Artículo de investigación

La modificación por N6-metiladenosina de Rab27A promueve la osteoporosis al influir en la diferenciación osteoclasta en el modelo murino ovariectomizado

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DOI:

10.3791/71964

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11 de agosto de 2026

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1Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 2Department of Orthopedics, The People's Hospital of Pengzhou, 3Department of Clinical Skills Center, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 4Southwest Medical University, 5Stem Cell Immunity and Regeneration Key Laboratory of Luzhou, Affiliated Hospital of Southwest Medical University

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En este artículo

Resumen

YTHDC1 promueve la exportación citoplasmática de Rab27A modificado por m6A, mientras que IGF2BP2 estabiliza Rab27A en el citoplasma, mejorando así la diferenciación osteoclasta y contribuyendo a la osteoporosis.

Resumen

El desarrollo de nuevas terapias para la osteoporosis ha atraído una atención creciente. Rab27A se regula al alza durante la diferenciación de osteoclastos, y la modificación de N6-metiladenosina (m6A) ha surgido como un importante regulador epigenético en enfermedades ortopédicas. Los análisis bioinformáticos predijeron que Rab27A contiene múltiples sitios de modificación de m6A e interactúa con varias proteínas asociadas a m6A. Se realizaron experimentos de knockdown para evaluar el papel de Rab27A en la diferenciación osteoclasta y la osteoporosis utilizando un modelo murino ovariectomatizado (OVX). La depleción de Rab27A atenuó la osteoporosis y aumentó el porcentaje de formación ósea del 14,73% al 28,13% (P < 0,05) en ratones OVX. El Western blot y la PCR cuantitativa demostraron que el knockdown de Rab27A redujo la expresión de proteínas y ARNm de los marcadores osteoclastos TRAP, NFATc1 y c-FOS, suprimiendo así la diferenciación osteoclasta de macrófagos derivados de la médula ósea (BMM) inducidos por el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) y el activador receptor del ligando del factor nuclear κB (RANKL). La tinción de TRAP mostró además que el agotamiento de Rab27A redujo significativamente la actividad de TRAP del 24,1% al 12,9% (P < 0,01) tras la inducción de M-CSF y RANKL. Los ensayos de inmunoprecipitación de ARN confirmaron las interacciones entre Rab27A y las proteínas lectoras de m6A YTHDC1 y IGF2BP2. La fraccionación nuclear y citoplasmática demostró que YTHDC1 facilita la exportación citoplasmática de Rab27A modificado por m6A. Además, los análisis q-PCR y western blot mostraron que la reducción de YTHDC1 o IGF2BP2 redujo la expresión de Rab27A y disminuyó la expresión de TRAP, NFATc1 y c-FOS, suprimiendo así la diferenciación de osteoclastos inducida por M-CSF y RANKL. En conjunto, estos hallazgos indican que la exportación citoplasmática mediada por YTHDC1 y la estabilización mediada por IGF2BP2 de Rab27A modificado por m6A promueven la diferenciación de osteoclastos y contribuyen a la pérdida ósea en el modelo murino OVX.

Introducción

La osteoporosis (OP) es un trastorno óseo común caracterizado por el deterioro de la microarquitectura ósea y la reducción de la densidad mineral ósea, lo que resulta en un mayor riesgo de fracturas a nivelmundial 1,2,3. Las fracturas osteoporóticas ocurren con mayor frecuencia en el antebrazo, húmero, cadera y columna, y son especialmente frecuentes en adultos mayores. Estas fracturas perjudican sustancialmente la calidad de vida e imponen cargas físicas, psicológicas y socioeconómicas considerables a los pacientes, sus familias y sistemassanitarios 3. En consecuencia, la prevención, el manejo y el tratamiento de la osteoporosis siguen siendo prioridades clínicas y de salud pública importantes.

Se han desarrollado diversas estrategias terapéuticas para la osteoporosis que generalmente pueden clasificarse en dos categorías: agentes formadores de huesos y terapias antirresorptivas 4,5. Los fármacos antirresorptios tradicionales incluyen bisfosfonatos, raloxifeno y ranelato de estroncio, mientras que los agentes más recientes incluyen denosumab, odanacatib y saracatinib. Las terapias formadoras de huesos incluyen la hormona paratiroidea (PTH 1–84), mientras que varios candidatos adicionales, como MK-5442, AMG 785 y BHQ 880, están en desarrolloclínico 5. Aunque estos tratamientos pueden ser efectivos, muchos están asociados a efectos adversos significativos, eficacia limitada a largo plazo o restricciones en el usoprolongado 4,6,7,8,9. Por ejemplo, la administración a largo plazo de aminobisfosfonatos y denosumab puede afectar la remodelación óseanormal 5. Por lo tanto, identificar objetivos terapéuticos más seguros y efectivos sigue siendo un objetivo importante en la investigación sobre la osteoporosis.

Las proteínas Rab son reguladores clave del tráfico intracelular de vesículas y la señalización celular, y participan en diversos procesos biológicos, incluyendo infecciones virales, autofagia y organizacióncitoesquelética 10. En los últimos años, se ha prestado cada vez más atención al papel de las proteínas de la familia Rab en el metabolismo óseo y la osteoporosis. Se ha informado que Rab44 regula la diferenciación de osteoclastos modulando la señalización intracelular de Ca2⁺ y el factor nuclear activador de células T 1 activadas (NFATc1) en el activador receptor de los macrófagos 11 tratados con el factor nuclear κB ligando (RANKL). Los osteoclastos son células multinucleadas derivadas de precursores de la línea de macrófagos y desempeñan un papel esencial en la reabsorción ósea y la homeostasisesquelética 12,13,14,15,16,17,18,19. Por lo tanto, comprender los mecanismos moleculares que rigen la diferenciación de los osteoclastos es fundamental para desarrollar nuevos enfoques terapéuticos para la osteoporosis.

