Compartiendo experiencias sobre la supervivencia a largo plazo en un modelo de trasplante de hígado de rata no arterializado

Resumen

El objetivo de este protocolo presentado es compartir la experiencia quirúrgica optimizada para establecer un modelo de trasplante de hígado de rata no arterializado, centrándose específicamente en mejoras técnicas que garanticen la supervivencia animal a largo plazo más allá de los 100 días.

Resumen

En el trasplante hepático experimental, el modelo de rata es el estándar de oro para investigar la inmunología y los procesos metabólicos de trasplante; sin embargo, reconstruir la arteria hepática extremadamente fina (~0,5 mm) presenta un reto técnico formidable. Para evitar esto, se utiliza ampliamente el modelo simplificado de trasplante hepático de rata no arterializado (NArLT). Desafortunadamente, complicaciones biliares graves —como fugas biliares y colangitis isquémica— derivadas de la privación arterial frecuentemente limitan la supervivencia a largo plazo de los receptores. Este obstáculo limita significativamente la investigación sobre temas clave, incluyendo la inmunocompatibilidad a largo plazo entre huésped y injerto y el rechazo crónico. En este caso, presentamos un protocolo optimizado para el modelo NArLT que incorpora refinamientos técnicos críticos para superar con éxito estas lesiones biliares isquémicas. Las mejoras clave incluyen una fase anhepática significativamente acortada, una técnica de disección biliar "sin contacto", un lavado completo del tracto biliar y un método optimizado de colocación de stent en la línea biliar interna. Tras implementar este procedimiento mejorado, la tasa de supervivencia del receptor superó el 94% durante el periodo de observación de 100 días. En última instancia, este protocolo optimizado proporciona una plataforma altamente reproducible y robusta para investigar los mecanismos subyacentes a la tolerancia a largo plazo al trasplante, apoyando así el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas en la medicina de trasplantes.

Introducción

El modelo de trasplante de hígado de rata sirve como la plataforma experimental más utilizada para la investigación básica en trasplantes. Sin embargo, su aplicación más amplia suele verse obstaculizada por una curva de aprendizaje notoriamente pronunciada, que puede dificultar significativamente el avance de los estudios experimentales^{posteriores 1,2}. Además, los modelos convencionales de trasplante hepático de rata suelen sufrir un éxito quirúrgico subóptimo y bajas tasas de supervivencia a largo plazo. Al optimizar críticamente los procedimientos quirúrgicos, refinar meticulosamente los detalles quirúrgicos y realizar reconstrucciones vasculares y biliares bajo visualización directa, la curva de aprendizaje asociada a este complejo modelo microquirúrgico puede abreviarse^{sustancialmente en 3,4}. El trasplante de hígado sigue siendo la única terapia curativa para la enfermedad hepática en fase terminal, lo que hace que el establecimiento de modelos de trasplante hepático en rata sea profundamente significativo para la investigación^{científica 5,6}.

El modelo de trasplante hepático de rata no arterializado (NArLT) ofrece ventajas significativas en la cirugía experimental: evita el formidable desafío de la anastomosis arterial microvascular, acorta el tiempo quirúrgico total y reduce la duración de la anestesia para las ratas. A pesar de la privación del suministro arterial de sangre, la respuesta biliar resultante en este modelo ofrece una perspectiva única para investigar las lesiones biliares isquémicas. Sin embargo, los modelos convencionales de NArLT se asocian con una alta tasa de complicaciones biliares postoperatorias de hasta el 30^{%, lo} que compromete gravemente la supervivencia a largo plazo. En el modelo clásico tradicional de trasplante de hígado de rata, la tasa de supervivencia a largo plazo del receptor es inferior al 70%–85%^8. Para abordar esto, este estudio introduce un protocolo optimizado que utiliza un stent biliar blando tratado con heparina. Mediante el emplear una técnica de disección biliar "sin contacto" para maximizar la preservación de la red microvascular perbil, junto con un lavado biliar completo mediante perfusión fría, este enfoque pretende mitigar fundamentalmente las complicaciones biliares mediante soporte físico y protección^{isquémica 9}, proporcionando finalmente una plataforma robusta y estable para el monitoreo inmunológico a largo plazo.

Por lo tanto, maximizar las tasas de éxito procedimentales y prolongar la supervivencia de los receptores son los principales objetivos de cualquier innovación técnica en el trasplante de hígado de rata. Alcanzar estos objetivos es un requisito fundamental para garantizar la progresión oportuna e ininterrumpida de la investigación experimental^{aguas abajo 10}.

Protocolo

Todos los experimentos y cirugías con animales de este estudio fueron aprobados por el Comité de Ética Experimental de Animales de la Universidad de Qingdao (Nº 20260301SD5020260401065). Haz todo lo posible por minimizar el sufrimiento animal.

