Efecto de Tuina en la expresión hipotalámica de orexina-A y el comportamiento del sueño en un modelo de ratas de insomnio primario

Resumen

Este estudio investiga si Tuina alivia el insomnio en un modelo de rata regulando la expresión de orexina hipotalámica A, utilizando ensayos conductuales, inmunohistoquímica y PCR cuantitativa en tiempo real.

Resumen

El insomnio es un trastorno del sueño común que provoca deterioro de la función diurna y un mayor riesgo de comorbilidades, afectando significativamente la calidad de vida de los pacientes. Los tratamientos actuales, principalmente la terapia cognitivo-conductual y la farmacoterapia, están limitados por problemas como la dependencia de medicamentos, la tolerancia y el rebote por abstinencia. Se ha demostrado que la terapia con tuina regula los sistemas nervioso, endocrino e inmunitario, mientras que el sistema de orexinas es un regulador clave del ciclo sueño-vigilia. Esto ha impulsado la exploración de si Tuina alivia el insomnio modulando el sistema de orexinas hipotalámicas. Este protocolo describe los métodos de intervención en Tuina en un modelo de ratas de insomnio primario inducido por el método modificado de entorno acuático con múltiples plataformas. Asignamos al azar a 64 ratas Wistar en cuatro grupos: control, modelo, Tuina y antagonista de la orexina. Se realizaron evaluaciones conductuales (prueba de campo abierto, prueba de sueño inducida por pentobarbital), y la expresión de Orexin-A en el hipotálamo se detectó mediante PCR cuantitativa en tiempo real e inmunohistoquímica. El protocolo tiene como objetivo evaluar la eficacia de Tuina e investigar su posible mecanismo relacionado con el sistema de orexinas, proporcionando una referencia para la aplicación y el estudio mecanicista de Tuina en trastornos del sueño.

Introducción

El insomnio, caracterizado por la insatisfacción con la duración o calidad del sueño que conduce a deterioro durante el día, es un problema de salud global prevalente con una carga significativa para las personas y los sistemas^{sanitarios 1,2}. En China, la prevalencia del insomnio es notablemente alta, lo que agrava aún más su impacto en la salud^{pública 3}. Este trastorno se asocia con una función cognitiva deteriorada, un mayor riesgo de enfermedades cardiovasculares y una alta comorbilidad con condiciones psiquiátricas como la depresión y la ansiedad ^4,5. La gestión clínica actual se basa principalmente en la terapia cognitivo-conductual y la farmacoterapia, especialmente en las benzodiacepinas y en sedantes-hipnóticos no benzodiacepinos. Sin embargo, su aplicación a largo plazo está limitada por la dependencia de fármacos, tolerancia, efectos residuales diurnos y síntomas de abstinencia, lo que pone de manifiesto la necesidad de alternativas no farmacológicas^eficaces. En la práctica clínica, Tuina es especialmente adecuado para pacientes con insomnio primario crónico que buscan intervenciones no farmacológicas, especialmente para personas mayores con alto riesgo de dependencia a medicamentos, así como para mujeres embarazadas o lactantes^.

Como pilar fundamental de la terapia externa de la Medicina Tradicional China, Tuina ha demostrado ventajas únicas en el tratamiento del^{insomnio 8}. La evidencia metaanalítica muestra que Tuina supera significativamente a los medicamentos o a la acupuntura sola en tasa efectiva total (OR = 4,12), calidad del sueño y estados de ansiedad-depresivo, con alta seguridad⁹. Los protocolos específicos de Tuina ofrecen ventajas claras: el Tuina tradicional alcanza una eficacia del 89,5% para el insomnio tipo flema por calor, el frotamiento abdominal reduce las tasas de recaída al 14,7% (frente al 38,2% del Tuina convencional)¹⁰. El método Tuina, compuesto por tres partes, aumenta la eficacia de la terapia herbal del 80,49% al 92,68%, mientras mejora la arquitectura del sueño y los perfiles de^{neurotransmisores 11}. Estudios clínicos y revisiones sistemáticas han confirmado que Tuina puede mejorar significativamente la calidad del sueño, reducir las puntuaciones de ansiedad y depresión, y modular los niveles séricos de neurotransmisores como la 5-hidroxitriptamina (5-HT⁾¹². Se cree que sus efectos terapéuticos están mediados por la regulación holística de la red neuroendocrina-inmune. Las investigaciones recientes se han centrado cada vez más en el sistema de orexinas, un sistema neuropeptídico clave que se origina en el hipotálamo lateral y que es crucial para promover y mantener la^{vigilia 13}. La sobreactividad anormal de las neuronas de orexina está implicada en la fisiopatología del insomnio, mientras que la inhibición de esta vía ha mostrado potencial^{terapéutico 14}. Evidencias preliminares sugieren que manipulaciones como el frotamiento abdominal pueden influir en los niveles cerebrales de Orexina-A en ratas privadas de^{sueño 12}, pero no existe una investigación sistemática sobre si Tuina ejerce sus efectos antiinsomnio específicamente modulando el sistema de orexinas.

Por ello, basándose en un modelo de ratas de insomnio primario, este estudio pretende: (1) Evaluar la mejora del comportamiento al dormir tras la intervención estandarizada de Tuina mediante pruebas de conducta; y (2) Investigar el mecanismo subyacente examinando si el efecto de Tuina está asociado con la regulación a la baja de la expresión de Orexina-A en el hipotálamo, comparando su eficacia con la de un antagonista del receptor de orexina. Esta investigación busca proporcionar evidencia experimental sobre el mecanismo central de Tuina en el tratamiento del insomnio.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales y evaluaciones de bienestar animal fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad Médica de Xinjiang (número de aprobación ética: IACUC-20020158). El protocolo sigue las directrices institucionales para el cuidado y uso de animales. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación animal

1. Ratas Wistar libres de patógenos específicos (SPF) de la casa 64 (peso corporal 250 g ± 50 g, distribución igual de sexo) en un sistema de barrera SPF a 18–22 °C con un ciclo claro-oscuro de 12 horas. Proporciona comida y agua ad libitum.
2. Tras una semana de alimentación adaptativa, dividir aleatoriamente las ratas en 4 grupos (n = 16 por grupo): control (Grupo A), modelo (Grupo B), Tuina (Grupo C) y antagonista (Grupo D).

