Artículo de método

Establecimiento de un ensayo de reporte de STAT6 para el cribado de tóxicos ambientales que afectan la inflamación alérgica de las vías respiratorias

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DOI:

10.3791/71694

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25 de agosto de 2026

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1Chakri Naruebodindra Medical Institute, Faculty of Medicine Ramathibodi Hospital, Mahidol University

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe la generación y validación de un ensayo estable de luciferasa con reportero STAT6 en células epiteliales de las vías respiratorias humanas. El método permite la detección eficiente de tóxicos ambientales y componentes de la contaminación del aire que modulan la actividad de STAT6 bajo condiciones in vitro controladas.

Resumen

La inflamación de las vías respiratorias asociada a la contaminación del aire es una preocupación creciente para la salud pública. Las interleucinas‑4 (IL‑4) e interleucina‑13 (IL‑13), que activan la vía de señalización del transductor de señales y activador de la transcripción 6 (STAT6), un mediador central de la inflamación alérgica de las vías respiratorias, podrían modular las toxicidades respiratorias de los contaminantes. En este estudio se describe la generación y validación de un ensayo estable de luciferasa como sistema reportero de STAT6 en células epiteliales humanas de las vías respiratorias, con el fin de evaluar tóxicos ambientales que modulan la señalización de STAT6. Las células epiteliales bronquiales humanas 16HBE14o− fueron transducidas con un reportero de luciferasa sensible a STAT6 mediante un vector lentiviral, seguido de la optimización de la selección con puromicina y de la multiplicidad de infección, y del aislamiento monoclonal por dilución límite. Se seleccionó un clon estable que mostró una inducción fuerte y reproducible a través de pasajes seriados. La respuesta del reportero fue validada mediante estimulación con IL-4/IL-13, y la dependencia de STAT6 se confirmó utilizando inhibidores selectivos de STAT6, STAT5 y STAT3. El desempeño del ensayo se cuantificó mediante análisis del factor Z′, que indicó una separación reproducible de la señal. Además, el ensayo se aplicó a componentes individuales de la contaminación atmosférica, y se observó que el benzo[b]fluorantheno y las partículas suspendidas aumentaron significativamente la actividad del reportero STAT6. Este método proporciona un enfoque escalable para medir la actividad de STAT6 en células epiteliales de las vías respiratorias y para priorizar tóxicos ambientales que modulan la señalización alérgica en las vías respiratorias.

Introducción

La contaminación del aire representa uno de los desafíos más urgentes para la salud pública global, con profundos efectos sobre la salud y consecuencias socioeconómicas. Actualmente se clasifica como el segundo factor de riesgo principal para la mortalidad, responsable de 8,1 millones de muertes anuales1,2,3. Entre los contaminantes atmosféricos, las partículas finas con diámetros menores a 2,5 micrómetros (PM2,5) representan el mayor riesgo para la salud debido a su capacidad de penetrar profundamente en el tracto respiratorio4,5. Se ha demostrado consistentemente que la exposición elevada a PM2,5 está asociada con una función pulmonar deteriorada y mayores tasas de hospitalización por enfermedades respiratorias6. La prevalencia de enfermedades inflamatorias alérgicas, incluyendo asma, rinitis alérgica y dermatitis atópica, ha ido en aumento a nivel mundial y se encuentra desproporcionadamente elevada en las megaciudades altamente contaminadas4.

Las enfermedades alérgicas de las vías respiratorias, como el asma atópico, están mediadas principalmente por una respuesta inflamatoria de tipo 2 caracterizada por niveles elevados de las citoquinas interleucina‑4 (IL‑4) e interleucina‑13 (IL‑13) y la activación de la vía de señalización del transductor de señales y activador de la transcripción 6 (STAT6)7. En las células epiteliales de las vías respiratorias, la fosforilación de STAT6 inducida por IL-4 e IL-13 promueve la hipersecreción de moco y la alteración de la barrera epitelial, lo que identifica a STAT6 como un mediador central de la patología alérgica de las vías respiratorias y como un objetivo terapéutico relevante8,9. Evidencia experimental obtenida en modelos murinos indica que la exposición a PM2.5 y dióxido de azufre potencia la señalización de STAT6 y agrava la inflamación alérgica de las vías respiratorias10,11. Sin embargo, no se ha evaluado sistemáticamente si los constituyentes individuales de la contaminación del aire modulan directamente la actividad transcripcional de STAT6 en células epiteliales humanas de las vías respiratorias.

La contaminación del aire comprende una mezcla químicamente compleja de componentes, incluyendo material particulado, hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP), metales pesados y sales inorgánicas, cuyas contribuciones individuales a la activación de STAT6 en las vías respiratorias aún no están bien definidas12,13. Las metodologías actuales para medir la actividad de STAT6 en células epiteliales de las vías respiratorias, como los ensayos de fosforilación en punto final o los sistemas de reportero basados en transfección transitoria, no son adecuados para cribados químicos a gran escala. Por lo tanto, una plataforma estable de reportero celular para STAT6 en células epiteliales humanas de las vías respiratorias proporcionaría una herramienta escalable para identificar compuestos derivados de la contaminación que modulan la señalización alérgica en las vías respiratorias. Este protocolo describe el desarrollo y validación de un ensayo estable de reportero luciferasa para STAT6 en células epiteliales de las vías respiratorias 16HBE14o−, lo que permite la evaluación cuantitativa de la activación de STAT6 para el cribado sistemático de muestras ambientales y tóxicos químicos individuales.