1. Preparación preoperatoria

1. Animales experimentales
   1. Utilizar ratas machos adultas de Sprague–Dawley (SD), de entre 8 y 10 semanas y que pesan entre 220 y 250 g, como donantes. Asegúrate de que el peso del receptor sea ligeramente mayor que el del donante, con una diferencia dentro de 50 g.
   2. Ratas domésticas bajo condiciones específicas libres de patógenos, a una temperatura controlada de 22°C ± 2°C y humedad relativa del 50% ± 10%.
   3. Mantén un ciclo de 12 horas de luz y oscuridad con una densidad de jaula de 2–3 ratas por jaula.
   4. Proporciona una dieta estándar de laboratorio para roedores. Permite que las ratas se aclimaten al ambiente de laboratorio durante al menos una semana antes de la intervención quirúrgica.
   5. Animales rápidos durante 12 horas antes de la cirugía. Permite el acceso improvisado al agua.
      NOTA: El ayuno antes de la cirugía ayuda a minimizar el riesgo de aspiración durante la anestesia y previene la dilatación gástrica, que puede comprometer la función respiratoria y obstruir la exposición quirúrgica.
2. Instrumentos y materiales quirúrgicos
   1. Utilice los instrumentos necesarios para la cirugía de trasplante como se muestra en la Figura 1. Enumera los detalles de los consumibles utilizados en la cirugía en la Tabla de Materiales.
   2. Seleccione vainas epidurales 5F y 6F comparando el diámetro externo de los catéteres con los diámetros fisiológicos internos de los vasos objetivo en ratas SD macho que pesan entre 220 y 250 g.
   3. Utiliza una vaina 5F (aproximadamente 1,67 mm) para la vena porta (PV). Utiliza una vaina 6F (aproximadamente 2,00 mm) para la vena cava inferior infrahepática (IHIVC).
      NOTA: Seleccione el tamaño del catéter basándose en una combinación de estándares anatómicos y estimación visual intraoperatoria bajo un microscopio quirúrgico. Realizar una comparación en tiempo real entre el diámetro externo del catéter y el lumen interno del recipiente objetivo. Se logra una coincidencia adecuada cuando el catéter ocupa aproximadamente entre el 70% y el 80% de la luz del vaso, permitiendo una inserción suave sin estirar en exceso la pared del vaso ni dejar una holgura excesiva. Para ratas SD dentro del rango de peso especificado, se pueden usar diámetros anatómicos predefinidos para la selección inicial del tamaño, que debe ajustarse intraoperatoriamente según la variación individual. Los operadores deben establecer esta compatibilidad vaso-catéter mediante formación previa en microcirugía.
   4. Para ratas SD de entre 8 y 10 semanas, se seleccionan vainas epidurales 5F y 6F como manguitos para la PV y el IHIVC, respectivamente (Figura 2A).
   5. Preparar puños con una longitud funcional total (cuerpo tubular) de 2,0–2,5 mm. Mantener una longitud de extensión de 3,0–4,0 mm para manipular con pinzas.
   6. Sujetar la pared del manguito con las mandíbulas de las pinzas mosquito para crear una ranura circunferencial situada aproximadamente entre 0,5 y 1,0 mm del borde proximal del manguito (véase la Figura 2A para más detalles). Mantener una profundidad de ranura de aproximadamente 0,1–0,2 mm para facilitar un nudo seguro y la posterior fijación.
   7. Asegúrese de que la ranura evite que la ligadura de fijación 7-0 se deslice de la superficie rígida del catéter.
   8. Recorta un catéter intravenoso de 22G para crear un stent biliar con extremos inclinados o biselados. Asegúrate de una longitud de 5–7 mm.
   9. Prefiero un stent de 7 mm de longitud. Ajusta la longitud en función de la variación anatómica usando el nivel horizontal de la vena gástrica derecha como punto de referencia. Estima la distancia desde este punto de referencia hasta el hilo hepático para guiar la selección de la longitud del stent.
   10. Acortar el stent (aproximadamente a 5–6 mm) si la distancia estimada es limitada o si se encuentra resistencia durante la inserción. Asegúrese de que aproximadamente 2–3 mm del stent puedan insertarse en el conducto biliar sin doblarse, doblarse ni protuberanciar.
   11. Remoja el stent en suero fisiológico heparinizado (100 UI/mL) a temperatura ambiente (23°C ± 2°C). Mantenga el stent sumergido durante un mínimo de 30 minutos antes de usarlo para evitar la coagulación biliar intraluminal al insertarse en la luz biliar del donante (Figura 2A).
       NOTA: Prepara el manguito antes de la cirugía y utiliza pinzas antimosquito para crear surcos en la pared del manguito y así facilitar el nudo y la fijación tras una canulación exitosa. Asegúrese de que los extremos del stent biliar recortado no estén excesivamente afilados para evitar la perforación del conducto biliar. Bajo un microscopio quirúrgico (aumento 10×–16×), confirmar que el borde cortado está limpio y libre de muelas plásticas irregulares; Si la punta parece una aguja, embotada ligeramente con microtijeras. Durante la manipulación, utiliza solo micropinzas finas y sin dientes para manejar el stent. Evitar aplicar una fuerza externa excesiva, como indica cualquier aplanamiento, ovalización o dobladura del lumen del stent; Descartar y reemplazar cualquier stent deformado, ya que el estrechamiento luminal aumenta el riesgo de complicaciones biliares postoperatorias.

