Un sistema de reporte adenoviral basado en fibroblastos impulsado por el promotor del colágeno tipo I alfa 1 de ratón para el cribado de fármacos antifibróticos

Resumen

Este protocolo describe el desarrollo de un sistema de informe adenoviral basado en fibroblastos, controlado por un promotor de colágeno tipo I de ratón, que permite el seguimiento longitudinal de la activación de fibroblastos y facilita la cribado de alto rendimiento de compuestos antifibróticos.

Resumen

La fibrosis cardíaca, caracterizada por la activación anómala de los fibroblastos y el depósito excesivo de matriz extracelular, carece de terapias específicas dirigidas, en gran parte debido a la ausencia de métodos longitudinales, escalables y no destructivos in vitro plataformas de cribado. Los ensayos tradicionales de punto final y los modelos de células madre intensivos en recursos intrínsecamente impiden el monitoreo en tiempo real de la progresión fibrotica. Para superar estas limitaciones, este protocolo describe la generación, optimización y validación de un colágeno tipo I alfa 1 de ratón (Col1a1promotor impulsado por adenovirus mCherry sistema de marcador fluorescente (Ad-mCol1a1p-mCherry) en fibroblastos NIH/3T3. Se describen los pasos críticos para el empaquetamiento de adenovirus recombinante, la optimización de la transducción (multiplicidad de infección) para minimizar la citotoxicidad y el establecimiento de un modelo robusto de fibrosis inducida por el factor de crecimiento transformante beta (TGF-β). Al prescindir de la fijación celular, este sistema permite un monitoreo directo y longitudinal de la transcripción de colágeno en células vivas. La especificidad y fiabilidad del modelo se validan farmacológicamente mediante el inhibidor del receptor tipo I de TGF-β (ALK5) SB431542, con lecturas fluorescentes que se correlacionan con marcadores fibroticos endógenos cuantificados mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con retrotranscripción y ensayo inmunoenzimático (ELISA). En definitiva, esta plataforma de bajo costo proporciona una herramienta accesible para la selección de alto rendimiento de nuevos agentes antifibróticos, acelerando así la investigación cardiovascular traslacional.

Introducción

El manejo de la fibrosis cardíaca presenta desafíos clínicos significativos. Caracterizada por la activación anómala de fibroblastos quiescentes en miofibroblastos y la deposición excesiva de matriz extracelular (ECM), representa una vía terminal irreversible compartida por la insuficiencia cardíaca, el infarto de miocardio y otras enfermedades cardiovasculares^1,2,3. Sin embargo, las estrategias terapéuticas actuales enfrentan limitaciones importantes. Las intervenciones convencionales—como diuréticos, betabloqueadores e inhibidores del sistema renina-angiotensina-aldosterona—alivian principalmente el estrés hemodinámico sistémico y atenúan la activación neurohumoral^4,5,6,7. Estas terapias no logran atacar directamente la activación de los fibroblastos ni detener la deposición continua de colágeno. Además, aunque cascadas de señalización como la vía transformadora del crecimiento beta (TGF-β)/Smad, el estrés oxidativo y la reprogramación metabólica impulsan esta patología, traducir estos conocimientos en terapias antifibróticas de acción directa sigue siendo difícil debido a toxicidades sistémicas y mecanismos de entrega no específicos^8,9,10. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de terapias antifibróticas novedosas y específicas para cada diana. Un cuello de botella importante en la traslación es la falta de sistemas de evaluación funcional capaces de informar de forma sensible y dinámica sobre la activación de los fibroblastos. Los modelos experimentales tradicionales presentan limitaciones significativas que impiden un cribado farmacológico eficiente^11,12. Aunque los modelos animales in vivo reproducen la remodelación cardíaca global, presentan diferencias interespecíficas, cronogramas experimentales prolongados, altos costos y baja capacidad de procesamiento¹¹.

Para superar estos obstáculos, han surgido diversas plataformas de cribado in vitro; sin embargo, persisten defectos metodológicos críticos. Los ensayos de inmunofluorescencia de alto contenido requieren la fijación destructiva de las células y un procesamiento laborioso, proporcionando solo una instantánea estática en lugar de capturar la cinética en tiempo real de la activación de los fibroblastos. De manera similar, las plataformas que integran el monitoreo de impedancia sin etiquetas con espectrometría de masas (MS/MS) presentan falta de especificidad y baja escalabilidad, ya que las caídas de impedancia causadas por toxicidad celular general pueden confundirse fácilmente con una verdadera eficacia antifibrótica. Además, los sistemas reporteros diseñados mediante repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR) que utilizan células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) para rastrear marcadores del citoesqueleto (por ejemplo, la alfa-actina de músculo liso [α-SMA]/ACTA2) presentan barreras traductivas importantes¹³. Estos modelos basados en iPSCs son prohibitivamente costosos, técnicamente exigentes y en gran medida inaccesibles para cribados rutinarios de alto rendimiento. Asimismo, la dependencia de marcadores del citoesqueleto como α-SMA podría no reflejar con precisión el punto final patológico, ya que su expresión no se correlaciona estrictamente con la secreción funcional y la deposición excesiva de la MEC¹⁴. Por lo tanto, estos sistemas son insuficientes para trazar longitudinalmente las respuestas celulares en etapas tempranas a intervenciones farmacológicas.

En contraste, este protocolo describe un sistema longitudinal de reportero funcional impulsado por el promotor del gen de la alfa 1 del colágeno tipo I (Col1a1), con el objetivo de establecer una plataforma no destructiva y robusta para monitorear la activación de los fibroblastos. Dado que el colágeno tipo I es el componente predominante de la matriz extracelular depositado durante la remodelación cardíaca, capturar la activación transcripcional de su gen codificante, Col1a1, sirve como una lectura directa y patológicamente relevante de la activación de los fibroblastos. Este modelo basado en el promotor de Col1a1 permite un monitoreo continuo a nivel molecular de los procesos fibroticos, ofreciendo una plataforma sensible, longitudinal y cuantificable, optimizada para la selección de fármacos basada en mecanismos.

