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Este estudio se realizó utilizando líneas celulares de leucemia mieloide aguda humana establecidas y sus derivados resistentes a la doxorubicina. No participaron participantes humanos, animales ni muestras primarias derivadas del paciente. Por lo tanto, no se requería la aprobación del comité de revisión institucional para la investigación con sujetos humanos ni la aprobación de ética animal. Las líneas celulares se obtuvieron del Instituto de Hematología de la Academia China de Ciencias Médicas, en Tianjin, China, y se mantuvieron en el Instituto de Hematología de Fujian, Hospital Unión de la Universidad Médica de Fujian. La identidad celular fue confirmada mediante evaluación cariológica y morfológica antes de la experimentación, y todos los cultivos celulares fueron analizados para detectar contaminación por micoplasmas. Los productos químicos, equipos y software utilizados en el protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Cultivo celular y confirmación del fenotipo resistente
Las células humanas de leucemia mieloide aguda HL60 y K562 y sus derivados resistentes a la doxorubicina, HL60/A y K562/A, fueron obtenidos del Instituto de Hematología de la Academia China de Ciencias Médicas, Tianjin, China. Las células se cultivaron en un medio Roswell Park Memorial Institute 1640, suplementado con suero bovino fetal al 10% y 1% penicilina-estreptomicina a 37 °C en una incubadora humidificada que contenía un 5% de dióxido de carbono.
Las células HL60/A se mantuvieron en un medio completo que contenía 1 μg/mL de doxorubicina, y las células K562/A se mantuvieron en un medio completo con 5 μg/mL de doxorrubicina para preservar el fenotipo resistente. La doxorrubicina se retiró del medio de cultivo un mes antes de las pruebas experimentales para evitar efectos agudos de selección de fármacos durante los ensayos de tratamiento.
Antes de los experimentos, el fenotipo resistente se reconfirmó comparando los valores de concentración inhibitoria de la mitad máxima de doxorubicina entre células parentales y resistentes. La estabilidad de la resistencia tras un mes de cultivo libre de fármacos se evaluó repitiendo el ensayo de sensibilidad a doxorrubicina y examinando la expresión basal de la P-glicoproteína y la proteína 1 asociada a múltiples fármacos. Los cultivos se utilizaron en experimentos solo cuando los derivados resistentes mantenían valores más altos de concentración inhibitoria media máxima y una mayor expresión del transportador que sus homólogos parentales.
2. Preparación de fármacos y diseño de tratamientos
FTY720, doxorrubicina y SC79 se prepararon como soluciones de serie según las instrucciones del fabricante. FTY720 y SC79 se disolvieron en dimetilsulfóxido, y se preparó doxorrubicina en el disolvente recomendado y se protegió de la luz durante el manejo. Las soluciones de trabajo se diluyeron frescas en medio de cultivo completo antes del tratamiento. La concentración final de dimetilsulfóxido se mantuvo idéntica en los grupos de tratamiento y no superó el 0,1%.
Los grupos de control del vehículo recibieron la misma concentración final de dimetilsulfóxido que los grupos de tratamiento correspondientes. Para experimentos de tratamiento combinado, se utilizó 5 μM FTY720 como concentración sensibilizante. La doxorrubicina se utilizó a 4 μM para células HL60/A y a 8 μM para células K562/A en ensayos de apoptosis y acumulación intracelular de doxorrubicina, salvo que se indique lo contrario.
3. Ensayo de viabilidad celular y cálculo de concentración inhibitoria semimáxima
Las células se sembraron en placas de 96 pozos a 1 × 104 células por pozo en un medio completo de 100 μL. Para las pruebas de un solo fármaco FTY720, las células HL60, K562, HL60/A y K562/A se trataron con 0, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50 y 100 μM FTY720 durante 48 horas. Para la prueba de sensibilidad a doxorrubicina, se trataron células HL60/A y K562/A con concentraciones seriadas de doxorrubicina en presencia o ausencia de 5 μM FTY720 durante 48 horas.
La viabilidad celular se midió utilizando el ensayo Kit de Conteo Celular 8 según las instrucciones del fabricante. Tras el tratamiento, se añadió el reactivo Kit de Conteo Celular 8 a cada pozo y la placa se incubó a 37 °C durante 2 horas. La absorbancia se midió a 450 nm usando un lector de microplacas.
La viabilidad relativa de la celda se calculó de la siguiente manera: viabilidad relativa de la celda = [(absorbancia de pozos tratados - absorbancia de pozos en blanco) / (absorbancia de pozos de control de vehículos - absorbancia de pozos en blanco)] × 100%
Los valores de concentración inhibitoria a media máxima se calcularon mediante regresión no lineal con un modelo logístico dosis-respuesta de cuatro parámetros en GraphPad Prism, versión 9.5. Cada experimento incluía tres réplicas biológicas independientes, con tres pozos técnicos por condición de tratamiento.
