Protocolo estandarizado de citometría de flujo multicolor para la evaluación medible de enfermedades residuales en leucemia aguda

Resumen

Este protocolo describe un flujo de trabajo estandarizado de citometría de flujo multicolor para la evaluación medible de enfermedades residuales en leucemia aguda, integrando procesamiento controlado de muestras, parámetros de adquisición armonizados, estrategias de gating secuencial e interpretación ajustada al denominador para mejorar la reproducibilidad analítica en laboratorios clínicos rutinarios.

Resumen

La enfermedad residual medible (DMR) es un indicador pronóstico importante en el manejo de la leucemia aguda. Sin embargo, la evaluación rutinaria de citometría de flujo multicolor (MFC) sigue siendo vulnerable a la variabilidad preanalítica y analítica, incluyendo hemodilución, profundidad de adquisición inconsistente e interpretación subjetiva. Este artículo presenta un flujo de trabajo operativo estandarizado para la evaluación rutinaria de MRD en leucemia linfoblástica aguda de células B (B-ALL) y leucemia mieloide aguda (LMA). El protocolo incorpora criterios estrictos de aceptación de muestras, con evaluación integrada de hemodilución, y utiliza un método de lisis masiva de glóbulos rojos para muestras de médula ósea y sangre periférica. La estandarización analítica se logra mediante paneles de anticuerpos de dos tubos y ocho colores específicos para cada enfermedad, objetivos de adquisición armonizados que requieren al menos 500.000 eventos positivos en CD45 y estrategias de bloqueo secuencial fija. Además, el flujo de trabajo aplica límites de detección (LOD) y cuantificación ajustados por denominador (LOQ) para soportar un sistema objetivo de informes de tres niveles. La validación de 197 muestras clínicas demostró una fuerte repetibilidad, una linealidad dilucional robusta y una alta concordancia con ensayos moleculares ortogonales emparejados. En conjunto, este protocolo proporciona un marco práctico para la monitorización estandarizada de MRD. para el monitoreo estandarizado de MRD en laboratorios clínicos rutinarios mediante la integración de manejo preanalítico controlado y parámetros analíticos armonizados.

Introducción

Incluso después de alcanzar la remisión morfológica, los pacientes con leucemia aguda requieren un seguimiento continuo para detectar la enfermedad residual medible (DMR) para evaluar con precisión el riesgo de recaída. Los exámenes morfológicos y citopatológicos convencionales carecen de la sensibilidad necesaria para detectar poblaciones leucémicas residuales de bajo nivel. En consecuencia, la evaluación de la MRD se ha convertido en un componente esencial para el monitoreo de enfermedades tanto en la leucemia mieloide aguda (LMA) como en la leucemia linfoblástica aguda de células B (B-ALL). Las recomendaciones recientes de European LeukemiaNet enfatizan que la evaluación fiable de la MRD en LMA depende de la estandarización técnica y la reproducibilidad entre observadores, más que de la simple disponibilidad del^{ensayo 1,2}. En B-ALL, la citometría de flujo multicolor (MFC) sigue siendo especialmente importante para pacientes sin blancos moleculares estables. Estudios previos han demostrado que los enfoques estandarizados de citometría de flujo multicolor utilizando diseños estructurados de panel de anticuerpos pueden proporcionar una detección residual reproducible^{y sensible de la enfermedad 3}. La citometría de flujo se utiliza ampliamente debido a su amplia aplicabilidad, su rápido tiempo de respuesta y su rentabilidad. El rendimiento del ensayo sigue dependiendo en gran medida de la preparación estandarizada de la muestra, los parámetros de adquisición y la interpretación de datos⁴.

Uno de los principales retos técnicos en la evaluación de MRD citométrico de flujo es la detección de eventos raros, que está fuertemente influenciada por la profundidad de adquisición y el total de eventos. Los paneles de anticuerpos idénticos pueden producir sensibilidades analíticas diferentes si se adquieren muestras con tamaños de denominador^{inconsistentes 5}. Por tanto, la estandarización va más allá de la selección de anticuerpos y requiere un procesamiento armonizado de muestras, lisis masiva de glóbulos rojos, compensación de instrumentos, objetivos de adquisición y estrategias de gating. En muestras de médula ósea, la hemodilución también representa una variable preanalítica significativa porque la contaminación periférica de la sangre puede reducir artificialmente la carga residual aparente^{de leucemia 6,7}. Además, la interpretación de eventos de baja frecuencia requiere umbrales de reporte claramente definidos basados en la profundidad de adquisición específica de la muestra. Estudios recientes han enfatizado la importancia de los límites de detección (LOD) y cuantificación ajustados por denominador (LOQ) para mejorar la consistencia de la interpretación MRD citométrica^{de flujo 8}.

