fija en 10 W por cada animal.
NOTA: Una ablación exitosa se indica por un blanqueamiento uniforme de la mucosa y la formación de un cráter poco profundo de mucosa a submucosa sin carbonización. - Mantén la fibra estable durante los 5 s de aplicación y evita empujarla contra la pared. Evitar la formación de cráteres profundos o perforaciones de espesor completo. No dirijas la fibra hacia los orificios ureterales ni la uretra distal.
- Retira la fibra e riega la luz de la vejiga con suero fisiológico estéril para eliminar residuos y confirmar la hemostasia.
- Cierra la cistotomía con 2–3 interrumpidas 8-0 Suturas trenzadas absorbibles (PGA recubiertas) de forma estanca.
- Rellenar la vejiga con 0,5–1,0 mL de solución salina estéril para confirmar la ausencia de fuga por la línea de cierre (Figura 3C).
- Cierra la pared abdominal y la piel en capas (Figura 3D).
4. Cuidados postoperatorios
- Mantén a la rata en una almohadilla térmica hasta que se recupere completamente de la anestesia.
- Administrar meloxicam a 1 mg/kg por vía subcutánea para analgesia postoperatoria y continuar una vez al día durante 1–3 días, o según el protocolo animal aprobado.
- Vigila al animal diariamente durante al menos 7 días en busca de signos de dolor, malestar, hematuria, retención urinaria, dehiscencia de heridas o infección.
- Proporciona apoyo de hidratación y alimentos ablandados según sea necesario durante el periodo temprano de recuperación.
5. Evaluación de la contractura del cuello de la vejiga
- Permite que los animales se recuperen durante 4 semanas tras la cirugía para permitir la remodelación fibrótica en el cuello de la vejiga.
- En el punto final experimental, se eutanasia a los animales mediante sobredosis de pentobarbital sódico (150 mg/kg, intraperitoneal) u otro método aprobado por el protocolo institucional de animales, y confirmar la muerte antes de la extracción de tejido. Extrae la vejiga, el cuello y la uretra proximal en bloque.
- Abre el espécimen longitudinalmente y fotografía el cuello de la vejiga para documentar el estrechamiento macroscópico.
- Fijar el tejido en paraformaldehído al 4% a 4 °C durante 24 horas, deshidratar mediante etanol graduado, limpiar en xileno, incrustar en parafina y obtener secciones transversales seriadas de 4 μm a través de la región del cuello de la vejiga.
- Secciones de tinción con hematoxilina y eosina, tricromo de Masson y rojo picrosirio según protocolos histológicos estándar o las instrucciones del fabricante para evaluar el estrechamiento de la luz, el engrosamiento de la pared del cuello y la deposición de colágeno.
- Para inmunohistoquímica, desparafinizar secciones, realizar la recuperación de antígenos, bloquear la peroxidasa endógena y la unión inespecífica, incubar secciones con anticuerpos contra el colágeno tipo I y el colágeno tipo III, aplicar el anticuerpo secundario adecuado, desarrollar con cromógeno y contra-tinción con hematoxilina.
NOTA: Los anticuerpos se diluyen según las recomendaciones del fabricante. - Cuantifica el área de lúmen y el área positiva de colágeno usando ImageJ/Fiji o software de análisis de imágenes equivalente.
- Calibra la escala píxel a micrómetro usando la barra de la báscula del microscopio, delimita manualmente la luz del cuello y la región tisular de interés de la vejiga, y mide el área de la lúmen.
- Para la tinción tricroma de Masson, aplica un umbral de color consistente para identificar píxeles positivos para colágeno azul dentro de la región de interés.
- Calcular la fracción de área positiva para colágeno como área positiva para colágeno dividida por el área total del tejido.
- Realizar mediciones en secciones y campos comparables de cada animal, y analizar las imágenes de forma ciega.
NOTA: La inducción exitosa del modelo está respaldada por el estrechamiento de la salida buresa de la vejiga junto con evidencia histológica de fibrosis concéntrica y aumento de la deposición de colágeno en el lugar de la lesión. La tasa de éxito operativo fue de 6/8 en el grupo tratado con láser Ho:YAG, basada en el desarrollo del fenotipo macroscópico e histológico esperado.
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Resultados
Cuatro semanas después de la cirugía, las ratas tratadas con láser Ho:YAG mostraron cambios macroscópicos e histológicos reproducibles compatibles con estrechamiento fibrótico del cuello de la vejiga. En este estudio, el grupo de control sin cirugía incluyó 8 ratas, y el grupo tratado con láser Ho:YAG incluyó 8 ratas. 6 de los 8 animales tratados desarrollaron el fenotipo esperado; la pérdida consistió en 2 muertes postoperatorias en el grupo tratado con láser con Ho:YAG, sin exclusiones...
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Discusión
En este estudio, establecimos un modelo en ratas de estrechamiento fibrótico del cuello de la vejiga utilizando ablación láser transvesical Ho:YAG. La principal fortaleza de este método es que produce una lesión térmica controlada en el cuello anatómico de la vejiga, seguida de un remodelado fibrótico progresivo. Esto difiere de los modelos tradicionales de ligadura extravesical, que generan principalmente obstrucción por compresión externa en lugar de formación intrínseca
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (nº 82474255 para Recursos Humanos) y el Programa de Investigación de la Administración de la Provincia de Hebei de la MTC (B2025018 para Recursos Humanos).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Absorbable braided suture (coated PGA), 8-0 | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd., Shanghai, China | R831 | |
| Anti-collagen I antibody, mouse monoclonal | Proteintech Group, Inc., Wuhan, China | 66761-1-Ig | |
| Anti-collagen III antibody, mouse monoclonal | Proteintech Group, Inc., Wuhan, China | 68320-1-Ig | |
| Coated Vicryl Plus suture (polyglactin 910), 4-0 | Ethicon, Inc. (Johnson & Johnson) | VCP773D | SH 26 mm ½-circle taper needle; violet braided; absorbable; Lot: RLMCJX |
| Hematoxylin and eosin (HE) staining kit | Servicebio, Wuhan, China | 2310005 | |
| Holmium-YAG Laser System (LITHO) | Quanta System S.p.A, Italy | https://www.quantasystem.com/laser/litho/ | 1 J, 10 Hz, 10 W, 200 μm fiber |
| HRP-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody | Boster, Wuhan, China | BA1050 | |
| Isoflurane | RWD | 2025010601 | |
| Masson's trichrome staining kit | Zhuhai Baso Biotechnology Co., Ltd., Zhuhai, Guangdong, China | BA4079B | |
| Meloxicam Injection | Qilu Animal Health, Shandong, China | E135H003 | |
| Paraformaldehyde (4%) | Servicebio, Wuhan, China | 2510H0070148 | |
| Picrosirius red staining kit | Nanjing Senbeijia Biological Technology Co., Ltd., Nanjing, Jiangsu, China | 20250228 | |
| Safety intravenous catheter, 24 G | Guangdong Lily Medical Technology Co., Ltd., Foshan, Guangdong, China | AD4-240827 | |
| Small-animal inhalation anesthesia system | RWD Life Science, Shenzhen, China | https://www.rwdstco.com/inhalation-anesthesia-solutions/ | Induce with 3%–4% isoflurane in oxygen |
Referencias
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