Protocolo

La aprobación ética para sujetos humanos no es aplicable porque este estudio utilizó la línea celular epitelial bronquial humana 16HBE14o− establecida.

1. Generación de células 16HBE14o− que expresan establemente un reportero de actividad STAT6

NOTA: Figura 1 proporciona una visión general del flujo de trabajo.

  1. Cultivo celular
    NOTA: Realice todos los procedimientos utilizando técnica aséptica en una cabina de seguridad biológica de Clase II. Confirme que las células estén libres de contaminación por micoplasma antes de su uso.
    1. Mantenga las células 16HBE14o− en medio mínimo esencial suplementado con 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina-estreptomicina. Incube las células a 37 °C en una atmósfera humedecida que contenga 5% de CO2, y cambie el medio de cultivo cada dos días.
    2. Deje que las células alcancen aproximadamente el 80% de confluencia. Aspire el medio de cultivo y enjuague la monocapa celular una vez con solución salina tamponada con fosfato.
    3. Añada suficiente solución salina tamponada con fosfato para cubrir la monocapa celular e incube las células durante 20 min a 37 °C. Aspire completamente la solución salina tamponada con fosfato.
      NOTA: Utilice la incubación de 20 min con solución salina tamponada con fosfato para facilitar la ruptura de las uniones intercelulares estrechas formadas por esta línea celular. Esta duración representa una modificación optimizada internamente.
    4. Añada suficiente solución de tripsina al 0,25%–ácido etilendiaminotetraacético para cubrir la monocapa celular. Incube las células durante 10 min a 37 °C.
      NOTA: Supervise la desprendimiento celular utilizando un microscopio invertido de luz. Tape suavemente el recipiente de cultivo cuando sea necesario para facilitar el desprendimiento.
    5. Añada aproximadamente cinco volúmenes de medio de cultivo completo en relación con el volumen de la solución de tripsina–ácido etilendiaminotetraacético para detener la actividad enzimática. Pipetee suavemente la suspensión para obtener una suspensión de células individuales.
    6. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mL. Centrifugue la suspensión a 300 × g durante 5 min a 25 °C.
    7. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y resuspenda el sedimento celular en medio fresco de cultivo. Triture suavemente la suspensión y confirme la presencia de una suspensión de células individuales bajo un microscopio invertido de luz.
    8. Cuente las células utilizando un hemocitómetro y ajuste la concentración celular a la densidad requerida para el experimento subsiguiente. Utilice una relación de división rutinaria de 1:8.
      NOTA: Consulte la Tabla Suplementaria 1 y la Tabla Suplementaria 2 para conocer las áreas de crecimiento de los recipientes de cultivo y los volúmenes correspondientes de solución salina tamponada con fosfato y solución de tripsina–ácido etilendiaminotetraacético.
  2. Determinación de la citotoxicidad inducida por puromicina
    ​NOTA: Seleccione el antibiótico según el gen de resistencia codificado por el constructo lentiviral.
    1. Siembre las células 16HBE14o− a 2 × 104 células por pocillo en una placa de cultivo de 96 pocillos que contenga 100 µL de medio de cultivo completo por pocillo. Incube las células durante la noche.
    2. Reemplace el medio de cultivo con medio fresco que contenga puromicina a concentraciones finales de 0,5, 1, 2 o 4 µg/mL. Prepare placas separadas para los puntos temporales de 24, 48 y 72 h.
    3. Añada 5 µL de reactivo para conteo celular a cada pocillo. Incube la placa durante 1 h a 37 °C.
      NOTA: Evite introducir burbujas de aire en los pocillos, ya que podrían interferir con las mediciones de absorbancia.
    4. Mida la absorbancia a 450 nm utilizando 650 nm como longitud de onda de referencia. Agite la placa durante 15 s inmediatamente antes de registrar la absorbancia en modo de punto final.
    5. Calcule la viabilidad celular14 utilizando la Ecuación 1.
      Ecuación de viabilidad celular, OD450-650 para muestras, control, blanco; fórmula para análisis de bioensayo.
      donde:
      Ecuación de absorbancia OD450-650, método de sustracción, utilizado en espectrofotometría, fórmula.
      Fórmula de densidad óptica (OD450-650) para análisis de absorción en experimentos de espectroscopia.
      Ecuación de densidad óptica, OD450-650blanco=OD450blanco-OD650blanco, para análisis de datos espectroscópicos.
      NOTA: Defina el control como células no tratadas y el blanco como medio sin células que contenga el reactivo del ensayo. Seleccione la concentración más baja de puromicina que elimine completamente las células no transducidas en un período de 48–72 h.
  3. Determinación de la multiplicidad óptima de infección
    ADVERTENCIA: Manipule las partículas lentivirales bajo condiciones de Nivel de Seguridad Biológica 2 en una instalación registrada de Nivel de Seguridad Biológica 2 y de acuerdo con las regulaciones institucionales de seguridad biológica. Realice todas las manipulaciones del virus en una cabina de seguridad biológica de Clase II. Cubra los materiales desechables contaminados con virus y derrames con lejía al 10% durante al menos 1 h antes de desecharlos como residuos biopeligrosos.
    ​NOTA: Optimice la multiplicidad de infección porque afecta directamente la eficiencia de transducción.
    1. Calcule el volumen requerido del stock lentiviral15 utilizando la Ecuación 2.
      Fórmula de cálculo de MOI, relación de partículas virales a células diana, ecuación de biología molecular.
      donde:
      Fórmula del título funcional del virus, T_virus = UT/mL, ecuación para análisis de datos en investigación virológica.
