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Liposomas activados por luz y rayos X para la edición génica y la entrega de fármacos controladas

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DOI:

10.3791/71788

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14 de agosto de 2026

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1EosGene Therapeutics Pty Ltd, 2School of Biomedical Engineering, University of New South Wales, 3Biomedical AI Centre, Centenary Institute and Faculty of Medicine and Health, The University of Sydney, 4Centre for Vision Research, Department of Ophthalmology, and Westmead Institute for Medical Research, The University of Sydney, 5Department of Ophthalmology, Westmead Hospital, 6School of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering and Information Technology (FEIT), University of Technology Sydney

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe métodos para fabricar nanopartículas lipídicas integradas con verteporfina que se activan mediante luz visible o radiación de rayos X para la administración controlada espacial y temporalmente de ribonucleoproteínas CRISPR-Cas9 y agentes quimioterapéuticos, con posible relevancia traslacional en aplicaciones oftálmicas y oncológicas.

Resumen

La terapia fotodinámica (PDT) aprovecha la activación de fotosensibilizadores para generar especies reactivas de oxígeno (ROS), principalmente oxígeno singlete. Más allá de la citotoxicidad directa, esta fotoquímica puede reutilizarse para la liberación controlada de cargas desde sistemas de nanocarriers lipídicos, permitiendo un control espacio-temporal sobre la administración terapéutica que no es posible con nanopartículas lipídicas convencionales. Este protocolo presenta métodos para la fabricación y caracterización de dos formulaciones distintas de nanopartículas lipídicas integradas con verteporfina (VP): (1) liposomas activados por luz, compuestos por DOTAP, DOPE, colesterol y VP, para la entrega de complejos ribonucleoproteicos (RNP) CRISPR-Cas9; y (2) liposomas activados por rayos X, compuestos por DOTAP, DOPC, VP y nanopartículas de oro, para la liberación controlada de fármacos quimioterapéuticos. Tras la activación a 690 nm (luz visible) o mediante radiación clínica de rayos X (6 MeV), la VP genera oxígeno singlete que oxida los componentes lipídicos insaturados, desestabilizando la membrana de la nanopartícula y liberando las cargas encapsuladas. Se proporcionan protocolos para la formulación de liposomas mediante hidratación de película delgada y extrusión de membrana, caracterización fisicoquímica, evaluación de la liberación de cargas inducida por luz y rayos X, eliminación génica in vitro en células humanas y validación in vivo utilizando un sistema cuantitativo de reportero visual en pez cebra y un modelo de tumor xenoinjertado en ratón. Los resultados representativos demuestran la eliminación de hasta aproximadamente 326 fibras musculares lentas por embrión de pez cebra mediante activación por luz y una supresión significativa del crecimiento tumoral mediante la liberación de doxorrubicina activada por rayos X. El precedente clínico de la activación de la verteporfina a 689–690 nm en el ojo motiva la evaluación de esta plataforma para la administración oftálmica, aunque aún queda por establecer la biodistribución retiniana, la farmacocinética y la seguridad en animales grandes. Estos métodos proporcionan un enfoque experimental con potencial traslacional para la liberación de cargas terapéuticas controlada externamente. 

Introducción

Las nanopartículas lipídicas (LNPs) han surgido como la plataforma de administración no viral más validada clínicamente para terapéuticas con ácidos nucleicos, como se ha demostrado con su uso en las vacunas de ARNm contra la COVID-191. Sin embargo, las LNPs convencionales liberan su carga tras la captación celular mediante la fuga endosomal, lo que no ofrece control externo sobre el momento, la ubicación o el grado de entrega del fármaco2. Esta ausencia de control espacio-temporal limita su utilidad en aplicaciones donde la liberación precisa y bajo demanda resulta terapéuticamente ventajosa, incluyendo la edición génica específica de sitio, la quimioterapia dirigida en tumores heterogéneos y el silenciamiento génico titulado en órganos anatómicamente accesibles como el ojo3,4.

La terapia fotodinámica (PDT) proporciona un mecanismo bien establecido para efectos biológicos desencadenados externamente. Tras la activación a longitudes de onda específicas, los fotosensibilizadores generan oxígeno singlete (1O2) y otras ERO que pueden oxidar biomoléculas cercanas5. El verteporfirin (VP), un derivado de bencoporfirina aprobado clínicamente como Visudyne para el tratamiento fotodinámico de la neovascularización coroidea subfóvea en la degeneración macular relacionada con la edad (AMD), es particularmente adecuado como componente fotosensibilizador en nanopartículas6. El VP se activa clínicamente a 689 nm para la terapia fotodinámica oftálmica, lo que establece un precedente conocido en la administración ocular de luz6,7,8. El VP presenta una actividad fotodinámica aproximadamente cuatro veces mayor que la de los derivados de hematoporfirina de primera generación a longitudes de onda que penetran en los tejidos6.

Esta doble funcionalidad, mediante la cual el VP actúa simultáneamente como un fotosensibilizador clínicamente aprobado y como un disparador sensible a la luz para la liberación de cargas de nanopartículas, constituye la base mecanicista de los protocolos descritos en el presente documento. Cuando se incorpora en la bicapa lipídica en bajas relaciones molares, el VP genera 1O2 tras la iluminación, lo cual, de acuerdo con estudios previos, se propone que oxida las cadenas acilo de fosfolípidos insaturados, desestabilizando la membrana y liberando las cargas encapsuladas9. El corto radio de difusión del 1O2 (~20 nm en entornos biológicos) limita la desestabilización de la membrana a la inmediata vecindad del fotosensibilizador, minimizando así el daño a la carga mientras se interrumpe eficazmente la bicapa9,10. Además, la modalidad de activación con rayos X supera la limitación de profundidad de penetración en tejidos propia de la luz visible. Cuando se incorporan nanopartículas de oro (3–5 nm) conjuntamente en la bicapa lipídica, la irradiación con rayos X clínicos (6 MeV) potencia la activación del VP mediante transferencia de energía mediada por electrones Auger, extendiendo así su aplicabilidad a tumores profundos11,12. Mediciones directas de oxígeno singlete mediante el sensor Singlet Oxygen Sensor Green (SOSG) confirman que la generación de 1O2 aumenta con la dosis de rayos X y se potencia aproximadamente 1,4 veces mediante la carga conjunta con nanopartículas de oro en comparación con el VP solo11.

Esta plataforma tiene una relevancia traslacional particular para la terapia génica oftálmica. Los tratamientos actuales con anti-VEGF para la DMA exudativa requieren inyecciones intravítreas frecuentes, cuyos resultados en la práctica clínica disminuyen ante un tratamiento crónicamente insuficiente13,14, mientras que las terapias génicas emergentes con AAV reducen esta carga, pero expresan el anti-VEGF de forma constitutiva15,16 y, por lo tanto, no pueden ajustarse ni suspenderse, lo cual representa una preocupación dada la asociación entre la supresión sostenida del VEGF y la atrofia geográfica, la isquemia retiniana y la fibrosis17,18. Un enfoque basado en CRISPR activado por luz, que utilice liposomas VP, podría permitir una eliminación del VEGF-A controlada por el clínico y limitada espacialmente, proporcionando un control clínico sobre la localización y el momento del evento inicial de edición génica, al tiempo que mantiene la durabilidad de la edición génica. El mismo principio de liberación activada se extiende a las distrofias retinianas por genes grandes, como la enfermedad de Stargardt (ABCA4)19,20, y al melanoma uveal, donde los mecanismos convergentes de VP se ajustan adecuadamente a la biología del tumor21,22.