4. Análisis de combinación de fármacos
Los efectos de FTY720 sobre la sensibilidad a doxorrubicina se evaluaron comparando las relaciones dosis-respuesta en presencia o ausencia de FTY720. Las células HL60/A y K562/A se trataron con concentraciones seriadas de doxorubicina sola o doxorrubicina combinadas con FTY720 durante 48 horas.
La viabilidad celular se evaluó utilizando el Kit de Recuento Celular-8, y se calcularon valores de concentración inhibitoria a media máxima mediante regresión no lineal con un modelo logístico dosis-respuesta de cuatro parámetros. Los cambios en la sensibilidad a la doxorubicina se interpretaron en función de los desplazamientos en las curvas dosis-respuesta y las diferencias en los valores de concentración inhibitoria medio máximo entre grupos de tratamiento.
Como los experimentos no fueron diseñados como un estudio completo de matriz de dosis de razón fija, no se realizó un análisis formal de índice de combinación. Por lo tanto, los resultados se interpretaron como evidencia de una alteración de la sensibilidad a la doxorrubicina en lugar de una sinergia farmacológica definitiva.
5. Análisis de apoptosis mediante Anexina V y citometría de flujo de yoduro de propidio
Las células HL60/A y K562/A se sembraron en placas de 6 pozos a 4 × 10 célulasde 5 mL y tratadas durante 48 horas con vehículo, FTY720 solo, doxorubicina sola o doxorrubicina combinada con FTY720. Para el tratamiento combinado, se combinó 5 μM de FTY720 con 4 μM doxorubicina en células HL60/A o 8 μM doxorubicina en células K562/A.
Tras el tratamiento, se recogieron células, incluidas las suspendidas en el medio de cultivo, y se lavaron dos veces con solución salina fría tamponada con fosfato. Las células fueron resuspendidas en un tampón de unión a Annexin V a la concentración recomendada por el fabricante del kit de detección de apoptosis. Cada muestra se teñió con isotiocianato de Annexin V-fluorescein de 5 μL o Annexin V-alophycocyanin y 5 μL de yoduro propidio, seguida de una incubación durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
Las muestras se analizaron inmediatamente mediante citometría de flujo. Se usaron controles sin tinción, controles de una sola tinción y controles de fluorescencia menos uno para establecer compuertas de compensación y cuadrantes. Se excluyeron los escombros utilizando barreras de dispersión hacia adelante y lateral. Las primeras células apoptóticas se definieron como células negativas a Anexina V y propidio yoduro, y las células apoptóticas tardías o muertas como células Anexina V-positivas y propidio positivas al yoduro. La apoptosis total se calculó como la suma de fracciones celulares de apoptótica temprana y tardía. Se adquirieron al menos 10.000 eventos viables de célula única para cada muestra.
6. Ensayo intracelular de acumulación de doxorrubicina
Las células HL60/A y K562/A se sembraron en placas de 6 pozos a 4 × 105 células/mL y se cultivaron durante la noche. Las células se trataron luego con control vehicular, doxorrubicina sola o doxorubicina combinada con 5 μM FTY720. Las células HL60/A se trataron con doxorubicina de 4 μM, y las células K562/A con doxorubicina de 8 μM. Las células se incubaron durante 4 horas a 37 °C y se protegieron de la luz.
Tras el tratamiento, las células se extrajeron y lavaron dos veces con solución salina fría tamponada con fosfato para eliminar la doxorubicina extracelular. Las células fueron resuspendidas en solución salina tamponada con fosfato y analizadas mediante citometría de flujo utilizando la fluorescencia intrínseca de la doxorubicina. Se utilizaron células no tratadas para definir la autofluorescencia de fondo, y las células tratadas con doxorubicina como referencia positiva para fluorescencia. La acumulación intracelular de doxorrubicina se cuantificó como intensidad mediana de fluorescencia tras la exclusión de residuos y agregados. Los valores medianos de intensidad de fluorescencia se normalizaron al grupo solo de doxorrubicina dentro de cada experimento independiente.
7. Análisis citométrico de flujo de la expresión de proteínas P-glicoproteínas y proteínas asociadas a la resistencia multifármaco 1
Las células HL60/A y K562/A se sembraron en placas de 6 pozos a 2 × 106 celdas/mL y tratadas con 5 μM FTY720 o control de vehículo durante 24 horas. Tras el tratamiento, las células se lavaron dos veces con solución fisiológica tamponada con hielo frío y se resuspendieron en un tampón de tinción de células de 100 μL.
Las células se tiñeron con anticuerpo anti-P-glicoproteína conjugado con ficoeritrina y con el anticuerpo de proteína 1 asociada a resistencia multirfármaco conjugada con Alexa Fluor 647 en la dilución recomendada por el fabricante. Se incluyeron controles isotipo emparejados, controles sin tinte, controles de una sola tinción y controles de fluorescencia menos uno para la configuración y compensación de compuertas. Las muestras se incubaron durante 30 minutos a 4 °C en la oscuridad, se lavaron dos veces con tampón de tinción celular y se resuspendieron en tampón de tinción de 500 μL antes de la adquisición.
