Artículo de método

Electroacupuntura asistida por isoflurano en un modelo de rata de oligoastenozoospermia

DOI:

10.3791/71878

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16 de junio de 2026

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1Ningxia Medical University School of Traditional Chinese Medicine, 2Medical College of Acu-Moxi and Rehabilitation, Guangzhou University of Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Dryness Syndrome in Chinese Medicine, Ministry of Education, Ningxia Regional Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Prevention and Treatment of Regional High Incidence Disease, Ningxia Medical University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo detalla el establecimiento de un modelo de oligoastenozoospermia inducida por adenina en ratas y la posterior administración de electroacupuntura en CV3, CV4, ST36 y SP6 bajo anestesia isoflurana. Los resultados se verificaron mediante análisis asistido por ordenador para el recuento y la motilidad, junto con histología testicular con tinción de hematoxilina y eosina.

Resumen

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La oligoastenozoospermia es una de las formas más comunes de disfunción reproductiva masculina. En los estudios con roedores, administrar electroacupuntura (EA) de forma consistente a lo largo de las sesiones repetidas supone un reto técnico, especialmente al combinar los puntos de acupuntura de la línea media abdominal y de las extremidades posteriores, donde el contacto estable con los electrodos es fundamental. Se seleccionaron Zhongji (CV3), Guanyuan (CV4), Zusanli (ST36) y Sanyinjiao (SP6) porque estos puntos se utilizan frecuentemente en protocolos de acupuntura para infertilidad y anomalías sementales, y la configuración de la línea media abdominal más la extremidad posterior se adapta al emparejamiento estandarizado de electrodos. Este informe describe un protocolo práctico para establecer un modelo de rata inducido por adenina de oligoastenozoospermia y para administrar EA asistida por isoflurano con estimulación emparejada de CV3–CV4 y ST36–SP6. Los machos de ratas Sprague-Dawley recibieron adenina por manga diaria durante 28 días para inducir deterioro reproductivo. Posteriormente, se administró EA diariamente durante 28 días bajo anestesia inhalatoria, utilizando un 3% de isoflurano para inducción y un 1,5% para el mantenimiento de la mascarilla, para permitir una colocación estable de la aguja y el emparejamiento de electrodos (CV3–CV4 y ST36–SP6) con parámetros de estimulación definidos (2 Hz, 1,5 mA, 30 min). Los efectos del tratamiento se evaluaron mediante análisis asistido por ordenador del semen para el recuento y motilidad espermática, complementado con histología testicular de hematoxilina y eosina (HE). Los resultados representativos indican que la exposición a la adenina redujo el recuento y la motilidad espermática y alteró la arquitectura de los túbulos seminíferos, mientras que la EA se asoció con una recuperación parcial tanto en parámetros seme como en morfología testicular. Este protocolo ofrece una referencia lista para estudios que requieren entrega consistente de EA y verificación de semen/histológica en un modelo de rata de oligoastenozoospermia.

Introducción

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Los factores masculinos contribuyen sustancialmente a la infertilidad, representando aproximadamente la mitad de todas las parejas infértiles, siendo las anomalías en el recuento y la motilidad espermática algunos de los hallazgos clínicosmás comunes 1,2. La oligoastenozoospermia, caracterizada por una reducción de la concentración de espermatozoides y una motilidad deteriorada, es una de las formas más comunes de disfunción reproductivamasculina 3,4. A pesar de la disponibilidad de técnicas de reproducción asistida y terapias médicas empíricas, las estrategias efectivas para mejorar la calidad del semen siguen siendo limitadas, lo que pone de manifiesto la necesidad de una investigación preclínicaadicional 5,6,7. Estas necesidades clínicas y traslacionales motivan el desarrollo de flujos de trabajo experimentales reproducibles para estudiar el deterioro reproductivo masculino bajo condiciones controladas.

Se han investigado intervenciones de acupuntura para detectar anomalías en el semen e infertilidad masculina tanto en contextos clínicos comoexperimentales 8. Aunque los estudios clínicos sugieren beneficios potenciales para ciertos parámetros del semen, sus diseños, protocolos de intervención y medidas de resultado varíanenormemente. La electroacupuntura (EA) es especialmente adecuada para la investigación de laboratorio porque ofrece parámetros de estimulación controlados y una regulación más uniforme que la acupuntura manual, lo que facilita la evaluación de los cambios relacionados con el tratamiento en los resultados reproductivosmedibles 10,11,12. Esta ventaja procedimental hace que la EA sea adecuada para flujos de trabajo preclínicos estructurados en la investigación reproductiva masculina.