Figura 1. Instrumentos quirúrgicos utilizados en el procedimiento de trasplante. (A) Una palangana de riñón de acero inoxidable. (B) Portaagujas micro. (C) Microtijeras. (D) Micropinzas (rectas y curvas). (E) Pinzas microvasculares y pequeñas pinzas tipo bulldog tipo mosquito. (F) Portaagujas estándar. (G) Pinzas hemostáticas rectas (pinzas mosquito). (H) Pinza vascular. (I) Tijeras quirúrgicas estándar. (J) Liga elástica (hecha a partir del puño de un guante quirúrgico estéril). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2. Manguitos quirúrgicos hechos a medida, stent biliar e incisiones abdominales planificadas. (A) Preparación de manguitos vasculares y el stent biliar junto a una regla milimétrica. De izquierda a derecha: una vaina epidural 6F utilizada para el manguito de la vena cava inferior infrahepática (IHIVC), una vaina 5F usada para el manguito de la vena porta (PV) y un stent biliar de 5–7 mm recortado de un catéter intravenoso de 22G. (B) Una incisión cruzada marcada en el abdomen de la rata donante para maximizar la exposición quirúrgica. (C) Incisión estándar de laparotomía en la línea media marcada en el abdomen de la rata receptora. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

2. Operación con donantes

1. Primeros pasos
   1. Anestesiar a la rata donante usando isoflurano al 5% a una tasa de flujo de aire de 1 L/min en la cámara de inducción. Evalúa la profundidad de la anestesia confirmando la ausencia de movimiento espontáneo de las extremidades y reflejo de retirada.
      NOTA: La profundidad de la anestesia se evalúa observando la ausencia de movimiento espontáneo de las extremidades, la ausencia de reflejo de retirada y la frecuencia respiratoria. Para garantizar el desarrollo fluido y seguro de la cirugía, estos parámetros se reevalúan estrictamente cada 20 minutos durante todo el procedimiento.
   2. Administrar un 1% de pentobarbital (40–45 mg/kg) mediante inyección intraperitoneal en la parte inferior derecha del abdomen, aproximadamente 1–2 cm laterales a la línea media (línea alba) y 1–2 cm craneales al ligamento inguinal derecho. Confirma la anestesia adecuada pellizcando la pata trasera y asegurándote de que no haya reflejo de abstinencia.
   3. Coloca a la rata donante en posición supina sobre una almohadilla térmica a 37°C para mantener la temperatura corporal durante la operación.
   4. Afeita la zona quirúrgica abdominal. Desinfecta la zona con povidona-yodo tres veces.
2. Procedimientos antes de la perfusión hepática
   1. Realizar una incisión cruzada que se extiende hasta el proceso xifoides, baja hasta la sínfisis púbica y lateralmente hasta la línea media axilar para maximizar la exposición del campo quirúrgico (Figura 2B).
      NOTA: Realiza la laparotomía en dos capas. Primero incide la piel y el tejido subcutáneo. Luego acoche la línea alba con pinzas y haz una pequeña incisión inicial para permitir la entrada de aire, haciendo que las vísceras se desprendan. Extiende la incisión con tijeras manteniendo la hoja inferior paralela a la pared abdominal para evitar lesiones en los órganos.
   2. Envuelva los intestinos con gasa empapada en solución salina. Colócalos en el campo de operación estéril en el lado izquierdo del abdomen para exponer la zona operativa.
      NOTA: Es imprescindible mantener una humedad continua de los intestinos eviscerados durante todo el procedimiento para evitar la desecación isquémica y la hipotermia. Rehidrata periódicamente la gasa de cobertura aplicando gotas de solución salina normal tibia (37°C) aproximadamente cada 10–15 minutos, o inmediatamente después de que la gasa empiece a secarse bajo la iluminación quirúrgica.
   3. Divide el ligamento falciforme. Pinzar y retraer el proceso xifoides de forma craneal para exponer la VVI suprahepática (SHIVC) y la vena frrénica inferior izquierda.
   4. Divide el ligamento triangular izquierdo. Liga la vena frénica izquierda cerca del SHIVC usando un 7-0 u 8-0 Sutura (Figura 3A).
      NOTA: Al ligar la vena frrénica inferior izquierda, coloque la ligadura cerca del SHIVC. Ten en cuenta que la aguja de sutura puede perforar fácilmente el diafragma y causar neumotórax; sutura cerca del vaso sanguíneo.
   5. Se recomienda la electrocauterización para la división de vasos para lograr una hemostasia rápida y reducir el tiempo operatorio, mejorando así la consistencia y reproducibilidad del procedimiento.
      NOTA: La electrocauterización estandariza la hemostasis, reduce el tiempo operativo y mejora la reproducibilidad entre los operadores.
   6. Moviliza los lóbulos caudados y papilares (Figura 3B).
   7. Utiliza pinzas microscópicas para eliminar la grasa y el tejido conectivo de la superficie del VHII.
      NOTA: Retirar el tejido conectivo hasta que la pared del vaso parezca lisa y translúcida. Se logra una exposición adecuada cuando se pueden aplicar pinzas vasculares sin interferencias y no queda tejido residual que pueda comprometer el puñado o sutura.
   8. Liga la vena suprarrenal derecha al ras del IHIVC. Aísla la vena renal derecha y liga la vírcala con el VHII.