2. Establecimiento del modelo primario de insomnio

NOTA: Excepto en el Grupo A, las ratas de los Grupos B, C y D se someten al siguiente procedimiento de modelado.

1. Prepara un recipiente cilíndrico de plástico (diámetro superior: 30 cm, altura: 40 cm) como caja para ratas.
2. Fija una plataforma cilíndrica (diámetro: 6 cm, altura: 10 cm) en el fondo del recipiente.
3. Añade agua al recipiente hasta que el nivel del agua esté a 1 cm por debajo de la superficie de la plataforma. Mantén la temperatura del agua en 20 °C.
4. Coloca una malla circular de hierro (diámetro: 25 cm, tamaño de malla: 1 cm) horizontalmente dentro del recipiente, a 15 cm sobre la plataforma. Asegura la malla al borde del recipiente usando hilos finos de hierro.
5. Coloca agua potable y comida sobre la malla de hierro. Cambia el agua a diario y limpia y desinfecta el recipiente.
6. Coloca una rata por contenedor en la plataforma durante 8 días consecutivos.

3. Evaluación del modelo mediante prueba sinérgica de sueño pentobarbital sódico

1. La solución de pentobarbital sódico se prepara introduciendo directamente agua ultrapura. Pesa 1,0 g de polvo, añade agua ultrapura esterilizada a 100 mL, disuelve y filtra a 0,22 μm para obtener una solución al 1% (10 mg/mL).
2. En el día 9, inyectar a todas las ratas intraperitonealmente con solución de pentobarbital sódico en la dosis mínima umbral que induce el sueño (determinada en experimentos preliminares).
3. Registrar la latencia del sueño (tiempo desde la inyección hasta la primera pérdida del reflejo de enderezamiento) y la duración del sueño (tiempo desde la pérdida hasta la recuperación del reflejo de enderezamiento). Define la pérdida del reflejo de enderezamiento durante 1 minuto como el inicio del sueño, y su recuperación como el final del sueño.

4. Intervención de Tuina

NOTA: Las intervenciones comienzan el día siguiente a la evaluación exitosa del modelo y continúan una vez al día durante 14 días consecutivos. El Grupo A y el Grupo B son sometidos a la sujeción en un marco de fijación durante 10 minutos diarios. Los operadores reciben una formación rigurosa antes del experimento para garantizar la consistencia en la fuerza, frecuencia y ritmo.

1. Para el Grupo C, fije la rata en posición supina sobre una mesa de operaciones.
2. Fija suavemente las cuatro extremidades de la rata usando los cinco dedos de la mano izquierda, extendiendo completamente el abdomen.
3. Realizar Tuina abdominal con la mano derecha: usar la pulpa de la falange distal del dedo corazón para aplicar fuerza en el punto Guanyuan (CV4, situado a 25 mm por debajo del umbligo). Mantén los cuatro dedos restantes extendidos de forma natural.
4. Mueve el dedo corazón usando pequeños movimientos circulares anterolaterales desde la articulación del hombro, realizando fricción translacional circular en sentido antihorario sobre el abdomen.
5. Sigue un camino circular cerrado formado por Jiuwei (CV15, 5 mm por debajo del proceso xifoide), Guanyuan (CV4) y puntos bilaterales Daimai (GB26, punto medio entre el extremo libre de la^duodécima costilla y el borde superior de la cresta ilíaca).
6. Mantén un movimiento circular suave, constante y continuo a 5–7 ciclos/min.
7. Haz manipulación en sentido antihorario durante 5 minutos, luego manipulación en sentido horario durante 5 minutos.
8. Asegúrate de que la fuerza sea firme y constante, manteniendo la rata tranquila y sin forcejear. Aplica la intervención una vez al día durante 14 días.

5. Administración antagonista

1. Para el Grupo D, administrar MK-4305 (10 mg/kg) por gavage intragástrico una vez al día durante 14 días. Disuelva el MK-4305 en solución salina normal para preparar una solución de 5 mL.