Los modelos animales son centrales para dicha evaluación, pero la selección de modelos sigue siendo un tema metodológico clave en la investigación sobre oligoastenozoospermia. Una revisión sistemática reciente señaló que los métodos de modelado inducidos por busulfán son controvertidos y muestran una heterogeneidad sustancial en los índices de evaluación, lo que pone de manifiesto la necesidad de procedimientos más claros y lecturas másconsistentes 13. Los modelos basados en adenina ofrecen un enfoque experimental práctico porque la gavage de adenina puede inducir deterioro reproductivo en ratas, incluyendo reducción de los puntos finales relacionados con esperma y daño histológico en el tejidotesticular 14,15. En nuestro trabajo previo, un modelo de rata de rata oligoastenozoospermia inducido por adenina fue tratado con EA en un conjunto de puntos de acupuntura cerebro-riñón de Shu-Mu (Epangsanxian, BL23, GB25 y KI3), junto con condiciones no acupuntuales y de control positivo de fármacos, con medidas de resultado ampliadas que incluyeron coeficientes de órganos y niveles hormonales séricos cuantificados por ELISA16. Basándose en esta base experimental y reconociendo la heterogeneidad en la selección de puntos de acupuntura, el diseño de control, los parámetros de estimulación y las medidas de resultados entre los estudios existentes de EA, el presente protocolo fue diseñado para refinar y ampliar el flujo de trabajo metodológico para una entrega estable de EA.

En consecuencia, el protocolo actual se centra en la entrega, abordando dos variables prácticas críticas para sesiones repetidas de EA en roedores. Primero, para evitar el desplazamiento de la aguja y el contacto intermitente con electrodos causado por el movimiento del animal y la tracción del alambre de plomo, describimos un procedimiento mantenido con isoflurano que estabiliza la posición durante la estimulación y asegura un contacto fiable con los electrodos entre sesiones; Esto es especialmente importante al combinar los puntos de la línea media abdominal con los puntos de las extremidades posteriores. En segundo lugar, basándonos en revisiones previas y análisis de puntos de acupunturay prescripción 9,17, identificando CV4, SP6, ST36 y CV3 como puntos reproductivos comunes en protocolos de infertilidad y anomalías de semen, seleccionamos CV3, CV4, ST36 y SP6 y aplicamos estimulación emparejada a CV3-CV4 y ST36-SP6. Esta configuración, que combina los puntos de la línea media abdominal y de la extremidad posterior, estandariza las conexiones de los electrodos, minimiza la variabilidad causada por la inestabilidad de la inserción de los electrodos y favorece la administración reproducible de EA a través de sesiones de tratamiento repetidas. Para mantener un alcance orientado al protocolo y evitar la duplicación de módulos endocrinos, mecanicistas o de control positivo previamente reportados, la verificación de resultados se limita a un conjunto primario de lectura de semen y testículo. Este conjunto comprende análisis de esperma asistido por ordenador y tinción testicular de HE, que son suficientes para confirmar la inducción fenotípica exitosa y los cambios asociados al tratamiento dentro de este flujo de trabajo.

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Protocolo

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Todos los procedimientos con animales cumplían con las directrices institucionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad Médica de Ningxia (nº de aprobación IACUC-NYLAC-2021-130). Ratas machos Sprague-Dawley, de 8 semanas y con un peso de 180–220 g, fueron obtenidos del Centro Experimental de Animales de la Universidad Médica de Ningxia (licencia nº SYXK (Ning) 2020-0001). Los animales se alojaron en condiciones estándar de laboratorio a 22–24 °C y humedad relativa del 52%–56%, con un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad, y tenían libre acceso a alimento y agua.