   9. Continúe diseccionando el CIHII caudal hasta un nivel justo por encima de la vena renal izquierda (Figura 3C).
      NOTA: Asegúrese de que el VHII esté completamente esqueletado (separar los vasos sanguíneos lo más completamente posible del tejido conectivo graso) durante la disección. Esto facilita procedimientos posteriores de explantación hepática y colocación del manguito.
   10. Eleva suavemente el hígado con un hisopo de algodón. Disecciona las inserciones ligamentosas entre el lóbulo hepático inferior derecho y el retroperitoneo.
       NOTA: Identifique el SHIVC como un vaso corto, ancho y de pared delgada azulada en el polo superior del hígado. Detener la disección una vez que su superficie anterior está despejada y las fibras diafragmáticas adyacentes se vuelven visibles.
   11. Detener la disección al llegar al SHIVC.
       NOTA: Manipula el hígado con extremo cuidado para evitar lesiones parénquimatos. Actúa con precaución para proteger la VI durante la disección retroperitoneal craneal.
   12. Disecciona el tejido conectivo entre el PV y el AH adecuado. Aísla el PV.
   13. Liga la vena gástrica derecha (vena pilórica) al ras de la PV. Continúa la disección hasta la raíz de la vena esplénica.
   14. Expone la porta hepatis. Identificar el tejido conectivo graso similar al cordón cordón situado a la izquierda de la PV, que encapsula el conducto biliar común (CBD) y el AH.
   15. Realiza una incisión en forma de "V" en la pared anterior del CBD, de 3 a 5 mm distal a la bifurcación del conducto hepático.
   16. Usa microfórceps para sujetar el stent biliar. Inserta el stent aproximadamente 3 mm en el tracto biliar manteniendo una alineación paralela con el conducto.
       NOTA: Avanza el stent suavemente sin resistencia. Asegúrate de no hacer abultamiento lateral, angulación ni acampadas en las paredes del conducto. Si ocurre resistencia o deformación, retirar y realinear antes de volver a insertar.
   17. Asegura el stent con una corbata de seda 7-0 en la circunferencia. Liga el AH a nivel de la incisión y transecta proximalmente (Figura 3D).
       NOTA: Evita estrictamente la "esqueletización" excesiva al diseccionar el CBD donante. Preservar el tejido conectivo peribiliario, los plexos nerviosos y las redes microvasculares para promover la circulación colateral temprana y la cicatrización biliar postoperatoria. Dado que el extremo distal del conducto donante es la región más isquémica, se debe mantener el sitio anastomótico cerca del hilo hepático para minimizar la carga isquémica.
3. Perfusión hepática
   1. Expone la aorta abdominal. Inserta una aguja para venas de cuero cabelludo de calibre 23 (23 G) conectada a una jeringuilla de 20 mL llena de solución fría (4°C) de la Universidad de Wisconsin (UW).
      NOTA: Inserta la aguja en la aorta abdominal en un ángulo poco profundo (15°–20°). Confirma la entrada observando el retroceso arterial de la sangre, luego avanza ligeramente y alinea la aguja paralela al vaso para evitar la perforación de la pared posterior.
   2. Retira el aire de la jeringuilla antes de la infusión. Pinza y fija la aorta abdominal y la aguja usando una pinza vascular.
      NOTA: Elimina todo el aire de la jeringuilla golpeando para desalojar las burbujas y expulsando líquido hasta que se vea una gota continua en la punta de la aguja. Confirma la ausencia de aire en el cubo de la aguja antes de la canulación.
   3. Inicia la perfusión lentamente presionando manualmente la jeringuilla a una velocidad constante de 3–3,5 mL/min (Figura 3E).
      NOTA: Confirme la correcta colocación intravascular observando el retorno sanguíneo en el tubo.
   4. Incisa el diafragma. Exponer completamente la VI torácica y la aorta torácica.
   5. Pinza la VCI torácica en su unión con la aurícula derecha, junto con la aorta torácica, utilizando pinzas vasculares.
   6. Transecta la VI torácica justo debajo de la pinza para permitir el flujo de perfuso.
      NOTA: Aplica la pinza lo más cranealmente posible y transecta debajo de ella para preservar la longitud del vaso. Comienza la perfusión inmediatamente para prevenir la coagulación y preservar la calidad del injerto.
   7. Continúa la perfusión a un ritmo constante (3–3,5 mL/min) hasta un volumen total de aproximadamente 40 mL.
   8. Detener la perfusión una vez que el parénquima hepático se vuelve completamente pálido (marrón amarillento) (Figura 3F).
      NOTA: Se confirma una perfusión adecuada cuando el hígado se vuelve uniformemente pálido (marrón amarillento) y el efluente del IHIVC transectado es transparente, sin sangre residual.
   9. Transecta el IHIVC con la vena renal izquierda. Transecta el PV a nivel de la vena esplénica.
      NOTA: Evitar la inyección rápida o violenta de perfusado para prevenir lesiones endoteliales y parénquimatos.
   10. Agranda la incisión diafragmática. Extrae el injerto hepático en bloque con el diafragma adjunto.
   11. Coloca el injerto en una placa de Petri estéril que contenga una solución fría de conservación UW.
   12. Mantén el injerto en una solución fría de UW a 4°C. Trasplante completo en las 2 horas siguientes a la adquisición.