      Ecuación de volumen de virus, V_virus=volumen de virus en mL, fórmula, estudio virológico, método de cálculo
      Equilibrio estático, ecuación: N_células = número de células diana, diagrama para uso educativo en investigación.
      NOTA: El título funcional del stock lentiviral del reportero de luciferasa STAT6 utilizado en este protocolo fue de 5 × 107 unidades transductoras/mL. Para 2 × 104 células diana, una MOI de 20 corresponde a 8 µL de stock lentiviral por pocillo. El volumen del virus debe recalcularse para preparaciones virales con títulos diferentes.
    2. Siembre las células 16HBE14o− a 2 × 104 células por pocillo en una placa de 96 pocillos blanca con fondo transparente que contenga 100 µL de medio de cultivo completo por pocillo. Incube las células durante la noche hasta que alcancen aproximadamente el 80% de confluencia.
    3. Reemplace el medio de cultivo con medio fresco que contenga 5 µg/mL de polibreno y lentivirus del reportero de luciferasa STAT6 a MOIs de 1, 5, 10 y 20. Incluya un pocillo control mock no transducido sin lentivirus.
      NOTA: Calcule el volumen de lentivirus requerido para cada MOI a partir del título funcional del stock.
    4. Incube las células con las partículas lentivirales durante 48 h. Reemplace el medio de transducción con medio de cultivo fresco e incube las células durante 24 h adicionales.
    5. Reemplace el medio de cultivo con medio fresco que contenga interleucina-4 e interleucina-13 a 10 ng/mL cada una. Incube las células durante 24 h.
    6. Añada 25 µL de reactivo para ensayo de luciferasa a cada pocillo16. Proteja la placa de la luz e incube durante 20 min a temperatura ambiente.
    7. Agite la placa linealmente durante 20 s. Mida la luminiscencia en modo de punto final utilizando una lectura completa de placa y un ajuste de ganancia de 120.
      ADVERTENCIA: Registre la luminiscencia dentro de la primera hora tras añadir el reactivo de ensayo de luciferasa para capturar la señal máxima. Siga las instrucciones del fabricante sobre seguridad y manipulación del reactivo.
      NOTA: Utilice el mismo lector de microplacas multimodal y los mismos ajustes de adquisición para todas las mediciones de absorbancia y luminiscencia.
  4. Selección de células transducidas
    1. Siembre las células 16HBE14o− a 2 × 105 células/mL en una placa de cultivo de 24 pocillos. Incube las células durante la noche.
    2. Reemplace el medio de cultivo con medio fresco que contenga el lentivirus del reportero de luciferasa STAT6 a una MOI de 20 y 5 µg/mL de polibreno. Incube las células durante 48 h.
    3. Reemplace el medio de transducción con medio de cultivo fresco. Incube las células durante 24 h adicionales.
    4. Aspire el medio de cultivo y añada medio fresco que contenga 1 µg/mL de puromicina. Incube las células durante 5 días, reemplazando el medio de selección cada 2 días.
    5. Continúe la selección con puromicina hasta que todas las células en el pocillo control mock no transducido sean eliminadas.
      ​NOTA: Permita al menos 24 h tras la transducción antes de aplicar la selección con antibiótico para permitir la expresión del gen de resistencia.
  5. Aislamiento de clones monoclonales mediante dilución límite
    1. Desprenda y cuente las células seleccionadas con puromicina que expresan el reportero STAT6. Prepare una suspensión de células individuales a 5 células/mL mediante dilución seriada.
      ​NOTA: Evite la formación de agregados celulares durante la dilución. Pase la suspensión a través de un filtro celular cuando sea necesario.
    2. Dispense 200 µL de la suspensión celular en cada pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos para obtener una densidad media de aproximadamente una célula por pocillo.
    3. Examine cada pocillo utilizando un microscopio invertido dentro de las 24 h e identifique los pocillos que contengan una sola célula. Excluya los pocillos que contengan más de una célula o múltiples focos celulares espacialmente separados.
    4. Supervise los pocillos seleccionados durante la primera semana para confirmar el crecimiento clonal. Cambie el medio de cultivo cada 3 días.
    5. Amplíe cada clon en la placa original de 96 pocillos durante aproximadamente 20 días o hasta que las células alcancen confluencia. Transfiera cada clon secuencialmente a una placa de 6 pocillos y luego a un matraz de cultivo T-25.
      NOTA: Cultive las células en la placa de 6 pocillos durante aproximadamente 6 días antes de transferirlas al matraz T-25, o transfiéralas cuando alcancen la confluencia adecuada.
      ​PUNTO DE PAUSA: Continúe ampliando los clones o criopresérvelos a 1 × 106 células por vial en 1 mL de medio de criopreservación que contenga 90% de suero bovino fetal y 10% de dimetilsulfóxido.
    6. Siembre cada clon ampliado a 2 × 105 células/mL en una placa de 96 pocillos blanca con fondo transparente. Incube las células durante la noche.
    7. Reemplace el medio de cultivo con medio fresco que contenga IL-4 e IL-13 a 10 ng/mL cada una. Incube las células durante 24 h.
    8. Mida la actividad de luciferasa según se describe en los pasos 1.3.6–1.3.7. Compare la actividad del reportero inducida entre los clones individuales.
    9. Repita el ensayo de luciferasa con números crecientes de pases celulares. Seleccione clones que mantengan una actividad del reportero inducida por citoquinas consistente a lo largo de los pases.
      NOTA: Se seleccionó el clon 3 por su baja luminiscencia basal y su capacidad para mantener una señal de activación inducida por citoquinas consistente a lo largo de pases seriales.