6. Prueba en campo abierto

1. Tras el periodo de intervención, realiza la prueba en campo abierto utilizando una caja cúbica negra (base: 100 cm × 100 cm, altura: 40 cm). Divide el suelo en 25 cuadrados iguales por líneas grises (16 periféricas, 9 centrales).
2. Coloca la rata en la casilla central y empieza a calcular el tiempo.
3. Registrar la distancia total recorrida, el número de episodios de crianza y el tiempo pasado en la zona central durante más de 3 minutos utilizando un sistema de adquisición de imágenes.
4. Después de cada prueba, retira las heces y limpia el suelo y las paredes interiores con etanol al 75%.
5. Funcionamiento del sistema de adquisición de imágenes
   1. Configura el sistema de adquisición de imágenes. Monta una cámara digital CCD (resolución: 1280 × 720 píxeles; tasa de fotogramas: 25 fps) verticalmente a 1,5 m sobre el campo abierto. Conecta la cámara a un ordenador mediante una interfaz USB.
   2. Configura el software de seguimiento y los ajustes de análisis. Realizar seguimiento automatizado utilizando software de análisis de vídeo conductual. Establezca los parámetros de seguimiento de la siguiente manera:
      1. Define el foco de seguimiento como el punto central (centro de masa) de la rata.
      2. Configura la tasa de fotogramas a 25 fps tanto para la adquisición como para el análisis de imágenes.
      3. Calibrar la resolución espacial para que cada píxel corresponda a 1,5 mm de distancia real según las dimensiones del campo abierto y la resolución del vídeo.
      4. Establece el umbral de resta de fondo a 15 niveles de gris (rango: 0–255) para distinguir a la rata del fondo.
      5. Establece la duración mínima del evento a 0,2 s (5 fotogramas) para minimizar las detecciones de falsos positivos causadas por el ruido.
      6. Divide el campo abierto virtualmente en 5 × 5 casillas de igual área (Zonas 1–25). Defina la zona central como las Zonas 7, 8, 9, 12, 13, 14, 17, 18 y 19 (las 3 × 3 cuadrículas centrales, que representan el 36% del área total). Define la zona periférica como los cuadrados restantes.
   3. Registrar los siguientes parámetros de salida: distancia total recorrida (mm), velocidad media (mm/s), tiempo inmóvil (s), tiempo de movimiento (s), tiempo en cada zona(s), distancia recorrida en cada zona (mm), número de entradas en cada zona y número de episodios de crianza. Verifica manualmente los episodios de crianza.

7. Perfusión para inmunohistoquímica

NOTA: Utiliza 4 ratas de cada grupo para inmunohistoquímica.

1. Preparar solución salina al 0,9% (precalentada a 37 °C) y solución de paraformaldehído al 4% (almacenada a 4 °C).
2. Anestesiar profundamente a las ratas con uretano intraperitoneal (solución al 25%, 0,6 mL/100 g de peso corporal). Confirma pérdida de reflejos de pedal, córnea y de enderezamiento.
3. Asegura a la rata boca cerrada en una placa de espuma. Abre rápidamente la cavidad torácica cortando la piel, la fascia y el esternón.
4. Retrae el corazón suavemente para exponer la aorta. Introduce una aguja a través del ápice ventricular izquierdo hacia la aorta hasta que la punta de la aguja sea visible en la luz aórtica. Asegúrate de que la aguja, el ventrículo izquierdo y la aorta estén alineados horizontalmente.
5. Clampea la aorta y la aguja con pinzas hemostáticas. Corta inmediatamente la aurícula derecha para permitir la salida de la sangre.
6. Perfundir con 150–200 mL de solución salina precalentada al 0,9% (37 °C). La perfusión exitosa se indica por blanqueamiento del hígado, mesenterio y extremidades anteriores, y por el líquido claro de la aurícula derecha.
7. Cambiar a paraformaldehído frío al 4% (4 °C) y perfundir 400 mL. Realizar la perfusión inicial rápidamente hasta que se produzcan fasciculaciones musculares en todo el cuerpo y rigidez de las extremidades. Luego reduce el caudal a 2 gotas/s hasta que todo el fijador esté perfundido.
8. Confirma la fijación exitosa cuando el cerebro parece pálido y firme.

8. Disección cerebral

1. Tras la perfusión, decapita a la rata y retira cuidadosamente todo el cerebro del cráneo.
2. Incisa el cráneo a lo largo de la sutura sagital con tijeras. Arranca los huesos parietales y occipitales con los rongeurs óseos.
3. Levanta suavemente el cerebro con una espátula, seccionando los nervios craneales y ópticos con unas tijeras finas.
4. Para inmunohistoquímica: Transfiere inmediatamente todo el cerebro al 4% de paraformaldehído y fija a 4 °C durante 24 horas.
5. Para PCR cuantitativa en tiempo real: enjuaga la superficie cerebral con solución salina preenfriada, seca con papel de filtro, congela en nitrógeno líquido durante 5–10 minutos y almacena a –80 °C. Realiza todos los pasos sobre hielo.

9. Tinción inmunohistoquímica

1. Incrustar tejido hipotálamo en parafina y cortar secciones coronales a 4–5 μm de espesor usando un microtomo. Monta secciones sobre correderas anticaída, hornea a 65 °C durante 1,5–2 horas.
2. Secciones de dewax en xileno I y II (10 min cada una). Rehidratar con etanol graduado: etanol anhidro I y II (5 min cada uno), luego 95%, 90%, 80%, 70% etanol (5 min cada uno), y después agua destilada (5 min).
3. Realice la recuperación de antígenos colocando secciones en un tampón de citrato de 0,01 M hirviendo (pH 6,0) en una olla a presión. Calienta hasta que suba la válvula de presión y luego apaga el fuego. Deja en remojo durante 10 minutos y luego enfría de forma natural hasta temperatura ambiente.
4. Inactiva la peroxidasa endógena sumergiendo secciones en H₂O₂ fresco al 3% durante 10 minutos a temperatura ambiente. Lava 3× con PBS (5 min cada uno).
5. Círculo tejido con un bolígrafo de inmunohistoquímica. Aplicar anticuerpo policlonal anti-HCRT/Orexin-A de conejo (dilución 1:50, ~50 μL por portaobjetos). Incuba toda la noche a 4 °C en una caja humidificada.
6. Al día siguiente, calienta a temperatura ambiente durante 20 minutos. Lava 3× con PBS (5 min cada uno).
7. Aplica un anticuerpo secundario marcado con peroxidasa de rábano picante. Incuba 20 minutos a temperatura ambiente. Lava 3× con PBS (3 min cada uno).
8. Aplica la solución de trabajo marcada con estreptavidina marcada con peroxidasa de rábano picante. Incuba 20 minutos a temperatura ambiente. Lava 3× con PBS (5 min cada uno).
9. Preparar la solución de cromógeno DAB (0,85 mL de agua destilada + 50 μL de cada uno de los reactivos A, B, C). Aplica en secciones y revela durante 3–10 minutos a temperatura ambiente, monitorizando bajo un microscopio. Detén la reacción sumergiéndote en agua del grifo durante 3 minutos.
10. Contra-tinte con hematoxilina durante 3 minutos. Diferenciar en alcohol de ácido clorhídrico al 1% durante 1–2 segundos. Azul en agua del grifo durante 5 minutos.
11. Deshidrata con agua destilada (3 min), 70%, 80%, 90%, 90% etanol (3 min cada uno) y etanol anhidro I y II (5 min cada uno). Transparente en xileno I y II (5 min cada uno).
12. Aplica bálsamo neutro y capa de cobertura. Seca durante la noche a 37 °C.
13. Observa y fotografía secciones usando un microscopio óptico (40×, 100×, 200×, 400×). Cuenta las células positivas de Orexina-A (precipitado granular marrón en el citoplasma) usando ImageJ.
14. Calcular la puntuación total (0–12) como la puntuación de intensidad de la tinción (0 = negativo, 1 = amarillo claro, 2 = marrón claro, 3 = marrón oscuro) multiplicado por la puntuación porcentaje positivo de la célula (0 = 0%, 1 = 1–25%, 2 = 26–50%, 3 = 51–75%, 4 = 76–100%). Define de 1 a 5 como baja expresión, 6 a 12 como alta expresión.