Figura 3. Pasos quirúrgicos clave durante la movilización hepática con donante y la perfusión in situ. (A) Exposición y ligadura de la vena frrénica inferior izquierda. (B) Aislamiento y división de las ramas hepatoesofágicas comunicantes. (C) Disección del VHII, demostrando la ligadura de las venas suprarrenal derecha y renal derecha. (D) Inserción del stent biliar personalizado en el conducto biliar común (CBD) utilizando la técnica de "no-touch" para preservar el tejido conectivo peribiliar. (E) Anulación de la aorta abdominal para iniciar una perfusión in situ fría. (F) Hígado de donante completamente perfundido con apariencia uniformemente pálida, indicando un lavado sanguíneo exitoso. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

3. Preparación de injertos ex vivo

NOTA: Realizar toda la preparación del injerto ex vivo sobre hielo (Figura 4A). Mantener el injerto en solución UW a 4°C ± 2°C y controlar la temperatura periódicamente para asegurar una conservación adecuada en frío.

Figura 4. Preparación ex vivo del injerto de hígado donante. (A) El injerto de hígado extraído se coloca en una placa de Petri estéril que contiene una solución fría de conservación de UW, colocado sobre hielo triturado para mantener la hipotermia. (B) Punción del donante PV por eversión sobre un manguito personalizado y fijación con una ligadura circunferencial. (C) Preparación completa del manguito para PV e IHIVC, con el stent biliar en su lugar. (D) Preparación de la VI suprahepática (SHIVC) con suturas de tirante colocadas en ambas esquinas laterales para facilitar la anastomosis posterior. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

1. Preparación del manguito PV
   1. Sujeta la cola del manguito PV con pinzas mosquito y fíjala de modo que el extremo de la cola quede orientado hacia abajo, perpendicular al fondo de la placa de Petri.
   2. Pasar microfórceps a través del lumen del manguito. Tira del PV a través del manguito.
   3. Ajusta la pared anterior del PV. Everte aproximadamente 3 mm de la pared del recipiente sobre el extremo ensanchado de la cola de manguito.
   4. Asegura el recipiente evertido a la pared exterior del puño usando una corbata de seda circunferencial 7-0 (Figura 4B).
      NOTA: Asegúrese de que el recipiente y el manguito estén alineados sin torsión ni angulación. Tras la fijación, enjuaga el manguito PV con aproximadamente 1 mL de solución UW y confirma la permeabilidad observando el derrame del SHIVC.
2. Preparación del puño IHIVC
   1. La preparación y el puño del IHIVC se realizan siguiendo los pasos idénticos descritos para el PV en el Paso 3.1. En resumen, esto incluye la movilización, el ajuste y la fijación de los brazaletes siguiendo el mismo protocolo estandarizado para garantizar la consistencia experimental y la reproducibilidad. (Figura 4C).
      NOTA: Confirme la permeabilidad del manguito del VIII observando el flujo sin obstrucciones del SHIVC tras el flushing.
3. Enjuague del tracto biliar
   1. Enjuaga suavemente el conducto biliar a través del stent biliar usando una jeringuilla de 1 mL que contiene 0,5 mL de solución UW.
   2. Asegúrate de que no haya fugas de líquido durante el lavado.
      NOTA: La ausencia de fuga de líquido confirma la integridad del conducto biliar.
4. Preparación del SHIVC
   1. Recorta el SHIVC del injerto hepático extirpando el diafragma residual.
   2. Asegúrese de que el SHIVC esté completamente esquelético, según se define en el Paso 2.2.7.
5. Colocación de suturas por suspensión
   1. Usa 7-0 o 8-0 Suturas basadas en la preferencia del operador.
      NOTA: En cuanto a los resultados quirúrgicos (incluyendo la patencia anastomótica y la supervivencia del receptor), ambos tamaños de sutura son funcionalmente equivalentes en este modelo. La elección entre ambos puede basarse enteramente en la preferencia personal del operador o en la disponibilidad de laboratorio, sin afectar la reproducibilidad del procedimiento.
   2. Aplana suavemente el tocón SHIVC. Coloca suturas en las esquinas laterales izquierda y derecha pasando la aguja de dentro a fuera, aproximadamente a 1 mm del borde (Figura 4D).