2. Establecimiento y validación del ensayo de actividad del reportero STAT6

NOTA: Figura 2 proporciona una visión general del flujo de trabajo.

  1. Validación del ensayo del reportero de actividad STAT6
    1. Siembre las células reporteras STAT6 a 2 × 105 células/mL en una placa de 96 pocillos blanca con fondo transparente, utilizando 100 µL de medio de cultivo completo por pocillo. Incube las células durante la noche.
    2. Sustituya el medio de cultivo por medio fresco que contenga IL-4 e IL-13 a concentraciones finales de 10 ng/mL cada una. Añada simultáneamente los inhibidores selectivos de la siguiente manera: 100 nM de AS1517499 (inhibidor de STAT6), 2,5 µM de AC-4-130 (inhibidor de STAT5) o 2,5 µM de Stattic (inhibidor de STAT3).
    3. Incluya un control de vehículo que contenga 0,1 % de dimetilsulfóxido (DMSO). Incube las células durante 24 h.
    4. Determine la viabilidad celular utilizando el ensayo de recuento de células descrito en los pasos 1.2.3–1.2.5.
    5. Mida la actividad de luciferasa según se describe en los pasos 1.3.6–1.3.7.
    6. Normalice la señal de luminiscencia de cada pocillo respecto a su viabilidad celular correspondiente. Exprese los valores normalizados en relación con el grupo control tratado con citocinas.
      NOTA: Una viabilidad celular reducida puede disminuir la señal de luciferasa independientemente de la actividad de STAT6. Interprete la actividad del reportero únicamente tras confirmar una viabilidad celular aceptable.
  2. Evaluación de la robustez del ensayo
    1. Evalúe la robustez del ensayo calculando el factor Z′ utilizando 21 pocillos replicados tanto para los grupos control positivo como negativo.
    2. Calcule el factor Z′ utilizando la Ecuación 3.
      Ecuación de equilibrio estático, fórmula del factor Z, expresión matemática para el control de calidad del ensayo.
      donde:
      Ecuación de equilibrio estático, σₚ denota la desviación estándar en el control, ilustración educativa de fórmula.
      Ecuación de desviación estándar, σn, utilizada en análisis estadístico para la precisión del control negativo.
      Ecuación μ<sub>p</sub>= señal media del control positivo; concepto de análisis de datos estadísticos.
      Equilibrio estático, ecuación μn= señal media del control negativo, análisis educativo.
      NOTA: Un factor Z′ comprendido entre 0,5 y 1,0 indica que el ensayo es adecuado para cribado de alto rendimiento.

3. Aplicación del ensayo de reportero STAT6 para el cribado de tóxicos ambientales

PRECAUCIÓN: Manipule los hidrocarburos aromáticos policíclicos y las sales de metales pesados como materiales tóxicos y potencialmente carcinogénicos. Utilice equipo de protección personal adecuado, realice todas las manipulaciones en una campana extractora de gases químicos certificada y deseche los materiales contaminados de acuerdo con los procedimientos institucionales para residuos peligrosos.

  1. Selección de tóxicos ambientales
    1. Siembre las células reporteras STAT6 a 2 × 105 células/mL en una placa de 96 pocillos blanca con fondo transparente, utilizando 100 µL de medio de cultivo completo por pocillo. Incube las células durante la noche.
    2. Sustituya el medio de cultivo por medio fresco que contenga cada compuesto de prueba a la concentración final deseada, que en este protocolo es de 10 µM, y trate las células en ausencia de IL-4 e IL-13.
    3. Incluya un grupo control negativo con 0,1 % de dimetilsulfóxido y un grupo control positivo con IL-4 e IL-13 a 10 ng/mL cada una. Incube las células durante 24 h.
    4. Determine la viabilidad celular utilizando el ensayo de recuento de células según se describe en los pasos 1.2.3–1.2.5.
    5. Mida la actividad de luciferasa según se describe en los pasos 1.3.6–1.3.7.
    6. Normalice la señal de luminiscencia de cada pocillo respecto al valor correspondiente de viabilidad celular. Exprese el resultado normalizado en relación con el grupo control negativo.
    7. Excluya los compuestos que reduzcan la viabilidad celular por debajo del 80 % al interpretar la actividad del reportero STAT6.
      NOTA: Considere poco fiables las señales del reportero obtenidas bajo condiciones citotóxicas, ya que la reducción de la viabilidad celular puede alterar la luminiscencia independientemente de la actividad de la vía STAT6.

Resultados

Para determinar la concentración óptima de puromicina para la selección estable, las células parentales 16HBE14o− se trataron con concentraciones crecientes de puromicina (0,5–4 µg/mL) y la viabilidad celular se evaluó a las 24, 48 y 72 h mediante un ensayo de viabilidad celular. La puromicina redujo la viabilidad celular de manera dependiente de la dosis y del tiempo, con todas las concentraciones disminuyendo la viabilidad por debajo del 20 % tras 48–72 h (Figura 3). Una concentración de 1 µg/mL fue la más baja que eliminó completamente las células no transducidas, reduciendo la señal de viabilidad residual a aproximadamente el 4,5 % en 48 h (p < 0,0001). Aumentar la concentración de puromicina no produjo ninguna reducción adicional en la viabilidad celular. Por lo tanto, se seleccionó una concentración de 1 µg/mL de puromicina para la selección posterior de las células transducidas.

