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Artículo de investigación
Este estudio retrospectivo de casos y controles evaluó el miR-146a sérico, el miR-642a, el miR-2861 y los marcadores metabólicos en mujeres con síndrome de ovario poliquístico. Se observaron alteraciones coordinadas en los miARN, adipocinas, resistencia a la insulina, inflamación y testosterona, mientras que un modelo combinado de biomarcadores mostró un rendimiento discriminatorio más fuerte que los marcadores individuales.
El síndrome de ovario poliquístico (SOP) es un trastorno endocrino y metabólico común en mujeres en edad reproductiva, pero las relaciones entre los microARNs (miARNs) circulantes y las proteínas relacionadas con la nutrición aún no se comprenden completamente. Este estudio investigó las asociaciones entre el miARN-146a, miARN-642a y miARN-2861 séricos y los marcadores metabólicos e inflamatorios en el SOP. El estudio incluyó a 62 mujeres con SOP y 71 controles sanos. Los niveles séricos de miARN-146a, miARN-642a y miARN-2861 se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real, mientras que también se evaluaron la adiponectina (ADPN), la leptina (LEP), la proteína fijadora del retinol 4 (RBP4), el modelo de evaluación de la homeostasis de la resistencia a la insulina (HOMA-IR), la interleucina-6 (IL-6) y la testosterona (T). La validación metodológica evaluó las condiciones de procesamiento de las muestras, la precisión del ensayo y la concordancia entre métodos analíticos. En comparación con los controles, las mujeres con SOP mostraron un aumento en la expresión del miARN-146a y una disminución en la expresión del miARN-642a y miARN-2861. Los niveles de ADPN se redujeron, mientras que los niveles de LEP, RBP4, HOMA-IR, IL-6 y T aumentaron. El miARN-146a mostró una correlación negativa con ADPN y una correlación positiva con LEP, RBP4, HOMA-IR, IL-6 y T. El miARN-642a mostró una correlación negativa con RBP4, HOMA-IR e IL-6, mientras que el miARN-2861 mostró una correlación positiva con ADPN. La validación metodológica mostró una estabilidad aceptable del ensayo, precisión y concordancia entre métodos. El modelo que combinó los tres miARNs con ADPN, LEP, RBP4, HOMA-IR, IL-6 y T alcanzó un área bajo la curva de 0,929, con una sensibilidad del 82,26 % y una especificidad del 94,37 %. Estos hallazgos demuestran alteraciones coordinadas en los miARNs circulantes y los marcadores metabólicos en el SOP y respaldan la evaluación adicional de su potencial diagnóstico combinado.
El síndrome de ovario poliquístico (SOP) es el trastorno endocrino y metabólico más común en mujeres en edad reproductiva. Se estima que su prevalencia global oscila entre el 6 % y el 20 %. Aproximadamente el 70 % de las mujeres afectadas presentan resistencia a la insulina, y más de la mitad tienen sobrepeso u obesidad1. El SOP puede provocar disfunción ovulatoria, infertilidad, diabetes tipo 2, enfermedad cardiovascular y otras complicaciones a largo plazo, afectando gravemente la salud reproductiva y la calidad de vida2. Aunque su patogénesis no se ha elucidado completamente, en general se considera que el SOP implica múltiples factores, entre ellos la susceptibilidad genética, la inflamación crónica de bajo grado, anomalías en las vías de señalización de la insulina y la alteración del microentorno ovárico local. En este contexto, la identificación de marcadores moleculares específicos que reflejen la progresión de la enfermedad tiene un valor evidente para el diagnóstico precoz y la intervención precisa en el SOP3,4.