10. PCR cuantitativa en tiempo real para ARNm de Orexina-A

1. El procesamiento del ARN tras el descongelamiento del tejido debe realizarse en condiciones libres de RNasa. Los requisitos específicos de RNasa son los siguientes:
   1. Entorno de trabajo: Utiliza un área de trabajo dedicada al ARN que haya sido limpiada con un descontaminante RNasa y expuesta a irradiación UV.
   2. Consumibles: Utiliza tubos de centrífuga certificados libres de RNasa y puntas de pipeta, o alternativamente, sumergirlos en agua DEPC al 0,1% seguido de autoclave.
   3. Reactivos: Utiliza un tampón de lisis libre de RNasa y agua tratada con DEPC.
   4. Operación: Llevar guantes sin polvo durante todo el procedimiento, cambiar de guantes con frecuencia y evitar el contacto directo con el interior de los consumibles y las muestras.
   5. Procedimiento experimental
      NOTA: Durante los pasos de extracción de ARN y transcripción inversa, todos los consumibles y herramientas que entren en contacto con ARN o reactivos de transcripción inversa deben estar libres de RNasa. En la etapa de amplificación por PCR, dado que el ADNc es una estructura de doble cadena y la RNasa no puede degradar el ADN de doble cadena, los consumibles y herramientas en esta etapa solo necesitan estar libres de DNasa y otras impurezas que puedan inhibir las reacciones de PCR; no se requiere tratamiento adicional sin RNasa. Tritura tejido hipotálamo congelado bajo nitrógeno líquido. Pesa entre 50 y 100 mg de polvo de tejido en un tubo con 1 mL de Trizol. Mezcla y deja reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
2. Añade 200 μL de cloroformo, mezcla por inversión y deja reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos. Centrifugar a 12.000 × g durante 15 minutos a 4 °C.
3. Transfiere la fase acuosa superior a un tubo nuevo. Añade el mismo volumen de isopropanol, mezcla y deja a –20 °C durante 35 minutos. Centrifugar a 12.000 × g durante 15 minutos a 4 °C. Descarta el sobrenadante.
4. Lavar el precipitado con etanol al 75%, centrifugar a 12.000 × g durante 15 minutos a 4 °C. Descarta el sobrenadante y repite el lavado una vez.
5. Precipitado secado al aire a temperatura ambiente. Disuelve en agua libre de RNasa.
6. Mide la concentración y pureza del ARN (relación A260/A280 1,8–2,1). Evalúa la integridad mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% (bandas 28S y 18S claras, banda 5S débil o ausente).
7. Preparar la reacción de transcripción inversa (20 μL): 800 ng de ARN total, 1 μL cebador aleatorio (0,1 μg/μL), 10 μL 2× mezcla de reacción TS, 1 μL mezcla enzimática TransScript RT/RI, removedor de ADN gD de 1 μL y agua libre de RNasa a volumen.
8. Incubar a 25 °C durante 10 minutos, luego 85 °C durante 5 segundos para sintetizar ADNc de primera cadena. Diluye ADNc 1:1 con agua libre de RNasa.
9. Preparar la reacción qPCR (10 μL): 5 μL de EvaGreen 2× MasterMix qPCR, cebador directo de 0,3 μL (10 μM), cebador inverso de 0,3 μL (10 μM), plantilla de ADNc de 1 μL, agua sin RNasa a volumen. Funciona en triplicado.
   NOTA: Cebadores: Orexina-A-F: 5'-CGCCAGAAGGTGTTCCT-3'; Orexin-A-R: 5'-GCCGCTTTCCCAGAGTGAG-3' (longitud del producto 88 pb); β-Actin-F: 5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3'
   β-Actina-R: 5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3' (longitud del producto 150 pb).
10. Ejecutar el programa qPCR: 95 °C durante 30 s (pre-desnaturalización); 40 ciclos de 95 °C durante 5 s (desnaturalización) y 60 °C durante 30 s (recocido/extensión).
11. Verifica las curvas de amplificación y fusión. Aplicar 5 μL de producto en gel de agarosa al 2% para confirmar la especificidad.
12. Calcula la expresión relativa de ARNm de Orexina-A utilizando el método 2^⁻ΔΔCt con β-actina como control interno.