El objetivo general de este protocolo es proporcionar métodos completos y reproducibles para fabricar nanopartículas lipídicas integradas con VP utilizando dos formulaciones distintas, una activada por luz visible (690 nm) y otra por radiación de rayos X, y para evaluar la eficacia de la entrega tanto en sistemas modelo in vitro como in vivo. Dado que estas formulaciones difieren en su composición lipídica, estrategia de carga del fármaco y modalidad de activación, se presentan como protocolos separados. Este protocolo está dirigido a investigadores que estudian plataformas de nanopartículas con liberación inducida, estrategias de entrega basadas en terapia fotodinámica, edición génica controlada espaciotemporalmente o sistemas de administración de fármacos oftálmicos y oncológicos activados por luz.

Protocolo

Todos los experimentos con animales que involucraron peces cebra se realizaron en condiciones estándar de acuerdo con protocolos aprobados por el Comité de Ética en Investigación con Animales de la Universidad Macquarie (ARA: 2015-034). Los experimentos de xenoinjertos en ratones se llevaron a cabo cumpliendo con el Comité de Ética Animal de la Universidad Macquarie (número de aprobación: 2017/001). Todos los procedimientos se realizaron cumpliendo con la Ley de Investigación con Animales de 1985 y el Reglamento de Investigación con Animales de 2010.

Parte A: Liposomas sensibles a la luz para la entrega de CRISPR-Cas9 (basado en Aksoy et al.9)

1. Preparación de liposomas sensibles a la luz que encapsulan el RNP de CRISPR-Cas9 con VP

  1. Disuelva DOTAP, DOPE, colesterol (Chol) y VP en 500 µL de cloroformo en un matraz redondo de vidrio en una proporción molar de 1:0,94:1:0,069.
    ADVERTENCIA: El cloroformo es tóxico y volátil. Realice todos los pasos que involucren cloroformo en una campana extractora de gases con el equipo de protección personal adecuado, incluyendo guantes de nitrilo y gafas de seguridad.
  2. Evapore el cloroformo bajo un flujo de gas argón hasta que se forme una película delgada de lípidos en la pared del matraz.
  3. Coloque el matraz bajo vacío (por ejemplo, en un liofilizador o desecador conectado a una bomba de vacío) durante la noche (≥12 h) para eliminar completamente el disolvente residual.
  4. Prepare la solución de hidratación combinando el ARNsg (concentración final de 0,01 µM) y la proteína Cas9 (concentración final de 0,1 mg/mL) en 500 µL de agua libre de nucleasas⁹. Incube previamente el ARNsg y Cas9 a temperatura ambiente durante 5 minutos para permitir la formación del complejo de ribonucleoproteína (RNP) antes de la hidratación.
    NOTA: El complejo RNP se carga durante el paso de hidratación, no se añade tras la formación. Esto asegura la encapsulación dentro del núcleo acuoso del liposoma.
  5. Hidrate la película lipídica seca añadiendo directamente la solución de RNP de 500 µL sobre la película y mezcle hasta que la suspensión se homogenice. Deje la suspensión lipídica hidratada durante 2 h a temperatura ambiente para permitir la hidratación completa de los lípidos.
  6. Extruir la suspensión multilamelar resultante 11 veces a través de una membrana de policarbonato de 200 nm utilizando un extrusor miniatura para producir liposomas unilamelares de tamaño uniforme9.
    NOTA: La extrusión, no la sonicación, es el método de reducción de tamaño para esta formulación. Pase la suspensión un número impar de veces (11) para asegurar que el producto final se encuentre en el lado opuesto de la membrana respecto al material inicial, reduciendo así la contaminación con vesículas no extruidas.
  7. Almacene los VP-liposomas a 4 °C, protegidos de la luz. Utilícelos dentro de las 48 h posteriores a su preparación para obtener una actividad óptima. Este límite de trabajo de 48 h es conservador: la liberación de VP permanece por debajo del 3 % durante 96 h en suero bovino fetal al 10 %9.
    NOTA: Para aplicaciones in vitro e in vivo, prepare y manipule los liposomas utilizando técnicas asépticas estándar, y esterilice la suspensión final mediante filtración a través de un filtro de 0,22 µm antes de su uso.

2. Caracterización fisicoquímica de liposomas VP

  1. Diluya la suspensión de liposomas 1:100 en agua libre de nucleasas. Mida el diámetro hidrodinámico, el índice de politispersidad (PDI) y el potencial zeta mediante dispersión dinámica de la luz (DLS). Realice todas las mediciones de DLS por triplicado (n = 3 réplicas técnicas) por muestra y reporte los valores como media ± desviación estándar.
    NOTA: Las características esperadas de una formulación exitosa de la Parte A son un diámetro hidrodinámico de 167,5 ± 1,9 nm, PDI < 0,3, potencial zeta de +28 ± 1,1 mV y una eficiencia de encapsulación de Cas9 de aproximadamente 75,09 %. Las características fisicoquímicas representativas de formulaciones exitosas se resumen en Tabla 1.9
  2. Para microscopía electrónica de transmisión (TEM), deposite 10 µL de la suspensión de liposomas diluida sobre una rejilla de cobre recubierta con carbono. Tiña con acetato de uranilo al 2 % durante 20 s. Capture imágenes a 100 kV9, obteniendo al menos 10 imágenes representativas por lote.
ParámetroParte A: VP-liposoma
(activado por luz)		Parte B: VP/AuNP-liposoma
(activado por rayos X)
Diámetro hidrodinámico167,5 ± 1,9 nm~100–150 nm
Índice de politispersidad (PDI)<0,3< 0,3 (típico)
Potencial zeta+28 ± 1,1 mVPositivo (basado en DOTAP)
Eficiencia de encapsulaciónRNP Cas9: 75,09%Doxorrubicina: carga remota con sulfato de amonio; cuantificación tras lisis con Triton X-100 al 0,1%
Carga de nanopartículas de oroNo aplicable156 ± 24 AuNPs por liposoma (ICP-MS)
Estabilidad de liberación de carga<3% de liberación de VP durante 96 h en FBS al 10%Estable durante 48 h en concentraciones de FBS del 0%, 10%, 25% y 50%, y a pH 7,4, 6,0 y 5,0
Condición de activaciónIrradiación con LED a 690 nm, 0,15 mW/cm²Irradiación con rayos X clínicos de 6 MeV
Carga principalComplejo RNP CRISPR-Cas9Doxorrubicina
Modalidad de activaciónLuz visibleRadiación de rayos X
Aplicación previstaEdición génica inducidaLiberación inducida de fármaco quimioterapéutico

Tabla 1: Puntos de referencia de caracterización fisicoquímica y perfiles de estabilidad de las dos formulaciones de liposomas con verteporfina (VP). Características representativas de las formulaciones, parámetros de carga, perfiles de estabilidad y condiciones de activación para la formulación de liposomas con VP activada por luz (Parte A) y la formulación de liposomas con VP/AuNP activada por rayos X (Parte B). Estos valores proporcionan puntos de referencia esperados de control de calidad para la preparación y caracterización exitosas de las formulaciones, y pueden utilizarse como criterios de referencia al reproducir los protocolos descritos en el presente documento.