Los miARN son una clase de ARN no codificantes de aproximadamente 22 nucleótidos de longitud. Estas moléculas regulan la expresión génica tras la transcripción, ya sea promoviendo la degradación del ARNm o inhibiendo la traducción. Por lo tanto, estas moléculas son cruciales para muchos procesos celulares, incluyendo el crecimiento celular, la diferenciación, las respuestas a la inflamación y la regulación metabólica5,6. Estudios previos han mostrado una desregulación característica de miR-146a, miR-642a y miR-2861 en el suero de pacientes con SOP. La sobreexpresión de miR-146a podría mediar respuestas inflamatorias crónicas mediante la regulación dirigida de la vía TLR4/NF-κB7, mientras que la disminución en la expresión de miR-642a y miR-2861 se ha asociado estrechamente con resistencia a la insulina y alteración de la función de las células granulosas ováricas8,9. ADPN, LEP y RBP4, que son proteínas relacionadas con la nutrición, desempeñan un papel fundamental en la regulación del equilibrio metabólico. Los cambios en sus niveles pueden afectar directamente el metabolismo de los lípidos, la sensibilidad a la insulina y el estado inflamatorio. Esto se considera una parte clave de la base molecular de los trastornos metabólicos observados en el SOP10,11. Sin embargo, la mayoría de los estudios publicados han analizado por separado los miARN o las proteínas relacionadas con la nutrición en relación con el SOP12,13, y la relación molecular entre ambos aún no se ha aclarado de manera sistemática.
En este estudio, se midieron los niveles de expresión de tres miARN y seis biomarcadores centrales en pacientes con SOP, se analizaron las correlaciones entre estos marcadores y sus asociaciones con índices bioquímicos clínicos, y se exploró además si los miARN podrían participar en el proceso patológico del SOP mediante asociaciones con proteínas relacionadas con la nutrición. Los hallazgos de este estudio podrían enriquecer el entendimiento actual de la base molecular del SOP, proporcionar objetivos potenciales para terapias dirigidas a la regulación nutricional y metabólica, y ofrecer evidencia de laboratorio para la detección temprana, el monitoreo de la eficacia y la gestión individualizada del SOP.
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Declaración de ética
El estudio se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de Ética Médica del Hospital de Medicina Tradicional China de Ganzhou (número de aprobación: GZSZYYKYLL20240092, Fecha: 2024-12-20).
Todos los materiales, reactivos, kits de ensayo y equipos utilizados en este protocolo se enumeran en la Tabla de materiales.
Diseño del estudio
Este estudio retrospectivo de casos y controles incluyó a 62 pacientes con SOP diagnosticadas en la clínica ambulatoria de ginecología del Hospital de Medicina Tradicional China de Ganzhou entre junio de 2024 y agosto de 2025, y a 71 mujeres sanas en edad reproductiva evaluadas en el centro de gestión de la salud del hospital durante el mismo periodo. Los controles se seleccionaron para lograr comparabilidad entre grupos a nivel de edad; el IMC no se utilizó como variable de emparejamiento y se evaluó como una característica basal.
Sujetos del estudio
Criterios de inclusión: Los criterios de inclusión para el grupo con SOP fueron los siguientes: (1) edad >18 años; (2) diagnóstico de SOP según los criterios de Rotterdam modificados, respaldados por la Guía Internacional Basada en Evidencia de 2023, que requieren al menos dos de las tres características siguientes tras la exclusión de trastornos relacionados: oligoovulación o anovulación, definida como ciclos menstruales más largos de 35 días o menos de ocho ciclos por año; hiperandrogenismo clínico y/o hiperandrogenismo bioquímico, siendo el hiperandrogenismo bioquímico un nivel sérico de testosterona total por encima del límite superior de referencia específico del ensayo; y morfología ovárica poliquística, definida como al menos 20 folículos en un ovario o un volumen ovárico de al menos 10 mL cuando no fue factible el recuento completo de folículos14; (3) historiales médicos electrónicos completos; (4) ausencia de terapia de reemplazo hormonal, agentes hipoglucemiantes o inmunosupresores durante los 3 meses previos; y (5) disponibilidad de una muestra sérica en ayunas recolectada al momento del ingreso y almacenada en el biobanco institucional.