11. Análisis estadístico

1. Utiliza SPSS 26.0 para el análisis de datos. Expresa todos los datos como media ± desviación estándar. Para comparaciones entre dos grupos, se utiliza la prueba t de muestras independientes si los datos están normalmente distribuidos; de lo contrario, utiliza la prueba Mann-Whitney U.
2. Para comparaciones entre varios grupos, utiliza ANOVA unidireccional con la prueba LSD post-hoc para varianzas homogéneas o la prueba de Tamhane para varianzas heterogéneas. Si los datos no se distribuyen normalmente, se utiliza la prueba H de Kruskal-Wallis. Consideremos que P < 0,05 estadísticamente significativo.

Resultados

La Tabla 1 muestra que, en comparación con el grupo A, la latencia del sueño en los grupos B, C y D fue significativamente prolongada, y la duración del sueño se acortó significativamente tras el modelado, lo que indica que el modelo primario de ratas de insomnio se estableció con éxito. Los hallazgos de las Tablas 2 y 3 ofrecen un apoyo preliminar sobre el efecto terapéutico de Tuina en el tratamiento del insomnio. La Prueba de Campo Abierto (OFT) es uno de los paradigmas más clásicos y comúnmente utilizados en neurociencia conductual para evaluar conductas similares a la ansiedad en^roedores. Los estudios han demostrado que la preferencia por el área de las cuatro esquinas es un indicador sensible para medir comportamientos similares a la ansiedad, y puede ser más discriminatoria que el indicador del área central en niveles moderados o bajos de ansiedad. Las ratas modelo de insomnio mostraron comportamientos y cambios significativos similares a la ansiedad^{en 16,17} en el comportamiento exploratorio, mientras que la intervención de Tuina alivió eficazmente los comportamientos similares a la ansiedad en estas ratas. Los resultados de biología molecular presentados en la Tabla 4, la Tabla 5 y la Figura 1 demuestran además que Tuina regula eficazmente a la baja la sobreexpresión de Orexin-A en el hipotálamo de ratas modelo de insomnio.

Figura 1: Resultados de la coloración inmunohistoquímica de Orexin-A en el hipotálamo de ratas de cada grupo (40×, 100×, 200×, 400×). (A) Se observaron neuronas positivas para orexina-A en el tejido hipotálmico de la rata, apareciendo como señales granulares marrón oscuro. La puntuación de intensidad de la tinción fue de 3 puntos, el porcentaje de células positivas fue del 40% (situándose entre el 26% y el 50%, con puntuación de 2 puntos), y la puntuación total fue de 6 puntos, lo que se sitúa dentro del rango de alta expresión. (B) El número de neuronas positivas a Orexina-A en el tejido hipotalámico de la rata aumentó significativamente en comparación con el grupo normal, con una distribución más densa de células positivas. La puntuación de intensidad de la tinción fue de 3 puntos (marrón oscuro), el porcentaje de células positivas alcanzó el 80% (entre el 76% y el 100%, con 4 puntos), y la puntuación total fue de 12 puntos, que se sitúa dentro del rango de alta expresión. (C) El número de neuronas positivas a Orexina-A en el tejido hipotalámico de la rata se redujo en comparación con el grupo modelo. La puntuación de intensidad de la tinción fue de 3 puntos (marrón oscuro), el porcentaje de células positivas fue del 75% (entre el 51% y el 75%, con 3 puntos), y la puntuación total fue de 9 puntos, lo que se sitúa dentro del rango de alta expresión. (D) El número de neuronas positivas a Orexina-A en el tejido hipotálamo de la rata también se redujo en comparación con el grupo modelo. La puntuación de intensidad de la tinción fue de 3 puntos (marrón oscuro), el porcentaje de células positivas fue del 60% (entre el 51% y el 75%, con 3 puntos), y la puntuación total fue de 9 puntos, lo que se sitúa dentro del rango de alta expresión. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Grupo	Latencia de sueño / min	Duración del sueño / min
A	4.13 ± 1.80	49,75 ± 38,46
B	6.31 ± 2.80*	22.13 ± 11.41*
C	6,33 ± 2,60*	24,93 ± 14,43*
D	6,53 ± 1,90*	24,73 ± 17,59*

Tabla 1: Comparación de pruebas de sueño inducidas por pentobarbital sodio entre grupos tras el modelado. * indica P < 0,05 en comparación con el grupo de control.

Grupo	Frecuencia de crianza	Tiempo(s) de inmovilidad	Tiempo(s) de locomoción	Distancia de locomoción (m)	Tiempo en la Zona Central (S)	Distancia en la Zona Central (m)	Tiempo en la Zona de Esquina	Distancia en la Zona de la Esquina (m)	Tiempo en la Zona de Esquina	Distancia en la Zona Lateral (m)
A	1,875 ± 0,835	76.700 ± 34.324	103.350 ± 34.307	18.318 ± 16.314	8.750 ± 7.718	2.937 ± 5.112	103.000 ± 28.582	6.315 ± 3.893	56.600 ± 27.772	6,705 ± 3,666
B	7.125 ± 5.668	31.513 ± 10.964	148.488 ± 10.964	22.399 ± 9.159	16.275 ± 10.703	3.244 ± 2.991	75.088 ± 21.561	6.578 ± 1.972	85.463 ± 23.374	11.724 ± 4.959
Valor T	-2.592	3.547	-3.545	-0.617	-1.613	-0.146	2.205	-0.171	-2.249	-2.302
Valor p	0.035	0.007*	0.007*	0.547	0.129	0.886	0.045*	0.867	0.041*	0.037*

Tabla 2: El análisis de la influencia de cada nivel indicador entre el grupo de control (A) y el grupo de modelos (B).* indica que P < 0,05 en comparación con el grupo de control.

