Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Establecimiento de un ensayo de reporte de STAT6 para el cribado de tóxicos ambientales que afectan la inflamación alérgica de las vías respiratorias

139 visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/71694

⸱

25 de agosto de 2026

 ,  ,  ,  , 
1Chakri Naruebodindra Medical Institute, Faculty of Medicine Ramathibodi Hospital, Mahidol University

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe la generación y validación de un ensayo estable de luciferasa con reportero STAT6 en células epiteliales de las vías respiratorias humanas. El método permite la detección eficiente de tóxicos ambientales y componentes de la contaminación del aire que modulan la actividad de STAT6 bajo condiciones in vitro controladas.

Resumen

La inflamación de las vías respiratorias asociada a la contaminación del aire es una preocupación creciente para la salud pública. Las interleucinas‑4 (IL‑4) e interleucina‑13 (IL‑13), que activan la vía de señalización del transductor de señales y activador de la transcripción 6 (STAT6), un mediador central de la inflamación alérgica de las vías respiratorias, podrían modular las toxicidades respiratorias de los contaminantes. En este estudio se describe la generación y validación de un ensayo estable de luciferasa como sistema reportero de STAT6 en células epiteliales humanas de las vías respiratorias, con el fin de evaluar tóxicos ambientales que modulan la señalización de STAT6. Las células epiteliales bronquiales humanas 16HBE14o− fueron transducidas con un reportero de luciferasa sensible a STAT6 mediante un vector lentiviral, seguido de la optimización de la selección con puromicina y de la multiplicidad de infección, y del aislamiento monoclonal por dilución límite. Se seleccionó un clon estable que mostró una inducción fuerte y reproducible a través de pasajes seriados. La respuesta del reportero fue validada mediante estimulación con IL-4/IL-13, y la dependencia de STAT6 se confirmó utilizando inhibidores selectivos de STAT6, STAT5 y STAT3. El desempeño del ensayo se cuantificó mediante análisis del factor Z′, que indicó una separación reproducible de la señal. Además, el ensayo se aplicó a componentes individuales de la contaminación atmosférica, y se observó que el benzo[b]fluorantheno y las partículas suspendidas aumentaron significativamente la actividad del reportero STAT6. Este método proporciona un enfoque escalable para medir la actividad de STAT6 en células epiteliales de las vías respiratorias y para priorizar tóxicos ambientales que modulan la señalización alérgica en las vías respiratorias.

Introducción

La contaminación del aire representa uno de los desafíos más urgentes para la salud pública global, con profundos efectos sobre la salud y consecuencias socioeconómicas. Actualmente se clasifica como el segundo factor de riesgo principal para la mortalidad, responsable de 8,1 millones de muertes anuales1,2,3. Entre los contaminantes atmosféricos, las partículas finas con diámetros menores a 2,5 micrómetros (PM2,5) representan el mayor riesgo para la salud debido a su capacidad de penetrar profundamente en el tracto respiratorio4,5. Se ha demostrado consistentemente que la exposición elevada a PM2,5 está asociada con una función pulmonar deteriorada y mayores tasas de hospitalización por enfermedades respiratorias6. La prevalencia de enfermedades inflamatorias alérgicas, incluyendo asma, rinitis alérgica y dermatitis atópica, ha ido en aumento a nivel mundial y se encuentra desproporcionadamente elevada en las megaciudades altamente contaminadas4.

Las enfermedades alérgicas de las vías respiratorias, como el asma atópico, están mediadas principalmente por una respuesta inflamatoria de tipo 2 caracterizada por niveles elevados de las citoquinas interleucina‑4 (IL‑4) e interleucina‑13 (IL‑13) y la activación de la vía de señalización del transductor de señales y activador de la transcripción 6 (STAT6)7. En las células epiteliales de las vías respiratorias, la fosforilación de STAT6 inducida por IL-4 e IL-13 promueve la hipersecreción de moco y la alteración de la barrera epitelial, lo que identifica a STAT6 como un mediador central de la patología alérgica de las vías respiratorias y como un objetivo terapéutico relevante8,9. Evidencia experimental obtenida en modelos murinos indica que la exposición a PM2.5 y dióxido de azufre potencia la señalización de STAT6 y agrava la inflamación alérgica de las vías respiratorias10,11. Sin embargo, no se ha evaluado sistemáticamente si los constituyentes individuales de la contaminación del aire modulan directamente la actividad transcripcional de STAT6 en células epiteliales humanas de las vías respiratorias.