3. Liberación de carga inducida por luz y medición de oxígeno singlete

  1. Para los ensayos de liberación activada por luz, prepare liposomas VP utilizando la misma formulación lipídica y el protocolo de hidratación/extrusión. Dispense 100 µL de la suspensión de liposomas en PBS en un dispositivo de diálisis sumergido en 12 mL de PBS agitado a 80 rpm.
  2. Irradie las muestras con una fuente de luz LED de 690 nm a 0,15 mW/cm2 durante intervalos definidos (2, 4 y 6 min)9.
  3. Muestree el dializado externo a las 0, 1, 3, 6 y 24 h, y cuantifique el VP liberado mediante fluorescencia; obtenga el VP total lisando una alícuota equivalente con 0,1 % de Triton X-100.
  4. Calcule la liberación de VP como Rvp (%) = (Ft − F0)/(Fmáx − F0) × 100, donde Ft, F0 y Fmáx son los valores de fluorescencia en el tiempo t, en la línea base y tras la lisis con Triton, respectivamente (n = 3).
  5. Confirme la desestabilización de la membrana midiendo el cambio en el diámetro hidrodinámico mediante DLS antes y después de la irradiación.
    NOTA: Proteja todas las muestras que contengan VP de la luz ambiental durante toda la preparación y almacenamiento. Utilice tubos ámbar o envuélvalos en papel de aluminio.

4. Transfección in vitro y ensayo de eliminación génica

  1. Siembre células HEK293-GFP (o una línea reporter equivalente) en placas de 96 pozos a una densidad adecuada para alcanzar aproximadamente un 70% de confluencia en el momento del tratamiento. Cultive las células en medio completo (DMEM + 10% SFB + 1% penicilina-estreptomicina) a 37 °C y 5% CO₂2.
  2. Añada liposomas VP que encapsulan el RNP de ARNsg anti-GFP/Cas9 a los pocillos a 50 ug/mL. Para el análisis por microscopía de fluorescencia, incube durante 2 h; para el análisis por citometría de flujo, incube durante 1 h.
  3. Cambie el medio por medio completo fresco. Irradie las pocilas tratadas con luz LED de 690 nm a 0,15 mW/cm². Para el análisis por microscopía de fluorescencia, irradie durante 2, 4 o 6 min; para el análisis por citometría de flujo, irradie durante 4 min. Incluya controles en oscuridad (liposomas sin irradiación) y controles con luz únicamente (irradiación sin liposomas).
  4. Evalúe la eliminación de GFP a las 48 h posteriores al tratamiento mediante microscopía de fluorescencia o citometría de flujo.
    NOTA: Las ARN guía deben validarse antes de su uso. En el estudio original, los ARN guía candidatos para eGFP se evaluaron por su eficiencia de corte mediante análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), y la guía seleccionada (sg_eGFP_06) alcanzó un 88,24 % de corte. El riesgo de efectos fuera del blanco se minimizó in silico mediante la confirmación de la unicidad de la guía (BLASTN contra el genoma de referencia utilizando Bowtie/Bowtie2, sin tolerancia a desemparejamientos en las primeras diez bases del extremo 3’). No se realizó secuenciación de efectos fuera del blanco a nivel del genoma completo, aunque este paso se recomienda para la traslación terapéutica.9.
  5. Para medir la eficiencia de encapsulación, centrifugar una muestra de liposomas a 15 000 rpm durante 1 h a 4 °C, seguido de la filtración del sobrenadante a través de un filtro para jeringa Whatman Anotop 10 de 20 nm
  6. Cuantifique Cas9 libre (no encapsulada) en el filtrado mediante ensayo proteico BCA.
  7. Calcule la eficiencia de encapsulación como EE (%) = [(Ctot − Csup) / Ctotal] × 100, donde Ctot es la cantidad total de Cas9 añadida y Csup es el Cas9 no encapsulado recuperado en el sobrenadante. Véase Tabla 1 para métricas representativas del rendimiento de la formulación y eficiencias de encapsulación esperadas.

5. Validación in vivo: ensayo con reportero visual en pez cebra

  1. Prepare la mezcla maestra de inyección combinando liposomas VP que encapsulan ARN-g diana para eGFP y proteína Cas9 en las proporciones especificadas en el protocolo original9. La mezcla maestra final de 8 uL contiene 3,5 uL de ARN-g (75 ng/uL), 1,0 uL de proteína Cas9 (500 ng/uL), 2,5 uL de liposomas VP y 1,0 uL de rojo de fenol. Para la mezcla maestra de control, sustituya 2,5 uL de agua libre de nucleasas por los liposomas.
  2. Microinyecte 2 nL de la mezcla maestra en la célula (no en la yema) de embriones de pez cebra en estadio de una sola célula utilizando un sistema de microinyección calibrado9.
    ADVERTENCIA: Realice todos los procedimientos con peces cebra bajo protocolos aprobados de ética animal. Manipule los embriones con cuidado para minimizar daños mecánicos durante la inyección.
  3. A las 2 horas post-fecundación (hpf), irradie los embriones inyectados con luz LED de 690 nm a 0,15 mW/cm2 durante duraciones definidas (por ejemplo, 0, 1, 2 y 5 min) para activar la liberación de la carga útil9.
  4. A las 72 hpf, anestesie los embriones en Tricaine y móntelos en agarosa de punto de fusión bajo al 1 %. Utilizando la línea transgénica reportera smyhc1:eGFP, cuantifique la eliminación de fibras musculares lentas como la pérdida de fluorescencia de eGFP mediante un microscopio de fluorescencia invertido y un microscopio confocal.
  5. Adquiera imágenes con enfoque apilado y cuente las fibras musculares lentas negativas para eGFP (eliminadas) por embrión, analizando típicamente 16 embriones por grupo (por ejemplo, en Imaris)9.
    NOTA: Este ensayo proporciona una lectura visual y cuantitativa de la eficiencia de eliminación génica. En la línea reportera smyhc1:eGFP, las fibras musculares lentas normalmente son positivas para eGFP; la eliminación exitosa se determina por la pérdida de fluorescencia de eGFP en estas fibras9.