1. Preparación animal, asignación en grupo y establecimiento modelo inducido por adenina

  1. Aclimata a las ratas durante 7 días antes del experimento y controla su estado general diariamente.
  2. Tras la aclimatación, asignar a nueve ratas números de identificación únicos y asignarlos aleatoriamente en una proporción 1:1:1 en tres grupos usando una secuencia de aleatorización generada por ordenador: un grupo de control (n = 3), un grupo modelo (n = 3) y un grupo EA (n = 3). Utilizar cada rata como unidad experimental e incluir todos los animales y muestras en el análisis final, salvo que se cumplan criterios de exclusión predefinidos.
  3. Mantén a los investigadores que realizan análisis asistidos por ordenador y evaluación histológica al ceguero ante la asignación de grupos.
    NOTA: Los investigadores que administran la EA no pueden quedar cegados porque la intervención implica procedimientos visibles específicos de cada grupo.
  4. Prepara una suspensión de 20 mg/mL de adenina en suero fisiológico normal que contenga 0,5% (p/v) de goma arábiga como agente suspendente, y mezcla bien tanto antes como durante el gavage para evitar la sedimentación.
  5. Administrar suero fisiológico normal al grupo de control y suspensión de adenina al grupo modelo y EA mediante gavage a 10 mL/kg, equivalente a 1 mL/100 g de peso corporal, una vez al día durante 28 días consecutivos. Usa una dosis de adenina de 200 mg/kg/día.
  6. Registrar el peso corporal y el estado general durante todo el periodo de modelado.
    NOTA: La adenina se administra en suspensión y cuida el sedimento durante la manipulación. Mantén una agitación continua durante el gavage para minimizar la precipitación, que de otro modo puede causar inconsistencias en la dosificación y obstrucción de la aguja del gavage. Si se produce obstrucción, vuelve a suspender la solución a fondo y vuelve a colocar la aguja de gavage antes de continuar.

2. Anestesia con isoflurano para la administración por electroacupuntura (Figura 1)

  1. Prepara un sistema de anestesia de isoflurano con una cámara de inducción, una mascarilla nasal y una almohadilla térmica.
  2. Inducir anestesia con isoflurano al 3% en la cámara de inducción hasta que la actividad espontánea disminuya notablemente.
  3. Transfiere a la rata a la almohadilla térmica en posición supina y mantenga la anestesia con un 1,5% de isoflurano mediante una mascarilla nasal durante todo el EA.
  4. Confirmar la anestesia adecuada reduciendo el movimiento espontáneo y perdiendo el reflejo de parpadeo, manteniendo la respiración regular.

3. Fidelidad y control de calidad de la entrega de la estimulación

  1. Utiliza una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal durante toda la sesión y reducir la variabilidad fisiológica debida a la hipotermia.
  2. Aplica ajustes anestésicos consistentes en todos los animales y sesiones, usando un 3% de isoflurano para la inducción y un 1,5% de isoflurano para el mantenimiento. Mantén la profundidad anestésica al nivel mínimo necesario para evitar dificultades, manteniendo la respiración normal.
  3. Inserta agujas de acupuntura desechables estériles (0,25 mm × 13 mm) verticalmente en los puntos seleccionados. Inserta las agujas a profundidades de aproximadamente 2 mm en CV3 y CV4, 7 mm en ST36 y 5 mm en SP6.
  4. Tras la inserción de la aguja y la conexión del electrodo, se confirma visualmente que cada aguja permanece estable en una posición estable, sin aflojar observable debido a la respiración o al movimiento de las extremidades. Si se produce desplazamiento, reinsertar la aguja verticalmente a la profundidad original y verificar el contacto estable del electrodo antes de reanudar la estimulación.
  5. Corta los electrodos cerca del extremo proximal del mango de la aguja, luego envíalos y asegura para minimizar la tracción, ya que el peso del plomo y el tirón son causas comunes de desprendimiento.
  6. Confirma la estimulación efectiva observando un leve temblor muscular local en el punto de acupuntura sin movimientos bruscos del cuerpo. Si no hay temblor, revisa y confirma el contacto del electrodo y la colocación de la aguja.
  7. Realiza una única comprobación estandarizada a mitad de la sesión a 15 minutos. Si es necesario, reajusta las agujas y reconfirma el leve temblor local antes de proceder para reducir la variabilidad en la estimulación en los animales.
    NOTA: Al conectar el dispositivo EA, sujeta los cables al extremo proximal del mango de la aguja para reducir la tracción por el peso del cable. Si es necesario, asegura el cable y/o la aguja con cinta adhesiva para evitar despegos durante la sesión.