Los criterios de inclusión para el grupo control fueron los siguientes: (1) asistencia a un examen de salud durante el mismo período; (2) ciclos menstruales regulares; (3) morfología ovárica normal en la ecografía transvaginal; (4) ausencia de antecedentes de trastornos endocrinos, enfermedades ginecológicas, infertilidad o disfunción hepática o renal clínicamente significativa; y (5) disponibilidad de una muestra sérica en ayunas recogida el día del examen y almacenada en el biobanco institucional.
Los criterios de exclusión fueron los siguientes: (1) endometriosis, fibromas uterinos, tumores ováricos, enfermedad inflamatoria pélvica u otros trastornos ginecológicos; (2) disfunción tiroidea, síndrome de Cushing, hiperprolactinemia, hiperplasia suprarrenal congénita, o cualquier otro trastorno endocrino que pudiera explicar la disfunción ovulatoria o el hiperandrogenismo; (3) disfunción grave cardíaca, hepática, renal o pulmonar, tumores malignos, enfermedades autoinmunes o trastornos hematológicos; (4) embarazo, parto o aborto durante los últimos 6 meses; (5) uso de glucocorticoides, anticonceptivos orales u otros medicamentos que afecten el metabolismo de la glucosa o los lípidos durante los últimos 3 meses; (6) trastornos psiquiátricos o deterioro cognitivo; (7) ausencia de información clínica clave; y (8) hemólisis sérica severa, definida como una concentración de hemoglobina >2.0 g/L, lipemia, ictericia, más de un ciclo de congelación-descongelación o almacenamiento de muestras interrumpido. La disfunción tiroidea, la hiperprolactinemia y la hiperplasia suprarrenal congénita no clásica se descartaron mediante la medición de hormona estimulante de la tiroides, prolactina sérica y 17-hidroxiprogesterona, respectivamente; se revisó la hormona foliculoestimulante cuando fue apropiado, mientras que se investigó el síndrome de Cushing o un tumor suprarrenal cuando lo indicaba la clínica. Se aplicó el mismo procedimiento preanalítico a todas las muestras clínicas, y ninguna muestra incluida en el análisis principal sufrió más de un ciclo de congelación-descongelación.
Recolección y almacenamiento de muestras de suero
Se recolectó sangre venosa en ayunas (10 mL) por la mañana en tubos sin anticoagulante, se dejó coagular a temperatura ambiente durante 30 min y se centrifugó a 1.505 x g durante 15 min a 4 °C. El suero se dividió en alícuotas de 200 µL y se almacenó a −80 °C hasta su análisis. Se aplicó el mismo procedimiento preanalítico a todas las muestras clínicas, y ninguna muestra incluida en el análisis principal sufrió más de un ciclo de congelación-descongelación.
Preparación de muestras para la validación metodológica
Se utilizaron diez muestras de suero agrupadas de voluntarios sanos para evaluar los efectos de la velocidad de centrifugación (1.505, 3.000 y 4.000 x g durante 15 min), la frecuencia de congelación-descongelación (0, 1, 3 y 5 ciclos), la temperatura de almacenamiento (4 °C, −20 °C y −80 °C durante 7 días), la duración del almacenamiento (1, 3, 6 y 12 meses a −80 °C) y la hemólisis (<0,1, 0,1–0,5 y 0,5–2,0 g/L de hemoglobina).
Pruebas de laboratorio
Todos los ensayos de laboratorio fueron realizados por el mismo técnico capacitado bajo condiciones ambientales estandarizadas y de acuerdo con procedimientos operativos preespecificados. Las miARN séricas se cuantificaron mediante qRT-PCR; la ADPN, la LEP y la RBP4 se midieron mediante ELISA de sándwich; la T y la IL-6 se midieron mediante inmunoensayos basados en quimioluminiscencia; y las variables del metabolismo glucídico se obtuvieron utilizando métodos automatizados de laboratorio de rutina.