Para optimizar la eficiencia de transducción lentiviral, las células 16HBE14o− fueron transducidas con el lentivirus del reportero de luciferasa STAT6 a multiplicidades de infección (MOI) de 1, 5, 10 y 20 durante 48 h, seguido de estimulación con IL-4 e IL-13 (10 ng/mL cada una) durante 24 h para activar la señalización STAT6. Como se muestra en la Figura 4, las unidades de luminiscencia relativa (RLU) aumentaron de manera dependiente del MOI. Un MOI de 20 produjo la mayor inducción del reportero, resultando en un aumento de aproximadamente 50 veces en la luminiscencia en comparación con el control no estimulado (p < 0,0001). En base a estos resultados, se seleccionó un MOI de 20 para experimentos posteriores.

Tras la transducción y la selección con puromicina bajo condiciones optimizadas, las células no transducidas sufrieron una muerte celular extensa, mientras que las células transducidas mantuvieron una morfología y viabilidad normales (Figura 5). Las células sobrevivientes se sometieron posteriormente a dilución límite para establecer líneas celulares reporteras monoclonales de STAT6.

Se evaluó la actividad del reportero STAT6 en tres líneas celulares reporteras monoclonales derivadas de células individuales. Todos los clones mostraron una luminiscencia basal baja (<1.000 RLU). La estimulación con IL-4 e IL-13 indujo una actividad del reportero robusta en los clones 2 y 3, con luminiscencia superior a 20.000 RLU y correspondiente a una inducción mayor de 20 veces (Figura 6A). El clon 3 presentó la luminiscencia basal más baja y, por lo tanto, fue seleccionado para su posterior caracterización. La actividad del reportero en el clon 3 se evaluó a lo largo de pasajes seriados (P9–P21) para evaluar su estabilidad a largo plazo. Como se muestra en Figura 6B, la inducción del reportero dependiente de STAT6 permaneció estable en todo el rango de pasajes evaluado. Un clon se consideró adecuado para experimentos posteriores cuando presentó una tasa de crecimiento normal, luminiscencia basal por debajo de aproximadamente 1.000 RLU y una inducción superior a 20 veces tras la estimulación con citocinas.

Dado que la IL-4 y la IL-13 pueden activar otros miembros de la familia STAT, incluidos STAT3 y STAT5, se evaluó aún más la especificidad del ensayo de reportero17,18. Las células reporteras STAT6 se estimularon con IL-4 e IL-13 en presencia o ausencia de inhibidores selectivos dirigidos contra STAT6, STAT5 o STAT3 durante 24 h19,20,21. La viabilidad celular se mantuvo por encima del 90 % en todas las condiciones de tratamiento (inhibidor de STAT6 AS1517499, 100 nM: 98,4 %; inhibidor de STAT5 AC-4-130, 2,5 µM: 97,4 %; inhibidor de STAT3 Stattic, 2,5 µM: 96,2 %; Figura 7A). La inhibición de STAT6 redujo marcadamente la actividad de luciferasa (p < 0,0001), mientras que la inhibición de STAT5 o STAT3 no produjo ningún efecto significativo sobre la actividad del reportero (p = 0,2593 y p = 0,8857, respectivamente; Figura 7B). Estos hallazgos confirmaron que la activación del reportero fue predominantemente dependiente de STAT6.

La solidez del ensayo se evaluó calculando el factor Z′ utilizando células estimuladas con IL-4 e IL-13 como control de señal alta y células tratadas con inhibidor de STAT6 como control de señal baja. El ensayo arrojó un factor Z′ de 0,703 ± 0,097, lo que indica un excelente rendimiento del ensayo, una ventana de señal amplia y adecuación para cribado de alto rendimiento.

Finalmente, se aplicó el ensayo del reportero STAT6 para analizar componentes ambientales seleccionados de material particulado según su capacidad para modular la señalización de STAT6. Tras 24 h de tratamiento, el benzo[b]fluoranteno (10 µM) aumentó significativamente la actividad del reportero STAT6 en aproximadamente 1,75 veces (p = 0,0006), mientras que el material particulado (100 µg/mL) incrementó la actividad del reportero en aproximadamente 1,5 veces (p = 0,0398; Figura 8). En contraste, los restantes hidrocarburos aromáticos policíclicos y compuestos de metales pesados, incluidos CdCl2, HgCl2 y NiSO4 (10 µM cada uno), no alteraron significativamente la actividad del reportero. En conjunto, estos resultados demuestran que el ensayo del reportero STAT6 es estable, específico, robusto y adecuado para la selección de alto rendimiento de compuestos ambientales que modulan la señalización de STAT6.