Protocolo

Confirmamos que todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales y nacionales. Dado que este estudio utilizó exclusivamente la línea celular establecida de fibroblastos embrionarios de ratón NIH Swiss (NIH/3T3) y el sistema reportero mCol1a1p-mCherry, y no involucró animales vertebrados, embriones ni sujetos humanos, no se requirió la aprobación ética por parte de un comité de revisión institucional para los procedimientos descritos en este manuscrito.

Todos los procedimientos que involucraron vectores adenovirales recombinantes se realizaron de acuerdo con las regulaciones institucionales de bioseguridad y las prácticas estándar de Nivel de Bioseguridad 2 (BSL-2). El manejo del virus, la transducción, el almacenamiento y la eliminación de desechos se llevaron a cabo utilizando cabinas de seguridad biológica certificadas y el equipo de protección personal adecuado. Los desechos líquidos que contenían material adenoviral se descontaminaron utilizando una solución de lejía recién preparada antes de su eliminación, y los materiales desechables contaminados se autoclavarón de acuerdo con los protocolos institucionales de bioseguridad. Los derrames accidentales se desinfectaron inmediatamente utilizando agentes virucidas aprobados, siguiendo los procedimientos institucionales para respuesta a derrames.

1. Vista general del flujo de trabajo experimental

1. Genere un adenovirus recombinante impulsado por el promotor murino Col1a1 como se describe en el Paso 2.
2. Optimice las condiciones de transducción viral en fibroblastos NIH/3T3 como se describe en el Paso 3.
3. Establezca un modelo de reportero de fibrosis in vitro sensible al TGF-β como se describe en el Paso 4.
4. Valide la estabilidad, especificidad y reproducibilidad biológica del modelo mediante la estimulación con TGF-β dependiente del tiempo y de la dosis como se describe en el Paso 4.
5. Realice la inhibición farmacológica utilizando SB431542 como se describe en el Paso 5.
6. Realice análisis posteriores mediante ensayo inmunoenzimático (ELISA) y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR) como se describe en el Paso 5.
   NOTA: Consulte la Figura 1A para obtener una descripción esquemática del flujo experimental. Consulte la Tabla de Materiales para conocer los aparatos y reactivos experimentales.

Figura 1. Flujo de trabajo para el establecimiento y validación del sistema reportero adenoviral mCol1a1p-mCherry en fibroblastos. (A) Esquema general de la construcción del sistema reportero adenoviral (AdV) mCol1a1p-mCherry y del flujo experimental para la validación del modelo en fibroblastos NIH/3T3. El flujo de trabajo incluye la clonación del promotor, ensamblaje del adenovirus recombinante, empaquetamiento viral en células HEK293, optimización de la multiplicidad de infección (MOI) y cribado posterior de fluorescencia de alto contenido. (B) Imágenes representativas de fluorescencia de fibroblastos NIH/3T3 infectados con el adenovirus Ad-mCol1a1p-mCherry a MOIs de 0, 1, 10, 100 y 1000. Los núcleos fueron teñidos con Hoechst 33342 (azul), y la fluorescencia de mCherry (rojo) indica la actividad del promotor Col1a1. La intensidad de fluorescencia se cuantificó mediante imágenes de alto contenido y se normalizó respecto al número de núcleos. Se seleccionó un MOI de 100 para experimentos posteriores basándose en una expresión homogénea y robusta del reportero con alteraciones morfológicas mínimas. Barras de escala = 200 µm. Esta figura fue creada con BioRender.com con licencias autorizadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Construcción, empaquetamiento y amplificación del adenovirus con el promotor mCol1a1