La contaminación del aire comprende una mezcla químicamente compleja de componentes, incluyendo material particulado, hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP), metales pesados y sales inorgánicas, cuyas contribuciones individuales a la activación de STAT6 en las vías respiratorias aún no están bien definidas12,13. Las metodologías actuales para medir la actividad de STAT6 en células epiteliales de las vías respiratorias, como los ensayos de fosforilación en punto final o los sistemas de reportero basados en transfección transitoria, no son adecuados para cribados químicos a gran escala. Por lo tanto, una plataforma estable de reportero celular para STAT6 en células epiteliales humanas de las vías respiratorias proporcionaría una herramienta escalable para identificar compuestos derivados de la contaminación que modulan la señalización alérgica en las vías respiratorias. Este protocolo describe el desarrollo y validación de un ensayo estable de reportero luciferasa para STAT6 en células epiteliales de las vías respiratorias 16HBE14o−, lo que permite la evaluación cuantitativa de la activación de STAT6 para el cribado sistemático de muestras ambientales y tóxicos químicos individuales.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

La aprobación ética para sujetos humanos no es aplicable porque este estudio utilizó la línea celular epitelial bronquial humana 16HBE14o− establecida.

1. Generación de células 16HBE14o− que expresan establemente un reportero de actividad STAT6

NOTA: Figura 1 proporciona una visión general del flujo de trabajo.