Cuantificación de miARN séricos mediante qRT-PCR
Se extrajo ARN total a partir de 200 µL de suero utilizando el reactivo TRIzol. No se dispuso de datos de concentración de ARN por espectrofotometría ni de la pureza A260/A280 para las preparaciones de ARN sérico archivadas. Por lo tanto, la aceptabilidad del ensayo de qRT-PCR se evaluó mediante la presencia de un único pico específico en la curva de fusión y la concordancia entre tres réplicas técnicas. Tras la separación de fases con cloroformo, precipitación con isopropanol y dos lavados con etanol al 75 %, el precipitado de ARN se disolvió en agua libre de enzimas. El sistema de reacción de 20 µL contenía 4 µL de tampón 5x, 1 µL de transcriptasa inversa, 1 µL de cebador en horquilla (10 µM) y 5 µL de molde de ARN. Las condiciones de reacción fueron 16 °C durante 30 min, 42 °C durante 30 min y 85 °C durante 5 s. Los productos transcritos a ADN complementario se almacenaron a −20 °C. La PCR cuantitativa se realizó utilizando el kit TaKaRa SYBR Premix Ex Taq II. Cada reacción de 20 µL contenía 10 µL de mezcla SYBR 2×, 0,8 µL de cada cebador (directo e inverso, 10 µM) y 2 µL de molde de ADNc. La amplificación se llevó a cabo en un sistema de PCR en tiempo real Applied Biosystems 7500 bajo las siguientes condiciones: desnaturalización previa a 95 °C durante 30 s; 40 ciclos de 95 °C durante 5 s y 60 °C durante 30 s; posteriormente, se realizó un análisis de la curva de fusión para confirmar la especificidad de la amplificación. El ARN snU6 se utilizó como gen de referencia interno, y los niveles relativos de expresión de miR-146a, miR-642a y miR-2861 se calcularon mediante el método 2-ΔΔCt. Cada muestra se analizó por triplicado. Las secuencias de todos los cebadores utilizados en este estudio se indican en Tabla 1.
Detección de marcadores proteicos en suero
Las concentraciones de ADPN, LEP y RBP4 en suero se midieron mediante ELISA de doble anticuerpo en sandwich utilizando el Human Total ADPN/Acrp30 Quantikine ELISA Kit (sensibilidad analítica, 0.891 ng/mL; rango del ensayo, 3.9–250 ng/mL), el Human Leptin Quantikine ELISA Kit (sensibilidad analítica, 7.8 pg/mL; rango del ensayo, 15.6–1,000 pg/mL) y el Human RBP4 Quantikine ELISA Kit (sensibilidad analítica, 0.628 ng/mL; rango del ensayo, 1.56–100 ng/mL), respectivamente. Cada ensayo fue específico para el analito humano correspondiente, y las muestras de suero se diluyeron según las instrucciones del fabricante. La absorbancia se midió a 450 nm, y las concentraciones se calcularon utilizando curvas estándar logísticas de cuatro parámetros. Los CV intraensayo o interensayo fueron del 2,5 % o 3,2 % para ADPN, del 2,7 % o 3,4 % para LEP, y del 2,6 % o 3,3 % para RBP4.
Medición de T
La testosterona sérica se midió mediante inmunoensayo por electroquimioluminiscencia utilizando un analizador inmunoensayos automatizado Roche Cobas e601.
Mediciones del metabolismo glucídico y de la inflamación
Los valores de glucosa plasmática en ayunas, insulina en ayunas y HbA1c se obtuvieron de los registros clínicos de laboratorio de rutina del mismo día, en lugar de los alícuotas de suero archivados utilizados para los ensayos de miARN y proteínas metabólicas. La glucosa plasmática en ayunas se midió mediante el método de glucosa oxidasa, la insulina en ayunas mediante inmunoturbidimetría y la HbA1c mediante cromatografía líquida de alta resolución. El HOMA-IR se calculó como [glucosa plasmática en ayunas (mmol/L) × insulina en ayunas (mIU/L)]/22,5. La IL-6 sérica se midió mediante inmunoensayo por quimioluminiscencia.