1. Construcción del vector adenoviral recombinante
   1. Clonar el fragmento del promotor murino Col1a1 de 2354 pb (coordenadas genómicas: chr11:94824779–94827132; −2271 a +83 pb respecto al sitio de inicio de la transcripción [TSS]) aguas arriba del gen reportero mCherry en el vector intermediario adenoviral pDC315.
      NOTA: La secuencia completa del promotor Col1a1 y el mapa detallado del plásmido pDC315-mCol1a1p-mCherry se proporcionan en el Archivo Suplementario 1 y la Figura Suplementaria 1.
   2. Linealizar el vector pDC315 usando BamHI y KpnI. Amplificar el inserto del promotor mediante cebadores que contengan brazos de homología de 15–25 pb.
      NOTA: Utilizar una estrategia de clonación sin costuras basada en recombinación homóloga para facilitar la recombinación in vitro.
   3. Verificar el plásmido resultante mediante cribado por PCR y secuenciación de Sanger.
      NOTA: Inspeccionar cuidadosamente la secuencia de la unión entre el promotor y el gen reportero para asegurar que no estén presentes desplazamientos del marco de lectura ni codones de terminación prematuros.
   4. Generar el adenovirus recombinante utilizando el sistema AdMax mediante recombinación intracelular mediada por Cre.
      NOTA: El plásmido andamio pBHGloxΔE1,3Cre contiene un genoma Ad5 no replicativo con deleciones en E1/E3 y un casete de expresión de recombinasa Cre que facilita la recombinación sitio-específica con el sitio loxP en el vector intermediario.
   5. Co-transfectar células HEK293 con el vector intermediario validado pDC315-mCol1a1p-mCherry y el plásmido andamio adenoviral pBHGloxΔE1,3Cre.
2. Empaquetamiento y amplificación del adenovirus
   1. Mantener las células HEK293 en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS). Utilizar células de bajo número de pases (<20 pases) para el empaquetamiento del adenovirus.
   2. Siembra de células HEK293 al 30%–40% de confluencia 24 h antes de la transfección para alcanzar un 50%–60% de confluencia en el momento de la transfección.
   3. Co-transfectar células HEK293 con 5 µg del plásmido intermediario y 5 µg del plásmido auxiliar pBHGloxΔE1,3Cre utilizando el reactivo de transfección Lipofectamine 2000.
      NOTA: Mantener una relación de ADN a reactivo de 1:1 (10 µg de ADN total por 10 µL de reactivo de transfección).
   4. Cultivar las células transfectadas a 37°C con 5% de CO₂ y monitorearlas diariamente en busca de efectos citopáticos.
      NOTA: Los efectos citopáticos iniciales pueden requerir entre 7 y 14 días para aparecer. Si el medio se vuelve ácido (amarillo), realizar un cambio parcial suave del medio sin perturbar las células.
   5. Recoger las células y el sobrenadante cuando se observen efectos citopáticos típicos, caracterizados por redondeo y encogimiento celular, y al menos el 50% de las células se hayan desprendido de la superficie del cultivo.
      NOTA: Esta etapa se alcanza típicamente entre 10 y 15 días posteriores a la transfección.
   6. Realizar tres ciclos de congelación-descongelación congelando las muestras a −70°C durante 30 min y descongelándolas en un baño de agua a 37°C.
   7. Vortexar la suspensión durante 30 s tras cada paso de descongelación para facilitar la lisis celular.
      NOTA: Evitar la incubación prolongada a 37°C durante la descongelación para preservar la estabilidad viral.
   8. Preparar diluciones seriadas decimales del lisado viral (10⁻¹ a 10⁻¹³) utilizando DMEM completo. Añadir 90 µL de cada dilución viral a células HEK293 sembradas en placas de 96 pocillos, utilizando 10 pocillos réplica por dilución.
      NOTA: Se definió un título viral de ≥1 × 10⁹ PFU/mL como punto final suficiente de amplificación para la purificación posterior.
   9. Clarificar 10 mL de lisado viral crudo mediante un filtro de 0,45 µm para eliminar restos celulares.
   10. Tratar el lisado clarificado con nucleasa Benzonase (10 U/mL) a 37°C durante 30 min.
   11. Purificar el adenovirus recombinante utilizando el Kit de Purificación Adeno-X según las instrucciones del fabricante.
       NOTA: Mezclar el lisado con tampón de dilución 1× antes de cargarlo en el filtro de purificación previamente equilibrado. Lavar el filtro con Tampón de Lavado 1× y eluir el virus purificado utilizando 3 mL de Tampón de Elución 1×.
   12. Incubar las placas durante 10 días y evaluar los efectos citopáticos (CPE) bajo un microscopio de luz. Puntuar el CPE positivo basándose en el redondeo celular característico y el desprendimiento. Calcular el título viral infeccioso utilizando el método de Spearman–Karber basado en la puntuación del CPE.
       NOTA: Asegurarse de que el stock viral final alcance al menos 1 × 10¹¹ PFU/mL para aplicaciones posteriores.
   13. Aliquotar el adenovirus purificado y almacenar el stock viral a −80°C.
       NOTA: Almacenar los alícuotas de adenovirus purificado a −80°C para su conservación a largo plazo. Evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación para preservar la infectividad viral.

3. Cultivo celular y optimización de las condiciones de infección viral

1. Mantenga los fibroblastos NIH/3T3 en DMEM/Mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F12) suplementado con 10% de SFB y 1% de penicilina-estreptomicina.
   NOTA: Utilice células entre los pasajes 3 y 8 que hayan alcanzado una confluencia del 70%–80% en el matraz de origen para asegurar un estado celular constante.
2. Siembre los fibroblastos NIH/3T3 en placas de 384 pozos a una densidad de 4 × 10³ células por pozo en 40 µL de medio de cultivo completo.
3. Incube las células a 37°C con 5% de CO₂ durante 12 h para permitir la adhesión celular y la entrada en la fase logarítmica de crecimiento.
   NOTA: Para minimizar la distribución desigual de células y los efectos de borde, deje reposar las placas a temperatura ambiente durante 20–30 min antes de la incubación. Llene los pozos periféricos con solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) o agua estéril.
4. Infecte las células con el adenovirus recombinante a multiplicidades de infección (MOI) que varíen de 1 a 1.000, junto con un control no infectado.
   NOTA: Calcule el volumen requerido del adenovirus utilizando la siguiente fórmula:
   
   
   Aquí, V es el volumen del stock de adenovirus (mL), N es el número de células sembradas por pozo (4 × 10³), MOI es la multiplicidad de infección deseada, y T es la titulación viral infecciosa (PFU/mL). El stock viral utilizado en este estudio tenía una titulación infecciosa de 1 × 10¹¹ PFU/mL, determinada mediante el método de Spearman-Karber descrito en el paso 2.2.12.
5. Asegúrese de que el volumen añadido del stock viral no exceda el 10% del volumen total del pozo.
   NOTA: Volúmenes excesivos de stock viral pueden alterar el pH del medio e inducir citotoxicidad no específica.
6. Reemplace el medio que contiene el virus por 40 µL de medio de cultivo completo fresco 24 h después de la infección.
   NOTA: Utilice DMEM/F12 suplementado con 10% de SFB y 1% de penicilina-estreptomicina, como en el paso 3.1.
7. Realice el cambio de medio utilizando un manipulador automático de líquidos de baja velocidad o inclinando cuidadosamente las puntas de pipetas multicanal contra la pared superior lateral de cada pozo.
   NOTA: Evite la aspiración al vacío convencional al manipular placas de 384 pozos para minimizar la desprendimiento celular.
8. Defina el MOI óptimo como la dosis viral más baja que produzca fluorescencia visible y homogénea de mCherry, manteniendo al mismo tiempo la morfología celular y los recuentos nucleares comparables a los de las células del control no infectado.
   NOTA: Evalúe la expresión del gen reportero mediante recuentos nucleares con tinción de Hoechst e imágenes de fluorescencia. Las células deben conservar su morfología alargada característica sin redondearse ni desprenderse. MOIs excesivamente altos pueden inducir activación basal de mCherry mediante respuestas de estrés celular. Los resultados representativos de fluorescencia a diferentes MOIs se muestran en Figura 1B.
9. Seleccione el MOI optimizado para todos los experimentos posteriores.
   NOTA: En este estudio, se seleccionó un MOI de 100 para los experimentos subsiguientes.