El objetivo general de este protocolo es proporcionar un flujo de trabajo estandarizado para la evaluación rutinaria de MRD basada en MFC en B-ALL y AML. El protocolo integra criterios de aceptación de muestras, evaluación de hemodilución, diseño de panel de anticuerpos específico para la enfermedad, preparación de muestras por lisis masiva, objetivos de adquisición armonizados, estrategias fijas de control secuencial y criterios de notificación ajustados por denominador en un único marco^{operativo 9,10}. Al combinar procedimientos preanalíticos y analíticos estandarizados, este método proporciona un enfoque práctico y reproducible para la implementación rutinaria en laboratorio clínico de la monitorización de la DMR. La Figura 1 ilustra el flujo de trabajo preanalítico y analítico estandarizado general implementado en este estudio. La Tabla 1 resume las características de la cohorte y de la muestra de los pacientes con leucemia linfoblástica aguda de células B (LLA) y leucemia mieloide aguda (LMA) inscritos durante el periodo de validación a través de ventanas de monitorización predefinidas (Fin de la inducción, consolidación y pre-HSCT).

Figura 1: Flujo de trabajo estandarizado para la evaluación rutinaria de MRD citométrica de flujo multicolor. (A) Flujo de trabajo preanalítico que muestre el cribado de muestras y la evaluación de la calidad a lo largo de intervalos de monitorización predefinidos. (B) Flujo de trabajo analítico desde la lisis masiva de glóbulos rojos y la tinción de anticuerpos hasta la intersección secuencial, interpretación ajustada al denominador y la notificación final de MRD. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Tabla 1: Demografía consolidada de los pacientes, características de las muestras clínicas y métricas de adquisición rutinaria. Esta única tabla revisada resume las características clínicas iniciales de la cohorte enrollada que comprende casos de leucemia linfoblástica aguda de células B (B-ALL) y leucemia mieloide aguda (LMA), y combina datos demográficos a nivel de paciente con características a nivel de muestra, intervalos de monitorización de tratamiento, viabilidad, puntuaciones de hemodilución, profundidades de adquisición y clasificaciones medibles de enfermedad residual ajustadas por denominador. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucraron muestras humanas se realizaron conforme a las directrices institucionales y fueron aprobados por el Comité de Ética del Segundo Hospital Popular de Neijiang (Aprobación nº PXTS887192). El estudio utilizó muestras clínicas residuales desidentificadas obtenidas tras pruebas diagnósticas rutinarias. Se renunció al consentimiento informado porque el estudio no afectó al cuidado del paciente, la asignación de tratamientos ni los procedimientos de recogida de muestras. Los productos químicos, reactivos y equipos utilizados en el protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Recogida de muestras y evaluación preanalítica

1. Recoger aspirados de médula ósea como el tipo de muestra preferido para la evaluación de la enfermedad residual medible (MRD). Utilizar muestras de sangre periférica solo cuando la aspiración de médula ósea esté clínicamente contraindicada o durante análisis seleccionados de vigilancia y comparación.
2. Recoge la muestra de médula ósea durante la primera extracción de aspirado siempre que sea posible. Evitar extracciones posteriores de aspirado para minimizar la contaminación periférica de la sangre y la subestimación de la enfermedad residual de bajo nivel.
3. Transfiere las muestras a tubos de ácido etilendediaminetetraacético dipotásico (K2-EDTA) o anticoagulante sodio-heparina inmediatamente después de la recogida. Almacenar y transportar los ejemplares a temperatura ambiente (18–25 °C) y protégelos de la luz solar directa.
   PRECAUCIÓN: No refrigeres los ejemplares.
4. Procesar todos los ejemplares en un plazo de 24 horas desde la recogida. Para estudios de estabilidad, conservar las alicuotas para análisis repetidos a las 24 h y 48 h, manteniendo las condiciones de almacenamiento a temperatura ambiente.
5. Verifique el identificador del paciente, el tipo de anticoagulante, la integridad de la muestra y el tiempo de recogida al recibirla. Ejemplares rechazados que demuestren coagulación extensa, hemólisis severa o degeneración celular marcada
6. Evalúa muestras de médula ósea para hemodilución antes de la interpretación final. Calcular una puntuación semicuantitativa de hemodilución que oscile entre 0,00 y 1,00 para estimar la contaminación de sangre periférica.
7. Determina este valor dividiendo la proporción de linfocitos maduros por la suma de progenitores CD34-positivos, granulocitos inmaduros y linfocitos maduros, donde un cociente más alto indica un mayor efecto dilucional.
   NOTA: Calcula la puntuación usando la siguiente fórmula:
    