Grupo	Frecuencia de crianza	Tiempo(s) de inmovilidad	Tiempo(s) de locomoción	Distancia de locomoción (m)	Tiempo en la Zona Central (S)	Distancia en la Zona Central (m)	Tiempo en la Zona de Esquina	Distancia en la Zona de la Esquina (m)	Tiempo en la Zona de Esquina	Distancia en la Zona Lateral (m)
B	5.875 ± 2.295	29.819 ± 12.871	150.219 ± 12.867	19.165 ± 8.054	24.838 ± 13.068	3.178 ± 2.438	69.075 ± 13.992	5.823 ± 1.422	83.019 ± 15.464	9.878 ± 4.393
C	6,357 ± 0,627	35.993 ± 32.237	144.021 ± 32.246	23.291 ± 4.873	14.321 ± 3.774	3.106 ± 2.214	87.057 ± 12.658 △	8.087 ± 1.496 △	68.943 ± 9.240	10.420 ± 1.225
D	6,667 ± 1,633	30.808 ± 15.389	149.200 ± 15.380	18.584 ± 4.969	27.792 ± 12.460	3.085 ± 1.114	74.600 ± 22.248	5,744 ± 1,291▲	74.192 ± 17.011	9.465 ± 3.380

Tabla 3: Análisis de la influencia de cada nivel indicador entre el grupo modelo (B), el grupo Tuina (C) y el grupo antagonista (D). ^△P < 0,05 comparado con el grupo de modelos (B); ^▲P < 0,05 comparado con el grupo de Tuina (C).

Grupo	Orexin-A
A	1.011 ± 0.173
B	10.436 ± 2.512△
C	2,392 ± 0,998▲
D	3,227 ± 1,703▲

Tabla 4: Niveles de expresión de ARNm de Orexina-A en tejido hipotalámico. ^△P < 0,05 comparado con el grupo de control (A); ^▲P < 0,05 comparado con el grupo de modelos (B).

Grupo	Orexin-A
	Intensidad de la tinción	Porcentaje de células positivas	Puntuación porcentual	Partitura
A	3	40%	2	6
B	3	80%	4	12
C	3	75%	3	9
D	3	60%	3	9

Tabla 5: Puntuaciones de tinción inmunohistoquímica de Orexin-A en el hipotálamo de ratas de cada grupo. Criterios de puntuación de intensidad de tinción: 0 = tinción negativa (incolora), 1 = amarillo claro, 2 = marrón claro, 3 = marrón oscuro. Porcentaje de criterios de puntuación de celdas positivas: 0 = 0%, 1 = 1%–25%, 2 = 26%–50%, 3 = 51%–75%, 4 = 76%–100%. Puntuación total = puntuación de intensidad de mancha × puntuación porcentual. Las puntuaciones totales de 1–5 se definieron como baja expresión, y las de 6–12 como alta expresión.

Discusión

Este estudio tenía como objetivo evaluar la eficacia de Tuina en un modelo primario de rata de insomnio y explorar su posible mecanismo relacionado con el sistema de orexinas hipotalámicas. Los hallazgos actuales demuestran que un protocolo estandarizado de Tuina mejoró significativamente la latencia y duración del sueño, alivió conductas similares a la ansiedad y redujo eficazmente la sobreexpresión de Orexin-A tanto a nivel de ARNm como de proteínas en el hipotálamo. Cabe destacar que el efecto de Tuina fue comparable al del antagonista del receptor de orexina MK-4305, lo que sugiere que la modulación del sistema de orexinas podría ser un mecanismo clave mediante el cual Tuina alivia el insomnio.

En comparación con las intervenciones farmacológicas, Tuina, como terapia externa no invasiva, ofrece ventajas en seguridad, efectos secundarios mínimos y adherencia en el paciente^12,18. Sus beneficios terapéuticos para el insomnio están respaldados por evidencia clínica que muestra mejoras en la calidad del sueño y el estado psicológico^18,19. El mecanismo es multifacético, implicando la regulación del eje hipotálamo-hipófisis-suprarrenal, la homeostasis del sistema nervioso autónomo y neurotransmisores clave como 5-HT^18,20. Los resultados amplían esta comprensión al identificar el sistema de orexinas como un objetivo específico. Las neuronas de orexina son motores centrales de la vigilia, y su hiperexcitabilidad está relacionada con la inestabilidad del sueño 21,22,23. La regulación a la baja de la orexina-A observada tras Tuina parece ser coherente con el efecto del nuevo fármaco para el insomnio antagonista del receptor dual de orexina, lo que pone de manifiesto una posible vía convergente entre intervenciones farmacológicas y no^{farmacológicas 24,25}.

Aunque este estudio se basa en nuestro trabajo previamente publicado sobre la tuina abdominal y la regulación²⁵ de la orexina-A, el manuscrito actual representa una extensión sustancial y un refinamiento metodológico más allá del informe original. Concretamente, este estudio amplía el tamaño de la muestra a 64 ratas para mejorar la potencia estadística e introduce una batería exhaustiva de evaluaciones conductuales, incluyendo la prueba de campo abierto y las pruebas de sueño inducidas por pentobarbital, para evaluar sistemáticamente la arquitectura del sueño y los comportamientos similares a la ansiedad, que no se abordaron en el estudio anterior. A diferencia del trabajo anterior, que se centró principalmente en el estrés oxidativo y los neurotransmisores clásicos, este artículo prioriza la validación funcional del sistema de orexinas mediante resultados conductuales integrados y ensayos moleculares, sirviendo como una investigación mecanicista independiente que complementa en lugar de replicar los hallazgos previos.

El diseño experimental se adhiere a la teoría de la MTC centrándose en el abdomen y en puntos de acupuntura específicos como el Guanyuan (CV 4), que se cree tonifica el Qi primordial y regula la función visceral, dentro de una vía de manipulación en lazo^{cerrado 26,27}. Los parámetros (frecuencia, duración, curso) se estandarizaron basándose en trabajos preliminares para asegurar la consistencia y la reproducibilidad, un aspecto crucial para los estudios mecanicistas con^{animales 12}.