4. Evaluación de la estabilidad del modelo mediante la estimulación con TGF-β

1. Infecte fibroblastos NIH/3T3 con el adenovirus recombinante a una MOI optimizada de 100, según se determinó en el paso 3.9.
2. Somete a los fibroblastos a privación de suero en DMEM/F12 que contenga 0,2 % de suero bovino fetal (FBS) durante 12 h antes de la estimulación con TGF-β.
   NOTA: La privación de suero se realizó para sincronizar las células y minimizar la activación basal del promotor Col1a1.
3. Prepara una solución stock de TGF-β humano recombinante a 100 µg/mL utilizando HCl 4 mM que contenga 0,1 % de albúmina sérica bovina (BSA).
   NOTA: Aliquota la solución stock de TGF-β en volúmenes pequeños y almacénala a −80°C para evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación.
4. Trata las células con un gradiente de concentración de TGF-β que varíe de 0–40 ng/mL en seis réplicas biológicas independientes.
   NOTA: La condición de 0 ng/mL sirvió como grupo control no estimulado.
5. Incuba las células estimuladas a 37°C con 5 % de CO₂ durante 24, 48 u 80 h. Utiliza placas paralelas separadas para cada punto temporal de imagen para minimizar la fototoxicidad acumulativa.
6. Tiñe las células con solución de Hoechst 33342 a una concentración de trabajo final de 2,5 µg/mL durante 15 min antes de la adquisición de imágenes.
   NOTA: Prepara la solución de tinción diluyendo la solución stock de Hoechst 33342 de 10 mg/mL en una proporción de 1:4.000 en PBS estéril. Realiza la tinción en condiciones protegidas de la luz para minimizar el fotoblancamiento.
7. Adquiere imágenes de fluorescencia utilizando un sistema de imagen de alto contenido equipado con un objetivo seco de 10×.
8. Captura cinco campos no superpuestos por pocillo en formato de placa de 384 pocillos para cada condición experimental.
   NOTA: Mantén configuraciones de imagen idénticas en todos los grupos experimentales para asegurar comparabilidad. Utiliza enfoque automático láser y mantén condiciones controladas del entorno a 37°C con 5 % de CO₂ durante la adquisición de imágenes de células vivas.
9. Adquiere imágenes de fluorescencia de mCherry con excitación a 561 nm, un filtro de emisión de banda pasante 600/52 (BP600/52) y un tiempo de exposición de 200 ms.
10. Adquiere imágenes de fluorescencia de Hoechst con excitación a 405 nm, un filtro de emisión BP445/45 y un tiempo de exposición de 30 ms.
    NOTA: Establece la ganancia de la cámara en 1,0 y adquiere todas las imágenes a resolución máxima de la cámara utilizando bining 1 × 1 para mantener la detección lineal de fluorescencia y maximizar la resolución espacial.
11. Analiza las imágenes adquiridas utilizando el software de análisis de imágenes CellPathfinder.
12. Identifica núcleos en el canal de Hoechst como objetos primarios utilizando un diámetro nuclear de referencia de 20 µm y un rango de área de 20–400 µm².
13. Define regiones citoplasmáticas de interés (ROIs) en el canal de mCherry expandiendo desde el límite nuclear utilizando un diámetro celular de referencia de 60 µm.
    NOTA: Aplica un filtro de “Excluir bordes” durante la segmentación para eliminar células parciales que toquen los bordes de la imagen.
14. Calcula la intensidad media de fluorescencia para cada célula identificada y determina la intensidad media de fluorescencia por pocillo a partir de los cinco campos capturados.

5. Validación de la fiabilidad del modelo mediante ELISA y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real

1. Infecte fibroblastos NIH/3T3 con el adenovirus recombinante a la MOI optimizada de 100, como se describe en el paso 3.9.
2. Pretienda las células con SB431542 durante 30–60 min antes de la estimulación con TGF-β.
   NOTA: Prepare una solución stock de SB431542 al 20 mM en dimetilsulfóxido (DMSO) y almacene las alícuotas a −20°C.
3. Trate las células con 10 ng/mL de TGF-β y SB431542 a concentraciones finales de 1, 5, 10 y 15 µM. Incluya un grupo control de vehículo que contenga DMSO al 0,1% (v/v) sin tratamiento con SB431542.
   NOTA: Mantenga la concentración final de DMSO al 0,1% (v/v) en todos los grupos de tratamiento.
4. Prepare la solución de trabajo de TGF-β utilizando un método de dilución en dos pasos.
   NOTA: Diluya la solución stock de TGF-β de 100 µg/mL (preparada en HCl 4 mM que contiene BSA al 0,1%) 1:100 en PBS estéril antes de una dilución adicional en medio de cultivo completo para alcanzar la concentración de trabajo final de 10 ng/mL.
5. Incube las células tratadas en placas de 6 pocillos durante 24 h a 37°C con 5% de CO₂.
6. Recopile 2 mL de sobrenadante de cultivo de cada pocillo para análisis por ELISA.
7. Centrifugue los sobrenadantes recopilados a 1.000 × g durante 5 min a 4°C para eliminar los restos celulares.
8. Aliquote los sobrenadantes clarificados y almacénelos a −80°C hasta el análisis por ELISA.
   NOTA: Los sobrenadantes clarificados pueden almacenarse a −80°C antes del análisis por ELISA.
9. Lave suavemente las células adherentes con PBS frío con hielo tras la eliminación del sobrenadante.
10. Añada 1 mL de reactivo TRIzol directamente a cada pocillo para lisar las células.
    NOTA: Pipetee el lisado varias veces para asegurar una homogeneización completa antes de transferir las muestras a tubos de microcentrífuga. Los lisados de ARN pueden almacenarse a −80°C antes de la extracción de ARN.
11. Extraiga ARN total de los lisados para análisis de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa por transcripción inversa (RT-qPCR).
12. Realice la transcripción inversa utilizando 1 µg de ARN total.
    NOTA: Lleve a cabo la transcripción inversa utilizando las siguientes condiciones de reacción: 25°C durante 10 min, 42°C durante 15 min y 85°C durante 2 min.
13. Realice la PCR cuantitativa utilizando PerfectStart Green qPCR SuperMix. Prepare cada reacción en un volumen final de 20 µL que contenga 5 µL de ADN complementario (cADN) como molde.
14. Realice las reacciones de qPCR utilizando las siguientes condiciones de ciclado: desnaturalización inicial a 94°C durante 30 s, seguida de 40 ciclos de 94°C durante 5 s, 60°C durante 15 s y 72°C durante 10 s.
    NOTA: Realice un análisis de la curva de fusión tras la amplificación para confirmar la especificidad del producto.
15. Normalice la expresión del gen Col1a1 respecto al ARNr 18S como control interno.
    NOTA: Todas las secuencias de cebadores se proporcionan en la Tabla Suplementaria 1.
16. Cuantifique los niveles de proteína de colágeno I secretada en los sobrenadantes clarificados mediante ELISA según las instrucciones del fabricante. El rango de la curva estándar para el ensayo de ELISA de colágeno tipo I de ratón es de 0,78–50 ng/mL, con una sensibilidad de detección del ensayo de 0,37 ng/mL.
17. Analice todos los estándares y muestras en duplicado técnico y mida la densidad óptica (DO) a 450 nm utilizando un lector de microplacas.
    NOTA: Utilice sobrenadantes clarificados sin diluir para maximizar la sensibilidad del ensayo en la detección de Col1a1 secretado.