4. Operación de receptores

1. Primeros pasos
   1. Anestesiar a la rata receptora usando el mismo protocolo descrito para el donante (Paso 2.1.1).
   2. Coloca a la rata receptora sobre una almohadilla térmica controlada por termostática mantenida a 37°C.
   3. NOTA: Pesa a la rata receptora antes de la anestesia. Asegúrate de que su peso corporal supere aproximadamente 50 g al del donante.
2. Movilización del hígado receptor
   1. Realiza una laparotomía de línea media.
   2. Retrae la pared abdominal lateralmente usando cuatro separadores elásticos. Colocar los dos retractores superiores lateralmente a los márgenes costales bilaterales y los dos retractores inferiores lateralmente a las regiones inguinales bilaterales para lograr una exposición óptima.
      NOTA: Aplicar suficiente retracción para exponer el campo operatorio evitando una tensión excesiva que pueda causar blanqueamiento tisular o dificultar la respiración.
   3. Liga la vena frrénica inferior izquierda (LIPV) de la misma manera descrita para el procedimiento con donante (véase el Paso 2.2.1).
   4. Diseca los ligamentos entre el lóbulo hepático izquierdo y el retroperitoneo. Moviliza los lóbulos caudados y papilares.
   5. Divide los ligamentos y las ramas comunicantes entre el esófago y el lóbulo hepático izquierdo mediante electrocauterización.
      NOTA: Se recomienda la electrocauterización para asegurar una hemostasia rápida, reducir el tiempo de operación y mejorar la reproducibilidad del procedimiento.
   6. Disecciona directamente el CIHII hasta el nivel de la vena renal derecha.
   7. Aislar y ligar cuidadosamente la vena suprarrenal izquierda aproximadamente a 2 mm de su confluencia con el CIHI.
   8. Manejar el lóbulo inferior derecho del hígado de la misma manera descrita para el procedimiento con donante (véase el Paso 2.2.4).
   9. Pasar una goma elástica (hecha con el puño de un guante quirúrgico estéril, de aproximadamente 10 cm de longitud) transversalmente detrás del SHIVC.
      NOTA: Aplica una tracción suave para exponer el SHIVC sin restringir el movimiento respiratorio.
   10. Deja la goma elástica en su lugar para usarla durante la posterior travesía del SHIVC.
   11. Diseccionar y aislar el PV desde el hilo hepático hasta el nivel de la rama de la vena pilórica.
       NOTA: Limitar la disección del PV a la región anastomótica. Preservar los afluentes circundantes para reducir el trauma quirúrgico.
   12. Aísla el hiahurón en el hilo hepático.
   13. Liga el HA al ras del hilo y transecta proximalmente.
   14. Identifica la confluencia de los conductos hepáticos izquierdo y derecho que forman el CBD debajo del hilo hepático. Liga el CBD en este lugar usando una sutura de Prolene 7-0 y transecta (Figura 5A).
       NOTA: Minimizar el trauma quirúrgico en esta región. Preservar la longitud máxima posible del AH junto con el tejido conectivo peribiliario, los plexos nerviosos y la red microvascular para facilitar el establecimiento temprano de la circulación colateral.
3. Hepatectomía receptora
   1. Aplica pinzas microvasculares para ocluir el CIHII inmediatamente cefalado en la vena renal derecha.
   2. Aplica una pinza microvascular para ocluir la PV justo por encima de su unión con la vena pilórica.
   3. Confirma la oclusión vascular exitosa observando un oscurecimiento visible del parénquima hepático.
      NOTA: Confirmar oclusión vascular mediante oscurecimiento uniforme (cianosis) del hígado, pérdida de turgencia parenquimatosa y colapso de la PV.
   4. Inserta una aguja de 23 G para venas en el cuero cabelludo unida a una jeringuilla de 5 mL en la PV.
   5. Infundir 2 mL de solución de glucosa al 5% durante aproximadamente 30 s para enjuaguar la sangre intrahepática en la circulación sistémica.
      NOTA: Inyecta lentamente a través del PV cerca del hilo hepático para enjuaguar la sangre intrahepática hacia la circulación sistémica.
   6. Aplica tracción hacia abajo en la goma para exponer el SHIVC.
   7. Clampe el SHIVC usando una pinza vascular (Figura 5B).
   8. Transecta el IVII, PV y SHIVC con el parénquima hepático.
   9. Elimina completamente el hígado nativo de la cavidad abdominal.
      NOTA: Mantener la fase anhepática en un plazo de 26 minutos (no más de 30 minutos). Los vasos del transecto se enlazan con el hígado para mantener la longitud adecuada y asegurar muñones vasculares lisos.
4. Implantación del injerto hepático
   1. Reconstrucción del SHIVC
      1. Colocar el injerto hepático en su orientación anatópica ortotópica.
      2. Utiliza la sutura 7-0 precolocada en la esquina izquierda para comenzar la sutura continua de la pared posterior hacia la esquina derecha.
      3. Asegura la sutura a la sutura de estay en la esquina derecha.
      4. Continúa la sutura de paso a lo largo de la pared anterior para completar la anastomosis (Figuras 6A–6C).
      5. Mantener una distancia de entrada de la aguja de 0,5–1,0 mm desde el borde del recipiente.
      6. Mantener un paso de sutura de 1,0–1,5 mm.
         NOTA: Mantener un espaciamiento constante entre agujas y paso de sutura para asegurar una anastomosis segura y sin tensiones.
      7. Aprieta la sutura después de cada puntada para eliminar espacios muertos y mantener la tensión adecuada.
         NOTA: Antes de completar la sutura de la pared anterior, enjuaga el SHIVC con solución UW usando una aguja permanente para expulsar el aire residual y prevenir embolias aéreas.
   2. Reconstrucción fotovoltaica
      1. Coloca suturas de estancia 7-0 en las esquinas izquierda y derecha del muñón PV receptor.
      2. Aplica tracción de tres puntos para crear una abertura triangular.
      3. Inserta el PV donante con manguito en la luz.
      4. Asegura con una ligadura 7-0 atada alrededor de la ranura circunferencial (Figuras 6D–6F).
   3. Reconstrucción del IHIVC
      1. Reconstruir el IHIVC usando la misma técnica que la reconstrucción PV (véase el Paso 4.4.2) (Figuras 6G–6I).
   4. Reperfusión
      1. Liberar secuencialmente pinzas vasculares en el SHIVC, PV e IHIVC.
      2. Confirmar la reperfusión exitosa observando una restauración uniforme del color del injerto sin congestión, hemorragia ni fuga (Figura 7A).
         NOTA: La producción activa de bilis por el conducto biliar indica restauración de la perfusión hepática y la función temprana del injerto.
   5. Reconstrucción biliar
      1. Haz una pequeña incisión transversal (la mitad del diámetro del conducto) en la pared anterior del muñón de CBD receptor.
      2. Inserta el stent biliar donante aproximadamente 3 mm dentro del lumen de CBD.
      3. Fija el stent con una sutura circunferencial 7-0 (Figura 7B).
         NOTA: Observar el derrame biliar activo desde la punta distal del stent donante antes de completar la reconstrucción. Esto confirma la patencia y la función temprana del injerto.
5. Recalentamiento del receptor
   1. Irrigar la cavidad peritoneal con 150 mL de solución salina normal a 37°C antes del cierre abdominal.
      NOTA: Este paso elimina la sangre residual, restaura la temperatura corporal y permite la inspección de la hemostasia en las anastosis SHIVC, IHIVC y PV.
6. Cierre abdominal y cuidados postoperatorios
   1. Cierra la capa musculofascial usando una sutura continua con hilo absorbible 4-0, dando mordiscos de 5 mm cada 1 cm.
   2. Cierra la piel usando una sutura continua con hilo de seda 4-0.
   3. Administrar buprenorfina (0,1 mg/kg) por vía subcutánea cada 12 horas, para un total de 2 dosis.
   4. Transfiere a la rata receptora a una jaula limpia y con control de temperatura.
   5. Monitorizar de forma continua hasta que se recupere completamente de la anestesia y se reanude el movimiento espontáneo normal.