La citometría de flujo se realizó utilizando un citómetro de flujo BD FACScan. Se adquirieron al menos 10.000 eventos viables de célula única para cada muestra. Los niveles de expresión de la proteína P-glicoproteína y de la proteína 1 asociada a la resistencia a múltiples fármacos se cuantificaron como intensidad mediana de fluorescencia tras la resta de la señal de control isotipo-control correspondiente. Los valores normalizados se expresaron en relación con el grupo de control del vehículo dentro de cada experimento independiente.
8. Western blot y cuantificación densitométrica
Tras los tratamientos indicados, se recogieron y lavaron las células dos veces con solución salina fría tamponada con fosfato. La proteína total se extrajo utilizando un tampón de radioinmunoprecipitación suplementado con inhibidores de proteasa y fosfatasa. La concentración de proteínas se midió utilizando un kit de análisis de proteínas con ácido bicincónico.
Un total de 30 μg de proteína por carril se separaron mediante electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio y poliacrilamida y se transfirieron a las membranas de difluoruro de polivinilideno. Las membranas se bloquearon con albúmina sérica desnatada al 5% o al 5% de albúmina sérica bovina en solución fisiológica Tween 20 amortiguada con Tris durante 1 hora a temperatura ambiente.
Las membranas se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra la proteína quinasa B total, la proteína quinasa B fosforilada, el objetivo mecanista total de la rapamicina, el objetivo mecanicista fosforilado de la rapamicina, la caspasa-3 escindida, la poli(adenosina difosfato-ribosa) polimerasa escindida, la P-glicoproteína, la proteína 1 asociada a la resistencia a múltiples fármacos y la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa. Tras el lavado, las membranas se incubaron con los anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante correspondientes durante 1 hora a temperatura ambiente. Las bandas proteicas se visualizaron mediante detección mejorada de quimioluminiscencia.
Las intensidades de las bandas se cuantificaron usando el software ImageJ, versión 1.53t. La proteína quinasa B fosforilada se normalizó a la proteína quinasa B total, y el objetivo mecanicista fosforilado de rapamicina se normalizó a objetivo mecanicista total de la rapamicina. P-glicoproteína, proteína 1 asociada a la resistencia a múltiples fármacos, caspasa-3 escindida y poli(adenosina difosfato-ribosa) polimerasa escindida se normalizaron a gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa. Los valores normalizados se expresaron como cambios de pliegue en relación con el grupo de control del vehículo o solo doxorrubicina, dependiendo de la comparación. Se realizaron análisis de Western blot utilizando tres réplicas biológicas independientes. Las imágenes de Western blot sin recortar se depositaban en el repositorio público de datos o se subían como archivos suplementarios.
9. Experimento de rescate SC79
Para examinar si la señalización de la quinasa de la proteína B estaba asociada con los efectos observados de las células FTY720, HL60/A y K562/A se trataron con FTY720 en presencia o ausencia de SC79, un activador de la proteína quinasa B. Las células fueron pretratadas con 5 μM FTY720 durante 12 horas y luego tratadas con 30 μM SC79 o control vehicular durante 12 horas adicionales.
Tras el tratamiento, se evaluaron con Western blot la proteína quinasa B, el objetivo mecanista fosforilado de la rapamicina, la P-glicoproteína y los niveles de proteína 1 asociada a la resistencia a múltiples fármacos. Paralelamente, la apoptosis se evaluó mediante la tinción con Annexin V y yoduro de propidio tras el tratamiento con doxorubicina, FTY720 y SC79. Los efectos del rescate se interpretaron como evidencia asociada a las vías. Como no se realizó ningún experimento de sobreexpresión genética ni de knockdown, las conclusiones causales se presentaron con cautela.
10. Análisis estadístico y reporte de datos
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism, versión 9.5, y IBM SPSS Statistics, versión 23.0. Las réplicas biológicas se definieron como experimentos independientes realizados en diferentes días utilizando células cultivadas de forma independiente. Las réplicas técnicas se definieron como pozos repetidos o mediciones repetidas dentro del mismo experimento biológico.
Los datos se presentaron como media ± error estándar de la media, salvo que se especifique lo contrario. Se analizaron comparaciones en dos grupos utilizando una prueba t de Student bicolar sin pareja cuando los datos estaban aproximadamente distribuidos de forma normal. Se analizaron las comparaciones entre tres o más grupos utilizando un análisis unidireccional de la varianza, seguido de la prueba post hoc de Tukey. Se analizaron experimentos que involucraron dos factores independientes, como la concentración de fármacos y la condición de tratamiento, mediante un análisis bidireccional de la varianza seguido de una corrección adecuada por comparación múltiple.
Cuando no se soportaban supuestos de normalidad, se usaban pruebas no paramétricas. Se informaron valores p exactos siempre que fue posible. La significación estadística se definió como p < 0,05 tras corrección para comparaciones múltiples. Todas las leyendas de las figuras especificaban el número de réplicas biológicas, la prueba estadística utilizada, el significado de las barras de error y el umbral de significación. Los valores biológicos replicados individuales se mostraban en diagramas de dispersión o se superponían en gráficos de barras siempre que era posible.