Parte B: Liposomas VP activados por rayos X para la administración de fármacos quimioterapéuticos (basado en Deng et al.11)

6. Preparación de liposomas VP/AuNP activados por rayos X cargados con doxorrubicina

  1. Combine 350 µL de DOTAP (100 mg/mL en cloroformo) y 370 µL de DOPC (100 mg/mL en cloroformo) en un matraz de fondo redondo de vidrio, y complete hasta un volumen total de 1,0 mL con cloroformo11.
    NOTA: La parte B utiliza DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicerol-3-fosfocolina), no DOPE. Las dos formulaciones difieren en su lípido auxiliar, y esta distinción es crítica para la reproducibilidad.
  2. Añada 50 µL de VP (2,3 mg/mL en DMSO) y 40 µL de una suspensión de nanopartículas de oro (diámetro de 3–5 nm) a la mezcla de lípidos. Esto produce aproximadamente 156 ± 24 nanopartículas de oro por liposoma, según se cuantificó mediante ICP-MS11.
    NOTA: Las nanopartículas de oro deben tener un diámetro de 3–5 nm para integrarse dentro de la bicapa lipídica. Las partículas más grandes (por ejemplo, 50 nm) no se incorporarán a la membrana y no mediarán la transferencia de energía de electrones Auger necesaria para la activación por rayos X11.
    NOTA: La formulación básica descrita aquí no está dirigida. En el estudio original, se introdujo una modificación opcional de direccionamiento activo mediante la inserción posterior de DSPE-PEG2000-Folato para dirigir los liposomas hacia células tumorales que expresan receptores de folato; este paso puede añadirse sin alterar el mecanismo central de liberación de VP/AuNP11.
  3. Evapore el cloroformo bajo argón y seque al vacío durante la noche según se describe en los pasos 1.2–1.3.
  4. Hidrate la película lipídica con 1,0 mL de tampón de sulfato amónico 250 mM (pH 5,5). Agite en vórtex, deje la suspensión hidratada durante la noche y luego extrúyala 11 veces a través de una membrana de policarbonato de 200 nm11.
  5. Elimine el sulfato amónico libre mediante diálisis frente a PBS (pH 7,4) a 4 °C con cuatro cambios de tampón, para establecer un gradiente transmembranal de sulfato amónico.
  6. Cargue doxorrubicina (Dox) incubando los liposomas dializados a una relación peso de fármaco/lípido de 1:10 a 60 °C durante 1 h11. El gradiente de sulfato amónico impulsa la acumulación de Dox en el interior del liposoma.
  7. Elimine la Dox no encapsulada mediante diálisis frente a PBS a 4 °C con cuatro cambios de tampón.
  8. Caracterice los liposomas cargados mediante DLS (tamaño esperado: ~100–150 nm) y mida la eficiencia de encapsulación lisisando los liposomas con 0,1 % de Triton X-100 y cuantificando la fluorescencia de Dox (excitación a 485 nm, emisión a 590 nm).
    NOTA: Las formulaciones exitosas de la parte B suelen presentar un diámetro hidrodinámico de aproximadamente 100–150 nm, PDI < 0,3 e incorporación de aproximadamente 156 ± 24 nanopartículas de oro por liposoma. Las características fisicoquímicas representativas se resumen en Tabla 1.11

7. Liberación de fármacos inducida por rayos X y citotoxicidad in vitro

  1. Irradiar liposomas VP/AuNP cargados con calceno utilizando un acelerador lineal clínico (haz de fotones de 6 MeV) a dosis definidas (1, 2 y 4 Gy)11. Cuantificar la liberación de la carga midiendo la fluorescencia del calceno (excitación a 485 nm, emisión a 510 nm) y obtener la liberación total tras la ruptura con Triton X-100 al 0,1%."
  2. Para los ensayos de citotoxicidad, sembrar células de cáncer colorrectal humano HCT116 en placas de 96 pocillos (por ejemplo, 2 × 104 células/mL en suero bovino fetal al 10%).
  3. Tratar las células con liposomas VP/AuNP cargados con Dox e irradiar con rayos X según se describió anteriormente, incluyendo controles solo con LipoDox, solo con rayos X y sin tratamiento. Evaluar la viabilidad celular mediante el ensayo MTS a las 0, 2, 4 y 24 h tras la irradiación con 4 Gy11.

8. Validación in vivo: modelo de tumor xenoinjertado en ratón

  1. Inocule 6–7 ratones hembra BALB/c desnudos de 7 semanas de edad por vía subcutánea en el flanco con 5 × 106 células HCT116 en 100 µL de medio McCoy’s 5A sin suero11.
  2. Cuando los tumores alcancen aproximadamente 100 mm3, inyecte liposomas VP/AuNP cargados con Dox (equivalente a 10 mg/kg de Dox) por vía intratumoral en un volumen de 20 µL11.
  3. A las 24 h posteriores a la inyección, irradie los tumores con radiación de rayos X de 4 Gy (6 MeV) utilizando un acelerador lineal clínico con el blindaje adecuado del tejido no diana.
  4. Monitoree el volumen tumoral cada 2 días utilizando un calibrador digital. Calcule el volumen tumoral como V = (π/6) × L × W2, donde L es la dimensión más larga y W es el ancho perpendicular11.
  5. En el punto final del experimento, extirpe los tumores, fíjelos en formalina al 10 % tamponada neutra y prepare secciones criostáticas de 6 µm para análisis histológico (tinción H&E)11.

9. Análisis estadístico

  1. Los datos cuantitativos se presentan como media ± desviación estándar (DE), salvo que se indique lo contrario.
  2. Los análisis estadísticos para los estudios de eliminación génica en pez cebra se realizaron mediante ANOVA de un factor, mientras que las comparaciones entre dos grupos se analizaron utilizando una prueba t de Student de dos colas. t-prueba, según se informó en los estudios de origen. La significancia estadística se definió como p < 0.05.
  3. Para los estudios de liposomas activados por rayos X, los datos de crecimiento tumoral, peso corporal, liberación de carga y análisis histológicos se analizaron utilizando la prueba t de Student t-pruebas tal como se describen en la publicación original.
  4. La definición de n se proporciona en las leyendas de las figuras correspondientes.
  5. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism versión 7.0 (GraphPad Software).
    NOTA: Este protocolo reproduce flujos de trabajo experimentales y conjuntos de datos representativos de estudios previamente publicados. Los lectores deben consultar las publicaciones originales para obtener los detalles completos del análisis estadístico cuando sea aplicable9,11.