   donde una puntuación más alta indica una mayor contaminación sanguínea periférica.
8. Clasifica las puntuaciones de hemodilución de la siguiente manera: <0,20, aceptable; 0,20–0,39, ligeramente hemodilutado; y ≥0,40, sustancialmente hemodilutado.
   NOTA: No asigne interpretaciones definitivas negativas a MRD a especímenes marcadamente hemodilutados a menos que se confirme un tamaño adecuado del denominador y una arquitectura de precursores de médula preservada.

2. Preparación de panel de anticuerpos específica para la enfermedad

1. Preparar paneles estandarizados de dos tubos y ocho colores de anticuerpos específicos para la enfermedad para análisis de B-ALL y LMA. Lograr la estandarización de los paneles cumpliendo estrictamente con marcadores fijos de columna vertebral en todos los tubos para establecer una vía de control poblacional.
2. Utilizar conjugados fluorocromos consistentes para los antígenos de linaje correspondientes y seguir estrictamente los volúmenes de titulación recomendados por el fabricante para minimizar la variabilidad de fluorescencia de lote a lote.
3. Consulte la Tabla Suplementaria 1 para combinaciones de marcadores, asignaciones de fluorocromo, clones de anticuerpos, volúmenes de tinción y parámetros de adquisición.
4. Para la evaluación de B-ALL, se utilizan CD19, CD45, CD34, CD10 y CD20 como marcadores de columna vertebral en ambos tubos para definir poblaciones precursoras y patrones de maduración. Añade CD38, CD58 y CD81 al Tubo 1.
5. Añadir CD66c, CD123 y CD73 o CD304 al tubo 2 según el inmunofenotipo diagnóstico asociado a leucemia establecido en la evaluación inicial.
6. Para la evaluación de LMA, utiliza CD45, CD34, CD117, CD13, CD33 y HLA-DR como marcadores de columna vertebral en ambos tubos para definir poblaciones de blastocios e inmaduras mieloides.
7. Añadir CD7 y CD56 al Tubo 1 para evaluar la expresión de antígenos cruzados entre líneas. Añadir CD11b y CD15 al tubo 2 para evaluar las anomalías de maduración mieloide.

3. Preparación y tinción para la lisis a granel

1. Transfiere 2,0 mL de médula ósea bien mezclada o muestra de sangre periférica a un tubo de polipropileno de 15 mL. Si el volumen de muestra es limitado, utilice un volumen mínimo de entrada de 1,0 mL.
2. Añade 10 mL de tampón de lisis de cloruro de amonio precalentado a la muestra. Incuba la suspensión durante 10 minutos a temperatura ambiente para lisar los glóbulos rojos.
3. Centrifuga la muestra a 500 × g durante 5 minutos. Desecha el sobrenadante con cuidado sin alterar la cápsula nucleada.
4. Resuspende el pellet en 2 mL de suero salino tamponado con fosfato (PBS) que contiene 0,5% de albúmina sérica bovina (BSA) y 2 mM de ácido etilendediaminetetraacético (EDTA). Repite el paso de lavado una vez si la contaminación residual por hemoglobina sigue siendo visible.
5. Determina la concentración de células nucleadas utilizando un analizador hematológico automatizado o recuento manual de hemocitómetros con exclusión de azul de tripán. Considera una concentración mínima de células nucleadas de 5 × 10⁶ células/mL como óptima para la adquisición estándar.
   NOTA: Si el rendimiento celular cae por debajo de este umbral, concentrar la muestra mediante una centrifugación adicional a 500 × g durante 5 minutos y reducir cuidadosamente el volumen del tampón de resuspensión para maximizar la densidad celular.
6. Cuocuota 5 × 10⁶ células nucleadas por tubo para la tinción rutinaria. Aumentar la entrada a un máximo de 1 × 10⁷ celdas por tubo para un análisis de alta sensibilidad cuando la recuperación de la muestra^{lo permita 6,7}.
7. Añadir el cóctel de anticuerpos titulado individualmente y el tinte de viabilidad reparable especificado en la Tabla de Materiales a cada tubo según la configuración validada del panel de tinción. El panel validado rutinario utiliza 5 μL por anticuerpo conjugado con fluorocromo, salvo que la titulación recomendada por el fabricante indique un volumen específico de anticuerpo diferente.
8. Asegúrese de que el volumen final de la reacción de tinción se mantenga estrictamente en 100 μL por prueba para preservar una estequiometría óptima entre anticuerpos y antígenos. Incuba las muestras durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
9. Lava las células teñidas una vez usando tampón de lavado y vuelve a suspender el último pellet en 500 μL de tampón de adquisición.
10. Preparar controles de compensación con una sola tinción utilizando perlas de compensación el mismo día de la adquisición del espécimen.

