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Artículo de método
Este protocolo describe un flujo de trabajo estandarizado de citometría de flujo multicolor para la evaluación medible de enfermedades residuales en leucemia aguda, integrando procesamiento controlado de muestras, parámetros de adquisición armonizados, estrategias de gating secuencial e interpretación ajustada al denominador para mejorar la reproducibilidad analítica en laboratorios clínicos rutinarios.
La enfermedad residual medible (DMR) es un indicador pronóstico importante en el manejo de la leucemia aguda. Sin embargo, la evaluación rutinaria de citometría de flujo multicolor (MFC) sigue siendo vulnerable a la variabilidad preanalítica y analítica, incluyendo hemodilución, profundidad de adquisición inconsistente e interpretación subjetiva. Este artículo presenta un flujo de trabajo operativo estandarizado para la evaluación rutinaria de MRD en leucemia linfoblástica aguda de células B (B-ALL) y leucemia mieloide aguda (LMA). El protocolo incorpora criterios estrictos de aceptación de muestras, con evaluación integrada de hemodilución, y utiliza un método de lisis masiva de glóbulos rojos para muestras de médula ósea y sangre periférica. La estandarización analítica se logra mediante paneles de anticuerpos de dos tubos y ocho colores específicos para cada enfermedad, objetivos de adquisición armonizados que requieren al menos 500.000 eventos positivos en CD45 y estrategias de bloqueo secuencial fija. Además, el flujo de trabajo aplica límites de detección (LOD) y cuantificación ajustados por denominador (LOQ) para soportar un sistema objetivo de informes de tres niveles. La validación de 197 muestras clínicas demostró una fuerte repetibilidad, una linealidad dilucional robusta y una alta concordancia con ensayos moleculares ortogonales emparejados. En conjunto, este protocolo proporciona un marco práctico para la monitorización estandarizada de MRD. para el monitoreo estandarizado de MRD en laboratorios clínicos rutinarios mediante la integración de manejo preanalítico controlado y parámetros analíticos armonizados.
Incluso después de alcanzar la remisión morfológica, los pacientes con leucemia aguda requieren un seguimiento continuo para detectar la enfermedad residual medible (DMR) para evaluar con precisión el riesgo de recaída. Los exámenes morfológicos y citopatológicos convencionales carecen de la sensibilidad necesaria para detectar poblaciones leucémicas residuales de bajo nivel. En consecuencia, la evaluación de la MRD se ha convertido en un componente esencial para el monitoreo de enfermedades tanto en la leucemia mieloide aguda (LMA) como en la leucemia linfoblástica aguda de células B (B-ALL). Las recomendaciones recientes de European....
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Todos los procedimientos que involucraron muestras humanas se realizaron conforme a las directrices institucionales y fueron aprobados por el Comité de Ética del Segundo Hospital Popular de Neijiang (Aprobación nº PXTS887192). El estudio utilizó muestras clínicas residuales desidentificadas obtenidas tras pruebas diagnósticas rutinarias. Se renunció al consentimiento informado porque el estudio no afectó al cuidado del paciente, la asignación de tratamientos ni los procedimientos de recogida de muestras. Los productos químicos, reactivos y equipos utilizados en el protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales.
<....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Características del conjunto de datos de implementación rutinaria
Durante el periodo del estudio, 197 muestras consecutivas superaron el cribado de elegibilidad y la evaluación preanalítica de calidad, y entraron en el flujo de trabajo reportable. La cohorte del estudio incluyó 98 pacientes, 62 (63,3%) con leucemia linfoblástica aguda de células B (B-ALL) y 36 (36,7%) con leucemia mieloide aguda (LMA). La cohorte estaba compuesta por 64 hombre.......
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El objetivo principal de este estudio fue establecer un flujo de trabajo estandarizado para la evaluación citométrica de flujo multicolor de la enfermedad residual medible (DMR) en leucemia aguda. La evaluación fiable de la MRD depende no solo de la selección del panel de anticuerpos, sino también de la manipulación consistente de la muestra, los parámetros de adquisición y la interpretación de losdatos 11. Los resultados de este estudio demuestran que un procesam.......
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Los autores no tienen nada que revelar.