Diagrama de transducción celular; reportero de luciferasa STAT6; selección con antibiótico; optimización de MOI.
Figura 1: Flujo de trabajo para la generación de células 16HBE14o− con reportero STAT6. Resumen esquemático del protocolo para generar células 16HBE14o− que expresan de manera estable un reportero de luciferasa STAT6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Diagrama del proceso del ensayo con células reporteras STAT6; estimulación con IL4/13, CCK8, adición de luciferasa, resultados.
Figura 2: Flujo de trabajo para el establecimiento y aplicación del ensayo con células reporteras STAT6. Descripción esquemática del ensayo con células reporteras STAT6 para la validación del ensayo y la selección de tóxicos ambientales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Gráfico de barras de viabilidad celular que muestra los efectos de la puromicina a 0,5-4 µg/mL durante 24-72 h; análisis estadístico.
Figura 3: Determinación de la concentración óptima de puromicina para la selección estable de células. Las células parentales 16HBE14o− se trataron con puromicina (0,5, 1, 2 o 4 µg/mL) durante 24, 48 o 72 h. Las células control por vehículo recibieron dimetilsulfóxido (DMSO) al 0,1%. La viabilidad celular se determinó mediante un ensayo de viabilidad celular. La viabilidad celular se calculó a partir de la diferencia de absorbancia entre 450 y 650 nm tras la sustracción del blanco y la normalización respecto al control de vehículo. Los datos se presentan como media ± DE de tres réplicas biológicas independientes con duplicados técnicos (n = 3). La significancia estadística se determinó mediante ANOVA de un factor seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. Los valores de p para las comparaciones con el control de vehículo se indican. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Gráficos de barras de luminiscencia frente a MOI; análisis de datos del cambio de la razón de RLU y valores p estadísticos.
Figura 4Optimización de la eficiencia de transducción lentiviral 16HBE14o− las células fueron transducidas con un lentivirus reportero de luciferasa STAT6 a multiplicidades de infección (MOI) de 1, 5, 10 o 20 durante 48 h. Tras un período de recuperación de 24 h, las células fueron estimuladas con IL-4 e IL-13 (10 ng/mL cada una) durante 24 h. (A) Unidades relativas de luminiscencia (RLUs) en células transducidas con control y células transducidas con el reportero a las MOI indicadas. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA de un solo factor, seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. (BInducción del plegamiento tras la estimulación con citocinas en relación con el control no estimulado de MOI 20. El análisis estadístico se realizó mediante una prueba t de Student no pareada t-prueba. Los datos se presentan como media ± DE de tres réplicas biológicas independientes (n = 3). pse indican los valores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Morfología celular bajo exposición a puromicina; imagen de microscopía que muestra variaciones a escala de 50 μm.
Figura 5: Imágenes representativas de células tras la selección con puromicina. Las células 16HBE14o− fueron transducidas o no con el lentivirus reportero de luciferasa STAT6 (MOI = 20) y posteriormente tratadas con puromicina 1 µg/mL durante 5 días. Las imágenes se obtuvieron mediante un microscopio invertido de contraste de fases a un aumento de 100×, en condiciones de adquisición idénticas. Las células parentales no tratadas formaron una monocapa epitelial normal (izquierda). Las células no transducidas tratadas con puromicina mostraron muerte celular extensa y desprendimiento (centro), mientras que las células transducidas seleccionadas con puromicina permanecieron viables y conservaron una morfología normal (derecha). Barra de escala = 50 µm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados del ensayo de luminiscencia; gráfico de barras que compara las condiciones de control frente a IL en clones y pasajes celulares.
Figura 6: Identificación de clones reporteros de STAT6 y evaluación de la estabilidad del reportero. Tras la dilución límite, se expandieron tres líneas celulares monoclonales reporteras de STAT6 y se estimularon con IL-4 e IL-13 (10 ng/mL cada una) durante 24 h. (A) Actividad de luciferasa de clones reporteros individuales tras la estimulación con citocinas, en comparación con controles no estimulados. (B) Estabilidad de la actividad reportera de STAT6 en el clon 3 a lo largo de pasajes seriados (P9–P21). Los datos se presentan como media ± DE de réplicas técnicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Gráficos de barras que comparan el % de viabilidad celular y la luminiscencia normalizada en ensayos de células tratadas con fármacos.
Figura 7: Inhibición selectiva de la actividad del reportero STAT6 sin afectar la viabilidad celular. Las células reporteras STAT6 fueron estimuladas con IL-4 e IL-13 (10 ng/mL cada una) durante 24 h en presencia del inhibidor de STAT6 AS1517499 (100 nM), el inhibidor de STAT5 AC-4-130 (2,5 µM) o el inhibidor de STAT3 Stattic (2,5 µM). El grupo control con vehículo estimulado con citocinas recibió DMSO al 0,1%. (A) La viabilidad celular se determinó mediante un ensayo de viabilidad celular. (B) Actividad de luciferasa dependiente de STAT6 normalizada respecto al control estimulado con citocinas. Los datos se presentan como media ± DE de tres réplicas biológicas independientes (n = 3). Se indican los valores de p. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Gráfico de barras de los resultados del ensayo de luminiscencia normalizados, que compara tratamientos químicos con muestras control.
Figura 8: Evaluación de los efectos moduladores de STAT6 de tóxicos ambientales. Las células reporteras de STAT6 fueron tratadas durante 24 h con material particulado (100 µg/mL) o con los tóxicos ambientales indicados, incluyendo hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) y metales pesados (10 µM cada uno). La actividad de luciferasa dependiente de STAT6 se normalizó respecto al control de vehículo (0,1 % DMSO). Los datos se presentan como media ± DE de tres réplicas biológicas independientes (n = 3). La significancia estadística se determinó mediante comparación con el control de vehículo, y se indican los valores de p. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla suplementaria 1: Especificaciones del recipiente de cultivo y parámetros de pase para 16HBE14o− cultivo celularHaga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 2: Comparación de métodos para medir la actividad de STAT6.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

La señalización IL-4/IL-13–JAK–STAT6 no solo es un objetivo terapéutico importante, sino también un impulsor clave de la patogénesis de enfermedades alérgicas, incluyendo asma y rinitis alérgica22. Este protocolo describe un ensayo de reportero basado en una línea celular simple y estable para identificar moduladores de la actividad de STAT6. El ensayo puede aplicarse para evaluar los efectos moduladores de STAT6 de una amplia gama de compuestos ambientales y es fácilmente adaptable a cribados de alto rendimiento, como se demuestra en el estudio de prueba de concepto (Figura 8). Al combinar un reportero de luciferasa con un ensayo paralelo de viabilidad celular, el método permite la evaluación cuantitativa de la modulación de la vía STAT6, minimizando al mismo tiempo los efectos engañosos derivados de la citotoxicidad inducida por los compuestos.