Rab27A es un miembro importante de la familia Rab GTPasa y se expresa ampliamente en células secretoras e inmunitarias. Desempeña un papel fundamental en el transporte de vesículas, la exocitosis y la señalización intracelular 20,21,22,23,24,25,26,27. Estudios previos han demostrado que Rab27A regula la desgranulación de eosinófilos durante la inflamación de las vías respiratorias y controla la movilización vesicular asociada a la actividad de la NADPH oxidasa en macrófagosactivados 20.23. Cabe destacar que la evidencia acumulada indica que la expresión de Rab27A está significativamente aumentada durante la diferenciación de osteoclastos. Shimada-Sugawara et al. informaron que la expresión de Rab27A aumenta durante la diferenciación de macrófagos derivados de la médula ósea (BMM) en osteoclastos, lo que sugiere un posible papel en laosteoclastogénesis 28. En conjunto, estos hallazgos sugieren que Rab27A puede influir en la formación y función de los osteoclastos al regular el tráfico vesicular y las vías de señalización intracelular28,29.

La N6-metiladenosina (m6A) es la modificación interna de ARN más abundante en los ARN mensajeros eucariotas y ARN no codificantes, y actúa como regulador fundamental del metabolismo del ARN y la expresión génica. Como la primera modificación identificada de ARNm en mamíferos, m6A ha estado implicada en numerosos procesos biológicos, incluyendo la estabilidad del ARN, el empalme, el transporte y la traducción. Wang et al. demostraron que las modificaciones de m6A, que suelen ocurrir dentro de motivos de secuencia conservados, son reconocidas por proteínas que contienen dominios YTH y contribuyen a la regulación de la estabilidad y metabolismo delARNm 30. Además, la modificación de m6A ha estado implicada en diversas funciones biológicas, incluyendo la estabilidad del genoma, la regulación transcripcional, la organización de la cromatina, la progresión del cáncer y las respuestasinmunitarias 31. Estudios recientes también han destacado papeles importantes de la señalización m6A en enfermedades relacionadas con los huesos y laosteoporosis 32.

Entre las proteínas lectoras de m6A, YTHDC1 funciona como un lector nuclear que regula el procesamiento de ARN y la exportación nuclear, mientras que la proteína de unión al ARNm 2 (IGF2BP2), similar a la insulina, estabiliza los transcritos modificados por m6A en el citoplasma. Chen et al. demostraron que YTHDC1 promueve la exportación nuclear de circNSUN2 modificado con m6A, que posteriormente interactúa con IGF2BP2 para estabilizar el ARNm de HMGA2 y promover la metástasis del cáncercolorrectal 33. Estos hallazgos sugieren que la regulación coordinada por YTHDC1 y IGF2BP2 puede representar un mecanismo general que controla el destino de los transcritos modificados por m6A.

El presente estudio investigó los sitios de modificación de m6A predichos dentro del ARNm Rab27A y examinó sus interacciones con YTHDC1 y IGF2BP2. Se descubrió que YTHDC1 facilitaba la exportación nuclear de transcritos de Rab27A modificados por m6A, mientras que IGF2BP2 interactuaba con Rab27A en el citoplasma y mejoraba su estabilidad. A través de este mecanismo regulador, Rab27A promovió la diferenciación osteoclasta y contribuyó a la progresión de la osteoporosis. En conjunto, los hallazgos identifican una vía reguladora dependiente de m6A previamente no reconocida que involucra YTHDC1, IGF2BP2 y Rab27A en la diferenciación de osteoclastos. Estos resultados aportan nuevas perspectivas sobre la patogénesis molecular de la osteoporosis y pueden facilitar el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas dirigidas a la regulación mediada por m6A de Rab27A.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Protección y Utilización Animal del Hospital Afiliado de la Universidad Médica del Suroeste (Aprobación nº 2024-Ética-042). Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices de ARRIVE, la Ley de Procedimientos Científicos (Animales del Reino Unido) de 1986 y las directrices asociadas, la Directiva de la UE 2010/63/UE y la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Publicación NIH nº 8023, revisada en 1978). Los ratones fueron asignados aleatoriamente a grupos experimentales y la secuencia de asignación se ocultó al investigador. Todas las adquisiciones y análisis de datos, incluyendo la evaluación histológica, el análisis de imágenes por tomografía microcomputarizada (micro-TC) y los análisis estadísticos, fueron realizados por investigadores cegados ante la asignación de grupos. No se excluyeron animales ni muestras de los análisis. Todos los reactivos, equipos, software y otros recursos utilizados en este protocolo se listan en la Tabla de Materiales.

1. Construcción del modelo de ovariotomía (OVX)

Se utilizaron veinticuatro hembras de ratones tipo salvaje C57BL/6 de 8 semanas para establecer un modelo de osteoporosis. Tras un periodo de aclimatación de una semana, los ratones fueron asignados aleatoriamente al grupo Sham o OVX. El modelo OVX se estableció mediante ovariotomía bilateral como se describióanteriormente 34,35. Los ratones operados simuladamente fueron sometidos a exposición quirúrgica de los ovarios sin ser extirpados.

Para la administración del gen intrafemoral, se inyectaron vectores lentivirales que expresaban sh-Rab27A o sh-NC 7 días después de la cirugía OVX, según se informópreviamente 36,37. Brevemente, se inyectaron partículas lentivirales concentradas (1 × 106 unidades transductoras/mL) en el fémur a través de la vía rotuliana, utilizando una aguja calibre 22 bajo anestesia. Cada ratón recibió 20 μL de suspensión lentiviral. Posteriormente se suturó la incisión y se vigiló a los animales durante toda la recuperación.

Todos los experimentos con animales se realizaron bajo condiciones específicas libres de patógenos. Las muestras de femur se recogieron 8 semanas después de la cirugía. Se utilizaron al menos seis ratones por grupo para análisis histológicos y extracción de ARN o proteínas.