El autor agradece al Departamento de Laboratorio Clínico del Segundo Hospital Popular de Neijiang por proporcionar instalaciones de laboratorio y apoyo técnico para este estudio. El autor también agradece al personal de laboratorio y al personal clínico por su ayuda en el procesamiento de muestras y la recogida de datos. Por último, el autor agradece a los pacientes cuyos especímenes clínicos residuales contribuyeron a este trabajo. Esta investigación no recibió financiación específica de organismos públicos, comerciales o sin ánimo de lucro.
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Acquisition buffer | Laboratory-prepared | PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA; final resuspension volume 500 µL | Final resuspension before flow cytometric acquisition |
| AML Tube 1 anti-CD117-APC antibody | BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA) | Clone: 104D2; fluorochrome: APC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs | Early myeloid/blast identification |
| AML Tube 1 anti-CD13-FITC antibody | BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA) | Clone: L138; fluorochrome: FITC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs | Myeloid lineage anchor |
| AML Tube 1 anti-CD33-PE antibody | BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA) | Clone: P67.6; fluorochrome: PE; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs | Myeloid lineage anchor |
| AML Tube 1 anti-CD34-PerCP-Cy5.5 antibody | BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA) | Clone: 8G12; fluorochrome: PerCP-Cy5.5; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs | Immaturity marker |
| AML Tube 1 anti-CD45-APC-H7 antibody | BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA) | Clone: 2D1; fluorochrome: APC-H7; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs | Leukocyte backbone marker and denominator definition |
| AML Tube 1 anti-CD56-V500 antibody | BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA) | Clone: NCAM16.2; fluorochrome: V500; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs | Aberrant blast-associated phenotyping |
| AML Tube 1 anti-CD7-V450 antibody | BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA) | Clone: M-T701; fluorochrome: V450; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs | Cross-lineage aberrancy detection |
| AML Tube 1 anti-HLA-DR-PE-Cy7 antibody | BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA) | Clone: G46-6; fluorochrome: PE-Cy7; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs | Maturation and subtype discrimination |
| AML Tube 2 anti-CD117-APC antibody | BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA) | Clone: 104D2; fluorochrome: APC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs | Early myeloid/blast identification |
| AML Tube 2 anti-CD11b-V450 antibody | BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA) | Clone: ICRF44; fluorochrome: V450; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs | Maturation-discordance assessment |
| AML Tube 2 anti-CD13-FITC antibody | BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA) | Clone: L138; fluorochrome: FITC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs | Myeloid lineage anchor |
| AML Tube 2 anti-CD15-V500 antibody | BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA) | Clone: HI98; fluorochrome: V500; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs | Different-from-normal myeloid pattern assessment |
| AML Tube 2 anti-CD33-PE antibody | BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA) | Clone: P67.6; fluorochrome: PE; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs | Myeloid lineage anchor |
| AML Tube 2 anti-CD34-PerCP-Cy5.5 antibody | BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA) | Clone: 8G12; fluorochrome: PerCP-Cy5.5; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs | Immaturity marker |
| AML Tube 2 anti-CD45-APC-H7 antibody | BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA) | Clone: 2D1; fluorochrome: APC-H7; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs | Leukocyte backbone marker and denominator definition |
| AML Tube 2 anti-HLA-DR-PE-Cy7 antibody | BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA) | Clone: G46-6; fluorochrome: PE-Cy7; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs | Maturation and subtype discrimination |
| Ammonium chloride-based red blood cell lysis buffer | Laboratory-prepared / commercial supplier | Ammonium chloride-based lysis buffer; 10 mL/test; 10 min at room temperature | Bulk red blood cell lysis |
| Analysis software | Beckman Coulter (Brea, CA, USA) | Kaluza 2.1 | Data analysis and sequential gating |
| Automated hematology analyzer | Commercial supplier | Automated hematology analyzer used for nucleated cell concentration and viability assessment | Nucleated cell concentration and viability assessment |
| B-ALL Tube 1 anti-CD10-PE antibody | BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA) | Clone: HI10a; fluorochrome: PE; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs | Precursor B-cell definition |
| B-ALL Tube 1 anti-CD19-FITC antibody | BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA) | Clone: SJ25C1; fluorochrome: FITC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs | B-lineage identification and entry into precursor compartment |
| B-ALL Tube 1 anti-CD20-APC antibody | BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA) | Clone: L27; fluorochrome: APC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs | Maturation pattern assessment |
| B-ALL Tube 1 anti-CD34-PerCP-Cy5.5 antibody | BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA) | Clone: 8G12; fluorochrome: PerCP-Cy5.5; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs |
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