4. Configuración de instrumentos y adquisición de datos

1. Realizar el control de calidad diario de arranque en el citómetro de flujo antes de adquirir muestras del paciente. Verifica la fluidica, la alineación láser, el rendimiento del detector y los valores objetivo de fluorescencia utilizando perlas de calibración, siguiendo las instrucciones del fabricante.
2. Prepara controles de compensación con tinción única utilizando los mismos fluorocromos incluidos en los paneles de anticuerpos. Ajustar la matriz de compensación antes de la adquisición por parte del paciente y confirmar que los marcadores de la columna principal permanezcan dentro de los rangos de fluorescencia objetivo predefinidos.
3. Utiliza la misma plantilla de adquisición, ajustes del detector, estrategia de compensación y jerarquía de gating para todas las muestras analizadas durante el periodo de validación.
   NOTA: Garantizar una armonización adecuada entre instrumentos estableciendo valores estandarizados de intensidad mediana de fluorescencia objetivo para todos los detectores utilizando perlas de calibración especializadas, y confirmar que muestras idénticas producen perfiles de fluorescencia comparables entre plataformas antes de la adquisición de datos clínicos.
4. Adquirir datos a un caudal bajo a moderado para reducir eventos coincidentes y preservar la precisión de detección de eventos raros. Monitoriza la tasa de eventos de forma continua durante la adquisición.
5. Adquirir al menos 500.000 eventos nucleados positivos en CD45 para cada resultado de MRD notificable. Cuando la calidad y estabilidad de los eventos lo permitan, se extiende la adquisición a 1,0–1,5 millones de eventos totales, especialmente cuando se sospecha de enfermedad residual de bajo nivel.
6. Pausa o detiene la adquisición si se produce inestabilidad fluídica, obstrucciones de muestras, cambios bruscos en la velocidad de eventos o un deterioro visible en la calidad de la dispersión. Refiltra o remezcla la muestra cuando sea apropiado, y solo se recupera la muestra después de que se haya restaurado el flujo estable.

5. Acceso secuencial e interpretación ajustada al denominador

1. Analizar los datos de citometría de flujo utilizando un software validado de análisis de citometría de flujo. Utilizar la misma estrategia de gating secuencial para todas las muestras para reducir la variabilidad entre operadores.
2. Establecer patrones de maduración normales y regeneratorios adquiriendo y analizando de forma independiente un banco de referencia de al menos 20 muestras de médula ósea normales o en regeneración para servir como plantillas de expresión base.
3. Excluye los escombros usando parámetros de dispersión hacia adelante y dispersión lateral. Aislar las células individuales aplicando una filtración por área de dispersión directa frente a altura de dispersión directa.
4. Excluye las celdas no viables usando la compuerta de colorante de viabilidad que aparece en la tabla de Materiales. Elimina estas células no viables de forma rutinaria porque presentan unión inespecífica a anticuerpos y pueden elevar artificialmente el ruido de fondo o imitar poblaciones aberrantes raras.
   NOTA: Requieren un umbral mínimo de viabilidad del 75% para un análisis óptimo aguas abajo, teniendo en cuenta que los especímenes que estén por debajo de este valor merecen una interpretación cautelosa respecto a posibles artefactos de eventos raros. Definir el denominador leucocitos mediante la filtración en eventos viables CD45-positivos con características de dispersión lateral adecuadas.
5. Para muestras de B-ALL, se restringe el análisis al compartimento precursor positivo de CD19. Implementar un marco alternativo de acceso para pacientes que reciben terapias dirigidas a anti-CD19.
6. Trasladar la evaluación primaria a compartimentos positivos para CD22, CD24 o CD34 para capturar la población leucémica independientemente de la expresión de CD19. Evaluar los patrones de maduración de CD34, CD10 y CD20 e identificar poblaciones aberrantes utilizando patrones de expresión CD38, CD58, CD81, CD66c, CD123 y CD73 o CD304.
7. Para muestras de LMA, define la región del blasto o precursor usando la expresión CD45, dispersión lateral, CD34 y CD117.
8. Evaluar la expresión aberrante o asincrónica de marcadores mieloides y de líneas cruzadas, incluyendo CD13, CD33, HLA-DR, CD7, CD56, CD11b y CD15.
9. Calcula el límite específico de detección (LOD) y el límite de cuantificación (LOQ) específicos de la muestra usando el número total de eventos viables adquiridos en CD45 positivos como denominador:
    