  1. Cultivo celular
    NOTA: Realice todos los procedimientos utilizando técnica aséptica en una cabina de seguridad biológica de Clase II. Confirme que las células estén libres de contaminación por micoplasma antes de su uso.
    1. Mantenga las células 16HBE14o− en medio mínimo esencial suplementado con 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina-estreptomicina. Incube las células a 37 °C en una atmósfera humedecida que contenga 5% de CO2, y cambie el medio de cultivo cada dos días.
    2. Deje que las células alcancen aproximadamente el 80% de confluencia. Aspire el medio de cultivo y enjuague la monocapa celular una vez con solución salina tamponada con fosfato.
    3. Añada suficiente solución salina tamponada con fosfato para cubrir la monocapa celular e incube las células durante 20 min a 37 °C. Aspire completamente la solución salina tamponada con fosfato.
      NOTA: Utilice la incubación de 20 min con solución salina tamponada con fosfato para facilitar la ruptura de las uniones intercelulares estrechas formadas por esta línea celular. Esta duración representa una modificación optimizada internamente.
    4. Añada suficiente solución de tripsina al 0,25%–ácido etilendiaminotetraacético para cubrir la monocapa celular. Incube las células durante 10 min a 37 °C.
      NOTA: Supervise la desprendimiento celular utilizando un microscopio invertido de luz. Tape suavemente el recipiente de cultivo cuando sea necesario para facilitar el desprendimiento.
    5. Añada aproximadamente cinco volúmenes de medio de cultivo completo en relación con el volumen de la solución de tripsina–ácido etilendiaminotetraacético para detener la actividad enzimática. Pipetee suavemente la suspensión para obtener una suspensión de células individuales.
    6. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mL. Centrifugue la suspensión a 300 × g durante 5 min a 25 °C.
    7. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y resuspenda el sedimento celular en medio fresco de cultivo. Triture suavemente la suspensión y confirme la presencia de una suspensión de células individuales bajo un microscopio invertido de luz.
    8. Cuente las células utilizando un hemocitómetro y ajuste la concentración celular a la densidad requerida para el experimento subsiguiente. Utilice una relación de división rutinaria de 1:8.
      NOTA: Consulte la Tabla Suplementaria 1 y la Tabla Suplementaria 2 para conocer las áreas de crecimiento de los recipientes de cultivo y los volúmenes correspondientes de solución salina tamponada con fosfato y solución de tripsina–ácido etilendiaminotetraacético.
  2. Determinación de la citotoxicidad inducida por puromicina
    ​NOTA: Seleccione el antibiótico según el gen de resistencia codificado por el constructo lentiviral.
    1. Siembre las células 16HBE14o− a 2 × 104 células por pocillo en una placa de cultivo de 96 pocillos que contenga 100 µL de medio de cultivo completo por pocillo. Incube las células durante la noche.
    2. Reemplace el medio de cultivo con medio fresco que contenga puromicina a concentraciones finales de 0,5, 1, 2 o 4 µg/mL. Prepare placas separadas para los puntos temporales de 24, 48 y 72 h.
    3. Añada 5 µL de reactivo para conteo celular a cada pocillo. Incube la placa durante 1 h a 37 °C.
      NOTA: Evite introducir burbujas de aire en los pocillos, ya que podrían interferir con las mediciones de absorbancia.
    4. Mida la absorbancia a 450 nm utilizando 650 nm como longitud de onda de referencia. Agite la placa durante 15 s inmediatamente antes de registrar la absorbancia en modo de punto final.
    5. Calcule la viabilidad celular14 utilizando la Ecuación 1.
      Ecuación de viabilidad celular, OD450-650 para muestras, control, blanco; fórmula para análisis de bioensayo.
      donde:
      Ecuación de absorbancia OD450-650, método de sustracción, utilizado en espectrofotometría, fórmula.
      Fórmula de densidad óptica (OD450-650) para análisis de absorción en experimentos de espectroscopia.
      Ecuación de densidad óptica, OD450-650blanco=OD450blanco-OD650blanco, para análisis de datos espectroscópicos.
      NOTA: Defina el control como células no tratadas y el blanco como medio sin células que contenga el reactivo del ensayo. Seleccione la concentración más baja de puromicina que elimine completamente las células no transducidas en un período de 48–72 h.
  3. Determinación de la multiplicidad óptima de infección
    ADVERTENCIA: Manipule las partículas lentivirales bajo condiciones de Nivel de Seguridad Biológica 2 en una instalación registrada de Nivel de Seguridad Biológica 2 y de acuerdo con las regulaciones institucionales de seguridad biológica. Realice todas las manipulaciones del virus en una cabina de seguridad biológica de Clase II. Cubra los materiales desechables contaminados con virus y derrames con lejía al 10% durante al menos 1 h antes de desecharlos como residuos biopeligrosos.
    ​NOTA: Optimice la multiplicidad de infección porque afecta directamente la eficiencia de transducción.
    1. Calcule el volumen requerido del stock lentiviral15 utilizando la Ecuación 2.
      Fórmula de cálculo de MOI, relación de partículas virales a células diana, ecuación de biología molecular.
      donde:
      Fórmula del título funcional del virus, T_virus = UT/mL, ecuación para análisis de datos en investigación virológica.
      Ecuación de volumen de virus, V_virus=volumen de virus en mL, fórmula, estudio virológico, método de cálculo