2. Micro-TC in vivo

Se realizó una tomografía microcomputarizada (micro-TC) para evaluar la morfología ósea trabecular. La tibia derecha de cada ratón fue escaneada in vivo antes de la cirugía OVX a las 14 semanas de edad. Se realizaron ecografías de seguimiento semanalmente hasta las 22 semanas de edad. Al menos seis ratones por grupo se incluyeron en el análisis de micro-TC.

Los ratones fueron anestesiados con pentobarbital sódico intraperitoneal (50 mg/kg de peso corporal). Se confirmó una anestesia adecuada por la ausencia del reflejo de pellizco del dedo del pie y por el seguimiento continuo de la frecuencia respiratoria, y se mantuvo durante todo el procedimiento de imagen. Todos los procedimientos de eutanasia se llevaron a cabo de acuerdo con el protocolo animal aprobado, las directrices institucionales de bienestar animal y las normativas nacionales para la eutanasia de animales de laboratorio.

A las 24 semanas, los ratones fueron eutanasiados por luxación cervical tras anestesia profunda, y ambas tibias fueron extraídas para escanear ex vivo usando el mismo protocolo de imagen. Los parámetros de barrido incluían un tamaño voxel de 10,4 μm, un voltaje de 55 kV, una corriente de 145 μA, un campo de visión de 32 mm, 1500/750 muestras por proyección y un tiempo de integración de 100 ms.

Las imágenes se procesaron mediante un algoritmo de corrección de endurecimiento de haz polinómico de tercer orden calibrado contra un fantasma de 1200 mg HA/cm 3 . La fracción volumétrica ósea (VB/TV), el grosor trabecular (Tb.Th) y el número trabecular (Tb.N) se cuantificaron en la metáfisis distal femoral situada a 1,0 mm proximal de la placa de crecimiento.

3. Transfección de plásmidos

Se generaron plásmidos sh-Rab27A y sh-NC para la producción de lentivirus. Los plásmidos de empaquetado lentival y los constructos de shRNA fueron co-transfectados en HEK293T células según las instrucciones del fabricante. Los títulos virales se determinaron antes de la administración intrafemoral como se describióanteriormente en 36. Se realizaron tres réplicas biológicas independientes.

4. Tinción de hematoxilina y eosina (HE)

Las muestras femorales se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 24 horas, se descalcificaron en EDTA al 10% durante 4 semanas, se crioprotegieron con 30% de sacarosa/PBS, se incrustaron en parafina y se seccionaron con un grosor de 5 μm. Las secciones de tejido se teñieron con hematoxilina y eosina y se examinaron con un microscopio óptico. Se analizaron al menos seis ratones por grupo.

5. Tinción con fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP)

La tinción por TRAP de las secciones femorales se realizó según las instrucciones delfabricante 38. La actividad de TRAP en macrófagos derivados de la médula ósea (BMM) se evaluó mediante un ensayo de tinción TRAP. Los osteoclastos maduros se definieron como células multinucleadas positivas para TRAP que contienen al menos tres núcleos. Se realizaron tres réplicas biológicas independientes, cada una con tres réplicas técnicas.

6. q-PCR

El ARN total se aisló usando reactivo TRIzol según las instrucciones del fabricante. El ADN complementario se sintetizó usando transcriptasa inversa y se sometió a PCR cuantitativa en tiempo real usando química verde SYBR. Se realizaron tres réplicas biológicas independientes, cada una con tres réplicas técnicas.

Las secuencias de cebadores fueron las siguientes:

Rab27A: F, TTCCTGCTTCTGTTCGACCT; R, GGCAGCACTGGTTTTCAAAT

TRAMPA: F, TGTTGACAGCGGTCCATCTA; R, CCTCCTTCTTAACCCGAAGC

NFATc1: F, GGTGCTGTCTCTCCATAACT; R, GCGGAAAGGTGGTATCTCAA

C-FOS: A, TACTACCATTCCCCCCAGCCGA; R, GCTGTCACCGTGGGGATAAA

YTHDC1: F, GAAGTGGAAGCTCTGCATCAG; R, TTGATCTTTTCGGACACCACG

IGF2BP2: F, GACTACCCCGACCAGAACTG; R, GAGGCGGGATGTTCCGAATC

β-actina: F, GGGAAATCGTGCGTGACATTAAG; R, TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG

7. Western blot

Las células o tejidos fueron lisados usando un tampón RIPA suplementado con inhibidores de proteasa. Las concentraciones de proteínas se determinaron mediante un ensayo de Bradford. Cantidades iguales de proteína (20 μg) se separaron con SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de polivinilideneno fluoruro (PVDF) o nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon con leche desnatada al 5% durante 1 hora a temperatura ambiente y se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra TRAP, NFATc1, c-FOS, Rab27A, YTHDC1, IGF2BP2 o β-actina. Tras el lavado, las membranas se incubaron con los anticuerpos secundarios adecuados durante 1 hora a temperatura ambiente. Las bandas proteicas se visualizaron utilizando procedimientos estándar de detección. Se realizaron tres réplicas biológicas independientes.

8. Cultivo celular

Los macrófagos derivados de la médula ósea (BMM) fueron aislados como se describióanteriormente: 39. Las células de médula ósea extraídas de fémures de ratón se cultivaron durante la noche en un medio esencial α mínimo suplementado con suero bovino fetal al 10%, 30 ng/mL de factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) y 1% penicilina/estreptomicina a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía un 5% de CO₂. Se recogieron y cultivaron células no adherentes en un sistema libre de células estromales que contenía 30 ng/mL DE M-CSF. Tras 3 días, las células adherentes se extrajeron como BMMs y se cultivaron posteriormente en presencia de 30 ng/mL de m-csf y un activador receptor de 50 ng/mL del ligando del factor nuclear κB (RANKL) durante 72 horas para inducir la diferenciación de osteoclastos.

9. Interferencia de ARN (ARNi)

Pequeños ARN interferentes (siRNAs) se sintetizaban y transfectaban utilizando un reactivo de transfección a base de lípidos según las instrucciones del fabricante. Las células se sembraron a una densidad de 2 × 104 células por pozo en placas de seis pozos antes de la transfección. Se realizaron tres réplicas biológicas independientes.

Las secuencias de objetivos fueron las siguientes:

si-Rab27A: GGACUUAAUCAUCTAAGAGAAUGGAA

si-YTHDC1: GCAAGGAGUGUUAUCUUAATT

si-IGF2BP2: CCGUUAACCAACAAGCCAATT

10. Inmunofluorescencia

Las células se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 20 minutos y permeabilizaron con 0,1% de Triton X-100 durante 10 minutos. Tras el bloqueo con albúmina sérica bovina al 5% durante 30 minutos, las células se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C.

Tras el lavado, se aplicaron anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los núcleos se contrateñieron con DAPI y se obtuvieron imágenes mediante microscopía confocal. Se realizaron tres réplicas biológicas independientes.

11. Separación nuclear y citoplasmática

Las fracciones nucleares y citoplasmáticas se aislaron según las instrucciones del fabricante. Las células se lisaron sobre hielo durante 10 minutos y centrifugaron a 500 × g durante 3 minutos a 4 °C. Se recogía el sobrenadante que contenía componentes citoplasmáticos, mientras que el pellet que contenía los núcleos se lavaba y procesaba por separado.

12. Inmunoprecipitación de proteínas de unión al ARN (RIP)

Los ensayos de inmunoprecipitación de ARN (RIP) se realizaron según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las celdas se lizaron sobre hielo durante 30 minutos. Tras la centrifugación, los sobrenadantes se incubaban durante la noche con anticuerpos y perlas de agarosa de proteína A/G. Tras el lavado, las proteínas inmunoprecipitadas se analizaron mediante western blot y el ARN co-inmunoprecipitado se analizó mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se realizaron tres réplicas biológicas independientes.

13. Ensayo de estabilidad de ARNm Rab27A

El ARN total se extrajo en los momentos indicados tras IGF2BP2 knockdown. Posteriormente se realizaron transcripciones inversas y PCR cuantitativa en tiempo real. Los niveles de ARNm de Rab27A se normalizaron al grupo si-NC correspondiente a las 0 horas. Se realizaron tres réplicas biológicas independientes.

14. Análisis estadístico

Todos los experimentos se realizaron de forma independiente utilizando al menos tres réplicas biológicas. Para q-PCR, interferencia de ARN, tinción TRAP, western blot y otros ensayos celulares, cada réplica biológica incluía tres réplicas técnicas salvo que se especifique lo contrario. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar (DS).

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism versión 9.0 y el software SPSS. Se realizaron comparaciones entre dos grupos utilizando una prueba t de Student de dos colas. Las comparaciones entre varios grupos se analizaron mediante análisis bidireccional de la varianza (ANOVA), seguido de la prueba de comparación múltiple post hoc de Tukey para ajustar las comparaciones múltiples. Un valor P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados

La reducción de Rab27A redujo la osteoporosis in vivo.

Para investigar el papel de Rab27A en la osteoporosis, se realizó un knockdown de Rab27A en un modelo murino ovariotectomizado (OVX) establecido utilizando métodos previamentereportados 34,40. El diseño general del estudio se resume en la Figura 1. El análisis de tomografía microcomputarizada demostró que la densidad mineral ósea, la fracción volumétrica ósea (BV/TV), el grosor trabecular (Tb.Th) y el número trabecular (Tb.N) se redujeron significativamente en ratones OVX en comparación con controles Sham (Figura 2A). Estos hallazgos confirmaron el establecimiento exitoso del modelo de osteoporosis. El knockdown de Rab27A restauró significativamente todos los parámetros estructurales óseos medidos, indicando la atenuación de la pérdida ósea inducida por OVX y el deterioro microarquitectónico (Figura 2A).

El examen histológico respaldó aún más estos hallazgos. La tinción de hematoxilina y eosina reveló una marcada pérdida ósea trabecular y una alteración de la arquitectura trabecular en ratones OVX en comparación con el grupo de Sham (Figura 2B). En cambio, el agotamiento de Rab27A alivió el deterioro trabecular y restauró parcialmente la morfología ósea (Figura 2B). Dado que Rab27A ha sido implicado en la diferenciaciónosteoclasta 28, la actividad osteoclasta fue evaluada mediante tinción de fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP). La actividad de TRAP fue notablemente elevada en ratones OVX en comparación con los controles Sham y se redujo significativamente tras el knockdown de Rab27A (Figura 2C).

Posteriormente se examinó la expresión de marcadores asociados al osteoclasto. El análisis de Western blot demostró que los niveles de proteínas Rab27A, TRAP, NFATc1 y c-FOS aumentaron significativamente en ratones OVX y se redujeron tras el agotamiento de Rab27A (Figura 2D). Se obtuvieron resultados consistentes a nivel transcripcional, con PCR cuantitativa en tiempo real (q-PCR) que demostró patrones de expresión similares para la expresión de ARNm Rab27A, TRAP, NFATc1 y c-FOS (Figura 2E).

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Figura 1: Visión esquemática del diseño experimental y del mecanismo regulatorio propuesto subyacente a la regulación mediada por YTHDC1 y IGF2BP2 de Rab27A modificado por m6A durante la diferenciación de osteoclastos y la progresión de la osteoporosis. Se utilizaron un modelo murino ovariectomatizado (OVX) y un activador receptor del modelo de diferenciación osteoclasta inducido por el factor nuclear κB (RANKL) y el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) para investigar el papel de Rab27A en la osteoclastogénesis. Se realizaron ensayos de knockdown de Rab27A, fraccionamiento nuclear y citoplasmático, e inmunoprecipitación de ARN para evaluar marcadores de diferenciación de osteoclastos (TRAP, NFATc1 y c-FOS), expresión de Rab27A y localización subcelular. YTHDC1 facilitó la exportación citoplasmática de Rab27A modificado por m6A, mientras que IGF2BP2 estabilizó Rab27A en el citoplasma. En conjunto, estos mecanismos reguladores coordinados promovieron la diferenciación de osteoclastos y contribuyeron a la pérdida ósea en el modelo OVX. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 2: La reducción de Rab27A redujo la osteoporosis in vivo. (A) Análisis morfométrico del hueso trabecular. Se cuantificaron la densidad mineral ósea, la fracción volumétrica ósea (BV/TV), el grosor trabecular (Tb.Th) y el número trabecular (Tb.N). **P < 0,01, ***P < 0,001. (B) Evaluación histológica del hueso trabecular femoral tras el agotamiento de Rab27A. Se realizó tinción por hematoxilina y eosina (HE) para evaluar los cambios estructurales en el fémur distal. Los grupos OVX y OVX + sh-NC servían como controles. Barra de escala = 50 μm. ***P < 0,001. (C) Tinción por trapo en las secciones femorales. Se evaluó la actividad de TRAP para valorar la actividad osteoclasta. Los grupos OVX y OVX + sh-NC servían como controles. Barra de escala = 50 μm. ***P < 0,001. (D–E) Expresión de Rab27A, TRAP, NFATc1 y c-FOS tras el agotamiento de Rab27A. La expresión proteica se determinó mediante western blot (D), y la expresión de ARNm por q-PCR (E). β-actina servía como control de carga. **P < 0,01, ***P < 0,001. El grupo de Sham fue sometido a exposición quirúrgica de los ovarios sin ovariotomía, mientras que el grupo de OVX se sometió a una ovariotomía bilateral. sh-NC, control negativo de ARN de horquilla corto. Se incluyeron seis ratones en cada grupo experimental. Los datos se presentan como media ± SD. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Eliminación de la diferenciación osteoclasta suprimida por Rab27A de BMM inducida por M-CSF y RANKL

Para evaluar más a fondo el papel de Rab27A durante la osteoclastogénesis, se estimularon macrófagos derivados de la médula ósea (BMM) con el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) y el activador receptor del ligando del factor nuclear κB (RANKL) para inducir la diferenciaciónosteoclasta 28.

Los análisis cuantitativos en tiempo real por PCR y western blot demostraron que la estimulación de M-CSF y RANKL aumentó significativamente la expresión de ARNm y proteínas de Rab27A, mientras que la transfección con si-Rab27A redujo efectivamente la expresión de Rab27A (Figuras 3A, B). La tinción TRAP demostró un aumento notable en la actividad osteoclasta tras el tratamiento con M-CSF y RANKL. El knockdown de Rab27A redujo significativamente la actividad de TRAP en comparación con el grupo inducido (Figura 3C).

Posteriormente se examinó la expresión de marcadores de diferenciación osteoclasto. El análisis cuantitativo de PCR en tiempo real demostró que los niveles de ARNm de TRAP, NFATc1 y c-FOS aumentaron significativamente tras la inducción de osteoclastos y se redujeron por el agotamiento de Rab27A (Figura 3D). Se observaron resultados similares a nivel de proteína por el western blot (Figura 3E).

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Figura 3: Eliminación de la diferenciación osteoclasta suprimida por Rab27A de macrófagos derivados de la médula ósea (BMM) inducida por M-CSF y RANKL. (A–B) Expresión de Rab27A tras la inducción del osteoclasto. Los niveles de ARNm (A) y proteína (B) de Rab27A se determinaron por q-PCR y western bloting, respectivamente. β-actina servía como control de carga. P < 0,001. (C) Tinción por TRAP en osteoclastos derivados de BMM. El aumento de la actividad TRAP inducida por M-CSF y RANKL fue suprimido tras el derribo de Rab27A. Barra de escala = 50 μm. ***P < 0,001. (D–E) Expresión de marcadores de diferenciación osteoclasto tras la disminución de Rab27A. Los niveles de ARNm de TRAP, NFATc1 y c-FOS se determinaron mediante q-PCR (D), y los niveles de proteínas por western blot (E). β-actina servía como control de carga. **P < 0,01, ***P < 0,001. Control de células sin tratar; si-NC, siRNA de control negativo. Se realizaron tres réplicas biológicas independientes. Los datos se presentan como media ± SD. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

La exportación citoplasmática de Rab27A modificado por m6A fue facilitada por YTHDC1

Para investigar la posible implicación de la modificación de m6A en la regulación de Rab27A, se realizaron análisis bioinformáticos. Se identificaron múltiples sitios de modificación de m6A predichos dentro del transcrito Rab27A (Figura 4A). Además, el análisis de predicción de interacción sugirió posibles asociaciones entre Rab27A y las proteínas lectoras de m6A YTHDC1 y IGF2BP2 (Figura 4B).

Para validar la interacción entre el ARNm YTHDC1 y Rab27A, se realizaron ensayos de inmunoprecipitación de ARN (RIP). El ARNm de Rab27A se enriqueció significativamente en complejos inmunoprecipitados con anticuerpo anti-YTHDC1 en comparación con el control de inmunoglobulina G (IgG) (Figura 4C).

Dado que YTHDC1 funciona como un lector nuclear de m6A implicado en la exportación deARN 41, se realizaron ensayos de fraccionamiento nuclear y citoplasmático. El knockdown de YTHDC1 aumentó significativamente la retención nuclear del ARNm Rab27A mientras reducía su abundancia citoplasmática (Figura 4D).

Se evaluó más a fondo el efecto de YTHDC1 sobre la expresión de Rab27A. El análisis cuantitativo de PCR en tiempo real demostró que el agotamiento de YTHDC1 redujo la expresión de ARNm de Rab27A (Figura 4E). De forma consistente, el análisis western blot mostró una disminución en la expresión de la proteína Rab27A tras el knockdown de YTHDC1 (Figura 4F).

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Figura 4: La exportación citoplasmática de Rab27A modificado por m6A fue facilitada por YTHDC1. (A) Sitios de modificación de m6A predicho dentro de Rab27A identificados usando la herramienta de predicción SRAMP. (B) Interacciones predichas entre Rab27A y las proteínas lectoras de m6A YTHDC1 y IGF2BP2 identificadas usando StarBase. (C) Ensayo de inmunoprecipitación de ARN (RIP) que demuestra la interacción entre YTHDC1 y el ARNm Rab27A. **P < 0,01. IgG actuaba como control negativo. El enriquecimiento Rab27A se normalizó al porcentaje de entrada. La banda de inmunoblot YTHDC1 refleja la eficiencia de inmunoprecipitación. (D) Análisis de fraccionamiento nuclear y citoplasmático que demuestra un aumento de la retención nuclear de Rab27A tras el knockdown de YTHDC1. **P < 0,01, ***P < 0,001. (E–F) Expresión de YTHDC1 y Rab27A tras el knockdown de YTHDC1. La expresión de ARNm se determinó mediante q-PCR (E), y la expresión proteica por western blot (F). β-actina servía como control de carga. **P < 0,01. si-NC, siRNA de control negativo. Se realizaron tres réplicas biológicas independientes. Los datos se presentan como media ± SD. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Estabilización de Rab27A mediante interacción con IGF2BP2

La interacción entre IGF2BP2 y Rab27A fue investigada mediante ensayos RIP. El ARNm de Rab27A se enriqueció significativamente en complejos inmunoprecipitados con anticuerpos anti-IGF2BP2 en comparación con el control de IgG, lo que indica una asociación entre ARNm IGF2BP2 y Rab27A (Figura 5A).

El análisis de inmunofluorescencia demostró la colocalización de IGF2BP2 y Rab27A predominantemente dentro del citoplasma (Figura 5B). Para determinar el efecto funcional de IGF2BP2 sobre la expresión de Rab27A, IGF2BP2 fue silenciado usando siRNA. El análisis cuantitativo de PCR en tiempo real reveló una reducción significativa en los niveles de ARNm de Rab27A tras IGF2BP2 agotamiento (Figura 5C). En consonancia con estos hallazgos, el análisis western blot mostró una disminución en la expresión de la proteína Rab27A tras IGF2BP2 knockdown (Figura 5D).

Posteriormente se evaluó el efecto de IGF2BP2 sobre la estabilidad del ARNm de Rab27A. IGF2BP2 agotamiento acortó significativamente la vida media del ARNm Rab27A y redujo la estabilidad del transcrito (Figura 5E).

figure-results-5
Figura 5: Estabilización de Rab27A mediante interacción con IGF2BP2. (A) Ensayo de inmunoprecipitación de ARN que demuestra la asociación entre IGF2BP2 y el ARNm Rab27A. IgG actuaba como control negativo. El enriquecimiento Rab27A se normalizó al porcentaje de entrada. P < 0,001. (B) Análisis de inmunofluorescencia que demuestra la colocalización de Rab27A y IGF2BP2 en el citoplasma. Los núcleos se contra-tinturaron con DAPI. Barra de escala = 20 μm. (C–D) Regulación a la baja de Rab27A tras IGF2BP2 agotamiento. Los niveles de ARNm de Rab27A se determinaron mediante q-PCR (C), y los niveles de proteínas por western blot (D). β-actina servía como control de carga. **P < 0,01, ***P < 0,001. (E) Estabilidad del ARNm Rab27A tras IGF2BP2 caída. Los niveles de ARNm de Rab27A se normalizaron al grupo si-NC correspondiente a 0 h. **P < 0,01. si-NC, siRNA de control negativo. Se realizaron tres réplicas biológicas independientes. Los datos se presentan como media ± SD. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

El silenciamiento de YTHDC1 o IGF2BP2 la diferenciación osteoclasta suprimida de BMMs inducida por M-CSF y RANKL

Para investigar más a fondo la relación funcional entre YTHDC1, IGF2BP2 y Rab27A durante la diferenciación osteoclasta, se realizaron experimentos de knockdown en BMM.

La estimulación de M-CSF y RANKL aumentó significativamente la expresión de ARNm de Rab27A, YTHDC1 y IGF2BP2 (Figura 6A). Correspondientemente, la expresión proteica de estas moléculas también se elevó tras la inducción de osteoclastos (Figura 6B). Silenciar tanto YTHDC1 como IGF2BP2 redujo significativamente la expresión de Rab27A, mientras que el knockdown de un regulador no afectó sustancialmente la expresión del otro.

La tinción TRAP demostró que la disminución de YTHDC1 o IGF2BP2 suprimió significativamente la actividad osteoclasta inducida por M-CSF y RANKL (Figura 6C). Además, el análisis cuantitativo por PCR en tiempo real reveló una reducción en la expresión de TRAP, NFATc1 y c-FOS tras YTHDC1 o IGF2BP2 knockdown (Figura 6D). El análisis de Western blot confirmó reducciones correspondientes a nivel de proteína (Figura 6E).

En conjunto, estos hallazgos indican que YTHDC1 y IGF2BP2 promover la diferenciación osteoclasta mediante la regulación de la expresión de Rab27A.

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Figura 6: Silenamiento de YTHDC1 o IGF2BP2 diferenciación osteoclasta suprimida de BMMs inducida por M-CSF y RANKL. (A–B) Expresión de Rab27A tras YTHDC1 o IGF2BP2 caída. Los niveles de ARNm (A) y proteína (B) de Rab27A se determinaron por q-PCR y western bloting, respectivamente. β-actina servía como control de carga. P < 0,001. (C) Tinción por TRAP que demuestra la supresión de la actividad osteoclasta tras YTHDC1 o IGF2BP2 agotamiento. Barra de la escala = 50 μm. **P < 0,01, ***P < 0,001. (D–E) Expresión de marcadores de diferenciación osteoclasta tras YTHDC1 o IGF2BP2 agotamiento. Los niveles de ARNm de TRAP, NFATc1 y c-FOS se determinaron mediante q-PCR (D), y los niveles de proteínas por western blot (E). β-actina servía como control de carga. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Control de células sin tratar; si-NC, siRNA de control negativo. Se realizaron tres réplicas biológicas independientes. Los datos se presentan como media ± SD. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

DISPONIBILIDAD DE DATOS:

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual (incluyendo datos de western blot, conjuntos de datos de imagen, análisis cuantitativos y archivos fuente) durante este estudio se han proporcionado en el Archivo Suplementario 1.

Archivo suplementario 1: Los conjuntos de datos y datos en bruto de este estudio. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

La diferenciación osteoclasta desempeña un papel esencial en la remodelación ósea, la reabsorción ósea, la reparación de fracturas y la homeostasisesquelética 12˒15˒17˒18˒42˒43. La actividad excesiva de osteoclastos es un factor importante en la osteoporosis, lo que convierte en la identificación de vías reguladoras que controlan la diferenciación osteoclasta en un objetivo de investigación importante. Varias terapias anti-resorptivas dirigidas a la función osteoclasta han demostrado eficacia clínica 6,44,45. Por ejemplo, el denosumab se ha asociado con una reducción de la incidencia de fracturas y un perfil de seguridad favorable6, mientras que el inhibidor de catepsina K ONO-5334 ha mostrado efectos beneficiosos sobre la densidad mineral ósea y la resistencia ósea en primates no humanos ovarionectomizados44. El presente estudio identificó un mecanismo regulador dependiente de m6A previamente no reconocido que involucra a YTHDC1, Rab27A y IGF2BP2 que promueve la diferenciación osteoclasta y la progresión de la osteoporosis. Estos hallazgos aportan nuevas perspectivas sobre la regulación molecular de la osteoclastogénesis y sugieren posibles objetivos terapéuticos para la osteoporosis.

Rab27A ha sido implicado anteriormente en la diferenciación osteoclasta y la reabsorción ósea mediante la regulación del tráfico vesicular y la señalización intracelular, y también puede influir en las cascadas de señalización inducidas por RANKL mediante el reciclaje endosomal de receptoresclave 28,29. En consonancia con estos informes, la expresión de Rab27A aumentó notablemente durante la diferenciación de osteoclastos, mientras que el agotamiento de Rab27A suprimió la diferenciación osteoclasta in vitro y alivió la pérdida ósea asociada a la osteoporosis in vivo. Estos hallazgos respaldan un papel fundamental de Rab27A en la biología osteoclasta y amplían aún más observaciones previas al demostrar que la actividad de Rab27A está regulada mediante mecanismos dependientes de m6A. En conjunto, los hallazgos sugieren que Rab27A modificado por m6A puede regular estos procesos a nivel post-transcripcional y, en consecuencia, influir en la actividad resortiva ósea.

La evidencia acumulada indica que la modificación de m6A contribuye al desarrollo y progresión de enfermedades relacionadas con loshuesos. Los análisis bioinformáticos identificaron múltiples sitios de modificación de m6A potenciales dentro del ARNm de Rab27A (Figura 4A), y estudios funcionales demostraron que YTHDC1 y IGF2BP2 regulan la expresión de Rab27A y la diferenciación de osteoclastos (Figuras 4–6). Estos hallazgos sugieren que la modificación de m6A es un importante mecanismo regulador aguas arriba que controla la función de Rab27A durante la osteoclastogénesis. Dado que se identificaron múltiples sitios m6A predichos dentro de Rab27A, futuros estudios deberían determinar si se requieren sitios individuales o combinaciones de sitios para la regulación de Rab27A. La construcción de mutantes deficientes en M6A en Rab27A y los experimentos de rescate posteriores proporcionarían evidencia directa de la importancia funcional de la modificación de m6A en esta vía.

Mecánicamente, el presente estudio demostró que YTHDC1 interactúa con el ARNm de Rab27A y facilita su exportación nuclear. Tras la translocación citoplasmática, IGF2BP2 se asocia directamente con el ARNm Rab27A y mejora la estabilidad del transcrito. En consecuencia, la disminución de YTHDC1 o IGF2BP2 redujo la expresión de Rab27A y suprimió la diferenciación de osteoclastos. Estos hallazgos apoyan un modelo en el que YTHDC1 y IGF2BP2 cooperan para mantener la expresión de Rab27A coordinando el transporte y la estabilidad del ARNm. Este mecanismo regulador amplía la comprensión actual de la regulación mediada por m6A de la diferenciación osteoclasta e identifica múltiples componentes de esta vía como posibles objetivos terapéuticos.

Deben reconocerse varias limitaciones. En primer lugar, aunque se ha demostrado que Rab27A regula la diferenciación de los osteoclastos, no se han investigado sus posibles efectos sobre la función de los osteoblastos. Dado que la homeostasis ósea depende del equilibrio entre la reabsorción ósea mediada por osteoclastos y la formación ósea mediada por osteoblastos, los estudios futuros deberían evaluar si Rab27A también influye en la diferenciación o actividad de los osteoblastos. En segundo lugar, el presente estudio se basó principalmente en enfoques de pérdida de función. La sobreexpresión complementaria de Rab27A, YTHDC1 y IGF2BP2, junto con experimentos de rescate utilizando mutantes de Rab27A deficientes en m6A, fortalecería aún más el modelo regulatorio propuesto. En tercer lugar, aunque varios sitios m6A presuntos dentro del ARNm de Rab27A se predijeron mediante enfoques bioinformáticos, los sitios específicos responsables de regular la función de Rab27A siguen sin identificarse y requieren validación experimental. Finalmente, se necesitan estudios adicionales para determinar si otras proteínas lectoras de m6A, proteínas que se unen al ARN o vías de señalización participan en la regulación de Rab27A durante la diferenciación de osteoclastos.

La regulación inmune ha surgido como un componente importante de la patogénesis de laosteoporosis 46,47. Rab27A ha establecido funciones en la secreción de células inmunitarias, liberación de gránulos citotóxicos, desgranulación de neutrófilos y regulación del microambientetisular 48,49,50,51,52,53,54,55. Una investigación más profunda de la relación entre Rab27A, la regulación inmunitaria y la homeostasis ósea podría aportar información adicional sobre la patogénesis de la osteoporosis.

Las futuras investigaciones deberían priorizar varias áreas clave. En primer lugar, se requiere mutagénesis sistemática de los sitios m6A predichos dentro de Rab27A para identificar los sitios funcionales de unión implicados en la regulación mediada por YTHDC1 y IGF2BP2. En segundo lugar, la sobreexpresión de Rab27A, YTHDC1 y IGF2BP2, junto con experimentos de rescate utilizando mutantes Rab27A deficientes en m6A, será esencial para establecer la contribución directa del eje regulador YTHDC1/Rab27A/IGF2BP2. En tercer lugar, la validación de esta vía en modelos adicionales de osteoporosis y la evaluación de la función de Rab27A en osteoblastos serán importantes para respaldar aún más los hallazgos actuales.

En conclusión, el presente estudio identificó un nuevo eje regulador YTHDC1/Rab27A/IGF2BP2 que promueve la diferenciación osteoclasta y la progresión de la osteoporosis. YTHDC1 facilitó la exportación nuclear de ARNm de Rab27A modificado con m6A, mientras que IGF2BP2 mejoró la estabilidad del ARNm de Rab27A en el citoplasma. Estos eventos regulatorios coordinados aumentaron la expresión de Rab27A y promovieron la osteoclastogénesis. En conjunto, los hallazgos amplían la comprensión actual de la regulación mediada por m6A en la osteoporosis y proporcionan una base para desarrollar estrategias terapéuticas dirigidas a la vía YTHDC1/Rab27A/IGF2BP2.

Divulgaciones

Los autores declaran que no existen intereses financieros en competencia ni conflictos de interés.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por el Proyecto de Cooperación Estratégica Científica y Tecnológica entre el Hospital Popular de Pengzhou y la Universidad Médica del Suroeste (Beca nº 2023PZXNYD01) a Lian Tang.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
4% ParaformaldehydeThermo Fisher ScientificA5818101Tissue and cell fixation
Alexa Fluor 488 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-11001Fluorescent secondary antibody for immunofluorescence; RRID: AB_2534069
Alexa Fluor 546 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-11035Fluorescent secondary antibody for immunofluorescence; RRID: AB_2534093
Bovine serum albumin (BSA)MerckA2153Blocking reagent
Bradford Protein AssayMerckB6916Protein quantification
C57BL/6JSlac miceShanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd.—Female, 8 weeks old; RRID: MGI:2159769
c-FOS antibodyAbcamab222699Primary antibody for western blotting; RRID: AB_2891049
Confocal laser scanning microscope (SP8)Leica MicrosystemsSP8Immunofluorescence image acquisition; RRID: SCR_018169
DAPIThermo Fisher ScientificD3571Nuclear counterstain for immunofluorescence; RRID: AB_2307445
EDTAMerckV900081-500GTissue decalcification reagent
EosinSolarbioG1100Histological cytoplasmic stain
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher ScientificA5669701Cell culture supplement
GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersion 9.0Statistical analysis software; RRID: SCR_002798
HematoxylinCell Signaling Technology#14166Histological nuclear stain
IBM SPSS StatisticsIBMWindows versionStatistical analysis software; RRID: SCR_016479
IGF2BP2 antibodyProteintech11601-1-APPrimary antibody for western blotting and immunofluorescence; RRID: AB_2122672
Inverted light microscope (DMi8)Leica MicrosystemsDMi8Histological image acquisition; RRID: SCR_026672
Lentiviral titer quantification kitTakara Bio631235Lentiviral titer determination
Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000015Plasmid transfection reagent
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778150siRNA transfection reagent
M-CSFMedChemExpressHY-P7085Osteoclast differentiation factor
Micro-computed tomography systemScanco MedicalVivaCT80Bone morphometric analysis
M-MLV Reverse TranscriptasePromegaM1701cDNA synthesis
NFATc1 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-7294Primary antibody for western blotting; RRID: AB_2152503
PARIS KitThermo Fisher ScientificAM1556Nuclear and cytoplasmic fractionation
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122Antibiotic supplement for cell culture
Power SYBR Green Master MixThermo Fisher Scientific4367659Quantitative real-time PCR
Protease inhibitor cocktailThermo Fisher Scientific78429Prevention of protein degradation
Protein A/G agarose beadsMerckIP05Immunoprecipitation
PVDF membraneThermo Fisher Scientific88520Protein transfer membrane for western blotting
Rab27A antibodyAbcamab55667Primary antibody for western blotting and immunofluorescence; RRID: AB_945112
RANKLMedChemExpressHY-P7425Osteoclast differentiation factor
Real-time PCR systemApplied BiosystemsABI7900HTQuantitative real-time PCR instrument
RIPA bufferThermo Fisher Scientific78501Protein extraction buffer
RNA Immunoprecipitation (RIP) KitMilliporeRIP-12RXNRNA immunoprecipitation assay
SDS-PAGE reagentsThermo Fisher ScientificBT041210BOXProtein electrophoresis
shRNA plasmidsRiboBio—Gene silencing by RNA interference
Small interfering RNAs (siRNAs)GenePharma—Gene silencing by RNA interference
SRAMPOnline resource—Prediction of m6A modification sites; RRID: SCR_024500
StarBase (ENCORI)Online resource—RNA interaction prediction database; RRID: SCR_016303
TRAP antibodyAbcamab2391Primary antibody for western blotting; RRID: AB_303034
TRAP staining kitMerck387ADetection of osteoclast activity
Triton X-100Thermo Fisher Scientific85111Cell permeabilization reagent
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific15596026CNTotal RNA isolation
YTHDC1 antibodyAbcamab122340Primary antibody for western blotting; RRID: AB_11128253
α-MEMFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation139-15651Cell culture medium
β-Actin antibodyMerckA5441Loading control for western blotting; RRID: AB_476744

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