    
10. Clasificar la interpretación final de MRD en una de tres categorías: MRD-positivo, por debajo de LOD o limitado analíticamente.
    1. Asignar el resultado como MRD-positivo cuando un grupo claro y contiguo de eventos aberrantes supera el LOD específico de la muestra y demuestra un inmunofenotipo internamente consistente distinto de poblaciones hematopoyéticas normales o en regeneración.
       NOTA: No clasifique los eventos dispersos y no agrupados como MRD-positivos. Utilizar un enfoque de análisis integrado que combine tanto el inmunofenotipo asociado a la leucemia (LAIP) seguido de la muestra diagnóstica inicial como las estrategias de reconocimiento de patrones diferentes de lo normal (DfN).
    2. Asignar el resultado como inferior a LOD cuando existan eventos sospechosos raros pero no alcancen el umbral notificable específico de la muestra.
    3. Asignar el resultado como limitado analíticamente cuando el tamaño del denominador es insuficiente, la hemodilución es sustancial, la calidad de la muestra es pobre o las limitaciones preanalíticas o analíticas impiden una interpretación negativa y segura.
11. Revisa todos los casos de MRD positivo y de bajo nivel de forma independiente por un segundo analista cualificado.
12. Finalizar la interpretación de la citometría de flujo antes de revisar los datos de comparadores moleculares emparejados, incluyendo resultados cuantitativos de reacción en cadena de la polimerasa o de secuenciación de nueva generación.

6. Metodología analítica de validación

1. Evalúa la repetibilidad analítica preparando alicotas duplicadas de la misma suspensión celular post-lisis. Adquiere y analiza al menos 30 especímenes emparejados de forma independiente.
2. Evalúa la linealidad dilucional preparando diluciones en serie a lo largo de seis niveles dentro del rango esperado de baja carga. Comparar los valores de MRD observados con los valores esperados de MRD a lo largo de la serie de dilución.
3. Evalúa la reproducibilidad entre operadores e instrumentos analizando muestras de referencia entre múltiples operadores cualificados y citómetros de flujo armonizados.
4. Transformar los porcentajes citométricos de flujo y MRD molecular emparejados usando la transformación log10 antes de la comparación estadística. Evalúa la concordancia cuantitativa utilizando análisis de correlación y análisis de Bland-Altman.

Resultados

Características del conjunto de datos de implementación rutinaria

Durante el periodo del estudio, 197 muestras consecutivas superaron el cribado de elegibilidad y la evaluación preanalítica de calidad, y entraron en el flujo de trabajo reportable. La cohorte del estudio incluyó 98 pacientes, 62 (63,3%) con leucemia linfoblástica aguda de células B (B-ALL) y 36 (36,7%) con leucemia mieloide aguda (LMA). La cohorte estaba compuesta por 64 hombres (65,3%) y 34 mujeres (34,7%), con una edad mediana de 32 años (rango intercuartílico [IQR], 13–49 años; rango, 2–73 años). El porcentaje medio de blastos basal fue del 67,2% (IQR, 56,9% – 80,2%).

La mayoría de las muestras analizadas fueron aspiradas de médula ósea (174/197, 88,3%), mientras que las muestras de sangre periférica representaron 23/197 (11,7%). Según los intervalos de monitorización predefinidos, se recogieron 86 muestras (43,7%) al final de la terapia de inducción, 65 (33,0%) durante la terapia de consolidación y 46 (23,4%) antes del trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) (Tabla 1).

La viabilidad mediana de la muestra fue del 88,3% (IQR, 84,4% – 92,6%). El flujo de trabajo de adquisición produjo una mediana de 1.116.901 eventos totales (IQR, 908.521–1.258.946) antes de la limpieza de datos. Tras la exclusión analítica secuencial de escombros, dobletes coincidentes y células no viables, la estrategia de gating alcanzó una mediana de 907.325 eventos objetivo simples viables positivos para CD45 (IQR, 690,112–1,095,836), con un tiempo medio de adquisición de 11,9 min. La puntuación mediana de hemodilución fue de 0,20 (IQR, 0,14–0,28). Siguiendo la interpretación ajustada por denominador, 41 muestras (20,8%) fueron clasificadas como MRD-positivas y 156 muestras (79,2%) se clasificaron por debajo del límite específico de detección (LOD) específico de la muestra (Tabla 1).