      Equilibrio estático, ecuación: N_células = número de células diana, diagrama para uso educativo en investigación.
      NOTA: El título funcional del stock lentiviral del reportero de luciferasa STAT6 utilizado en este protocolo fue de 5 × 107 unidades transductoras/mL. Para 2 × 104 células diana, una MOI de 20 corresponde a 8 µL de stock lentiviral por pocillo. El volumen del virus debe recalcularse para preparaciones virales con títulos diferentes.
    2. Siembre las células 16HBE14o− a 2 × 104 células por pocillo en una placa de 96 pocillos blanca con fondo transparente que contenga 100 µL de medio de cultivo completo por pocillo. Incube las células durante la noche hasta que alcancen aproximadamente el 80% de confluencia.
    3. Reemplace el medio de cultivo con medio fresco que contenga 5 µg/mL de polibreno y lentivirus del reportero de luciferasa STAT6 a MOIs de 1, 5, 10 y 20. Incluya un pocillo control mock no transducido sin lentivirus.
      NOTA: Calcule el volumen de lentivirus requerido para cada MOI a partir del título funcional del stock.
    4. Incube las células con las partículas lentivirales durante 48 h. Reemplace el medio de transducción con medio de cultivo fresco e incube las células durante 24 h adicionales.
    5. Reemplace el medio de cultivo con medio fresco que contenga interleucina-4 e interleucina-13 a 10 ng/mL cada una. Incube las células durante 24 h.
    6. Añada 25 µL de reactivo para ensayo de luciferasa a cada pocillo16. Proteja la placa de la luz e incube durante 20 min a temperatura ambiente.
    7. Agite la placa linealmente durante 20 s. Mida la luminiscencia en modo de punto final utilizando una lectura completa de placa y un ajuste de ganancia de 120.
      ADVERTENCIA: Registre la luminiscencia dentro de la primera hora tras añadir el reactivo de ensayo de luciferasa para capturar la señal máxima. Siga las instrucciones del fabricante sobre seguridad y manipulación del reactivo.
      NOTA: Utilice el mismo lector de microplacas multimodal y los mismos ajustes de adquisición para todas las mediciones de absorbancia y luminiscencia.
  4. Selección de células transducidas
    1. Siembre las células 16HBE14o− a 2 × 105 células/mL en una placa de cultivo de 24 pocillos. Incube las células durante la noche.
    2. Reemplace el medio de cultivo con medio fresco que contenga el lentivirus del reportero de luciferasa STAT6 a una MOI de 20 y 5 µg/mL de polibreno. Incube las células durante 48 h.
    3. Reemplace el medio de transducción con medio de cultivo fresco. Incube las células durante 24 h adicionales.
    4. Aspire el medio de cultivo y añada medio fresco que contenga 1 µg/mL de puromicina. Incube las células durante 5 días, reemplazando el medio de selección cada 2 días.
    5. Continúe la selección con puromicina hasta que todas las células en el pocillo control mock no transducido sean eliminadas.
      ​NOTA: Permita al menos 24 h tras la transducción antes de aplicar la selección con antibiótico para permitir la expresión del gen de resistencia.
  5. Aislamiento de clones monoclonales mediante dilución límite
    1. Desprenda y cuente las células seleccionadas con puromicina que expresan el reportero STAT6. Prepare una suspensión de células individuales a 5 células/mL mediante dilución seriada.
      ​NOTA: Evite la formación de agregados celulares durante la dilución. Pase la suspensión a través de un filtro celular cuando sea necesario.
    2. Dispense 200 µL de la suspensión celular en cada pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos para obtener una densidad media de aproximadamente una célula por pocillo.
    3. Examine cada pocillo utilizando un microscopio invertido dentro de las 24 h e identifique los pocillos que contengan una sola célula. Excluya los pocillos que contengan más de una célula o múltiples focos celulares espacialmente separados.
    4. Supervise los pocillos seleccionados durante la primera semana para confirmar el crecimiento clonal. Cambie el medio de cultivo cada 3 días.
    5. Amplíe cada clon en la placa original de 96 pocillos durante aproximadamente 20 días o hasta que las células alcancen confluencia. Transfiera cada clon secuencialmente a una placa de 6 pocillos y luego a un matraz de cultivo T-25.
      NOTA: Cultive las células en la placa de 6 pocillos durante aproximadamente 6 días antes de transferirlas al matraz T-25, o transfiéralas cuando alcancen la confluencia adecuada.
      ​PUNTO DE PAUSA: Continúe ampliando los clones o criopresérvelos a 1 × 106 células por vial en 1 mL de medio de criopreservación que contenga 90% de suero bovino fetal y 10% de dimetilsulfóxido.
    6. Siembre cada clon ampliado a 2 × 105 células/mL en una placa de 96 pocillos blanca con fondo transparente. Incube las células durante la noche.
    7. Reemplace el medio de cultivo con medio fresco que contenga IL-4 e IL-13 a 10 ng/mL cada una. Incube las células durante 24 h.
    8. Mida la actividad de luciferasa según se describe en los pasos 1.3.6–1.3.7. Compare la actividad del reportero inducida entre los clones individuales.
    9. Repita el ensayo de luciferasa con números crecientes de pases celulares. Seleccione clones que mantengan una actividad del reportero inducida por citoquinas consistente a lo largo de los pases.
      NOTA: Se seleccionó el clon 3 por su baja luminiscencia basal y su capacidad para mantener una señal de activación inducida por citoquinas consistente a lo largo de pases seriales.