Sin embargo, este protocolo tiene limitaciones. Primero, la intervención se administró en un único punto temporal tras el modelado. Futuros estudios deberían investigar diferentes duraciones y frecuencias de intervención para establecer una relación óptima de "dosis-respuesta" para Tuina. En segundo lugar, este estudio es un diseño de investigación observacional. Aunque se encontró una correlación entre Tuina y la reducción de la expresión de Orexin-A y la mejora conductual, aún no está claro si esta asociación es un efecto directo o indirecto de Tuina u otros factores. Investigaciones futuras pueden utilizar estrategias experimentales como el knockout génico, la inhibición quimiogenética o el bloqueo de antagonistas para verificar aún más si Tuina mejora el comportamiento del insomnio al regular la expresión de Orexin-A, esclareciendo así su mecanismo causal. Finalmente, este estudio no estableció una operación simulada ni un grupo de control de intervención placebo. Sin embargo, este estudio ha tenido esto en cuenta durante el diseño, y todos los grupos de animales recibieron el mismo nivel de operaciones de agarre y fijación, que, en cierta medida, controlaban la influencia de factores de estrés no específicos. Además, la frecuencia, intensidad y vía de acción del programa Tuina en este estudio se estandarizaron basándose en experimentos preliminares para asegurar la consistencia y reproducibilidad de la intervención. La investigación futura debería centrarse en desarrollar métodos de control más rigurosos, como el uso de simulación sin contacto o estimulación táctil mínima, para aclarar los efectos específicos de las operaciones de Tuina.

Los pasos clave críticos para el éxito de este protocolo incluyen: primero, un control estricto de la temperatura del agua y las dimensiones de las plataformas en el método modificado de entorno acuático de múltiples plataformas; segundo, la titulación preexperimental de la dosis subumbral de sodio pentobarbital soso; tercero, la estandarización de los parámetros de manipulación de Tuina (frecuencia de 5–7 ciclos/min, manipulación en sentido antihorario y luego en sentido horario durante 5 minutos cada uno) y entrenamiento del operador; y cuarto, la rápida congelación del tejido hipotalámico en nitrógeno líquido seguida de una manipulación libre de RNasa para asegurar la estabilidad del ARNm de Orexina-A.

Las posibles modificaciones incluyen: primero, el desarrollo de un dispositivo automatizado mecánico Tuina para reducir la variabilidad entre operadores; segundo, el uso de telemetría EEG/EMG para sustituir la prueba de sueño pentobarbital sódico, permitiendo el monitoreo continuo de la etapa del sueño; y tercero, la combinación de enfoques quimiogenéticos u optogenéticos para verificar la necesidad de las neuronas de orexina en la mediación de los efectos de Tuina.

La reproducibilidad de este protocolo se basa en: trayectorias y parámetros operativos detallados, el uso de un fármaco control positivo, detección de doble dimensión tanto a nivel de proteínas como de ARNm, y informes estadísticos rigurosos. Su usabilidad práctica se refleja en los siguientes aspectos: bajos requisitos de equipamiento para pruebas de comportamiento sin necesidad de costosos sistemas de telemetría; un ciclo experimental total de solo 8 días para modelado y 14 días para intervención Tuina, que se completa en 4 semanas, lo que se ajusta bien a los ciclos de financiación y los calendarios de laboratorio de la mayoría de los proyectos de investigación rutinarios, facilitando la recogida rápida de datos y la validación metodológica. Además, el protocolo de manipulación de Tuina está claramente cuantificado en términos de trayectoria operativa (CV15 → CV4 → GB26 bilateral → retorno a CV15), frecuencia (5–7 ciclos/min), secuencia direccional (en sentido antihorario seguido de horario) y duración (10 minutos por sesión). Estas especificaciones permiten que diferentes operadores dominen la técnica tras un breve entrenamiento, reduciendo así el riesgo de mala reproducibilidad causada por diferencias individuales comúnmente observadas en estudios de manipulación manual.

Durante la implementación de este protocolo, pueden surgir varios problemas comunes y se recomiendan las medidas adecuadas de solución de problemas. Primero, las ratas pueden caerse de la plataforma durante el procedimiento modificado del entorno acuático múltiple de plataformas. Esto suele deberse a una superficie de plataforma excesivamente resbaladiza. La solución es rugar ligeramente la superficie de la plataforma con papel de lija fino para aumentar la fricción. Además, cada contenedor debe albergar solo una rata para evitar molestias mutuas. En segundo lugar, la prueba del sueño con pentobarbital sódico puede no mostrar diferencias significativas entre grupos. La solución es re-titular la dosis mínima subumbral en incrementos de 5 mg/kg durante los experimentos piloto utilizando una cohorte separada de animales (3–4 por grupo). Las inyecciones deben realizarse a la misma hora cada día (preferiblemente entre las 9:00 y las 11:00 de la mañana) para minimizar la variación circadiana. Tercero, las ratas pueden forcejear o vocalizar durante la manipulación de Tuina, lo que normalmente indica fuerza excesiva o una sujeción inadecuada. El operador debe reducir la fuerza aplicada hasta que la rata permanezca tranquila sin luchar. Se recomienda un entrenamiento previo con un maniquí con detección de presión para estandarizar la aplicación de la fuerza. La rata debe colocarse boca arriba con las cuatro extremidades fijadas suavemente pero de forma segura, asegurando la exposición total del abdomen. En cuarto lugar, la gran variabilidad en el porcentaje de células positivas para Orexerina-A dentro del mismo grupo experimental suele surgir de planos de sección inconsistentes a lo largo del hipotálamo, sesgo subjetivo de conteo o variación de lote a lote en la tinción. La solución recomendada es estandarizar el nivel anatómico refiriéndose a un atlas cerebral de rata (por ejemplo, Paxinos & Watson), recogiendo secciones coronales desde el bregma –1,8 mm hasta –3,3 mm para análisis hipotalámico. Dos observadores independientes cegados ante la asignación de grupos deben realizar el recuento de celdas, y debe usarse el valor medio. Todas las muestras para una medida de resultado dada deben teñirse en el mismo lote, y se fomenta el análisis semiautomatizado de umbrales usando ImageJ para reducir la subjetividad del observador.