Validación analítica: repetibilidad, linealidad y estabilidad

El rendimiento analítico del flujo de trabajo estandarizado se evaluó mediante estudios de repetibilidad, linealidad dilucional y estabilidad a corto plazo (Figura 2). Las alicuotas duplicadas preparadas a partir de las mismas muestras lisadas a granel demostraron una gran repetibilidad, con un coeficiente mediano de variación duplicada (CV) del 0,101% y un percentil 95 de CV del 0,222%.

Figura 2: Validación analítica del flujo de trabajo MRD de citometría de flujo multicolor estandarizado. (A) Distribución de la viabilidad de la muestra entre las muestras analizadas. (B) Correlación entre los valores esperados y observados de MRD en experimentos de dilución en serie en análisis logarítmico. (C) Acuerdo entre análisis replicados independientes durante la evaluación de la repetibilidad. (D) Estabilidad de las mediciones de MRD tras almacenamiento a temperatura ambiente a 0 h, 24 h y 48 h. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Para evaluar el comportamiento de detección a bajo nivel, se analizaron 12 experimentos de dilución en serie que comprendieron un total de 72 observaciones en el rango inferior esperado de MRD. Los valores observados de MRD mostraron una fuerte concordancia con los valores esperados en un análisis logarítmico (r = 0,999, ajustado^{R 2} = 0,998, pendiente = 1,009, intersección = 0,018), lo que indica una linealidad preservada a lo largo de rangos de eventos de baja frecuencia.

Las pruebas de estabilidad a corto plazo demostraron reducciones progresivas en la viabilidad de la muestra a lo largo del tiempo, con la viabilidad mediana disminuyendo del 89,1% a las 0 h al 84,9% a las 24 h y al 80,6% a las 48 h. En cambio, el cambio relativo absoluto mediano en la carga de MRD se mantuvo limitado en 24 horas (6,2%) y 48 horas (12,0%), apoyando el procesamiento rutinario dentro de un intervalo de 24 horas tras la recogida.

Reproducibilidad entre operadores e interinstrumentos

Se evaluó la reproducibilidad entre operadores e instrumentos utilizando 24 muestras de referencia analizadas entre múltiples operadores y citómetros de flujo armonizados, generando un total de 96 evaluaciones. La desviación relativa absoluta mediana respecto a los valores de referencia fue del 13,7%. Estos hallazgos demuestran un rendimiento analítico consistente tras la estandarización de la preparación de la muestra, los ajustes de adquisición y las estrategias de acceso secuencial (Tabla 2).

Tabla 2: Indicadores analíticos de validación y comparación de métodos para el flujo de trabajo estandarizado de la enfermedad residual medible. Esta tabla se limita a resultados de validación, incluyendo la repetibilidad intraensayos, la linealidad dilucional, la estabilidad a corto plazo, la reproducibilidad entre operadores e instrumentos, y las métricas de comparación de métodos moleculares ortogonales; no duplica la demografía de los pacientes ni las características de las muestras reportadas en la Tabla 1. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Aplicación clínica y comparación de métodos ortogonales

Se realizó una comparación ortogonal utilizando 117 muestras emparejadas, incluyendo 75 analizadas mediante reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa (qPCR) y 42 mediante secuenciación de nueva generación (NGS). Las evaluaciones qPCR supervisaron principalmente los transcripciones de fusión específicas de la enfermedad establecidas en el momento del diagnóstico, incluyendo BCR::ABL1, RUNX1::RUNX1T1 y PML::RARA. Los enfoques NGS evaluaron los reajustes génicos clonales de inmunoglobulina o receptores de células T para leucemia linfoblástica y rastrearon mutaciones somáticas recurrentes utilizando paneles mieloides dirigidos para leucemia mieloide aguda. Los valores de MRD citométricos de flujo demostraron una fuerte correlación con resultados moleculares emparejados a través de niveles medibles de enfermedad (r = 0,893 en análisis logarítmico).

El análisis de Bland-Altman demostró una diferencia logarítmica media de −0,093 con límites de concordancia que oscilan entre −0,848 y 0,663 (Figura 3). Entre los casos discordantes, se identificó un resultado falso negativo entre 25 especímenes molecularmente positivos. El flujo de trabajo demostró una concordancia porcentual positiva del 78,1%, una concordancia porcentual negativa del 97,6% y una tasa global de concordancia del 92,3%.