2. Establecimiento y validación del ensayo de actividad del reportero STAT6

NOTA: Figura 2 proporciona una visión general del flujo de trabajo.

  1. Validación del ensayo del reportero de actividad STAT6
    1. Siembre las células reporteras STAT6 a 2 × 105 células/mL en una placa de 96 pocillos blanca con fondo transparente, utilizando 100 µL de medio de cultivo completo por pocillo. Incube las células durante la noche.
    2. Sustituya el medio de cultivo por medio fresco que contenga IL-4 e IL-13 a concentraciones finales de 10 ng/mL cada una. Añada simultáneamente los inhibidores selectivos de la siguiente manera: 100 nM de AS1517499 (inhibidor de STAT6), 2,5 µM de AC-4-130 (inhibidor de STAT5) o 2,5 µM de Stattic (inhibidor de STAT3).
    3. Incluya un control de vehículo que contenga 0,1 % de dimetilsulfóxido (DMSO). Incube las células durante 24 h.
    4. Determine la viabilidad celular utilizando el ensayo de recuento de células descrito en los pasos 1.2.3–1.2.5.
    5. Mida la actividad de luciferasa según se describe en los pasos 1.3.6–1.3.7.
    6. Normalice la señal de luminiscencia de cada pocillo respecto a su viabilidad celular correspondiente. Exprese los valores normalizados en relación con el grupo control tratado con citocinas.
      NOTA: Una viabilidad celular reducida puede disminuir la señal de luciferasa independientemente de la actividad de STAT6. Interprete la actividad del reportero únicamente tras confirmar una viabilidad celular aceptable.
  2. Evaluación de la robustez del ensayo
    1. Evalúe la robustez del ensayo calculando el factor Z′ utilizando 21 pocillos replicados tanto para los grupos control positivo como negativo.
    2. Calcule el factor Z′ utilizando la Ecuación 3.
      Ecuación de equilibrio estático, fórmula del factor Z, expresión matemática para el control de calidad del ensayo.
      donde:
      Ecuación de equilibrio estático, σₚ denota la desviación estándar en el control, ilustración educativa de fórmula.
      Ecuación de desviación estándar, σn, utilizada en análisis estadístico para la precisión del control negativo.
      Ecuación μ<sub>p</sub>= señal media del control positivo; concepto de análisis de datos estadísticos.
      Equilibrio estático, ecuación μn= señal media del control negativo, análisis educativo.
      NOTA: Un factor Z′ comprendido entre 0,5 y 1,0 indica que el ensayo es adecuado para cribado de alto rendimiento.

3. Aplicación del ensayo de reportero STAT6 para el cribado de tóxicos ambientales

PRECAUCIÓN: Manipule los hidrocarburos aromáticos policíclicos y las sales de metales pesados como materiales tóxicos y potencialmente carcinogénicos. Utilice equipo de protección personal adecuado, realice todas las manipulaciones en una campana extractora de gases químicos certificada y deseche los materiales contaminados de acuerdo con los procedimientos institucionales para residuos peligrosos.