Una característica distintiva de este método es el uso de células epiteliales bronquiales humanas 16HBE14o− transducidas de forma estable, un tipo celular fisiológicamente relevante en el que la señalización inducida por contaminantes de IL-4/IL-13 contribuye a la inflamación alérgica de las vías respiratorias. Los enfoques existentes para medir la actividad de STAT6 presentan importantes limitaciones prácticas. La detección de la fosforilación de STAT6 o de proteínas diana downstream mediante inmunotransferencia (Western blotting) o ensayo inmunoenzimático (ELISA) es un proceso laborioso y con un rendimiento relativamente bajo. Los ensayos transitorios de transfección con reporteros de luciferasa miden directamente la actividad transcripcional de STAT6, pero se ven afectados por la eficiencia variable de la transfección, la variabilidad entre lotes y la necesidad de repetir la transfección en cada experimento, lo que reduce la reproducibilidad y el rendimiento.

La línea celular estable de reportero descrita en el estudio supera muchas de estas limitaciones. Dado que el constructo de reportero está integrado genómicamente y seleccionado de forma clonal, la expresión del reportero permanece uniforme en toda la población celular y reproducible entre pases, eliminando la variabilidad asociada con la transfección transitoria. La señal de luminiscencia se mide en células vivas y puede normalizarse con una medición paralela de viabilidad celular para excluir artefactos citotóxicos. Además, el ensayo es fácilmente compatible con un formato de 96 pocillos para aplicaciones de mediano a alto rendimiento. El ensayo arrojó un factor Z′ de 0,703, lo que indica una excelente separación entre los controles de señal alta y baja y confirma su idoneidad para cribado de alto rendimiento. En la Tabla Suplementaria 2 se proporciona una comparación de los enfoques comúnmente utilizados para medir la actividad de STAT6. Sin embargo, dado que el ensayo informa de la activación de un promotor sensible a STAT6 en lugar de la expresión de genes diana endógenos, sigue siendo importante la validación ortogonal mediante genes diana downstream de STAT6, como MUC5AC y CCL26.

Varios pasos son fundamentales para el establecimiento y la aplicación exitosa del ensayo con reportero STAT6. La optimización de la multiplicidad de infección (MOI) del lentivirus es esencial porque una cantidad insuficiente de virus reduce la eficiencia de transducción, mientras que una exposición excesiva al virus puede inducir estrés celular y comprometer la viabilidad celular. Asimismo, es necesario optimizar la concentración de puromicina para eliminar las células no transducidas, al tiempo que se preserva la viabilidad de las células reporteras resistentes. Dado que la susceptibilidad a la transducción lentiviral y a la selección con antibióticos varía entre los tipos celulares, ambos parámetros deben optimizarse empíricamente antes de establecer líneas celulares reporteras estables. La línea celular 16HBE14o− es una línea de células epiteliales bronquiales humanas inmortalizadas ampliamente utilizada para investigar la inflamación de las vías respiratorias, ya que forma uniones estrechas funcionales y produce moco8,23. Las células seleccionadas para la generación del reportero deben expresar receptores funcionales de IL-4 e IL-13 y conservar una señalización JAK–STAT intacta en la vía descendente24. Antes de establecer líneas reporteras estables, se debe validar el constructo reportero confirmando su respuesta a la estimulación con citocinas, su supresión mediante inhibidores específicos de la vía y la ausencia de efectos citotóxicos bajo las condiciones seleccionadas del ensayo. Estos pasos de validación ayudan a garantizar que los cambios en la actividad del reportero reflejen con precisión la señalización dependiente de STAT6 y no un estrés celular inespecífico.

También se deben considerar varias limitaciones de este método. Los vectores lentivirales se integran de forma aleatoria en el genoma del huésped, lo que puede provocar variaciones entre clones en la actividad basal del reportero, la inducibilidad y la estabilidad de la expresión a largo plazo. Además, dado que el ensayo mide la activación de un promotor sensible a STAT6, no evalúa directamente la activación del receptor upstream ni los eventos de señalización endógena downstream. El cultivo prolongado de células estables que expresan el reportero también puede conducir al silenciamiento epigenético o a una reducción en la expresión del transgén. Para minimizar estos efectos, se deben establecer bancos maestros de células en pasajes tempranos, y la respuesta del reportero debe verificarse periódicamente dentro de un rango de pasajes definido. Asimismo, el ensayo aún no ha sido validado en células epiteliales primarias de vías respiratorias humanas ni en una plataforma automatizada completa de cribado de alto rendimiento. Por último, los tóxicos ambientales evaluados en este estudio representan un panel de prueba de concepto más que una biblioteca química exhaustiva.