Figura 3: Aplicación clínica y validación ortogonal de la evaluación estandarizada de la MRD. (A) Distribución de casos positivos para MRD entre grupos de enfermedad e intervalos de monitorización. (B) Correlación entre los valores de MRD citométricos de flujo y los resultados de comparadores moleculares emparejados en análisis logarítmico. (C) Análisis Bland-Altman comparando mediciones citométricas de flujo y MRD molecular emparejada, con líneas horizontales que denotan el sesgo medio y los límites del 95% de concordancia a lo largo del rango analítico. (D) Distribución de los resultados positivos para MRD entre los intervalos de seguimiento del tratamiento. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Estos hallazgos demuestran que el flujo de trabajo estandarizado de citometría de flujo multicolor alcanzó una fuerte concordancia con los ensayos MRD moleculares ortogonales en muestras clínicas rutinarias.

Tabla suplementaria 1: Parámetros operativos completos para el flujo de trabajo estandarizado de citometría de flujo multicolor medible para enfermedades residuales. Esta tabla unificada delimita los componentes metodológicos esenciales divididos en secciones distintas. La Sección A detalla las configuraciones específicas de paneles de anticuerpos para la enfermedad, en las que la selección CD73 o CD304 se basa en el inmunofenotipo diagnóstico asociado a leucemia de referencia. La Sección B describe los objetivos estandarizados de procesamiento preanalítico de muestras y adquisición citométrica de flujo. La Sección C define los umbrales de reporte ajustados por denominador junto con los criterios de interpretación final. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

El objetivo principal de este estudio fue establecer un flujo de trabajo estandarizado para la evaluación citométrica de flujo multicolor de la enfermedad residual medible (DMR) en leucemia aguda. La evaluación fiable de la MRD depende no solo de la selección del panel de anticuerpos, sino también de la manipulación consistente de la muestra, los parámetros de adquisición y la interpretación de los^{datos 11}. Los resultados de este estudio demuestran que un procesamiento armonizado de muestras, una profundidad de adquisición controlada y los criterios de reporte ajustados al denominador pueden mejorar la reproducibilidad analítica en entornos rutinarios de laboratorio clínico. Estos hallazgos son coherentes con los esfuerzos recientes para estandarizar la evaluación de MRD citométrica de flujo en diferentes instituciones y^{operadores 12}.

Un componente importante de este flujo de trabajo es el procedimiento de lisis masiva de glóbulos rojos a base de cloruro de amonio. La detección de MRD en eventos raros requiere la adquisición de grandes denominadores celulares para alcanzar una sensibilidad analítica adecuada. La preparación estandarizada de lisis a granel permitió la recuperación constante de números suficientes de células nucleadas, superando frecuentemente entre 1,0 y 1,5 millones de eventos adquiridos, manteniendo la viabilidad aceptable de la muestra. Estudios previos del Consorcio EuroFlow también enfatizaron que la adquisición de altos eventos es necesaria para apoyar la detección sensible y reproducible de^{MRD 13}. En muestras con sensibilidad analítica subóptima, la resolución de problemas debe incluir la evaluación del volumen de la muestra, la recuperación celular y la profundidad de adquisición.

Este protocolo también incluye una evaluación rutinaria de hemodilución antes de interpretar los resultados bajos de MRD negativos. La hemodilución sigue siendo una limitación importante antes del análisis en la prueba de MRD basada en médula ósea, ya que la contaminación periférica de la sangre puede reducir artificialmente la carga leucémica aparente. Incorporar una puntuación semicuantitativa de hemodilución directamente en el flujo de trabajo de informes proporciona una salvaguarda adicional contra la mala interpretación como falso negativo. Estudios previos han informado que la hemodilución afecta significativamente a la fiabilidad del análisis MRD citométrico de flujo en leucemia^{mieloide aguda 7}. Por tanto, los ejemplares que demuestren hemodilución sustancial (≥0,40) deben interpretarse con cautela, especialmente cuando la profundidad de adquisición o la preservación de precursores de médula es insuficiente.

La comparación ortogonal realizada en este estudio demostró una fuerte concordancia general entre los métodos de evaluación de la CITOMETRÍA de flujo y los métodos moleculares de evaluación de la MRD. Sin embargo, los casos discordantes también subrayan que la citometría de flujo y los ensayos moleculares evalúan aspectos biológicos distintos de la enfermedad residual. Estudios previos han demostrado que los cambios fenotípicos, la evolución clonal y la hematopoyesis regenerativa pueden contribuir a discrepancias entre las plataformas^{analíticas 14}. En B-ALL, distinguir precursores leucémicos residuales de hematógonos normales sigue siendo especialmente complicado con bajas cargas de enfermedad y requiere una interpretación integrada de patrones inmunofenotípicos multidimensionales en lugar de anomalías antígenas^{aisladas 15}. Por esta razón, todos los casos de MRD límite y de bajo nivel en este flujo de trabajo fueron revisados de forma independiente por un segundo analista.