  1. Selección de tóxicos ambientales
    1. Siembre las células reporteras STAT6 a 2 × 105 células/mL en una placa de 96 pocillos blanca con fondo transparente, utilizando 100 µL de medio de cultivo completo por pocillo. Incube las células durante la noche.
    2. Sustituya el medio de cultivo por medio fresco que contenga cada compuesto de prueba a la concentración final deseada, que en este protocolo es de 10 µM, y trate las células en ausencia de IL-4 e IL-13.
    3. Incluya un grupo control negativo con 0,1 % de dimetilsulfóxido y un grupo control positivo con IL-4 e IL-13 a 10 ng/mL cada una. Incube las células durante 24 h.
    4. Determine la viabilidad celular utilizando el ensayo de recuento de células según se describe en los pasos 1.2.3–1.2.5.
    5. Mida la actividad de luciferasa según se describe en los pasos 1.3.6–1.3.7.
    6. Normalice la señal de luminiscencia de cada pocillo respecto al valor correspondiente de viabilidad celular. Exprese el resultado normalizado en relación con el grupo control negativo.
    7. Excluya los compuestos que reduzcan la viabilidad celular por debajo del 80 % al interpretar la actividad del reportero STAT6.
      NOTA: Considere poco fiables las señales del reportero obtenidas bajo condiciones citotóxicas, ya que la reducción de la viabilidad celular puede alterar la luminiscencia independientemente de la actividad de la vía STAT6.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Para determinar la concentración óptima de puromicina para la selección estable, las células parentales 16HBE14o− se trataron con concentraciones crecientes de puromicina (0,5–4 µg/mL) y la viabilidad celular se evaluó a las 24, 48 y 72 h mediante un ensayo de viabilidad celular. La puromicina redujo la viabilidad celular de manera dependiente de la dosis y del tiempo, con todas las concentraciones disminuyendo la viabilidad por debajo del 20 % tras 48–72 h (Figura 3). Una concent...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