Resultados

Edición génica activada por la luz (Parte A):

Siguiendo el protocolo de la Parte A, los liposomas VP que encapsulan el RNP CRISPR-Cas9 mostraron liberación de carga dependiente de la luz. Se observó una liberación mínima en condiciones de oscuridad, mientras que la irradiación a 690 nm (0,15 mW/cm2) produjo una liberación dependiente de la dosis que aumentó con el tiempo de iluminación (Figura 1A)9. El ensayo de reportero eGFP en pez cebra proporcionó una lectura visual cuantitativa de la eficiencia de knockout génico. Los embriones activados por luz mostraron un knockout de 308,37 ± 40,21 fibras musculares lentas positivas para eGFP por embrión, en comparación con 53,15 ± 35,38 fibras en los controles oscuros (n = 80), aumentando a 326,12 ± 36,55 fibras tras 5 minutos de irradiación (n = 60) (Figura 1B,C)9. In vitro, los liposomas VP activados por luz lograron una reducción de GFP comparable a la de Lipofectamine 2000 (aproximadamente 53 % frente a 50 % de reducción), proporcionando además un control espaciotemporal regulado por luz (Figura 1C)9. Estos hallazgos demuestran un control espaciotemporal, ya que la misma formulación de nanopartículas produjo eficiencias de knockout marcadamente diferentes según la exposición a la luz (Figura 1A–C).

Método de edición génica fotoquímica; CRISPR-Cas9, inducido por LED, microscopía de fluorescencia, resultados experimentales, medición de intensidad.
Figura 1. Entrega de CRISPR-Cas9 activada por luz y eliminación génica espaciotemporal en embriones de pez cebra. (A) Representación esquemática de liposomas de verteporfina (VP) (DOTAP:DOPE:Col:VP = 1:0,94:1:0,06) que encapsulan complejos de ribonucleoproteína Cas9/sgRNA (RNP). Tras la irradiación con luz de 690 nm, la VP genera especies reactivas de oxígeno que desestabilizan la membrana liposómica y desencadenan la liberación intracelular de la carga de CRISPR-Cas9. (B) Imágenes representativas de fluorescencia de embriones de pez cebra smyhc1:eGFP a las 72 h post-fecundación (hpf) tras el tratamiento con liposomas de VP y tiempos crecientes de exposición a la luz (0, 1, 2 y 5 min; 690 nm, 0,15 mW/cm2). La pérdida de fluorescencia eGFP indica la eliminación de las fibras de músculo lento. Los recuadros muestran ampliaciones de las regiones delimitadas. (C) Cuantificación de la intensidad de fluorescencia y del número de fibras de músculo lento eliminadas por embrión, que demuestra la activación de CRISPR-Cas9 y la eliminación génica dependiente de la luz. Los datos se presentan como media ± DE. Los experimentos con pez cebra se analizaron mediante ANOVA de un factor (n = 80 embriones para las mediciones de intensidad de fluorescencia y n = 60 embriones para el análisis del recuento de fibras; p < 0,0001). Los experimentos de validación en HEK293-GFP se analizaron mediante una prueba t de dos colas (n = 4). Barras de escala = 500 µm (imágenes generales) y 100 µm (imágenes ampliadas). Adaptado con permiso de Aksoy et al.9 Copyright © 2020 American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Los resultados subóptimos en el ensayo con pez cebra pueden incluir: (a) menos de 50 fibras alteradas por embrión, lo que indica una calidad deficiente de los liposomas, una actividad insuficiente de Cas9 o una dosis de luz subóptima; (b) mortalidad embrionaria superior al 20 %, lo que sugiere daño mecánico durante la microinyección o una fototoxicidad excesiva del VP; o (c) fibras alteradas en los controles no irradiados, lo que indica una fuga prematura de la carga útil de la formulación liposomal.

Entrega de fármacos desencadenada por rayos X (Parte B):

Los liposomas VP/AuNP preparados según el protocolo de la Parte B mostraron una liberación de calceína dependiente de la dosis entre 1 y 4 Gy (Figura 2A,B)11. En el modelo de xenoinjerto HCT116, los ratones que recibieron liposomas VP/AuNP cargados con Dox seguidos de irradiación con rayos X de 4 Gy mostraron una supresión significativa del crecimiento tumoral en comparación con Dox libre, rayos X solamente y controles de liposomas no irradiados (Figura 2C)11. El análisis histológico de secciones tumorales reveló áreas necróticas más extensas en el grupo con tratamiento combinado, según se evaluó mediante tinción H&E (Figura 2D).

Terapia contra el cáncer con liposomas dirigidos por rayos X; gráficos sobre la liberación de calceína, tamaño del tumor y análisis de necrosis.
Figura 2. Liberación de doxorrubicina inducida por rayos X y supresión del crecimiento tumoral. (A) Ilustración esquemática de liposomas integrados con nanopartículas de oro (AuNP) y verteporfina (VP), que contienen doxorrubicina (Dox). La exposición a radiación de rayos X activa el VP mediante transferencia de energía mediada por AuNP, generando oxígeno singlete que desestabiliza la bicapa lipídica y desencadena la liberación de la carga. (B) Perfiles de liberación de calceína desde liposomas expuestos a dosis crecientes de rayos X (0–4 Gy), que demuestran la liberación de la carga dependiente de la dosis en liposomas VP/AuNP. Las barras de error representan la desviación estándar de cuatro mediciones. (C) Mediciones del volumen tumoral (izquierda) y del peso corporal (derecha) en ratones portadores de xenoinjertos HCT116 tratados con PBS, LipoDox, rayos X solos o LipoDox activado por rayos X. Los datos se presentan como media ± DE (n = 4 ratones por grupo). La significancia estadística se evaluó mediante la prueba t (P < 0,05, P < 0,01, P < 0,001). (D) Secciones tumorales representativas teñidas con hematoxilina y eosina (H&E) y análisis morfométrico del área media de necrosis tumoral. Las flechas indican regiones necróticas representativas. Los diagramas de caja muestran la mediana y el rango intercuartílico, con bigotes que se extienden hasta 1,5 × IQR. Los datos se analizaron mediante la prueba t (n = 5). Barra de escala = 50 µm. Adaptado de Deng et al.11 bajo los términos de la Licencia Creative Commons Attribution 4.0 Internacional. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Los resultados subóptimos en el modelo de xenoinjerto pueden incluir: (a) ninguna diferencia en el crecimiento tumoral entre los grupos de liposomas irradiados y no irradiados, lo que indica una liberación insuficiente mediada por VP o una incorporación inadecuada de nanopartículas de oro; o (b) toxicidad sistémica (pérdida de peso > 15 %), lo que sugiere una fuga de Dox de los liposomas antes de la activación con rayos X.

Discusión

Varios pasos en estos protocolos son fundamentales para el éxito. En la Parte A, es imprescindible mantener con precisión la relación molar de lípidos (DOTAP:DOPE:Chol:VP = 1:0,94:1:0,06), ya que la concentración de VP determina directamente la magnitud de la generación de 1O2 y, en consecuencia, la eficiencia de liberación de la carga9. Es esencial cargar el RNP Cas9/sgRNA durante el paso de hidratación, y no mediante complejación posterior a la formación, para lograr la encapsulación en el núcleo acuoso. La extrusión a través de una membrana de policarbonato de 200 nm (11 pases) produce vesículas unilamelares uniformes; no se debe sustituir por sonicación, ya que podría desnaturalizar la proteína Cas9. Para la Parte B, el tamaño de las nanopartículas de oro (3–5 nm) es crítico, ya que las partículas deben ser lo suficientemente pequeñas como para integrarse dentro de la bicapa lipídica y permitir una transferencia eficaz de energía mediante electrones Auger al VP bajo irradiación con rayos X11. El método de gradiente de sulfato de amonio utilizado para la carga de Dox requiere la diálisis completa del sulfato de amonio externo antes de añadir el fármaco; una diálisis incompleta reducirá la eficiencia de carga.