4. Tratamiento con electroacupuntura (Figura 2)

  1. Inicia la EA al día siguiente al periodo de 28 días de gavage de adenina y administra una vez al día durante 28 días consecutivos.
  2. Bajo anestesia isoflurana, exponer la parte inferior del abdomen y las extremidades posteriores, y localizar a Zhongji (CV3), Guanyuan (CV4), Zusanli (ST36) y Sanyinjiao (SP6) utilizando puntos anatómicos superficiales.
  3. Inserta agujas de acupuntura desechables estériles (0,25 mm × 13 mm) verticalmente a profundidades de 2 mm en CV3 y CV4, 7 mm en ST36 y 5 mm en SP6.
  4. Conecta un par de electrodos a CV3 y CV4, y conecta el otro par a ST36 y SP6.
  5. Proporciona estimulación eléctrica a 2 Hz y 1,5 mA durante 30 minutos. Utilizar estos parámetros para coincidir con los empleados previamente en oligoastenozoospermia inducida poradenina 16.
  6. Aplica los controles de calidad descritos en la Sección 3, incluyendo una única revisión a mitad de sesión cada 15 minutos.
    NOTA: Localizar los puntos de acupuntura de ratas con referencia a Experimental Acupuncture and MoxibustionScience 18, Apéndice II de Yong Tang ("Puntos de acupuntura comúnmente usados en animales experimentales"), junto con hitos anatómicos comparativos. Dado que los puntos de acupuntura de rata representan regiones anatómicas discretas en lugar de puntos geométricos fijos, se utiliza una posición corporal consistente, puntos de referencia anatómicos fijos y mediciones superficiales basadas en milímetros entre animales y sesiones. Localizar a Zhongji (CV3) en la línea media ventral, aproximadamente 33 mm caudal hasta el centro del umbligo. Localizar Guanyuan (CV4) en la línea media ventral, aproximadamente a 25 mm caudal hasta el centro del ombligo, cerca de las arterias superficiales subcutáneas de la pared abdominal. Localizar Zusanli (ST36) en la parte posterolateral de la rodilla, aproximadamente 3 mm distal a la cabeza fibular. Localizar a Sanyinjiao (SP6) en la parte medial de la extremidad posterior, aproximadamente a 10 mm proximal a la punta de la maléola medial. Aplica las mismas referencias de localización, posición corporal, ángulo de inserción y profundidad de inserción de forma consistente en todos los animales y sesiones de tratamiento.

5. Recogida de muestras

  1. Ayuno a las ratas durante 24 horas tras la última sesión de EA.
  2. Inducir anestesia profunda mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 2% a 2 mL/kg antes de la recogida de tejido. Confirma la anestesia profunda por la ausencia del reflejo de retirada del pedal y el movimiento espontáneo.
  3. Eutanasiar a la rata decapitándola bajo anestesia profunda, siguiendo los protocolos institucionalmente aprobados.
  4. Expone inmediatamente los órganos reproductores de forma aséptica. Aislar un epidídimo de la cauda para análisis de esperma y extirpar un testículo para examen histológico.
  5. Fije el testículo en paraformaldehído al 4% durante al menos 24 horas antes del procesamiento histológico.

6. Análisis de esperma

  1. Retira la grasa circundante del epidídimo cauda y coloca inmediatamente el tejido en 2 mL de solución fisiológica normal precalentada a 37 °C.
  2. Incuba el tejido en un baño de agua a 37 °C durante 5 minutos, pícalo con tijeras oftálmicas, filtra la suspensión a través de una malla de 200 y mezcla suavemente el filtrado.
  3. Carga una alicuota de 10 μL de la suspensión espermática en una cámara de conteo precalentada y analiza el recuento y la motilidad de espermatozoides utilizando un sistema de análisis de semen asistido por ordenador (CASA).
  4. Utiliza el mismo tipo de cámara, condiciones de calentamiento y ajustes de adquisición para todas las muestras dentro de un experimento dado.

7. Examen histológico del tejido testicular

  1. Fija el tejido testicular con un 4% de paraformaldehído durante un mínimo de 24 horas. Recorta la zona objetivo y colócala en casetes etiquetados.
  2. Deshidrata las muestras mediante una serie de etanol graduado, las elimina en xileno, infiltra con parafina, incrusta y secciona a 4 μm.
  3. Haz flotar las secciones en un baño de agua a 40 °C, móntalas en los lavabos y sécalas en un horno a 60 °C.
  4. Para la tinción de hematoxilina y eosina, haz un dewax en las secciones de xileno, rehidrátalas con etanol graduado, tiñelas con hematoxilina durante 5–10 minutos y eosina durante 1–5 minutos, luego deshidrata, limpia y monta.
  5. Examina la organización de los túbulos seminíferos y la disposición de las células espermatogénicas bajo ajustes de aumento consistentes en todos los grupos.