La señalización IL-4/IL-13–JAK–STAT6 no solo es un objetivo terapéutico importante, sino también un impulsor clave de la patogénesis de enfermedades alérgicas, incluyendo asma y rinitis alérgica22. Este protocolo describe un ensayo de reportero basado en una línea celular simple y estable para identificar moduladores de la actividad de STAT6. El ensayo puede aplicarse para evaluar los efectos moduladores de STAT6 de una amplia gama de compuestos ambientales y es fácilmente adaptable a cribados de ...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores declaran que no existen conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Consejo Nacional de Investigación de Tailandia (NRCT) (Concesión N.º N42A680388), y este proyecto de investigación cuenta con el apoyo de la Universidad Mahidol (Fondo de Investigación Estratégica: 2025) (Concesión N.º 35). Las figuras 1 y 2 fueron creadas utilizando BioRender.com (Pothipan, P. (2026). https://BioRender.com/h44gy3h).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tripsina-EDTA al 0,25%Gibco25200072Reactivo de disociación celular
Tubo cónico estéril para centrífuga de 15 mLCorningCLS430791Tubo de centrífuga de polipropileno estéril
Línea celular epitelial bronquial humana 16HBE14o-Donación del Dr. Nawiya Huipao (Universidad Príncipe de Songkla, Tailandia) y del Prof. Dr. Dieter C. Gruenert (Universidad de California San Francisco, EE. UU.)RRID:CVCL_0112Línea celular epitelial bronquial humana (pasajes 35–40); confirmada libre de micoplasma y mantiene morfología epitelial de vía aérea diferenciada y propiedades de barrera. Referencia: Cozens AL, et al. Am J Respir Cell Mol Biol. 1994;10(1):38–47.
Placa de cultivo de tejidos de fondo plano transparente de 24 pocillosCorning3527Placa de cultivo celular
Placa de cultivo de tejidos de fondo plano transparente de 6 pocillosCorning3516Placa de cultivo celular
Microplaca de poliestireno de fondo plano transparente de 96 pocillosCorning3599Placa para ensayo de viabilidad celular
Microplaca de poliestireno de fondo transparente y paredes blancas de 96 pocillosCorning3610Placa para ensayo de luminiscencia
AC-4-130 (inhibidor de STAT5)MedChemExpressHY-124500Inhibidor selectivo de STAT5
AS1517499 (inhibidor de STAT6)MedChemExpressHY-100614Inhibidor selectivo de STAT6
Benzo[b]fluorantenoAccuStandardH-128NHidrocarburo aromático policíclico
Campana de seguridad biológica, Clase IINuaireNU-543-400EPara procedimientos asépticos de cultivo celular
Cloruro de cadmio (CdCl2)Sigma202908Compuesto de metal pesado
Kit de conteo celular-8 (CCK-8)MedChemExpressHY-K0301Ensayo de viabilidad celular
Frasco de cultivo celular de 25 cm² (T-25)Corning430639Frasco para cultivo de tejidos
Incubadora de CO2NuaireNU-5710EMantenida a 37 °C, 5% CO2, atmósfera humedecida
Dimetilsulfóxido (DMSO)SigmaD2650Solvente (concentración final 0,1%) y crioprotector (10%)
Suero bovino fetal (FBS)SigmaF7524Suplemento del medio (10%) y medio de criopreservación (10%)
HemocitómetroBOECOBOE14Conteo manual de células
Microscopio invertido de contraste de fasesZEISSPrimovertObservación de la morfología celular
Sistema de ensayo de luciferasa (ONE-Step)BPS Bioscience60690Ensayo de luciferasa reportera
Cloruro de mercurio (HgCl2)Sigma215465Compuesto de metal pesado
Lector de microplacasBioTekSynergy Neo2Lector multimodal de microplacas/luminómetro controlado por software Gen5 (v3.08.01). La absorbancia se midió a 450 nm con referencia a 650 nm tras agitación lineal de 15–20 s. La luminiscencia se midió en modo de punto final usando una ganancia del detector de 120 tras 20 s de agitación lineal.
Medio mínimo esencial de Eagle (MEM)Gibco11095-080Medio basal de cultivo
Sulfato de níquel (NiSO4)Tokyo Chemical IndustryN1203Compuesto de metal pesado
Materia particulada (PM)Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (National Institute of Standards and Technology)SRM 2975Material de referencia estándar para materia particulada
Penicilina-estreptomicina (100×)Gibco15140122Suplemento antibiótico (concentración final 1%)
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Gibco18912014Tampón de lavado
PoliabrenoSigmaTR-1003-GPotenciador de transducción lentiviral
PuromicinaMedChemExpressHY-B1743AAntibiótico para selección estable de células
IL-13 humana recombinanteThermo Fisher ScientificA42526Citocina para estimulación
IL-4 humana recombinanteThermo Fisher ScientificA42602Citocina para estimulación
Lentivirus reportero de STAT6BPS Bioscience78799Construcción reportera lentiviral; título del stock 5 × 107 UT/mL
Stattic (inhibidor de STAT3)MedChemExpressHY-13818Inhibidor selectivo de STAT3