La composición lipídica puede adaptarse para diferentes aplicaciones manteniendo el mecanismo de liberación mediado por VP. Por ejemplo, sustituir una fracción de DOTAP por un lípido PEGilado (por ejemplo, DSPE-PEG2000 al 5 mol%) puede mejorar el tiempo de circulación para administración sistémica, aunque esto reducirá la carga superficial positiva y podría disminuir la captación celular in vitro2. Si las mediciones de DLS muestran un PDI > 0,3, aumente el número de pasos de extrusión o verifique la integridad de la membrana. Si la generación de oxígeno singlete es baja a pesar de una incorporación correcta de VP, verifique la longitud de onda y la densidad de potencia de la fuente de luz LED con un medidor de potencia calibrado, ya que la activación de VP es específica de la longitud de onda (excitación máxima a 425 nm para la banda de Soret y activación terapéutica a 689–690 nm para la banda Q)9. Para el ensayo con pez cebra, si la mortalidad de embriones supera el 20 % en los grupos tratados, reduzca el volumen de inyección o la concentración de liposomas para minimizar la fototoxicidad asociada al VP. Un marco estructurado para la resolución de problemas, vinculado a los puntos de referencia de la Tabla 1, es el siguiente. PDI > 0,3: aumente el número de pasos de extrusión y verifique la integridad de la membrana. Liberación inducida baja o ausente a pesar de una incorporación correcta de VP: confirme la emisión a 690 nm con un medidor de potencia calibrado y verifique la relación molar de VP. Menos de aproximadamente 50 fibras musculares lentas eliminadas por embrión: vuelva a preparar los liposomas, confirme la actividad del RNP o aumente el tiempo de irradiación. Pérdida de la señal de eGFP en los controles no irradiados: revise las condiciones de almacenamiento utilizando los liposomas dentro de las 48 h posteriores a su preparación y almacenándolos a 4 °C en la oscuridad, y confirme la estabilidad de la membrana. En el modelo de xenoinjerto, la ausencia de diferencias entre los grupos de liposomas irradiados y no irradiados indica la necesidad de confirmar la inclusión de nanopartículas de oro de 3–5 nm y verificar la dosis de rayos X administrada.

La limitación principal de la modalidad activada por luz (Parte A) es la profundidad de penetración de la luz de 690 nm, lo que restringe la activación directa a tejidos accesibles superficialmente o a aquellos susceptibles de recibir luz mediante fibra óptica5. La modalidad activada por rayos X (Parte B) supera esta limitación de profundidad, pero requiere acceso a un acelerador lineal clínico y expone al tejido circundante a radiación ionizante, aunque a dosis terapéuticas11,12. Ambas formulaciones dependen actualmente de DOTAP, un lípido catiónico asociado con citotoxicidad dependiente de la dosis que podría limitar la ventana terapéutica en la administración sistémica2. La naturaleza transitoria de la edición génica mediada por RNP es ventajosa para la seguridad, pero implica que un knockout incompleto en una población celular diana no puede aumentarse mediante dosis repetidas en el mismo sitio sin una nueva administración de nanopartículas. Además, estos protocolos se han validado en líneas celulares y modelos de animales pequeños; la traducción a modelos animales más grandes y, finalmente, a aplicaciones clínicas humanas requerirá la optimización de la formulación, estudios de farmacocinética y evaluaciones toxicológicas formales bajo condiciones GLP. En particular, este protocolo no incluye datos de farmacocinética, biodistribución ni penetración retiniana. Aunque la penetración de la luz a través de tejidos oculares y otros está bien caracterizada en la literatura como dependiente de la longitud de onda, la pigmentación y el tipo de tejido (y puede mejorarse con agentes de clarificación óptica), los estudios cuantitativos de farmacocinética, biodistribución y entrega retiniana siguen siendo pasos importantes siguientes antes de que puedan respaldarse afirmaciones de traslación.

Los sistemas convencionales de nanopartículas lipídicas (LNP), incluidos los utilizados en las vacunas de ARNm, liberan su carga de forma pasiva tras la incorporación celular mediante el escape endosomal, y no ofrecen control temporal ni espacial sobre la entrega1,2. Los vectores virales como el AAV proporcionan una entrega génica eficiente, pero están limitados por la capacidad de empaquetamiento (~4,7 kb), la inmunogenicidad tras la administración repetida y la expresión constitutiva del transgén, que no puede modularse tras la administración3. La plataforma de liposomas VP aborda estas limitaciones al ofrecer un mecanismo de liberación controlable externamente, independiente del tipo de carga, compatible con cargas grandes (proteínas, complejos RNP y moléculas pequeñas), no viral y potencialmente compatible con administraciones repetidas, sujeto a estudios de inmunogenicidad y toxicología con dosis repetidas.  A diferencia de los sistemas optogenéticos o termoresponsivos, el enfoque basado en VP aprovecha un fotosensibilizador ya aprobado clínicamente, con datos de seguridad establecidos y una infraestructura láser clínica existente, especialmente en oftalmología, donde el láser Visudyne de 689 nm ya es equipo estándar6. Sang et al. demostraron además que las nanopartículas híbridas lipídicas-poliméricas que contienen VP mejoran la eficacia de la terapia radiodinámica en modelos de cáncer colorrectal, confirmando la adaptabilidad de la generación de ERO mediada por VP en diferentes arquitecturas de nanopartículas12.