Validación metodológica
Las comparaciones mediante métodos alternativos se realizaron para determinar si las mediciones principales eran robustas frente a la plataforma de ensayo, y no se utilizaron para generar los resultados principales entre grupos. Los niveles de expresión de los tres miARN y cinco marcadores bioquímicos se midieron bajo las diferentes condiciones de procesamiento descritas anteriormente, y se calculó el coeficiente de variación para cada indicador como CV = (desviación estándar/media) × 100 %. Un CV <Se consideró un 15 % como aceptable para evaluar la estabilidad de los resultados del ensayo bajo diferentes condiciones de procesamiento y almacenamiento de las muestras. La precisión intradía se evaluó mediante la medición repetida de la misma muestra de suero agrupada 10 veces en un solo día, mientras que la precisión interdía se determinó a partir de mediciones realizadas una vez al día durante cinco días consecutivos. Para cada indicador, se calcularon la media, la desviación estándar y el coeficiente de variación (CV) correspondiente. Para la prueba de concordancia analítica, cinco analitos bioquímicos—ADPN, LEP, RBP4, IL-6 y T—fueron medidos en las muestras de validación utilizando el ensayo principal y una plataforma de inmunoensayo basada en quimioluminiscencia Roche. Se utilizó el análisis de Bland-Altman para calcular los límites de concordancia del 95 %. El ensayo principal de qRT-PCR se utilizó para todas las mediciones clínicas de miARN, mientras que el Kit de PCR con SYBR Green miScript se empleó únicamente como un método ortogonal en el experimento de concordancia analítica; se calcularon los coeficientes de correlación de Pearson entre los dos sistemas de qRT-PCR.
Análisis estadístico
El análisis de datos se realizó utilizando software estadístico. Todas las variables continuas se probaron primero para normalidad mediante la prueba de Shapiro-Wilk. Los datos con distribución normal se expresan como media ± desviación estándar. Las comparaciones entre dos grupos se realizaron con la prueba t para muestras independientes, mientras que las comparaciones entre múltiples grupos se realizaron mediante análisis de varianza de un factor, seguido de la prueba t LSD para comparaciones por pares. Los datos que no seguían una distribución normal se presentan como mediana (rango intercuartílico) [M (P25, P75)]. Las comparaciones entre dos grupos se realizaron entonces con la prueba U de Mann-Whitney, y las comparaciones entre múltiples grupos con la prueba H de Kruskal-Wallis. Los datos categóricos se presentaron como frecuencias y porcentajes. Se utilizó la prueba χ2 o la prueba exacta de Fisher para comparar los grupos. Las correlaciones entre variables se evaluaron mediante análisis de correlación de Pearson o análisis de correlación de rangos de Spearman, según la distribución de los datos. Como análisis exploratorio, se repitieron las correlaciones de Pearson entre cada miARN y los seis marcadores metabólicos dentro de los subgrupos de PCOS no obesos (IMC <28 kg/m2) y obesos (IMC ≥28 kg/m2). Los coeficientes de correlación se compararon utilizando la transformación r-a-z de Fisher, y los valores p resultantes entre subgrupos se ajustaron mediante el procedimiento de tasa de descubrimientos falsos de Benjamini–Hochberg. Se evaluó el rendimiento diagnóstico mediante curvas de característica operativa del receptor (ROC) y el área bajo la curva (AUC). Además, se analizó la detección combinada utilizando un modelo de regresión logística. Todas las pruebas fueron bilaterales, y se consideró estadísticamente significativo un valor de p < 0,05.
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Características basales de la población de estudio
Un total de 62 pacientes con SOP y 71 controles sanos fueron incluidos en este estudio. Los dos grupos fueron comparables en edad, composición étnica y otras características basales (p > 0,05). Por el contrario, los ciclos menstruales fueron significativamente más largos en el grupo con SOP que en el grupo control (p < 0,001), lo cual es consistente con la presentación clínica típica del SOP (Tabla 2).