Referencias

  1. Organisation for Economic Co-operation and Development. The Economic Consequences of Outdoor Air Pollution. OECD Publishing; Paris; 2016.
  2. Thailand Pollution Control Department. Air Quality Assessments for Health and Environment Policies in Thailand. Thailand Pollution Control Department; Bangkok; 2018.
  3. Health Effects Institute. State of Global Air Report 2024. Available at: https://www.stateofglobalair.org/resources/report/state-global-air-report-2024
  4. State of Global Air. Trends in Air Quality and Health Impacts: Insights from Central, South, and Southeast Asia. 2025. Available at: https://www.stateofglobalair.org/
  5. Shi X. Acute effects of air pollution on human health in China: Evidence and prospects. China CDC Wkly. 2021;3(45):941-942.
  6. Tsai YG, et al. Long-term PM2.5 exposure impairs lung growth and increases airway inflammation in Taiwanese school children. ERJ Open Res. 2025;11(4).
  7. Walford HH, Doherty TA. STAT6 and lung inflammation. JAKSTAT. 2013;2(4):e25301.
  8. Moonwiriyakit A, et al. GPR120/FFAR4 stimulation attenuates airway remodeling and suppresses IL-4- and IL-13-induced airway epithelial injury via inhibition of STAT6 and Akt. Biomed Pharmacother. 2023;168:115774.
  9. Pelaia C, et al. Biological therapy of severe asthma with dupilumab, a dual receptor antagonist of interleukins 4 and 13. Vaccines (Basel). 2022;10(6).
  10. Yang Y, et al. Continuous exposure to PM2.5 exacerbates ovalbumin-induced asthma in mouse lung via the JAK-STAT6 signaling pathway. Adv Clin Exp Med. 2020;29(7):825-832.
  11. Li X, Huang L, Wang N, Yi H, Wang H. Sulfur dioxide exposure enhances Th2 inflammatory responses via activation of the STAT6 pathway in asthmatic mice. Toxicol Lett. 2018;285:43-50.
  12. Reiss R, et al. Evidence of health impacts of sulfate- and nitrate-containing particles in ambient air. Inhal Toxicol. 2007;19(5):419-449.
  13. Li R, et al. Key toxic components and sources affecting oxidative potential of atmospheric particulate matter using interpretable machine learning: Insights from fog episodes. J Hazard Mater. 2024;465:133175.
  14. Posimo JM, et al. Viability assays for cells in culture. J Vis Exp. 2014;(83):e50645.
  15. Baumlin-Schmid N, Salathe M, Fregien NL. Optimal lentivirus production and cell culture conditions necessary to successfully transduce primary human bronchial epithelial cells. J Vis Exp. 2016;(113).
  16. Nozeret K, Pernin A, Buddelmeijer N. Click-chemistry based fluorometric assay for apolipoprotein N-acyltransferase from enzyme characterization to high-throughput screening. J Vis Exp. 2020;(159).
  17. Rolling C, Treton D, Pellegrini S, Galanaud P, Richard Y. IL-4 and IL-13 receptors share the γc chain and activate STAT6, STAT3, and STAT5 proteins in normal human B cells. FEBS Lett. 1996;393(1):53-56.
  18. Deimel LP, Li Z, Roy S, Ranasinghe C. STAT3 determines IL-4 signalling outcomes in naïve T cells. Sci Rep. 2021;11(1):10495.
  19. Wingelhofer B, et al. Pharmacologic inhibition of STAT5 in acute myeloid leukemia. Leukemia. 2018;32(5):1135-1146.
  20. McMurray JS. A new small-molecule STAT3 inhibitor. Chem Biol. 2006;13(11):1123-1124.
  21. Chiba Y, Todoroki M, Nishida Y, Tanabe M, Misawa M. A novel STAT6 inhibitor, AS1517499, ameliorates antigen-induced bronchial hypercontractility in mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 2009;41(5):516-524.
  22. Zhang X, et al. The immunogenetic landscape of allergic rhinitis: From cellular effectors to gene regulation and targeted therapies. Int J Biol Sci. 2026;22(3):1322-1345.
  23. Yu H, Li Q, Kolosov VP, Perelman JM, Zhou X. Interleukin-13 induces mucin 5AC production involving STAT6/SPDEF in human airway epithelial cells. Cell Commun Adhes. 2010;17(4-6):83-92.
  24. White SR, Martin LD, Stern R, Laxman B, Marroquin BA. Expression of IL-4/IL-13 receptors in differentiating human airway epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2010;299(5):L681-L693.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Explorar más artículos

Células epiteliales de las vías respiratoriasseñalización de STAT6reportero de luciferasaestimulación con IL-4estimulación con IL-13análisis del factor Z'transducción lentiviral

Este artículo ha sido publicado

Video próximamente

Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.