Los métodos descritos en el presente documento tienen una relevancia particular para tres afecciones oftálmicas. En la DMAE neovascular, la carga de inyecciones anti-VEGF sigue siendo una barrera crítica para obtener resultados óptimos. Datos de registros del mundo real muestran un subtratamiento notable en comparación con los protocolos de ensayos clínicos (un promedio de 7,3 frente a 12 inyecciones en el primer año, con un 38,8 % de pacientes que interrumpen el tratamiento y una mejora mínima de la agudeza visual)14, así como un deterioro visual a largo plazo a pesar de la administración frecuente23. Las terapias génicas con AAV que se están desarrollando para reducir esta carga—ixoberógeno soroparvovec15, ABBV-RGX-31416 y el 4D-150 designado como RMAT (reducción del 83 % en inyecciones)24—expresan transgenes anti-VEGF de forma constitutiva y no pueden ajustarse ni retirarse. Esto representa una preocupación potencial, dado el evidente vínculo entre la supresión continua del VEGF y la atrofia geográfica (CATT17; un metaanálisis de 4.609 ojos18; y una prevalencia de atrofia que aumenta hasta el 78,3 % en ocho años25). Un sistema de liposomas activados por luz que transporte CRISPR-Cas9 dirigido al VEGF-A podría permitir, en cambio, una inactivación génica espacialmente delimitada, proporcionando un control clínico sobre la localización espacial y el momento temporal del evento inicial de edición, al tiempo que mantiene la durabilidad de la edición génica. Estudios preclínicos respaldan la viabilidad de este enfoque. La coadministración mediante LNP de ARNm de Cas9 y ARNsg dirigido a VEGFA redujo la neovascularización coroidea inducida por láser (CNV) en ratones26, las LNP de variante PEG lograron edición del genoma en el epitelio pigmentario de la retina (RPE)27, y las LNP guiadas por péptidos entregaron ARNm a los fotorreceptores en primates no humanos28. Sin embargo, hasta principios de 2026, ninguna terapia génica retiniana basada en LNP ha entrado en ensayos clínicos29, lo que subraya la oportunidad de traslación. En la enfermedad de Stargardt, la secuencia codificante de ABCA4, de aproximadamente 6,8 kb, excede la capacidad de empaquetamiento del AAV, lo que requiere estrategias con vectores duales y menor eficiencia de transducción19. Los candidatos clínicos incluyen las plataformas de AAV dual SB-007 y VG80130, junto con la terapia modificadora independiente del gen OCU410ST31. La administración no viral de ácidos nucleicos puede evitar las limitaciones de empaquetamiento del AAV. Las nanopartículas PEG-ECO que transportan un plásmido de ABCA4 redujeron la acumulación de A2E en ratones Abca4-/-20, mientras que otros estudios han demostrado la administración de grandes constructos de ADN retiniano32 y la expresión mediada por LNP de ARNm en tejidos oculares33. Dado que el tratamiento localizado de la mácula y la fóvea es suficiente para preservar la visión central, los liposomas VP son especialmente adecuados para entregar concentraciones elevadas de carga terapéutica génica precisamente a estas regiones. En el melanoma uveal, el verteporfirno actúa mediante tres mecanismos complementarios: citotoxicidad mediada por terapia fotodinámica (PDT), inhibición de la vía YAP/TAZ (siendo la expresión de YAP1 un marcador con fuerte correlación con los indicadores metastásicos más intensos, la monosomía 3 y la pérdida de BAP1)21, y muerte celular inmunogénica mediante la activación de cGAS-STING. La combinación de la inhibición de YAP y la PDT mediadas por VP con terapia anti-PD-L1 convirtió tumores inmunológicamente fríos en tumores inmunológicamente activos, suprimiendo notablemente el crecimiento tumoral y prolongando la supervivencia en modelos ortotópicos22. Estos hallazgos son coherentes con la tasa de respuesta del 80 % informada para la PDT basada en verteporfirno como tratamiento primario del melanoma coroideo34. La accesibilidad óptica del ojo para la activación a 689 nm, junto con la localización bien definida de la mayoría de los melanomas uveales, posiciona a los liposomas VP como una plataforma prometedora para administrar tratamientos localizados, reduciendo potencialmente la morbilidad asociada con los enfoques actuales de braquiterapia y de haz de protones.

Más allá de las aplicaciones oftálmicas y oncológicas discutidas anteriormente, la plataforma de liposomas VP es aplicable a cualquier contexto terapéutico que requiera la liberación de carga útil controlada externamente y bajo demanda. Las aplicaciones potenciales incluyen la edición génica activada por luz en afecciones dermatológicas accesibles a la iluminación transcutánea, la liberación de quimioterapia activada por rayos X sincronizada con los esquemas clínicos de fraccionamiento de radioterapia y la eliminación génica espacialmente patroneada para estudios en biología del desarrollo. Se han demostrado varios sistemas de edición génica fotoactivables en tejidos no retinianos, incluyendo el editor de bases fotoactivable Mag-ABE para edición del genoma controlada espaciotemporalmente in vivo35 y un sistema de nanopartículas de conversión ascendente activadas por luz infrarroja cercana (NIR) para edición espaciotemporalmente controlada con CRISPR-Cas9 y terapia fotodinámica36. En oftalmología, el creciente interés en estrategias duraderas de supresión del VEGF resalta aún más la necesidad de sistemas de administración que combinen eficacia terapéutica a largo plazo con control externo sobre el momento y la ubicación de la actividad biológica37. La integración de estos métodos de fabricación con tecnologías emergentes de administración de LNP en la retina y sistemas de edición génica fotoactivables representa una convergencia de componentes individualmente validados, cuya aplicación combinada en el ojo sigue siendo un campo de investigación abierto y potencialmente de alto impacto. El trabajo actual en nuestro grupo está dirigido a optimizar formulaciones para vías de administración subretiniana e intravítrea, evaluar perfiles de seguridad en modelos oculares de animales grandes y adaptar el modo de activación por rayos X para su uso simultáneo con protocolos estándar de radioterapia en oncología clínica.

Divulgaciones

Y.A.A. es director y cofundador de EosGene Therapeutics Pty Ltd, empresa que posee patentes relacionadas con la tecnología de nanopartículas lipídicas activadas por luz descrita en el presente documento. E.M.G. y W.D. son cofundadores de EosGene Therapeutics.