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Mediante ensayos bioquímicos séricos estandarizados y qRT-PCR, este estudio analizó muestras de suero de 62 pacientes con SOP y 71 controles sanos. Encontramos un patrón característico de expresión disregulada de microARN y proteínas relacionadas con la nutrición en el SOP, junto con asociaciones posrtranscripcionales significativas entre ambos. Todos los experimentos pasaron por una rigurosa validación metodológica. La precisión, estabilidad y concordancia entre métodos del sistema de detección cumplieron con los estánd...
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Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Congelador ultrade bajo de temperatura a -80 °C | Thermo Fisher (USA) | Forma 900 | Almacenamiento a largo plazo de muestras de suero a baja temperatura |
| Kit ELISA de adiponectina (ADPN) | R&D Systems (USA) | DY1065 | Detección cuantitativa de la concentración sérica de ADPN |
| Analizador bioquímico automático | Beckman Coulter (USA) | AU5800 | Detección de glucosa en sangre en ayunas, insulina y hemoglobina glucosilada |
| Lector automático de microplacas | Tecan (Suiza) | Infinite M200 Pro | Medición de absorbancia a 450 nm para experimentos de ELISA |
| Kit de detección de glucosa en sangre | Beckman Coulter (USA) | A11A01 | Detección de glucosa sérica en ayunas mediante el método de glucosa oxidasa |
| Analizador de inmunoensayo por quimioluminiscencia Cobas e601 | Roche (Alemania) | Cobas e601 | Detección electroquimioluminiscente de testosterona e IL-6 en suero |
| Tubo criogénico sin enzimas | Axygen (USA) | MCT-150-C | Aliquotación de muestras de suero, almacenamiento a -80 °C en congelador ultrade bajo |
| Pipeta Eppendorf Research plus | Eppendorf (Alemania) | Research plus 0,5-1.000 μL | Aspiración de suero, pipeteo de ARN/reactivos, aliquotación de muestras |
| Kit de hemoglobina glucosilada (HbA1c) | Beckman Coulter (USA) | A11A03 | Detección de HbA1c sérica mediante cromatografía líquida de alta eficacia |
| Kit de detección de IL-6 | Roche (Alemania) | 5200057190 | Cuantificación de interleucina-6 sérica |
| Kit de detección de insulina | Beckman Coulter (USA) | A11A02 | Detección de insulina sérica en ayunas mediante inmunoturbidimetría |
| Kit ELISA de leptina (LEP) | R&D Systems (USA) | DY398 | Detección cuantitativa de la concentración sérica de LEP |
| Centrífuga de alta velocidad y baja temperatura | Xiangyi Instrument (China) | TDZ5-WS | Centrifugación de muestras a las fuerzas centrífugas especificadas |
| Kit miScript SYBR Green PCR | Qiagen (Alemania) | 218073 | Verificación de consistencia metodológica para la detección de miARN |
| Kit de transcripción inversa PrimeScript RT | TaKaRa (Japón) | RR036A | Transcripción inversa de miARN para la síntesis de ADNc |
| Instrumento de PCR cuantitativa en tiempo real con fluorescencia | Applied Biosystems (USA) | 7500 | Amplificación por qRT-PCR de miARN y detección de fluorescencia |
| Kit ELISA de proteína fijadora de retinol 4 (RBP4) | R&D Systems (USA) | DY6005 | Detección cuantitativa de la concentración sérica de RBP4 |
| Software estadístico SPSS | IBM (USA) | 25 | Prueba de normalidad de datos, comparación entre grupos, análisis de correlación y ROC |
| Kit SYBR Premix Ex Taq II | TaKaRa (Japón) | RR420A | Amplificación por PCR cuantitativa con fluorescencia de miARN |
| Kit de detección de testosterona (T) | Roche (Alemania) | 5200067190 | Cuantificación de niveles séricos de testosterona |
| Reactivo de extracción de ARN total TRIzol | Invitrogen (USA) | 15596026 | Extracción de ARN total de muestras de suero |
| Tubo de recolección de sangre al vacío sin anticoagulante | BD Biosciences (USA) | 367812 | Recolección de sangre venosa cubital en ayunas para separación de suero |
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