Figura 5. Pasos quirúrgicos clave durante la movilización hepática y la hepatectomía del receptor. (A) Identificación y ligadura del receptor de CBD cerca de la bifurcación hilar. (B) Exposición y sujeción cruzada del SHIVC. Se coloca una goma elástica detrás del SHIVC para proporcionar tracción y mejorar la visualización durante el sujeción. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 6. Pasos quirúrgicos clave para la reconstrucción vascular durante la implantación de injertos hepáticos. Reconstrucción del SHIVC: (A) alineación usando suturas de tirantes en las esquinas, (B) sutura continua de la pared posterior y (C) sutura completa de la pared anterior. Reconstrucción PV usando la técnica del manguito: (D) tracción en tres puntos, (E) inserción de PV donante con manguito y (F) ligadura asegurando el manguito. Reconstrucción del VII usando la misma técnica de manguito: (G) exposición, (H) inserción y (I) ligadura. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 7. Verificación de la función del injerto, reconstrucción biliar y recuperación postoperatoria. (A) Evaluación de la función temprana del injerto tras la reperfusión, con un flujo visible de bilis desde el stent biliar donante. Se pueden ver reconstrucciones PV e IHIVC. (B) Completar la reconstrucción biliar con inserción y fijación del stent biliar donante en el CBD receptor. (C) Rata receptora representativa que demuestra recuperación postoperatoria completa con postura normal y actividad espontánea. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Resultados

Para garantizar una calidad quirúrgica y reproducibilidad consistentes en los modelos NArLT, todos los procedimientos fueron realizados por el mismo microcirujano experimentado. Durante el periodo del estudio se completaron un total de 50 trasplantes de hígado de rata. Las duraciones medias de los procedimientos quirúrgicos fueron las siguientes: la cirugía con donante fue de media 25,3 ± 2,6 minutos, la preparación del injerto ex vivo de 13,1 ± 2,1 minutos, la cirugía del receptor fue d...