La contaminación del aire, particularmente la materia particulada fina (PM2.5), comprende una mezcla compleja de componentes química y físicamente diversos, incluyendo carbono negro, sales inorgánicas, hidrocarburos aromáticos policíclicos y metales pesados12,13. Las variaciones en las fuentes de emisión y el procesamiento atmosférico producen diferencias sustanciales en la composición particulada, lo que podría contribuir a efectos adversos distintos sobre la salud. En consecuencia, identificar los componentes específicos responsables de las respuestas alérgicas sigue siendo un desafío en estudios epidemiológicos y in vivo. El ensayo con reportero STAT6 descrito en el estudio proporciona una plataforma in vitro práctica para evaluar la actividad moduladora de STAT6 de tóxicos atmosféricos individuales, extractos de materia particulada asociados a fuentes específicas o fracciones particuladas químicamente definidas. Este protocolo podría facilitar la priorización de tóxicos candidatos para estudios mecanicistas y apoyar la evaluación orientada al riesgo de mezclas complejas de contaminación del aire.

Divulgaciones

Los autores declaran que no existen conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Consejo Nacional de Investigación de Tailandia (NRCT) (Concesión N.º N42A680388), y este proyecto de investigación cuenta con el apoyo de la Universidad Mahidol (Fondo de Investigación Estratégica: 2025) (Concesión N.º 35). Las figuras 1 y 2 fueron creadas utilizando BioRender.com (Pothipan, P. (2026). https://BioRender.com/h44gy3h).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tripsina-EDTA al 0,25%Gibco25200072Reactivo de disociación celular
Tubo cónico estéril para centrífuga de 15 mLCorningCLS430791Tubo de centrífuga de polipropileno estéril
Línea celular epitelial bronquial humana 16HBE14o-Donación del Dr. Nawiya Huipao (Universidad Príncipe de Songkla, Tailandia) y del Prof. Dr. Dieter C. Gruenert (Universidad de California San Francisco, EE. UU.)RRID:CVCL_0112Línea celular epitelial bronquial humana (pasajes 35–40); confirmada libre de micoplasma y mantiene morfología epitelial de vía aérea diferenciada y propiedades de barrera. Referencia: Cozens AL, et al. Am J Respir Cell Mol Biol. 1994;10(1):38–47.
Placa de cultivo de tejidos de fondo plano transparente de 24 pocillosCorning3527Placa de cultivo celular
Placa de cultivo de tejidos de fondo plano transparente de 6 pocillosCorning3516Placa de cultivo celular
Microplaca de poliestireno de fondo plano transparente de 96 pocillosCorning3599Placa para ensayo de viabilidad celular
Microplaca de poliestireno de fondo transparente y paredes blancas de 96 pocillosCorning3610Placa para ensayo de luminiscencia
AC-4-130 (inhibidor de STAT5)MedChemExpressHY-124500Inhibidor selectivo de STAT5
AS1517499 (inhibidor de STAT6)MedChemExpressHY-100614Inhibidor selectivo de STAT6
Benzo[b]fluorantenoAccuStandardH-128NHidrocarburo aromático policíclico
Campana de seguridad biológica, Clase IINuaireNU-543-400EPara procedimientos asépticos de cultivo celular
Cloruro de cadmio (CdCl2)Sigma202908Compuesto de metal pesado
Kit de conteo celular-8 (CCK-8)MedChemExpressHY-K0301Ensayo de viabilidad celular
Frasco de cultivo celular de 25 cm² (T-25)Corning430639Frasco para cultivo de tejidos
Incubadora de CO2NuaireNU-5710EMantenida a 37 °C, 5% CO2, atmósfera humedecida
Dimetilsulfóxido (DMSO)SigmaD2650Solvente (concentración final 0,1%) y crioprotector (10%)
Suero bovino fetal (FBS)SigmaF7524Suplemento del medio (10%) y medio de criopreservación (10%)
HemocitómetroBOECOBOE14Conteo manual de células
Microscopio invertido de contraste de fasesZEISSPrimovertObservación de la morfología celular
Sistema de ensayo de luciferasa (ONE-Step)BPS Bioscience60690Ensayo de luciferasa reportera
Cloruro de mercurio (HgCl2)Sigma215465Compuesto de metal pesado
Lector de microplacasBioTekSynergy Neo2Lector multimodal de microplacas/luminómetro controlado por software Gen5 (v3.08.01). La absorbancia se midió a 450 nm con referencia a 650 nm tras agitación lineal de 15–20 s. La luminiscencia se midió en modo de punto final usando una ganancia del detector de 120 tras 20 s de agitación lineal.
Medio mínimo esencial de Eagle (MEM)Gibco11095-080Medio basal de cultivo
Sulfato de níquel (NiSO4)Tokyo Chemical IndustryN1203Compuesto de metal pesado
Materia particulada (PM)Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (National Institute of Standards and Technology)SRM 2975Material de referencia estándar para materia particulada
Penicilina-estreptomicina (100×)Gibco15140122Suplemento antibiótico (concentración final 1%)
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Gibco18912014Tampón de lavado
PoliabrenoSigmaTR-1003-GPotenciador de transducción lentiviral
PuromicinaMedChemExpressHY-B1743AAntibiótico para selección estable de células
IL-13 humana recombinanteThermo Fisher ScientificA42526Citocina para estimulación
IL-4 humana recombinanteThermo Fisher ScientificA42602Citocina para estimulación
Lentivirus reportero de STAT6BPS Bioscience78799Construcción reportera lentiviral; título del stock 5 × 107 UT/mL
Stattic (inhibidor de STAT3)MedChemExpressHY-13818Inhibidor selectivo de STAT3

Referencias

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