8. Evaluación del establecimiento del modelo y cambios asociados al tratamiento

  1. Confirmar el establecimiento del modelo mediante una reducción del recuento y motilidad de espermatozoides, incluyendo una estructura desorganizada del túbulo seminífero, en relación con el grupo de control.
  2. Confirmar los cambios asociados al tratamiento mediante el aumento del recuento y la motilidad de espermatozoides, junto con una restauración parcial de la morfología del túbulo seminífero, en el grupo EA en relación con el grupo modelo.
  3. Predefinan muestras técnicamente comprometidas, como aquellas con procesamiento tardío del esperma, fallo en la carga de la cámara o secciones de baja calidad no relacionadas con el modelado, como criterios de exclusión. Documenta cualquier exclusión durante el análisis.

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Resultados

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Análisis de esperma (Figura 3)
Las suspensiones epididimales de espermatozoides se analizaron mediante un sistema de análisis de semen asistido por ordenador para cuantificar el recuento y la motilidad de los espermatozoides. En este conjunto de datos representativo, la administración de adenina redujo notablemente ambos parámetros en relación con el grupo de control, confirmando el establecimiento exitoso del modelo. La intervención con EA aumentó posteriormente el recuento y la motilidad de espermat...

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Discusión

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Dada la etiología multifactorial de la oligoastenozoospermia y la eficacia limitada de los tratamientos farmacológicos disponibles, la acupuntura y la AA han ganado atención como intervenciones repetibles y nofarmacológicas 19. La literatura clínica y preclínica existente sugiere varios mecanismos plausibles por los cuales la acupuntura o el EA puede influir en la función reproductiva masculina, incluyendo la modulación de la regulación neuroendocrina, la mejora d...

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Divulgaciones

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Los autores no declaran que no hay intereses financieros o no financieros en competencia.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por el Fondo Regional de Ciencia de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China 2024 (82460972) y el Fondo Regional de Ciencia de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China 2022 (82260967); el Programa Clave de Investigación y Desarrollo 2022 de la Región Autónoma Hui de Ningxia (2022BEG02040); el Proyecto de Construcción de Disciplinas de Primera Clase de la Escuela de Medicina Tradicional China de la Universidad Médica de Ningxia (ZY0019110305); el Programa Clave de Investigación y Desarrollo 2023 del Condado de Yanchi (2023YCYDCT003); y el Programa Especial de Ciencia y Tecnología en Beneficio del Pueblo de la Región Autónoma Hui de Ningxia (2024CMG03054).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AdenineBeijing Solarbio Science & Technology Co.Ltd.A8330
CASA computer-assisted semen analysis systemNanning Songjing Tianlun Biotechnology Co.,Ltd.VICOS-SPERM
CentrifugeSartoriusA-14C
Differentiation fluidShanghai Biyuntian Biotechnology Co.,LtdC0163M
Disposable sterile acupuncture needlesHanyi brand0.25 mm ´ 13 mm
Drying machineLeicaHI1220
Electrical stimulatorChangzhou Yingdi Electronic Medical Device Co., LtdKWD-808I
Electronic balanceHangzhou Youheng Weighing Equipment Co.,LtdHLD-6002
Eosin Y Stain SolutionLanke BiotechBS248
Hematoxylin staining solutionZhuhai Beso Biotechnology Co. LTDBA-4041
IsofluraneRWD Life Science Co., Ltd.R510-22-10
MicrotomeLeicaRM2255
Neutral balsamBeijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co.,LtdZli-9555
Paraffin embedding machineLeicaHistoCore Arcadia H
SD ratsAnimal Center of Ningxia Medical University8-week-old, Male, 180-220 g
Slide scannerLeicaAperio LV1
Small Animal Anesthesia MachineRWD Life Science Co., Ltd.R500
Vortex oscillatorHaimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co.,LtdQL-902
Warming padDongguan Hongda Electronics Co., Ltd.45W-80X28CM

Referencias

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