Discusión

El modelo NArLT es una piedra angular para la investigación experimental de trasplantes debido a su evitación de la anastomosis arterial microvascular^{compleja 11}. Sin embargo, los métodos convencionales de NArLT han estado históricamente afectados por altas tasas de complicaciones biliares—hasta el 30%—que limitan severamente la supervivencia a largo plazo y dificultan los estudios inmunológicos^{crónicos 2}. La importancia del método propuest...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sutura absorbible 4-0	Ethicon	W9109H	Utilizado para el cierre de la capa musculofascial (línea alba)
Sutura de seda 4-0	Ethicon	VCP304H	Utilizado para el cierre de la piel
7-0 o 8-0 Sutura / Corbata de seda	Ethicon	Z1711E	Usado para ligar vasos sanguíneos (por ejemplo, vena frrénica izquierda)
22G Catéter Intravenoso	B. Braun	4252098B	Recortado a 5– 7 mm con extremos inclinados para preparar el stent biliar
Aguja de vena del cuero cabelludo de 23G	Shandong Qinkai Medical Industry Co., Ltd.	MDLSSVS	Usado para la inserción en la aorta abdominal para la perfusión hepática
Buprenorfina	Instituto de Investigación Farmacéutica de Tianjin Pharmaceutical Co., Ltd.	H12020275	Administrada como analgesia subcutánea tras la cirugía
Bastoncillo de algodón	Aoocn	216-236	Se usa para elevar suavemente el hígado durante la disección
Hielo triturado	N/A	N/A	Se utiliza para mantener la temperatura del injerto durante la preparación ex vivo
Separadores elásticos	N/A	N/A	Se utiliza para retraer la pared abdominal durante una laparotomía
Vainas de catéter epidural.	Jiangsu Maichuang Medical Device Co., Ltd.	20173084015	Tallas 5F y 6F; usados como esposas para PV y IHIVC
Gasa	Central Medical Technology Co., Ltd.	CH-1001	empapados en solución salina; Usado para cubrir y proteger los intestinos
Solución de glucosa (5%)	Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.	H20044307	Se usó para lavar sangre intrahepática durante la hepatectomía receptora
Solución fisiológica de heparina	Shenzhen Life Biotechnology Co., Ltd.	H2012003	100 UI/mL; Usado para remojar el stent biliar
Aguja de Indwelling	B. Braun	4254074B	Se usa para limpiar el SHIVC y eliminar el aire antes de completar la anastomosis
Isoflurano	Jinan Guangshengyuan Biotechnology Co., Ltd.	153107015	concentración del 5%; Usado para inducción de anestesia
Pinzas microvasculares	Shanghai Medical Devices Co., Ltd.	JCZ200	Usado para oclusión de vasos durante la cirugía
Pinzas para mosquitos	Shanghai Medical Devices Co., Ltd.	J31010	Utilizado para manipulación fina y preparación de puños
Solución salina normal (0,9%)	Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.	H20044304	Utilizado para riego y remojo en gasa (37 grados; C)
Pentobarbital (1%)	Shanghai Yuansi Technology Co., Ltd.	P0500000	40– 45 mg/kg; Utilizado para anestesia quirúrgica
Catéter venoso insertado periféricamente (PIVC)	Covidien	8888145015	Se usó para limpiar PV esposada y confirmar la patencia
Povidona-Yodo	Shanxi Trinda Biotechnology Co., Ltd.	41836054	Utilizado para la desinfección del sitio quirúrgico
Goma elástica (de Surgical Glove)	Ansell	N/A	Utilizado para la tracción SHIVC durante la cirugía del receptor
Sprague y dash; Dawley Rats	Huafukang (Pekín) Biotechnology Co., Ltd.	22001A	Ratas machos adultas, 8 y ndash; 10 semanas, 220 y un guiño; 250 g
Placa de Petri estéril (10 cm)	Shandong Enyou Biotechnology Co., Ltd.	H905001	Se utiliza para retener el injerto en una solución de UW durante la preparación ex vivo
Jeringuilla (20 mL)	Grupo Shandong Weigao Medical Polymer Products Co., Ltd.	20163141593	Usado para perfusión hepática controlada (3– 3,5 mL/min)
Solución de Preservación de la UW	Puente hacia la Vida	BTL-UW-1L	Mantenido en 4º grado; C; Utilizado para la perfusión de hígado por donante y la preservación de injertos