Este estudio tiene varias limitaciones. Primero, la validación se realizó en una sola institución utilizando un número limitado de instrumentos armonizados. En segundo lugar, las muestras de sangre periférica solo se incluyeron en situaciones clínicas seleccionadas porque no pueden reemplazar la médula ósea para la evaluación rutinaria de la MRD tras el tratamiento en la mayoría de entornos de leucemia aguda. Además, algunos parámetros analíticos, incluyendo la puntuación de hemodilución y la interpretación de eventos de bajo nivel, aún requieren revisión de operadores experimentados a pesar del flujo de trabajo estandarizado. No obstante, el protocolo proporciona un marco práctico para la implementación clínica rutinaria de la evaluación estandarizada de MRD con flujo multicolor^{y flujo 16,17}. Al integrar la evaluación de calidad preanalítica, estrategias de adquisición armonizadas y criterios de interpretación ajustados al denominador, este flujo de trabajo apoya informes de MRD más reproducibles y clínicamente consistentes en la práctica rutinaria de laboratorio.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Acquisition buffer	Laboratory-prepared	PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA; final resuspension volume 500 µL	Final resuspension before flow cytometric acquisition
AML Tube 1 anti-CD117-APC antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 104D2; fluorochrome: APC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Early myeloid/blast identification
AML Tube 1 anti-CD13-FITC antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: L138; fluorochrome: FITC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Myeloid lineage anchor
AML Tube 1 anti-CD33-PE antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: P67.6; fluorochrome: PE; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Myeloid lineage anchor
AML Tube 1 anti-CD34-PerCP-Cy5.5 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 8G12; fluorochrome: PerCP-Cy5.5; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Immaturity marker
AML Tube 1 anti-CD45-APC-H7 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 2D1; fluorochrome: APC-H7; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Leukocyte backbone marker and denominator definition
AML Tube 1 anti-CD56-V500 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: NCAM16.2; fluorochrome: V500; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Aberrant blast-associated phenotyping
AML Tube 1 anti-CD7-V450 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: M-T701; fluorochrome: V450; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Cross-lineage aberrancy detection
AML Tube 1 anti-HLA-DR-PE-Cy7 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: G46-6; fluorochrome: PE-Cy7; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Maturation and subtype discrimination
AML Tube 2 anti-CD117-APC antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 104D2; fluorochrome: APC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Early myeloid/blast identification
AML Tube 2 anti-CD11b-V450 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: ICRF44; fluorochrome: V450; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Maturation-discordance assessment
AML Tube 2 anti-CD13-FITC antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: L138; fluorochrome: FITC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Myeloid lineage anchor
AML Tube 2 anti-CD15-V500 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: HI98; fluorochrome: V500; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Different-from-normal myeloid pattern assessment
AML Tube 2 anti-CD33-PE antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: P67.6; fluorochrome: PE; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Myeloid lineage anchor
AML Tube 2 anti-CD34-PerCP-Cy5.5 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 8G12; fluorochrome: PerCP-Cy5.5; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Immaturity marker
AML Tube 2 anti-CD45-APC-H7 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 2D1; fluorochrome: APC-H7; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Leukocyte backbone marker and denominator definition
AML Tube 2 anti-HLA-DR-PE-Cy7 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: G46-6; fluorochrome: PE-Cy7; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Maturation and subtype discrimination
Ammonium chloride-based red blood cell lysis buffer	Laboratory-prepared / commercial supplier	Ammonium chloride-based lysis buffer; 10 mL/test; 10 min at room temperature	Bulk red blood cell lysis
Analysis software	Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Kaluza 2.1	Data analysis and sequential gating
Automated hematology analyzer	Commercial supplier	Automated hematology analyzer used for nucleated cell concentration and viability assessment	Nucleated cell concentration and viability assessment
B-ALL Tube 1 anti-CD10-PE antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: HI10a; fluorochrome: PE; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Precursor B-cell definition
B-ALL Tube 1 anti-CD19-FITC antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: SJ25C1; fluorochrome: FITC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	B-lineage identification and entry into precursor compartment
B-ALL Tube 1 anti-CD20-APC antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: L27; fluorochrome: APC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Maturation pattern assessment
B-ALL Tube 1 anti-CD34-PerCP-Cy5.5 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 8G12; fluorochrome: PerCP-Cy5.5; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs