Generación de células madre pluripotentes inducidas humanas aneuploides a partir de células primarias de líquido amniótico mediante Electroporación de plásmidos episomales

Zifan Song; Jing Wang; Peng Yuan; Xiaohui Zhu; Liying Yan; Jianying Guo

doi:10.3791/71975

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Generación de células madre pluripotentes inducidas humanas aneuploides a partir de células primarias de líquido amniótico mediante Electroporación de plásmidos episomales

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DOI:

10.3791/71975

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3 de septiembre de 2026

Zifan Song¹^,²^,³^,⁴ , Jing Wang¹^,²^,³^,⁴ , Peng Yuan¹^,²^,³^,⁴ , Xiaohui Zhu¹^,²^,³^,⁴ , Liying Yan¹^,²^,³^,⁴ , Jianying Guo¹^,²^,³^,⁴

¹State Key Laboratory of Female Fertility Promotion, Center for Reproductive Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology, Peking University Third Hospital, ²National Clinical Research Center for Obstetrics and Gynecology, Peking University Third Hospital, ³Key Laboratory of Assisted Reproduction (Peking University), Ministry of Education, ⁴Beijing Key Laboratory of Collaborative Innovation in Frontier Technologies for Population Quality

En este artículo

Resumen

Este protocolo proporciona un método reproducible para generar iPSC humanas aneuploides libres de integración a partir de células primarias de líquido amniótico mediante electrotransferencia de plásmidos episomales. Optimiza las condiciones de entrega y cultivo para estabilizar las anomalías cromosómicas, ofreciendo una plataforma práctica para crear modelos específicos de enfermedades para investigaciones posteriores y aplicaciones clínicas.

Resumen

La generación de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) específicas del paciente a partir de células del líquido amniótico (AFC) que portan aneuploidías cromosómicas definidas proporciona una plataforma poderosa para modelar trastornos genéticos. Sin embargo, establecer una metodología de reprogramación confiable y reproducible para AFC aneuploides sigue siendo técnicamente desafiante debido a la inestabilidad genómica intrínseca y a la capacidad proliferativa variable de estas células. Aquí presentamos un método completo y no integrador para generar iPSC humanas aneuploides a partir de AFC primarias mediante electroforesis con plásmidos episomales. Este protocolo detalla todo el flujo de trabajo, que comprende el descongelamiento y expansión celular con una estrategia gradual de adaptación al medio, y la entrega optimizada de plásmidos vía sistema de electrotransferencia, cultivo post-electrotransferencia secuencial con cambios de medio dirigidos a la transición mesenquimal a epitelial (MET) y selección mecánica de colonias basada en criterios morfológicos definidos. Asimismo, describimos procedimientos de validación, incluyendo tinción de inmunofluorescencia para marcadores centrales de pluripotencia, análisis del cariotipo por bandeo G para confirmar el mantenimiento del cariotipo aneuploide y verificación mediante PCR de la eliminación de vectores episomales. Este protocolo libre de células alimentadoras y libre de integración genera líneas de iPSC aneuploides adecuadas para la modelización de enfermedades, cribado de fármacos y estudios de biología cromosómica.

Introducción

El advenimiento de la tecnología de células madre pluripotentes inducidas ha transformado la medicina regenerativa, la modelización de enfermedades y el descubrimiento de fármacos, al permitir la generación de células pluripotentes específicas del paciente sin las preocupaciones éticas asociadas con las células madre embrionarias humanas (hESCs). La base conceptual de la reprogramación celular se originó en la demostración de Gurdon sobre la transferencia nuclear de células somáticas¹, seguida del establecimiento de las células madre embrionarias²^,³^,⁴ y, finalmente, del desarrollo de la pluripotencia inducida⁵mediante la expresión ectópica de OCT4, SOX2, KLF4 y c-MYC. Desde entonces, la tecnología de iPSC se ha convertido en una plataforma indispensable para investigar el desarrollo humano, los trastornos genéticos y la medicina de precisión. Los primeros métodos de reprogramación utilizaron vectores retrovirales o lentivirales, pero sus riesgos relacionados con la integración limitaron su aplicación clínica. En consecuencia, el desarrollo de métodos de reprogramación libres de integración se convirtió en una prioridad para la traducción clínica. Estos incluyen el uso del virus Sendai⁶, ARN mensajero sintético⁷, vectores episomales basados en el mecanismo oriP/EBNA1 (antígeno nuclear de Epstein-Barr-1)⁸ y la reprogramación química⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹² utilizando únicamente compuestos de moléculas pequeñas.

La aneuploidía es la causa principal de aborto espontáneo y defectos congénitos en humanos. Comprender los mecanismos celulares y moleculares subyacentes a las anomalías del desarrollo relacionadas con la aneuploidía requiere modelos celulares adecuados que recapitulen fielmente el fondo genético de estas afecciones. Las células del líquido amniótico (AFC) representan un material inicial atractivo y eficiente para la generación de iPSC específicas del paciente¹³^,¹⁴^,¹⁵, particularmente en el contexto de trastornos genéticos diagnosticados prenatalmente¹⁶^,¹⁷. El líquido amniótico residual obtenido durante la amniocentesis de rutina permite acceder a células de origen fetal sin necesidad de realizar una biopsia tisular invasiva adicional tras el nacimiento. En comparación con las células somáticas adultas, las AFC generalmente exhiben una mayor capacidad proliferativa, telómeros más largos, menor carga acumulativa de mutaciones ambientales y mayor plasticidad del desarrollo, todos los cuales facilitan la reprogramación celular¹⁸^,¹⁹. Es importante destacar que las AFC preservan fielmente la constitución cromosómica del feto en desarrollo, lo que las convierte en una fuente ideal para establecer modelos de iPSC específicos de enfermedades para anormalidades cromosómicas, incluyendo la trisomía 21²⁰, la trisomía 18²¹, el síndrome de Turner y el síndrome de Klinefelter²².

Este protocolo proporciona una guía completa para generar iPSCs libres de integración a partir de células de líquido amniótico aneuploides utilizando vectores episomales. El método incluye procedimientos detallados para el aislamiento celular, reprogramación, selección de clones y caracterización. En comparación con otros métodos de reprogramación libres de integración, el sistema de plásmidos episomales ofrece un equilibrio práctico entre seguridad genómica, simplicidad técnica y rentabilidad, lo que lo hace particularmente adecuado para uso rutinario en laboratorio y aplicaciones de biobanco a gran escala. El protocolo es aplicable tanto a AFCs criopreservadas procedentes de biobancos establecidos como a muestras frescas residuales de líquido amniótico obtenidas durante el diagnóstico prenatal de rutina. Aunque se han reportado eficiencias de reprogramación episomal relativamente bajas para las AFCs, y puede ocurrir una recuperación cromosómica espontánea durante la reprogramación o el cultivo prolongado, especialmente en ciertas aneuploidías, el flujo de trabajo es fácilmente aplicable al establecimiento de biobancos de iPSCs específicos de enfermedad, estudios de biología cromosómica y desarrollo humano temprano, y diferenciación posterior en tipos celulares específicos de linaje. Este enfoque es particularmente adecuado para generar líneas de iPSCs libres de integración y clínicamente relevantes a partir de muestras prenatales, para modelado de enfermedades y estudios mecanicistas de anomalías cromosómicas.

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Protocolo

Todos los procedimientos que involucraron muestras de líquido amniótico humano se realizaron de acuerdo con la Declaración de Helsinki y fueron aprobados por el Comité Institucional de Revisión (IRB)/Comité de Ética en Investigación Humana del Hospital Tercero de la Universidad de Pekín (Protocolo N.º M2023406). Las muestras aneuploides se obtuvieron del Biobanco del Centro de Medicina Reproductiva del Hospital Tercero de la Universidad de Pekín, un repositorio clínico certificado por el estado especializado en recursos humanos de desarrollo y reproducción. Estos especímenes consisten en líquido amniótico residual originalmente recolectado durante amniocentesis de rutina para diagnóstico prenatal clínico, los cuales de otro modo habrían sido descartados. Se obtuvo consentimiento informado por escrito de todos los donantes antes de la recolección, autorizando explícitamente el almacenamiento de las muestras residuales en el Biobanco y su uso posterior para investigación. Todas las muestras fueron estrictamente anonimizadas para proteger la privacidad del paciente. Se seleccionaron muestras con cariotipos aneuploides confirmados identificados mediante análisis clínico de bandeo G, incluyendo trisomía 21 (síndrome de Down, N = 2), trisomía 18 (síndrome de Edwards, N = 1), monosomía X (síndrome de Turner, N = 1) y síndrome de Klinefelter (N = 2), para la inducción de iPSCs. La información detallada sobre las líneas celulares aneuploides utilizadas en la reprogramación se resume en Tabla 1.

1. Descongelación y cultivo primario de células de líquido amniótico almacenadas en biobanco

NOTA: Esta sección detalla el procedimiento estandarizado para recuperar y aislar AFC aneuploides del Biobanco. Las células cultivadas se amplifican para obtener poblaciones suficientes para la reprogrmación episomal subsiguiente.

Procedimiento estandarizado de descongelación
1. Equilibrio del medio: Caliente el medio AmnioType-1 completo a 37 °C antes de su uso.
2. Recuperación de la muestra: Recupere un criovial que contenga aproximadamente 300.000 CFA criopreservadas en medio de congelación celular desde el almacenamiento en nitrógeno líquido. Transfiera inmediatamente el vial al laboratorio sobre hielo seco para evitar la descongelación prematura.
3. Descongelación rápida: Sumerja la mitad inferior del criovial en un baño de agua a 37 °C y agite suavemente. Detenga el proceso de descongelación cuando solo quede un pequeño cristal de hielo visible.
  NOTA: Evite la descongelación completa. Esto evita que las células se expongan a los efectos tóxicos del DMSO caliente.
4. Dilución: En una cabina de flujo laminar, transfiera la suspensión celular gota a gota a un tubo cónico de 15 mL que contenga 4 mL de medio AmnioType-1 previamente calentado.
5. Centrifugación: Centrifugue la suspensión a 300 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
6. Siembra: Aspire el sobrenadante y resuspenda suavemente el sedimento celular en 2 mL de medio AmnioType-1 fresco. Transfiera las células a una placa de 6 pocillos o un frasco T25 previamente recubierto con gelatina al 0,1 %, a una densidad de 30.000–50.000 células/cm².
7. Incubación inicial: Coloque las células en un incubador humedecido a 37 °C y 5 % de CO₂. Examine los frascos bajo un microscopio invertido de contraste de fases el día 3 después de la siembra para confirmar la adhesión inicial de las células.
Expansión y transición de medio de CFA primarias
1. Preparación del medio de cultivo de fibroblastos (FC): Para preparar 100 mL de medio de cultivo de fibroblastos casero, mezcle 82 mL de DMEM de alta glucosa con 15 mL de suero bovino fetal (FBS). Añada 1 mL de GlutaMAX 100×, 1 mL de ácidos aminoácidos no esenciales (NEAA) 100× y 1 mL de penicilina-estreptomicina (P/S). Filtre el medio a través de un sistema de filtración al vacío de 0,22 µm en un entorno estéril.
2. Durante la expansión, cambie gradualmente el medio de las CFA cada 3 días, pasando del medio clínico especializado (AmnioType-1) a un sistema estandarizado de cultivo de fibroblastos (medio FC, casero), para asegurar la estabilidad metabólica antes de la electroforesis.
  1. Realice una transición gradual del medio:
    1. Día 3 (75 % AmnioType-1: 25 % FC): Aspire el medio AmnioType-1 existente. Añada un medio mixto compuesto por 75 % de AmnioType-1 y 25 % de medio FC.
    2. Día 6 (50 % AmnioType-1: 50 % FC): Aspire y reemplace con una proporción 1:1 de medio AmnioType-1 y medio FC.
    3. Día 9 (25 % AmnioType-1: 75 % FC): Aspire y reemplace con una mezcla de 25 % de AmnioType-1 y 75 % de medio FC.
    4. Día 12 (100 % FC): Aspire y cambie al 100 % de medio FC.
      NOTA: Esta adaptación gradual reduce el choque celular y evita la desprendimiento de clones aneuploides sensibles.
3. Observe diariamente la morfología de las colonias. El líquido amniótico contiene una población heterogénea de células. Mediante microscopía de contraste de fases, identifique los dos tipos principales: tipo F (similar a fibroblastos, con forma alargada) y tipo E (similar a epiteliales, redondeadas). La subpoblación mesenquimatosa con características de fibroblasto es la más adecuada para la reprogramación.
  NOTA: Supervise cuidadosamente las células en busca de signos de senescencia.
Pasaje de CFA primarias
1. Cuando las células alcancen una confluencia del 80 %–90 % (generalmente entre el día 10 y 14), aspire el medio del frasco y lave una vez suavemente con 2 mL de solución salina tamponada con fosfatos de Dulbecco (DPBS) sin Ca²⁺/Mg²⁺.
2. Añada 1 mL de solución de tripsina-EDTA al 0,25 % para un solo pocillo de una placa de 6 pocillos, cubriendo completamente la monocapa celular.
3. Incube a 37 °C durante 4–5 min hasta que las células se desprendan completamente.
4. Neutralice el reactivo de disociación añadiendo 3 mL de medio FC. Transfiera la suspensión a un tubo cónico de 15 mL.
5. Centrifugue a 300 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
6. Aspire el sobrenadante y resuspenda el sedimento celular en 1 mL de medio FC fresco. Cuente las células viables utilizando un hemocitómetro o un contador celular automatizado con exclusión de azul de tripano.
7. Siembre las células en un nuevo frasco T25 a una densidad de 30.000–50.000 células/cm² en medio completo (generalmente en una proporción de 1:2 o 1:3).
8. Expanda las células hasta el pasaje 3–5 antes de utilizarlas para la reprogramación. No utilice células más allá del pasaje 6.
  NOTA: La calidad celular en el momento de la electroforesis es el factor más importante para el éxito de la reprogramación. Utilice únicamente CFA tipo F sanas, en fase logarítmica de crecimiento, sin signos de senescencia ni morfología anormal.

2. Electroforesis de plásmidos episomales en células AFC mediante un sistema de electroforesis celular

Recubrir los recipientes de cultivo con matriz de membrana basal
1. Descongele la matriz de membrana basal (Matrigel) durante la noche a 4 °C en hielo
2. Enfriar DPBS o DMEM/F-12 estéril en hielo. Enfriar previamente en hielo puntas de pipeta y tubos durante 30 min.
3. Diluya la matriz de membrana basal 1:200 en DMEM/F-12 frío usando puntas y tubos fríos (por ejemplo, 30 µL matriz + 6 mL de DMEM/F-12 para una placa de 6 pocillos
4. Mezcle bien pero suavemente, pipeteando hacia arriba y hacia abajo 5-6 veces. Evite introducir burbujas de aire.
5. Añada la solución de recubrimiento diluida a los recipientes de cultivo a razón de 1 mL por pocillo para una placa de 6 pocillos.
6. Incubar los recipientes recubiertos a 37 °C durante al menos 1 h, o a temperatura ambiente durante 2 h.
7. Aspire inmediatamente la solución de recubrimiento antes de sembrar las células. Añada 2 mL de medio FC sin antibiótico más 10 μM Y-27632 (inhibidor de ROCK) y devuelva la placa a un 37 °C incubadora. No permita que la superficie recubierta se seque.
  NOTA: Las placas recubiertas pueden almacenarse a 4 °C sellado con parafilm durante hasta 7 días. Equilibrar a temperatura ambiente antes de usar.
Descongelar y preparar los plásmidos de reprogramación episómica
1. Selección de plásmidos: Utilice los siguientes plásmidos episomales para la reprogramación: pCXLE-hOCT3/4-shp53, pCXLE-hSK, pCXLE-hUL y pCXLE-EBNA1.
  NOTA: (Opcional) Para la optimización de las condiciones de electrotransferencia, se puede electrotransferir pCE-GFP en paralelo bajo condiciones idénticas. La expresión de GFP durante las primeras 48–72 h proporciona un indicador conveniente de la eficiencia de transfección, mientras que la pérdida gradual de la señal de GFP durante los subcultivos posteriores puede utilizarse para monitorear la dilución transitoria del plásmido.
2. Control de calidad (QC): Verifique la concentración y pureza del ADN utilizando un espectrofotómetro. Asegúrese de que la relación A260/280 esté entre 1,8 y 1,9. Asegúrese de que la concentración de cada plásmido sea mayor que 1 µg/µL y estéril.
  NOTA: Es fundamental asegurarse de que todos los plásmidos se preparen utilizando métodos libres de endotoxinas. Las endotoxinas residuales pueden provocar una citotoxicidad elevada y una eficiencia de reprogramación significativamente reducida. Almacene los plásmidos en alícuotas pequeñas a -20 °C para evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación.
3. Para un 100 µL reacción, preparar 5 µg de la mezcla de plásmidos (relación igual de peso de pCXLE-hOCT3/4-shp53, pCXLE-hSK, pCXLE-hUL y pCXLE-EBNA1
Configure los parámetros de electroforesis.
1. Inicialice el dispositivo de electropermeabilización. Configure los parámetros del pulso según la configuración optimizada para células adherentes primarias: voltaje del pulso: 1.200 V; duración del pulso: 20 ms; número de pulsos: 2.
2. Llene la estación de pipetas con 2 mL del tampón E, asegurándose de que el electrodo quede completamente sumergido.
  NOTA: Si los experimentos iniciales arrojan una viabilidad celular inferior al 50 %, considere probar conjuntos alternativos de parámetros: 950 V / 20 ms / 2 pulsos (más suave). Estas alternativas sacrifican algo de eficiencia para mejorar la supervivencia.
Preparar las CFA para la electrotransferencia
1. En el día 0, verifique que las células presenten una morfología sana y alargada bajo el microscopio, sin signos de sobrecrecimiento, senescencia ni contaminación. Asegúrese de que las células hayan alcanzado una confluencia del 90 % y se encuentren en la fase logarítmica activa de crecimiento.
2. Justo antes del procedimiento de electroforesis, aspire el recubrimiento de Matrigel y reemplácelo con 2 mL de medio sin antibióticos, previamente calentado medio FC más 10 μM Y-27632 (inhibidor de ROCK). Precaliente este medio FC sin antibiótico a 37 °C en un incubador durante al menos 20 min antes de recolectar las células para el sistema de electroporación.
  NOTA: NO agregue Penicilina-Estreptomicina (P/S) ni ningún otro antibiótico a este lote específico de medio. Tras la electrotransferencia, la membrana celular permanece transitoriamente permeable y vulnerable. La presencia de antibióticos puede provocar un aumento de la apoptosis.
3. Aspire el medio de las AFC para la electrotransferencia y lave la monocapa una vez con DPBS sin Ca²⁺/Mg²⁺.
4. Añada 2 mL (para frasco T25) de enzima TrypLE Select e incube a 37 °C durante 4–5 min.
5. Neutralice con 6 mL de medio completo FC y transfiera a un tubo cónico de 15 mL. Contar las células utilizando un contador automático de células.
6. Centrifugar a 300 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
7. Retire completamente el sobrenadante utilizando un 200 μL punta de pipeta, teniendo cuidado de no perturbar el pequeño pellet celular.
8. Resuspender el pellet celular en el tampón R a una densidad final de 1,0 × 10⁷ a 1.4 × 10⁷ células/mL
  NOTA: Aspire el sobrenadante de manera lo más completa posible para asegurar que el botón celular esté seco. El medio de cultivo residual puede diluir el tampón de resuspensión, lo que podría reducir la eficiencia de la electrotransferencia. Utilice el tampón R (para células adherentes) en las AFC. Verifique la selección del tampón según las recomendaciones del fabricante.
Realice la electroforesis.
1. Aliquota 110 μL de la suspensión celular (que contiene 1,0–1,4 × 10⁶ células) en un tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 mL.
  NOTA: Añada un extra 10 μL del tampón R hasta el volumen final para asegurar una suspensión celular adecuada, lo que ayuda a evitar la introducción de burbujas de aire durante la aspiración.
2. Añadir 5 μg mezcla de plásmidos al 110 μL alícuota de células. Mezclar mediante pipeteo suave 3 veces.
3. Coloque un estéril 100 μL punta de electroforesis al pipeta. Asegúrese de que la punta haga clic y quede firmemente sujeta.
4. Cargar 100 μL de la suspensión de células/ADN, asegurándose de que no haya burbujas de aire visibles presentes.
  NOTA: Las burbujas de aire provocan descargas eléctricas durante el pulso eléctrico, lo que mata las células y daña la punta. Si se observan burbujas, expulse la mezcla nuevamente en el tubo y repita la aspiración lentamente.
5. Introduzca la pipeta cargada verticalmente en el tubo de tampón en la estación hasta que haga clic al encajarse. Verifique que todos los parámetros sean correctos en la pantalla táctil, luego presione el botón Inicio para entregar la secuencia de pulsos.
6. Espere a que la pantalla muestre "Completo" (típicamente dentro de 1–2 s). Retire inmediatamente la pipeta de la estación y dispense directamente la suspensión celular electroporada en 2–3 pozos de una placa de 6 pozos recubierta que contiene medio FC sin antibióticos precalentado + 10 μM Y-27632
7. Deseche la punta usada de forma segura. Repita los pasos para pozos adicionales o réplicas según sea necesario. Coloque la placa de 6 pozos en una 37 °C, 5 % CO₂₂ incubadora humedecida durante la noche

3. Cultivo de reprogramación posterior a la electroporación

NOTA: Esta sección describe los cambios secuenciales de medio y el logro de la reprogramación completa de las CFA a iPSC. La cronología abarca aproximadamente 25 días desde la electrotransferencia hasta la selección de colonias.

Aproximadamente entre 16 y 18 h después de la electrotransferencia, aspire cuidadosamente el medio sin desalojar las células adherentes que hayan sobrevivido. Añada suavemente 2 mL de medio FC precalentado (que contenga P/S) a cada pocillo para permitir que las células se estabilicen durante las primeras 24 h. Devuelva la placa al incubador.
Desde el Día 2 hasta el Día 6, reemplace la mitad del medio cada dos días: aspire cuidadosamente 1 mL del medio gastado y añada 1 mL de medio fresco TeSR-E8 (E8).
NOTA: El cambio parcial del medio preserva los factores autocrinos secretados que apoyan los eventos iniciales de reprogramación. Aspire lentamente desde el borde del pocillo para minimizar la perturbación de las células en transición que están débilmente adheridas.
En los Días 7, realice un reemplazo completo del medio con 2 mL de medio E8 cada dos días.
Observe diariamente los cambios morfológicos bajo el microscopio. Espere la aparición de colonias parcialmente reprogramadas con aspecto de adoquines alrededor del Día 10–14.
NOTA: (Opcional) Suplemente los cultivos con 25–100 μM de butirato de sodio entre los Días 9–15 si la formación de colonias es deficiente²³.
Reemplace el medio E8 diariamente a partir del Día 15.
A partir del Día 18 aproximadamente, inspeccione diariamente los pocillos en busca de la aparición de colonias verdaderas de iPSC. En Tabla 2 se proporciona una cronología completa del flujo de trabajo de reprogramación, desde la electrotransferencia del Día 0 hasta la selección de colonias.

4. Selección mecánica de colonias de iPSC y expansión de líneas establecidas de iPSC

NOTA: Distinga las colonias verdaderas de iPSC de las células reprogramadas o no reprogramadas según los criterios morfológicos siguientes. Identifique colonias «ideales» basándose en las siguientes características morfológicas: (1) Definición del borde: Busque un borde nítido, liso y circular que delimite claramente la colonia de las células del líquido amniótico circundantes; (2) Densidad celular: Asegúrese de que las celdas dentro de la colonia sean pequeñas, estrechamente empaquetadas y posean una alta relación nucleocitoplasmática con nucléolos prominentes; (3) Refractividad: Las colonias de alta calidad se ven brillantes y altamente refractivas en contraste de fase; (4) Planicidad: La colonia debe crecer como una lámina plana y bidimensional, en lugar de un «grumo» tridimensional. Las colonias parcialmente reprogramadas suelen aparecer antes que las colonias verdaderas de iPSC y tienden a ser más grandes, más gruesas y más tridimensionales. Estas se diferenciarán espontáneamente al ser seleccionadas y pasadas. No seleccione colonias que presenten «vacuolas», bordes irregulares o signos de diferenciación central.

Seleccionar y transferir colonias de iPSC mediante procedimientos mecánicos
1. Preparar una placa de 24 pocillos recubierta con Matrigel con 0,5 mL por pocillo de medio E8 suplementado con 10 μM de Y-27632. Mantener a 37 °C hasta su uso.
2. Colocar la placa de cultivo bajo un estereomicroscopio dentro de una cabina de seguridad biológica de Clase II. Esterilizar el objetivo y la platina del estereomicroscopio con etanol al 70 % antes de acercar la placa al campo visual.
3. Identificar las colonias que presenten la morfología adecuada (planas, compactas, con bordes definidos).
4. Utilizando una punta estéril de pipeta de 10 μL sostenida en un ángulo poco pronunciado (aproximadamente 30° respecto a la horizontal), rayar suavemente alrededor del perímetro de una colonia seleccionada para definir su borde. Dividir la colonia en aproximadamente 3 fragmentos realizando incisiones paralelas a través de su diámetro. Usar la misma punta de pipeta para raspar y levantar suavemente los fragmentos de la colonia del sustrato, y transferir los fragmentos a un pocillo de la placa de 24 pocillos preparada.
5. Repetir los pasos para cada colonia, colocando los fragmentos en pocillos separados.
6. Colocar la placa de 24 pocillos en el incubador. Dejar sin perturbar durante 24 h para permitir la adhesión de los fragmentos.
7. A partir del día 2 posterior a la selección, reemplazar el medio diariamente con medio E8 sin Y-27632.
8. Cuando las colonias seleccionadas alcancen una confluencia del 70–80 % (típicamente entre 3 y 6 días), realizar el paso con Accutase.
Paso y expansión de líneas establecidas de iPSC
1. Aspirar el medio del pocillo que contiene las iPSC. Añadir Accutase para cubrir la monocapa. Incubar a temperatura ambiente durante 2–6 min. Observar los bordes de las colonias al microscopio; las células deben comenzar a separarse y deben aparecer espacios entre ellas.
2. Aspirar completamente la solución de Accutase. Añadir 1 mL de medio E8 + 10 μM de Y-27632. Pipetear suavemente el medio sobre la superficie de la colonia de 5 a 8 veces usando una pipeta P1000 para disociar las colonias en pequeños agregados de 2–8 células.
  NOTA: Evitar una disociación excesiva de las iPSC, ya que reduce drásticamente su viabilidad. El objetivo es obtener agregados pequeños y uniformes, no una suspensión de células individuales.
3. Transferir los agregados con 1 mL de medio E8 + 10 μM de Y-27632 de forma uniforme a una placa de 12 pocillos recién recubierta con Matrigel. Colocar la placa en el incubador.
4. Cambiar el medio diariamente con medio E8 (sin Y-27632 a partir del día 1).
5. Continuar el paso cada 3–4 días con una relación de división de 1:2 a 1:5, dependiendo de la confluencia.
6. Cultivar las líneas de iPSC durante un mínimo de 10 pasajes antes de aplicaciones posteriores para asegurar la eliminación estable del episoma.

5. Caracterización de líneas de iPSC aneuploides

NOTA: Realice los siguientes ensayos de validación en líneas iPSC establecidas (paso 10 o posterior) para confirmar la pluripotencia, la integridad del cariotipo y la eliminación del vector episomal.

Confirmar la expresión de los marcadores de pluripotencia.
1. Validar la expresión de los marcadores esenciales de pluripotencia mediante tinción por inmunofluorescencia, citometría de flujo o ambas técnicas. Los perfiles esperados de marcadores se resumen en Tabla 3.
  NOTA: Aunque la tinción por inmunofluorescencia proporciona una confirmación inicial de la pluripotencia, se recomiendan la RT-qPCR y la RNA-seq para una evaluación más amplia de la expresión génica asociada a la pluripotencia, incluyendo LIN28A, DPPA4 y KLF4.
Análisis del cariotipo mediante bandeo G
CRÍTICO: La reprogramación puede inducir la recuperación de trisomía en un subconjunto de clones. Analice múltiples clones (5–10 por línea parental) para identificar tanto derivados que mantienen la aneuploidía como aquellos que han recuperado la euploidía.
1. Recoger las iPSC en el pase 10–15 cuando alcancen una confluencia del 70%–80%.
2. Añadir colcemida a 0,1 μg/mL al medio de cultivo. Incubar a 37 °C durante 2–4 h para detener las células en metafase.
  NOTA: La colcemida es un veneno mitótico. Manipúlela con guantes dentro de una cabina de seguridad biológica. Deseche los residuos que contengan colcemida como material peligroso.
3. Disociar las células hasta obtener una suspensión individual mediante Accutase o un agente equivalente. Centrifugar a 300 × g durante 5 min.
4. Re suspender el sedimento en 5 mL de solución hipotónica precalentada (cloruro potásico 0,075 M). Incubar a 37 °C durante 15–20 min.
5. Añadir 1 mL de fijador recién preparado (metanol:ácido acético, relación volumétrica 3:1) al tubo agitando suavemente. Centrifugar a 300 × g durante 10 min.
6. Aspirar el sobrenadante. Añadir 5 mL de fijador fresco. Mezclar suavemente e incubar durante 10 min. Volver a centrifugar.
7. Repetir el paso de fijación (Paso 6) una vez más, para un total de 3 fijaciones.
8. Tras la última centrifugación, re suspender el sedimento en 0,5–1 mL de fijador fresco para obtener una densidad celular adecuada.
9. Dejar caer 2–3 gotas de la suspensión celular sobre portaobjetos limpios y húmedos desde una altura aproximada de 30 cm. Dejar secar al aire.
10. Incubar los portaobjetos a 80 °C durante 2 h o a 65 °C durante toda la noche para envejecer los cromosomas.
11. Realizar el bandeo G: tratar los portaobjetos con solución de tripsina al 0,025% durante 30–60 s, enjuagar y teñir con solución de Giemsa al 5% durante 1–5 min.
12. Analizar al menos 20 metafases bien extendidas por cada clone bajo un microscopio de campo brillante con inmersión en aceite (objetivo 100×).
13. Documentar el cariotipo utilizando la nomenclatura ISCN (por ejemplo, 47,XX,+21 para trisomía 21 femenina; 45,X para síndrome de Turner).
  NOTA: El cariotipado con bandeo G detecta anomalías cromosómicas mayores, pero su resolución es limitada. Se recomiendan ensayos complementarios, como el análisis de variaciones en el número de copias (CNV), secuenciación del exoma completo (WES) o secuenciación del genoma completo (WGS), para identificar cambios genéticos submicroscópicos y confirmar la integridad genómica de las iPSC.
Verificar la eliminación del vector episomal mediante PCR.
NOTA: Este paso confirma que todos los plásmidos episomales han sido perdidos de la línea de iPSC mediante amplificación por PCR de secuencias específicas del vector.
1. Extraer ADN genómico de las iPSC (pase ≥ 10) y de las AFC no transfectadas como control, utilizando un kit estándar de extracción basado en columnas.
2. Preparar una reacción de PCR de 25 μL. Realizar la PCR utilizando pares de cebadores Orip/GAPDH bajo las condiciones de ciclado siguientes (94 °C durante 2 min; seguido de 35 ciclos de 94 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s; extensión final a 72 °C durante 5 min). Incluir un control positivo (plásmido como molde) y un control negativo (ADN genómico de células no transfectadas) en cada corrida de PCR.
3. Separar los productos de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% con una escala de ADN adecuada.
4. Interpretar los resultados: las líneas de iPSC con episomas eliminados no deben mostrar bandas de amplificación en 544 pb. El control positivo debe mostrar bandas del tamaño esperado. El control negativo no debe mostrar bandas.
Detección de micoplasma mediante PCR
1. Recoger 0,5–1 mL de sobrenadante del cultivo tras al menos 24 h de incubación de las iPSC antes del cambio de medio, y centrifugar a 12.000 × g durante 5 min para eliminar los restos celulares.
2. Utilizar el sobrenadante clarificado como molde para la PCR con el Kit de Detección de Micoplasma por PCR, siguiendo las instrucciones del fabricante.
3. Separar los productos de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%. Continuar con experimentos posteriores solo si se confirma que los cultivos de iPSC están libres de micoplasma.
  NOTA: Si las AFC parentales no se obtienen de un biobanco certificado con esterilidad documentada y pruebas de micoplasma, se recomienda encarecidamente realizar un cribado rutinario de micoplasma antes de la reprogramación como paso inicial de control de calidad.
Ensayo de potencial de diferenciación trilinaje (Opcional)
1. Confirmar la capacidad de diferenciación in vitro mediante diferenciación dirigida trilinaje o formación de cuerpos embrioides (EB), seguido del análisis de marcadores específicos de cada capa germinal. Alternativamente, realizar la formación de teratoma in vivo en ratones inmunodeficientes para la validación de oro de la pluripotencia.
  NOTA: Para protocolos detallados del ensayo de teratoma o de diferenciación dirigida, consulte los procedimientos operativos estándar publicados²⁴. Estos ensayos se recomiendan, pero pueden omitirse si se proporcionan análisis amplios de marcadores in vitro y datos funcionales de diferenciación.

6. Derivación y verificación clonal de células individuales

NOTA: Para asegurar que cada línea de iPSC provenga de una sola célula, se recomienda un proceso de verificación clonal en dos etapas. Después de la selección mecánica y la expansión, se recomienda una segunda siembra de clones a partir de una sola célula tras la confirmación del cariotipo. La verificación de que cada línea de iPSC se origine a partir de una sola célula es un requisito fundamental para la generación de iPSC. Esto garantiza la eliminación del mosaicismo somático parental y confirma que la firma diagnóstica de aneuploidía sea uniforme en toda la población.

Siembra de células individuales
1. Disociar y resuspender colonias de iPSC con cariotipo confirmado en una suspensión de células individuales utilizando Accutase durante 2–6 min a 37 °C.
2. Utilizar medio E8 suplementado con 10 µM de Y-27632 para maximizar la supervivencia de células individuales aisladas. Realizar la deposición de células individuales mediante uno de los siguientes métodos:
  1. Dilución límite: Diluir la suspensión hasta una concentración de 0,5–1 célula por 100 µL. Sembrar 100 µL en cada pocillo de una placa de 96 pocillos recubierta con Matrigel.
  2. Ordenación celular por citometría de flujo (FACS): Ordenar directamente células individuales viables en los pocillos de una placa de 96 pocillos recubierta con Matrigel.
Verificación y expansión de la monoclonalidad
1. Inspección inicial: A las 24–48 h posteriores a la siembra, utilizar un microscopio de contraste de fases de alta resolución para inspeccionar cada pocillo. Marcar únicamente los pocillos que contengan un solo evento de adhesión claramente definido. Excluir los pocillos con múltiples cúmulos o sin células.
2. Crecimiento de colonias: Mantener las células individuales identificadas en medio E8 sin inhibidor de ROCK tras las primeras 24 h.
3. Expansión secuencial: Una vez que la colonia derivada de célula única alcance el 70 % de confluencia, expandir secuencialmente las células desde la placa de 96 pocillos a placas de 24, 12 y finalmente de 6 pocillos.
  NOTA: En investigaciones relacionadas con terapia celular, a menudo se requiere evidencia fotográfica del estadio de célula única (día 0 o día 1) como parte del Certificado de Análisis para demostrar el estado de linaje puro de las líneas de iPSC.
  Las causas potenciales de reprogramación fallida, formación subóptima de colonias y dificultades durante el establecimiento de clones de iPSC se resumen junto con soluciones prácticas en Tabla 4.

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Resultados

Progresión morfológica durante la reprogramación

Las células primarias de líquido amniótico mostraron morfologías heterogéneas, incluyendo células de tipo E y de tipo F (Figura 1A). Las células de tipo F deben ampliarse y utilizarse para la reprogramación. Tras la electroforesis de las AFC con plásmidos episómicos Epi5, se observa una secuencia característica de cambios morfológicos. En el día 0, las AFC presentan una morfología típica alargada, similar a la de fi...

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Discusión

Este protocolo describe un método no integrador y libre de células alimentadoras para generar iPSC humanas aneuploides a partir de células del líquido amniótico utilizando plásmidos episomales introducidos mediante electroporación. Varios pasos críticos determinan el éxito de la reprogramación. En primer lugar, la calidad de la población inicial de células del líquido amniótico (AFC) es fundamental. En laboratorios clínicos de citogenética, las AFC suelen expandirse en medios diseñados para acelerar la prol...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en conflicto. La ilustración esquemática de la Figura 7A fue generada utilizando herramientas asistidas por inteligencia artificial y posteriormente revisada y modificada por los autores.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (número de concesión 2022YFA0913300) y el Proyecto Clínico Clave del Hospital Tercero de la Universidad de Pekín (número de concesión BYSY2022054) concedidos a Jianying Guo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tripsina-EDTA al 0,25%	Thermo Fisher (Gibco)	25200056	Disociación celular para el paso de AFC
Escalera de ADN 100 pb Plus II	TransGen Biotech	BM321-01	Escalera de ADN
Congelador a -80 °C	Thermo Fisher	FDE60086fv	Almacenamiento a largo plazo de ADN plasmídico y muestras
Solución de disociación celular Accutase	StemCell Technologies	07920	Disociación suave de iPSC en pequeños agregados
Ácido acético (glacial)	Sigma-Aldrich	338826	Componente del fijador para cariotipo (MeOH:AcOH 3:1)
Agarosa	Sigma-Aldrich	A9539	Electroforesis en gel para productos de PCR (2%)
Medio AmnioType-1	VivaCell BIOSCIENCES	C3620-0100	Medio primario para cultivo de AFC
Contador celular automático / Hemocitómetro	Countstar	TC20	Recuento de células viables mediante exclusión de azul de tripano
Microscopio de campo claro (100x con aceite)	Zeiss	Axiovert5	Análisis de extensiones metafásicas para cariotipo
Centrífuga (rotor de cesta oscilante)	Eppendorf	5810R	Formación de pellet celular a 300 x g
Campana de seguridad biológica Clase II	ESCO	AC2-4S8-CN	Área de trabajo estéril para todas las operaciones de cultivo celular
Incubadora de CO₂ (humidificada)	Thermo scientific	3131	Mantener ambiente a 37 °C y 5% de CO₂
Colcemid (10 µg/mL)	Capricorn scientific	COL-H	Detención en metafase para cariotipo (0,1 µg/mL, 2-4 h)
Medio de congelación de células CryoStor CS10	STEMCELL Technologies	07959	Medio de congelación de células
DAPI	Merck Millipor	10236276001	Tinción nuclear
DMEM (alta glucosa)	Thermo Fisher (Gibco)	11965092	Medio base para cultivo de fibroblastos (medio FC)
DMEM/F-12	Thermo Fisher (Gibco)	11330032	Solución tampón para dilución de Matrigel (1:200)
DPBS sin Ca²⁺/Mg²⁺	Thermo Fisher (Gibco)	14190250	Tampón de lavado
Plásmido episomal (pCE-GFP)	Addgene	#41858	Vector de reprogramación no integrante (control GFP)
Plásmido episomal (pCXLE-hOCT3/4-shp53-F)	Addgene	#27077	Vector de reprogramación no integrante (OCT4 + shp53)
Plásmido episomal (pCXLE-hSK)	Addgene	#27078	Vector de reprogramación no integrante (SOX2 + KLF4)
Plásmido episomal (pCXLE-hUL)	Addgene	#27080	Vector de reprogramación no integrante (L-MYC + LIN28)
Suero bovino fetal	HyClone	SH30071.03	Suplemento sérico para expansión de AFC (medio FC, 15%)
Microscopio de fluorescencia	Leica	Sp8	Visualización de tinción viva y de inmunofluorescencia para TRA-1-60/81
Sistema de electroforesis en gel	Bio-Rad	164-5056	Análisis en gel de agarosa de productos de PCR
Gelatina (0,1%)	Sigma-Aldrich	G1393	Recubrimiento de recipientes de cultivo para la adhesión de AFC
Kit de extracción de ADN genómico	TIANGEN	4992199	Aislamiento de ADN de calidad para PCR a partir de iPSC
Solución de tinción de Giemsa	Sigma-Aldrich	GS500	Tinción G de bandeo cromosómico (5%)
GlutaMAX (100x)	Thermo Fisher (Gibco)	35050061	Suplemento para medio FC
Microscopio invertido de contraste de fase	Zeiss	Axiovert5	Monitoreo diario del cultivo y morfología de colonias
Tanque de almacenamiento en nitrógeno líquido	Thermo Scientific	CY50985	Criopreservación de células
Matriz de membrana basal Matrigel	Corning	354230	Recubrimiento de recipientes de cultivo para la adhesión de iPSC
Metanol (anhidro)	Sigma-Aldrich	34860	Componente del fijador para cariotipo (MeOH:AcOH 3:1)
Anticuerpo NANOG (Conejo)	Abcam	ab109250	Inmunofluorescencia; marcador nuclear de pluripotencia
Kit de electroporación Neon NxT (100 µL)	Thermo Fisher (Invitrogen)	N10025	Electroporación; contiene los tampones R, T, E y puntas de 100 µL
Sistema de electroporación Neon NxT	Thermo Fisher (Invitrogen)	NEON18S	Entrega de plásmidos episomales mediante electroporación
Ácidos aminoácidos no esenciales (NEAA, 100x)	Thermo Fisher (Gibco)	11140050	Suplemento para medio FC
Anticuerpo OCT4 (Conejo)	Abclonal	A7920	Inmunofluorescencia; marcador nuclear de pluripotencia
Mezcla maestra de PCR (alta fidelidad)	TIANGEN	4992920	Verificación de eliminación episomal mediante PCR
pCXWB-EBNA1	Addgene	#37624	Expresión episomal no replicante de EBNA1
Anticuerpo PE anti-TRA-1-81 humano	BioLegend	330708	Tinción de pluripotencia
Penicilina-Estreptomicina (100x)	Thermo Fisher (Gibco)	15140122	Suplemento antibiótico (NO se usa tras la electroporación)
Reactivo Phalloidin-iFluor 647	Abcam	ab176759	Etiquetado de F-actina (filamentos de actina)
Cloruro de potasio (KCl)	Sigma-Aldrich	P5405	Solución hipotónica para cariotipo (0,075 M)
Sistema de PCR en tiempo real	Thermo Fisher Scientific	QuantStudio3	qPCR para verificación de genes marcadores
Butirato de sodio (NaB)	Sigma-Aldrich	B5887	Inhibidor de HDAC; 25-100 µM para mejorar la reprogramación
Anticuerpo SOX2 (Ratón)	R&D Systems	MAB2018	Inmunofluorescencia; marcador nuclear de pluripotencia
Anticuerpo SSEA-4	BioLegend	330408	Inmunofluorescencia; marcador de superficie celular de pluripotencia
Stereo microscopio	Nikon	SMZ745	Selección mecánica de colonias bajo aumento
TeSR-E8	STEMCELL Technologies	05990	Medio de mantenimiento de iPSC sin células alimentadoras
Anticuerpo TRA-1-60	Merck Millipor	MAB4360	Tinción de pluripotencia
Escalera de ADN Trans DNA Marker II	TransGen Biotech	BM411-01	Escalera de ADN
Kit de detección de micoplasma por PCR TransDetect	TransGen Biotech	FM311-01	Prueba de micoplasma
Enzima TrypLE Select (1x)	Thermo Fisher (Gibco)	12563011	Disociación suave de AFC adherentes
Tripsina (0,025%)	Sigma-Aldrich	T4799	Pretatamiento con G-banding de portaobjetos (30-60 s)
Ciclador térmico VeritiPro de 96 pocillos	Thermo Fisher Scientific	A48141	PCR para verificación de eliminación episomal
Baño de agua (37 °C)	Shanghai Zhixin Experimental Instrument Technology Co., Ltd.	ZX-S22	Descongelación de medios y reactivos
Y-27632 Dihidrocloruro (inhibidor ROCK)	Tocris	1254	Mejora la supervivencia de iPSC tras la disociación (10 µM)

Referencias

Gurdon JB. The developmental capacity of nuclei taken from intestinal epithelium cells of feeding tadpoles. Development. 1962;10(4):622-640.
Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 1981;292(5819):154-156.
Martin GR. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1981;78(12):7634-7638.
Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel J, et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 1998;282(5391):1145-1147.
Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 2007;131(5):861-872.
Fusaki N, Ban H, Nishiyama A, Saeki K, Hasegawa M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2009;85(8):348-362.
Warren L, Manos PD, Ahfeldt T, Loh YH, Li H, et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 2010;7(5):618-630.
Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, Stewart R, et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 2009;324(5928):797-801.
Hou P, Li Y, Zhang X, Liu C, Guan J, et al. Pluripotent stem cells induced from mouse somatic cells by small-molecule compounds. Science. 2013;341(6146):651-654.
Guan J, Wang G, Wang J, Zhang Z, Fu Y, et al. Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells. Nature. 2022;605(7909):325-331.
Liuyang S, Wang G, Wang Y, He H, Lyu Y, et al. Highly efficient and rapid generation of human pluripotent stem cells by chemical reprogramming. Cell Stem Cell. 2023;30(4):450-459.e9.
Wang Y, Peng F, Yang Z, Cheng L, Cao J, et al. A rapid chemical reprogramming system to generate human pluripotent stem cells. Nat Chem Biol. 2025;21(7):1030-1038.
Li C, Zhou J, Shi G, Ma Y, Yang Y, et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Hum Mol Genet. 2009;18(22):4340-4349.
Slamecka J, Salimova L, McClellan S, van Kelle M, Kehl D, et al. Non-integrating episomal plasmid-based reprogramming of human amniotic fluid stem cells into induced pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Cell Cycle. 2016;15(2):234-249.
Li Q, Fan Y, Sun X, Yu Y. Generation of induced pluripotent stem cells from human amniotic fluid cells by reprogramming with two factors in feeder-free conditions. J Reprod Dev. 2013;59(1):72-77.
Crosland BA, Hedges MA, Ryan KS, D'mello RJ, Mccarty OJT, Amniotic fluid: its role in fetal development and beyond. J Perinatol. 2025 Aug;45(8):1163-1170. doi: 10.1038/s41372-025-02313-1. Epub 2025 May 8. PMID: 40341778; PMCID: PMC12354197.
Liu L, et al. Amniotic fluid stem cells in birth defects: integrated roles in disease modeling, prenatal diagnosis, and therapy. Stem Cell Rev Rep. 2026. doi:10.1007/s12015-026-11161-1.
Antonucci I, Provenzano M, Rodrigues M, Pantalone A, Salini V, et al. Amniotic fluid stem cells: a novel source for modeling of human genetic diseases. Int J Mol Sci. 2016;17(4):607.
Guillot PV. Induced pluripotent stem (iPS) cells from human fetal stem cells. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 2016;31:112-120. doi:10.1016/j.bpobgyn.2015.08.007.
Lu HE, Yang YC, Chen SM, Su HL, Huang PC, et al. Modeling neurogenesis impairment in Down syndrome with induced pluripotent stem cells from trisomy 21 amniotic fluid cells. Exp Cell Res. 2013;319(4):498-505.
Lee CC, et al. Establishment of a human trisomy 18 induced pluripotent stem cell line from amniotic fluid cells. Stem Cell Res. 2018;29:115-119.
D'Aurora M, et al. Modeling Klinefelter syndrome using induced pluripotent stem cells reveals impaired germ cell differentiation. Front Cell Dev Biol. 2020;8:567454.
Mali P, Chou BK, Yen J, Ye Z, Zou J, et al. Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes. Stem Cells. 2010;28(4):713-720.
Guo J, Lee Q, Qiu H, Wei Y, Zhu X, et al. Patient-derived neural organoids reveal developmental impairments associated with a novel GJB1 mutation in X-linked Charcot-Marie-Tooth disease. Neurobiol Dis. 2026;220:107299.
Nanbo A, Sugden A, Sugden B. The coupling of synthesis and partitioning of EBV's plasmid replicon is revealed in live cells. EMBO J. 2007;26(19):4252-4262.
Chou BK, Mali P, Huang X, Ye Z, Dowey SN, et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 2011;21(3):518-529.
Okita K, Matsumura Y, Sato Y, Okada A, Morizane A, et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 2011;8(5):409-412.
Cheng L, Wang Y, Yang Z, Cao J, Peng F, et al. p53 safeguards chemical reprogramming of human somatic cells toward pluripotency. Cell. 2026. doi:10.1016/j.cell.2026.03.038.
Akutsu SN, Miyamoto T, Oba D, Tomioka K, Ochiai H, et al. iPSC reprogramming-mediated aneuploidy correction in autosomal trisomy syndromes. PLoS One. 2022;17(3):e0264965.

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iPSC humanas aneuploides marcadores de pluripotencia transición mesenquimal a epitelial cariotipo por bandeo G eliminación del vector por PCR reprogramación sin células alimentadoras modelado de enfermedades biología cromosómica

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