Agradecimientos

Los autores agradecen las instalaciones y la asistencia técnica proporcionadas por la Instalación de Peces Cebra de la Universidad Macquarie (trabajo con peces cebra) y por el Comité de Ética Animal de la Universidad Macquarie. Este trabajo fue apoyado en parte por el Centro de Excelencia de ARC para Biofotónica a Escala Nanométrica (CE140100003). Los autores también agradecen el apoyo recibido de EosGene Therapeutics Pty Ltd.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Membrana de filtración de 20 nm (Anotop 10 o equivalente)Whatman (Cytiva)N/AUtilizada para la separación de Cas9 libre durante las mediciones de eficiencia de encapsulación
Fuente de luz LED de 690 nmThorlabsM690L4Fuente de luz para activar la liberación del contenido de liposomas mediada por VP; densidad de potencia ajustable
Antibiótico–Antimicótico (100X)Thermo Fisher Scientific15240062Suplemento para cultivo celular; concentración final del 1%
Cilindro de gas argón y reguladorN/AN/AUtilizado para la evaporación del disolvente durante la preparación de la película lipídica
Extrusor manual Avanti MiniAvanti Polar Lipids610000Sistema de extrusión manual utilizado con membranas de policarbonato de 200 nm para la estandarización del tamaño de liposomas
Ratones BALB/c desnudos (hembras, 5–6 semanas)Animal Resources CentreN/ARatones inmunodeficientes utilizados para el modelo de tumor xenoinjertado HCT116
Kit de ensayo de proteínas BCAThermo Fisher ScientificN/AUtilizado para la cuantificación de Cas9 libre y mediciones de eficiencia de encapsulación
Sistema de imagen ChemiDoc MP de Bio-RadBio-Rad Laboratories12003154Sistema de imagen para geles y blot de proteínas
CalceínaSigma-AldrichC0875Tinte fluorescente para ensayos de liberación; autoextinción a altas concentraciones
Espectrofotómetro UV-Vis-NIR Cary 5000Agilent TechnologiesN/AEspectroscopía de absorción UV-Vis de liposomas y verteporfina
Células CCD841 CoN (epitelio normal de colon humano)ATCCCRL-1790Línea celular epitelial de colon normal; utilizada como control no canceroso
CloroformoSigma-Aldrich288306Disolvente orgánico para la preparación de la película lipídica
ColesterolSigma-AldrichC8667Componente de la membrana liposomal utilizado en la formulación activada por luz
Acelerador lineal clínico (haz de fotones de 6 MeV)Varian Medical SystemsN/AFuente clínica de rayos X para estudios de irradiación
Calibradores digitalesN/AN/AUtilizados para mediciones del volumen de tumores xenoinjertados
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-Aldrich472301Disolvente para la preparación del stock de verteporfina
DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicerol-3-fosfocolina)Avanti Polar Lipids850375PComponente lipídico utilizado en la formulación activada por rayos X
DOPE (1,2-dioleoil-sn-glicerol-3-fosfoetanolamina)Sigma-AldrichP1223Lípido auxiliar utilizado en la formulación activada por luz
DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano)Avanti Polar Lipids890890PLípido catiónico utilizado en ambas formulaciones
Clorhidrato de doxorrubicinaSigma-AldrichD1515Fármaco quimioterapéutico cargado en liposomas activados por rayos X
DSPE-PEG2000Avanti Polar Lipids880120PLípido PEGilado utilizado en la formulación activada por rayos X
Medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)Thermo Fisher Scientific11965092Medio de cultivo celular para células HEK293 y PC12
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS)Thermo Fisher Scientific14190144Tampón de lavado
Suero bovino fetal (FBS)Thermo Fisher Scientific10099141Suplemento para cultivo celular; concentración final del 10%
Espetrofluorómetro Fluorolog-Tau3HORIBA ScientificN/AEspectroscopía de fluorescencia para caracterización de verteporfina
Software de enfoque apilado (por ejemplo, Zerene Stacker)N/AN/AUtilizado para la generación de imágenes apiladas en el enfoque en imágenes de pez cebra
Liofilizador (Alpha 1-4 LDplus)Martin Christ / John Morris ScientificN/AUtilizado para secado al vacío y eliminación de disolventes
sgRNA GFPThermo Fisher ScientificA35943ARN guía simple dirigido a eGFP; utilizado para validación de knockout
Nanopartículas de oro (3–5 nm, estabilizadas con citrato)NanoComposixN/ARadiosensibilizador utilizado en la formulación activada por rayos X
GraphPad PrismGraphPad Software7.0Análisis estadístico y visualización de datos
Células HCT116 (carcinoma colorrectal humano)ATCCCCL-247Línea celular de cáncer colorrectal utilizada en estudios in vitro e in vivo
Células HEK293/GFPGenTargetSC001Línea celular estable que expresa GFP utilizada para validación de knockout mediante CRISPR
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570Tinción nuclear; concentración de trabajo de 5 µg/mL
Software de análisis de imágenes (por ejemplo, Imaris)Bitplane (Oxford Instruments)N/AUtilizado para la cuantificación de fibras musculares lentas con knockout
ImageJ/FijiNational Institutes of Health (NIH)Open sourceSoftware de análisis de imágenes
Microscopio de fluorescencia invertidoLeica MicrosystemsDMi3000Utilizado para imágenes de reportero en pez cebra y evaluación de fluorescencia GFP
Sistema de imagen in vivo IVIS SpectrumCTPerkinElmer128201Sistema de imagen de fluorescencia in vivo
Microscopio electrónico de transmisión JEOL JEM-1400JEOLJEM-1400Imagen por TEM de liposomas
Microscopio confocal Leica SP2Leica MicrosystemsN/AImagen confocal de la captación celular
Agarosa de punto de fusión bajoN/AN/AUtilizada para montar embriones de pez cebra durante la imagen
Lipofectamina 2000Thermo Fisher Scientific11668019Reactivo de transfección utilizado como control positivo
Software Living ImagePerkinElmerN/ASoftware para adquisición y análisis de imágenes
Medio McCoy 5AThermo Fisher Scientific16600082Medio de cultivo celular para células HCT116
Sistema de microinyecciónN/AN/AUtilizado para microinyección en embriones de pez cebra en el estadio de una célula
Ensayo de proliferación celular MTSPromegaG3582Ensayo de viabilidad celular
Espectrofotómetro NanoDropThermo Fisher ScientificND-2000Mediciones de pureza y concentración de ARN
Agua libre de nucleasasThermo Fisher ScientificR0582Utilizada para la preparación de RNP CRISPR-Cas9
Medio Opti-MEM con suero reducidoThermo Fisher Scientific31985070Medio de transfección
Paraformaldehído (4%)Sigma-AldrichP6148Fijador para análisis histológico
Células PC12 (feocromocitoma de rata)ATCCCRL-1721Línea celular tipo neuronal utilizada para estudios de captación
Filtros de membrana de policarbonato (200 nm)Avanti Polar Lipids610006Membranas de extrusión para ajuste del tamaño de liposomas
Kit RNeasy Plus MiniQIAGEN74134Kit de extracción de ARN
Sensor verde de oxígeno singlete (SOSG)Thermo Fisher ScientificS36002Sonda fluorescente para detección de oxígeno singlete
Dispositivos de diálisis Slide-A-Lyzer MINI (10 kDa MWCO)Thermo Fisher Scientific69570Dispositivos de diálisis para preparación de liposomas y carga de fármacos
Tinción SYBR Gold para geles de ácidos nucleicosThermo Fisher ScientificS11494Tinción para geles de ácidos nucleicos
Pez cebra transgénico Tg(ubi:EGFP)Zebrafish International Resource CenterZDB-GENO-080606-2Pez cebra transgénico utilizado para validación in vivo de CRISPR
TNF-α (recombinante humano)Life TechnologiesRTNFAICitocina utilizada en estudios de inducción de TNFAIP3
sgRNA TNFAIP3Thermo Fisher ScientificN/AsgRNA dirigido a TNFAIP3
Tricaina metanosulfonato (MS-222)N/AN/AAnestésico para pez cebra utilizado antes de la imagen
Tritón X-100Sigma-AldrichT8787Detergente utilizado para lisis de liposomas y ensayos de liberación
Proteína Cas9 TrueCut v2Thermo Fisher ScientificA36498Nucleasa Cas9 utilizada para la preparación de RNP CRISPR-Cas9
Tripsina-EDTA (0,25%)Thermo Fisher Scientific25200056Reactivo de disociación celular
Acetato de uranilo (2%)Electron Microscopy Sciences22400Tinción negativa para imagen por TEM
VerteporfinaSigma-AldrichSML0534-5MGFotosensibilizador incorporado en formulaciones liposomales
Zetasizer Nano ZSMalvern PanalyticalZEN3600Mediciones de dispersión dinámica de luz y potencial zeta

Referencias

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