Resultados

En la Figura 1A se muestra un esquema general de la construcción y empaquetamiento del adenovirus recombinante mCol1a1p-mCherry. El promotor de Col1a1 de ratón se clonó aguas arriba del gen reportero mCherry e incorporó en un vector adenoviral, seguido del empaquetamiento viral y la amplificación en células HEK293. El flujo de trabajo ilustra los pasos experimentales clave, incluyendo la infección viral, la estimulación fibrogénica, la intervención farmacológica y la lectura de la señal basada en fluorescencia. Este esquema proporciona un marco visual para la implementación del sistema de reportero y apoya la interpretación de los experimentos posteriores de validación funcional.

Para determinar las condiciones óptimas de infección viral, los fibroblastos NIH/3T3 fueron infectados con el adenovirus mCol1a1p-mCherry en una serie de MOI. Como se muestra en Figura 1B, la intensidad de fluorescencia de mCherry aumentó con el incremento del MOI. En MOI bajos, la expresión del reportero fue débil y heterogénea, lo que representa una condición subóptima para el análisis cuantitativo. En MOI altos, las células mostraron una morfología alterada, incluyendo redondeo y desprendimiento, lo que indica efectos citotóxicos. Un MOI de 100 produjo una fluorescencia intensa y homogénea con la morfología celular preservada, por lo tanto se seleccionó como la condición óptima para experimentos posteriores.

A la MOI optimizada, los fibroblastos NIH/3T3 fueron estimulados con concentraciones crecientes de TGF-β. La fluorescencia del reportero se midió a las 24, 48 y 72 h tras la estimulación. Como se muestra en la Figura 2A–C, la intensidad de la fluorescencia de mCherry aumentó de manera dependiente de la concentración en todos los puntos temporales. La intensidad de la señal aumentó progresivamente entre las 24 y 72 h, lo que demuestra una respuesta dependiente del tiempo. Estos resultados representan un resultado positivo, lo que indica que el sistema de reportero responde de forma longitudinal y reproducible a la estimulación fibrótica.

Figura 2. Activación dependiente del tiempo y de la dosis del reportero mCol1a1p-mCherry mediante la estimulación con factor de crecimiento transformante beta (TGF-β). Los fibroblastos NIH/3T3 infectados con el adenovirus Ad-mCol1a1p-mCherry en la MOI optimizada fueron estimulados con concentraciones crecientes de TGF-β. Se muestran imágenes de fluorescencia representativas y los análisis cuantitativos correspondientes de la actividad del reportero mCherry a las 24 h (A), 48 h (B) y 72 h (C) posteriores a la estimulación. La fluorescencia de mCherry (roja) refleja la actividad del promotor Col1a1, y los núcleos fueron contratinjidos con Hoechst 33342 (azul). La intensidad de fluorescencia se cuantificó mediante imágenes de alto contenido y se normalizó respecto al número de núcleos. Los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM) a partir de seis réplicas biológicas independientes por condición. Las comparaciones estadísticas se realizaron en relación con el grupo control no tratado utilizando un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. Los parámetros de imagen se mantuvieron constantes en todas las condiciones experimentales. Barras de escala = 200 µm. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Para evaluar la especificidad de la vía, los fibroblastos NIH/3T3 fueron tratados con el inhibidor del receptor tipo I de TGF-β (ALK5) SB431542 bajo estimulación con TGF-β. Como se muestra en Figura 3A–C, SB431542 redujo la intensidad de fluorescencia de mCherry de manera dependiente de la dosis. Se observó inhibición de la actividad del reportero en todos los puntos temporales analizados, con una supresión mayor a concentraciones más altas del inhibidor. Estos resultados representan un resultado positivo, lo que indica que la activación del reportero depende de la señalización de TGF-β y puede ser modulada farmacológicamente.

Figura 3. SB431542 inhibe la activación inducida por TGF-β del reportero mCol1a1p-mCherry de manera dependiente del tiempo y de la dosis. Los fibroblastos NIH/3T3 infectados con el adenovirus Ad-mCol1a1p-mCherry fueron estimulados con TGF-β (10 ng/mL) en presencia de concentraciones crecientes del inhibidor del receptor tipo I de la transformación del factor de crecimiento beta (ALK5) SB431542 (0, 1, 5, 10 y 15 µM; abreviado como SB43 en los paneles de la figura). Se muestran imágenes de fluorescencia representativas y los análisis cuantitativos correspondientes a las 24 h (A), 48 h (B) y 72 h (C) posteriores al tratamiento. La fluorescencia de mCherry (roja) refleja la actividad del promotor Col1a1, y los núcleos fueron contratinjidos con Hoechst 33342 (azul). La intensidad de fluorescencia se cuantificó mediante imágenes de alto contenido y se normalizó respecto al número de núcleos. Los datos se presentan como media ± EE de seis réplicas biológicas independientes por condición. Las comparaciones estadísticas se realizaron en relación con el grupo tratado con TGF-β utilizando ANOVA de un factor seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. Los parámetros de imagen se mantuvieron constantes en todas las condiciones experimentales. Barras de escala = 200 µm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para evaluar si la actividad del gen reportero refleja respuestas fibróticas endógenas, se analizaron fibroblastos NIH/3T3 bajo condiciones optimizadas de infección, estimulación e inhibición. El flujo experimental utilizado para la validación del sistema reportero se resume en la Figura 4A. Los marcadores asociados a fibrosis se midieron a nivel de proteína y de ARNm. Como se muestra en la Figura 4B–C, el ELISA demostró un aumento en la secreción de proteínas asociadas a fibrosis tras la estimulación con TGF-β, lo cual disminuyó tras el tratamiento con SB431542. De manera consistente, la RT-qPCR mostró cambios correspondientes en la expresión de genes relacionados con fibrosis, incluyendo Col1a1. La concordancia entre la lectura de fluorescencia, la secreción de proteínas y la expresión génica representa un resultado positivo de validación, lo que indica que el sistema reportero refleja la activación fibrótica bajo estas condiciones.

Figura 4. Validación del sistema reportero mCol1a1p-mCherry mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con retrotranscripción (RT-qPCR) y ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). (A) Esquema general del flujo experimental para la validación del sistema reportero. Los fibroblastos NIH/3T3 fueron estimulados con TGF-β (10 ng/mL) y tratados con concentraciones crecientes del inhibidor del receptor de TGF-β SB431542 (SB43). Se recolectaron lisados celulares y sobrenadantes de cultivo para análisis posteriores. (B) Análisis cuantitativo de la expresión del ARN mensajero (ARNm) de Col1a1 determinado mediante RT-qPCR bajo estimulación con TGF-β a lo largo de un gradiente de concentración de SB431542. Los niveles relativos de expresión de ARNm de Col1a1 se normalizaron respecto al ARN ribosómico 18S (ARNr 18S) y se expresaron como cambio de expresión relativo al grupo control no tratado. (C) Cuantificación de los niveles de colágeno tipo I secretado en los sobrenadantes de cultivo celular mediante ELISA, en las mismas condiciones experimentales que en el panel B. Las concentraciones de colágeno tipo I se expresan en ng/mL. Los datos se presentan como media ± EE de seis réplicas biológicas independientes por condición. Las comparaciones estadísticas se realizaron respecto al grupo tratado con TGF-β utilizando ANOVA de un solo factor seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Archivo suplementario 1. Secuencia nucleotídica completa del fragmento del promotor de Col1a1 de ratón utilizado para la construcción del vector viral adenoviral con gen reportero. La región del promotor de 2354 pb corresponde a las coordenadas genómicas chr11:94824779–94827132 (NC_000077.7) y abarca desde −2271 hasta +83 pb respecto al sitio de inicio de la transcripción (TSS). El fragmento del promotor se clonó aguas arriba del gen reportero mCherry en el vector intermediario pDC315 para la generación del sistema viral adenoviral recombinante con gen reportero.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria S1. Secuencias de cebadores utilizadas para el análisis de RT-qPCR. Se indican las secuencias de los cebadores directos e inversos para Col1a1 y el gen de referencia interno 18S rRNA en orientación 5′–3′.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S1. Mapa del plásmido del vector intermediario adenoviral pDC315-mCol1a1p-mCherry. El fragmento de 2354 pb del promotor del gen Col1a1 de ratón se insertó aguas arriba del gen reportero mCherry mediante una estrategia de clonación perfecta basada en recombinación homóloga para la generación del constructo recombinante adenoviral reportero.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

La fibrosis cardíaca contribuye a la progresión de la insuficiencia cardíaca, y el desarrollo de terapias antifibróticas efectivas está limitado por la falta de plataformas de cribado longitudinal^2,13. Los métodos convencionales para evaluar la eficacia antifibrótica, incluyendo la transferencia Western, RT-qPCR y la tinción de inmunofluorescencia, dependen de mediciones puntuales que requieren lisis o fijación celular. Estos enfoques impiden el monitoreo en tiempo real de la progresión fibrótica en células vivas y limitan su aplicabilidad para análisis longitudinales y de alto rendimiento. Además, la generación de líneas celulares estables con reporteros mediante transfección de plásmidos o integración lentiviral suele estar restringida por baja eficiencia de transfección en fibroblastos, variabilidad asociada a la integración genómica aleatoria y silenciamiento progresivo de la expresión del reportero durante pases continuos¹⁵.

Aunque los vectores lentivirales se utilizan frecuentemente para la transferencia génica en fibroblastos NIH/3T3, en nuestro estudio se empleó específicamente un sistema de reportero adenoviral para preservar la fidelidad fisiológica de los fibroblastos. Los lentivirus se integran de forma permanente en el genoma del huésped, lo que conlleva un riesgo inherente de mutagénesis por inserción que podría interrumpir inadvertidamente las redes de señalización endógenas, una preocupación fundamental al evaluar cascadas complejas como la fibrogénesis inducida por TGF-β. En contraste, los vectores adenovirales permanecen episomales, garantizando la integridad genómica. Además, al evitar la prolongada selección con antibióticos necesaria para líneas celulares estables con lentivirus, se previenen cambios fenotípicos inducidos por el tratamiento, permitiendo una expresión transitoria rápida, robusta y altamente eficiente, adecuada para ensayos de alto rendimiento.

Para abordar estas limitaciones técnicas, el sistema de reportero adenoviral dirigido por el promotor mCol1a1 que expresa mCherry proporciona un método para monitorear la activación de fibroblastos in vitro. El sistema combina la entrega adenoviral con el promotor murino Col1a1, un marcador transcripcional asociado con la activación de fibroblastos y el depósito de matriz extracelular¹⁶. Acoplar la actividad del promotor Col1a1 a un reportero fluorescente permite visualizar y cuantificar las respuestas transcripcionales fibróticas en células vivas. La fluorescencia del reportero aumenta tras la estimulación con TGF-β en múltiples puntos temporales, reflejando la progresión longitudinal de la activación de fibroblastos. La inhibición de la actividad del reportero por el inhibidor de ALK5 SB431542 indica una regulación dependiente de la vía. La correspondencia entre la fluorescencia del reportero y la expresión endógena de genes y proteínas asociados con fibrosis, medida mediante RT-qPCR y ELISA, respalda el uso de este método para monitorear respuestas fibróticas bajo estas condiciones.

Estudios recientes han utilizado células cardíacas derivadas de iPSC combinadas con perturbaciones genéticas basadas en CRISPR-Cas9 para la selección de fármacos y el descubrimiento de dianas^11,13. Por ejemplo, se han aplicado fibroblastos cardíacos derivados de iPSC con reporteros fluorescentes diseñados mediante CRISPR en enfoques de cribado a gran escala de compuestos^11,17. Aunque estos métodos ofrecen alta precisión genética, están asociados con largos plazos de diferenciación, complejidad técnica, variabilidad entre lotes y un mayor costo experimental^13,18. En comparación, la plataforma de reportero adenoviral descrita aquí permite una implementación más rápida sin necesidad de edición del genoma ni diferenciación celular prolongada. Estos enfoques pueden utilizarse de manera complementaria, empleando el sistema de reportero mCol1a1p-mCherry como herramienta inicial de cribado y los modelos basados en iPSC para la validación posterior¹¹.

El sistema de informe mCol1a1p-mCherry descrito aquí proporciona un método para cribar compuestos candidatos, incluyendo moduladores metabólicos y productos naturales, en un modelo basado en fibroblastos. Para garantizar la reproducibilidad de este protocolo, es necesario prestar atención a varios pasos críticos y consideraciones de solución de problemas. En primer lugar, es esencial la pureza de la preparación de adenovirus. El uso de lisados virales no purificados puede introducir restos de células huésped y componentes citotóxicos, lo que provocaría efectos no específicos en los fibroblastos NIH/3T3 y dificultaría la interpretación de la señal del reportero. Además, para asegurar una reproducibilidad rigurosa y una consistencia entre lotes en aplicaciones de cribado posteriores, cada preparación viral se sometió a una purificación estandarizada y se cuantificó estrictamente mediante un ensayo de dilución en punto final. Al aplicar una multiplicidad de infección (MOI) precisamente definida basada en títulos virales funcionales (PFU/mL) en lugar de cantidades volumétricas, logramos neutralizar las variaciones entre lotes, estandarizando así la respuesta del reportero en todos los experimentos independientes. En segundo lugar, durante la optimización de esta MOI, es importante asegurarse de que el volumen del inóculo viral no supere el 10 % del volumen total del cultivo. Un exceso de tampón viral puede alterar el pH y la osmolaridad del medio de cultivo, lo que podría inducir respuestas de estrés celular independientes de la estimulación por TGF-β.

Además, manipular placas de 384 pocillos para imágenes de alto contenido presenta desafíos técnicos. Los fibroblastos NIH/3T3 son susceptibles a la desprendimiento durante el intercambio de medio y los pasos de lavado. Una manipulación suave de líquidos, como el uso de dispensadores automáticos con velocidades bajas de dispensación o colocar las puntas de pipeta en ángulo contra las paredes laterales de los pocillos, puede reducir la pérdida celular. Para minimizar la activación basal del promotor Col1a1 y mejorar la relación señal-ruido, se puede emplear la privación de suero durante 12–24 h antes de la estimulación con TGF-β. Durante imágenes secuenciales de células vivas en múltiples puntos temporales (por ejemplo, 24, 48 y 72 h), se debe minimizar la fototoxicidad acumulativa y los efectos de unión al ADN derivados de las tinciones repetidas con Hoechst, optimizando las condiciones de exposición o utilizando placas experimentales paralelas para cada punto temporal¹⁹.

Se deben considerar varias limitaciones de este método. En primer lugar, el sistema se basa en una línea celular de fibroblastos inmortalizados y no representa completamente la heterogeneidad celular de los fibroblastos cardíacos in vivo. En segundo lugar, el sistema reportero refleja la activación transcripcional de Col1a1 y no captura la regulación postranscripcional ni la maduración de la matriz extracelular. Las adaptaciones futuras podrían incluir el uso de fibroblastos cardíacos primarios, sistemas de cultivo conjunto o modelos tridimensionales para mejorar la relevancia fisiológica. En resumen, este protocolo describe un sistema reportero adenoviral dirigido por el promotor de Col1a1 para monitorear la activación de fibroblastos. El método integra la entrega viral, la modulación farmacológica y ensayos moleculares complementarios para permitir un análisis longitudinal y no destructivo en células vivas. Este enfoque podría aplicarse al cribado de compuestos y al estudio de procesos de señalización fibrótica bajo condiciones in vitro controladas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa microscópica de fondo de vidrio de 384 pocillos	Cellvis, EE. UU.	P384-1.5H-N	Placa de fondo de vidrio de 384 pocillos utilizada para siembra celular, infección viral, tinción e imagen de fluorescencia.
Plásmido de andamiaje adenoviral	Microbix, Canadá	pBHGloxΔE1,3Cre	Plásmido utilizado para generar el genoma adenoviral recombinante de longitud completa.
Vector intermediario adenoviral: pDC315-mCol1a1p-mCherry	GeneChem, China	Servicio personalizado	Vector recombinante adenoviral tipo plásmido que contiene el promotor de 2354 pb del gen Col1a1 de ratón dirigiendo la expresión de mCherry.
Benzonasa Nucleasa	Merck Millipore, EE. UU.	70664-3	Endonucleasa utilizada durante la purificación de adenovirus para eliminar ácidos nucleicos contaminantes.
Cabina de Seguridad Biológica (Clase II)	Esco Lifesciences Group, Singapur	AC2-4S1	Cabina de seguridad biológica certificada utilizada para el manejo de adenovirus recombinantes y procedimientos de cultivo celular estéril.
Medio de cultivo celular (DMEM/F12 completo)	HyClone, EE. UU.	12800-017	Medio de cultivo completo utilizado para el mantenimiento de células NIH/3T3 y HEK293.
Software de análisis de imágenes CellPathfinder	Yokogawa Electric Corporation, Japón	Versión 3.08.01	Software de análisis de imágenes utilizado para la cuantificación automatizada de fluorescencia y la segmentación celular.
Sistema de cribado de alto contenido CellVoyager CV8000	Yokogawa Electric Corporation, Japón	CV8000	Sistema de imagen de alto contenido utilizado para la adquisición de fluorescencia de mCherry y Hoechst.
CO2 Incubadora de cultivo celular	Thermo Fisher Scientific, EE. UU.	3111	Incubadora humedecida mantenida a 37 °C con 5 % de CO2 para cultivo de células de mamífero.
DMSO (dimetilsulfóxido)	Sigma-Aldrich, EE. UU.	D2650	Disolvente utilizado para la preparación de SB431542.
Dulbecco’Medio de Eagle modificado/mezcla nutricional F-12 (DMEM/F-12)	Servicebio, China	G4610	Medio de cultivo basal utilizado para fibroblastos NIH/3T3.
Suero bovino fetal (SBF)	Ausbian, Australia	VS500T	Suplemento sérico utilizado al 10 % (v/v) para la preparación del medio de cultivo completo.
Tinción fluorescente Hoechst 33342	Invitrogen, EE. UU.	H3570	Tinción nuclear utilizada para la imagen de fluorescencia y la normalización del recuento nuclear.
Células HEK293	ATCC, EE. UU.	CRL-1573	Línea celular de empaquetamiento utilizada para la producción y amplificación de adenovirus.
TGF-β recombinante humanoβ1	MedChemExpress, China	HY-P78214	Citocina utilizada para inducir la activación fibrotica en fibroblastos NIH/3T3.
Software de adquisición de imágenes	Yokogawa Electric Corporation, Japón	Versión 3.08.01.03	Software utilizado para la adquisición automatizada de imágenes de fluorescencia y el control del microscopio.
Reactivo de transfección basado en lípidos	Invitrogen, EE. UU.	11668-019	Reactivo de transfección utilizado para la entrega de plásmidos adenovirales en células HEK293.
Tubos de microcentrífuga	Axygen, EE. UU.	MCT-150-C	Tubos utilizados para el almacenamiento de lisados de ARN y el procesamiento de muestras.
Lector de microplacas	Tecan, Suiza	Chispa	Lector multimodal de microplacas utilizado para mediciones de absorbancia en ELISA.
Kit ELISA de Colágeno Tipo I de Ratón	Meike Biotechnology, China	MK6778A	Kit de ELISA utilizado para cuantificar el colágeno tipo I secretado en sobrenadantes de cultivo.
Fibroblastos murinos NIH/3T3	Procell Life Science, China	CL-0171	Línea celular de fibroblastos de ratón utilizada para el establecimiento y validación del modelo de reportero.
Enzima de restricción PacI	New England Biolabs, EE. UU.	R0547S	Enzima de restricción utilizada para la linealización del plásmido adenoviral.
Penicilina–Solución de estreptomicina	Gibco, EE. UU.	15140-122	Solución de antibiótico suplementada al 1% (v/v) para prevenir contaminación bacteriana.
PerfectStart Green qPCR SuperMix	TransGen Biotech, China	AQ602	Mezcla maestra basada en SYBR Green utilizada para el análisis de PCR cuantitativa.
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Servicebio, China	G4202	Tampón utilizado para lavar células y preparar reactivos.
Vector intermediario pDC315-EGFP	GeneChem, China	N/A	Vector intermediario adenoviral parental utilizado para la construcción del plásmido reportero.
Sistema de qPCR	Applied Biosystems, EE. UU.	QuantStudio 5	Sistema de PCR en tiempo real utilizado para el análisis cuantitativo de la expresión génica.
Enzimas de restricción (BamHI y KpnI)	Abclonal, China	RK21101, RK21104	Enzimas de restricción utilizados para la linealización del vector de transferencia.
Kit de transcripción inversa	TransGen Biotech, China	AT311	Kit de transcripción inversa utilizado para la síntesis de ADNc antes de la RT-qPCR.
Reactivo de lisis de ARN	Invitrogen, EE. UU.	15596026	Reactivo utilizado para la extracción de ARN total de células cultivadas.
SB431542	MedChemExpress, China	301836-41-9	TGF-β inhibidor del receptor de tipo I utilizado en experimentos de inhibición farmacológica
Servicio/Reactivos de Secuenciación Sanger	Shanghai Boshang Biotechnology Co., Ltd., China	Servicio personalizado	Servicio/reagentes de secuenciación utilizados para la verificación de la secuencia del plásmido.
Pipetas serológicas	Corning, EE. UU.	4488	Pipetas estériles utilizadas para el manejo de líquidos durante procedimientos de cultivo celular.
Ciclador térmico T30	LongGene Scientific Instruments, China	T30	Ciclador térmico utilizado para la transcripción inversa y la amplificación por PCR.
Solución de tripsina-EDTA	Gibco, EE. UU.	25200-056	Reactivo de disociación celular utilizado para el pase rutinario de células.
Kit de purificación viral	Takara Bio USA	631533	Kit utilizado para la purificación de adenovirus recombinante.
Baño de agua	Shanghai Yiheng Scientific Instruments, China	HWS-12	Baño de agua con control de temperatura utilizado durante la congelación de adenovirus–ciclos de descongelación