En conclusión, este estudio estableció un protocolo estandarizado de intervención Tuina y un sistema de evaluación multinivel en un modelo primario de insomnio. Proporciona pruebas contundentes de que Tuina mejora los comportamientos de insomnio, potencialmente mediante un mecanismo que implica la supresión de la sobreexpresión hipotalámica de Orexina-A. Este marco metodológico no solo ofrece un paradigma reproducible para investigar los mecanismos centrales de Tuina, sino que también proporciona una referencia para estudios mecanicistas de otras intervenciones no farmacológicas para trastornos del sueño.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
5x All-In-One RT MasterMix	abm	G492	síntesis de cDNA
Acetilcolina (Ach)	Nanjing Jiancheng	A105-1	reactivo ELISA
Diapositivas de microscopio de adhesión	Jiangsu ShiTai Experimental Equipment Co., Ltd.	N/A	Montaje de secciones de tejido
Agarosa	Sangon Biotech (Shanghai)	A811BA0014	Electroforesis en gel
Etanol anhidro	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.	N/A	deshidratación de tejido
Diluyente de anticuerpos	Beijing ZSGB-Bio Technology Co., Ltd.	ZLI-9029	diluición de anticuerpos primarios
Cesto	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	N/A	Soporte de diapositivas
Polvo de citrato	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	MVS-0066	preparación de tampón de recuperación de antígeno
Cubreobjetos	Jiangsu ShiTai Experimental Equipment Co., Ltd.	N/A	microscopía
Kit de cromógeno DAB	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	DAB-1031	detección cromogénica
DEPC	Sangon Biotech (Shanghai)	B417BA0001	tratamiento libre de RNase
Dopamina (DA)	Wuhan Huamei Bioengineering Co., Ltd.	CSB-E08660r	reactivo ELISA
Célula de electroforesis	Beijing Liuyi Instrument Factory	DYCZ-21	Electroforesis en gel
Fuente de alimentación para electroforesis	Beijing Liuyi Instrument Factory	DYY-6C	Electroforesis en gel
EvaGreen Express 2× qPCR MasterMix-Low Rox	abm	G891 / MasterMix-EL	reactivo qPCR
Ácido gamma-aminobutírico (γ-GABA)	AMOKE	AE91068Ra	reactivo ELISA de neurotransmisor
Sistema de imagen de gel	Shanghai Tanon	2500	documentación de gel
H2O2 (30%)	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.	N/A	bloqueo de peroxidasa endógena
Solución de tinción de hematoxilina	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	CTS-1097	Contratinción
Centrífuga refrigerada de alta velocidad	Shanghai Lishen Scientific Equipment Co., Ltd.	Nefuqe 15R	centrifugación de muestras
Histamina (HIS)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	EH171-1	reactivo ELISA
Horno de aire caliente	Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.	Serie DHG	secado de muestras
Cámara de humedad para tinción IHC	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	BOX-1001	cámara de incubación húmeda
Kit de tinción para inmunohistoquímica	Beijing ZSGB-Bio Technology Co., Ltd.	SP9000	tinción IHC
Incubadora	Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.	DNP-9272	incubación a temperatura controlada
Cocina de inducción	Guangdong Midea Living Electric Manufacturing Co., Ltd.	C21-RK2101	fuente de calor
Lector de microplacas	Bio-Rad, China	xMark	medición de absorbancia
Microscopio	Nikon	E200	imagen microscópica
MK-4305	Meilun Bio	MB3773	reactivo experimental
Bálsamo neutro	Beijing ZSGB-Bio Technology Co., Ltd.	ZLI-9555	medio de montaje
Norepinefrina (NA)	Nanjing Jiancheng	H096	reactivo ELISA
Cuantificador de ácidos nucleicos y proteínas	Beijing Kaiao	K5500	cuantificación de ácidos nucleicos
Orexin A	Wuhan Huamei Bioengineering Co., Ltd.	CSB-E08860r	reactivo ELISA
Termociclador PCR	Bio-Rad, USA	MyCycler Thermal Cycler	amplificación PCR
Solución tamponada con fosfato (PBS)	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	PBS-0060/0061	búfer de lavado
Pipeta	Eppendorf, Alemania	Dragon lab	manipulación de líquidos
Olla a presión	Zhejiang Supor Co., Ltd.	YW20F1	recuperación de antígeno
Kit de cuantificación de proteínas	TransGen Biotech	DQ111-01	kit de ensayo de proteínas BCA
Anticuerpo policlonal de conejo anti-HCRT (Orexin-A)	Sangon Biotech (Shanghai)	D163595	anticuerpo primario
Instrumento de PCR en tiempo real	ABI (Thermo Fisher)	QuantStudio 6 Flex	análisis qPCR
Refrigerador	Hefei Meiling Co., Ltd.	BCD-249LCK	almacenamiento de muestras
Serotonina (5-HT)	Wuhan Huamei Bioengineering Co., Ltd.	CSB-E08364r	reactivo ELISA
Recipiente de tinción	Genérico	N/A	contenedor de tinción de diapositivas
Pluma super inmunohistoquímica	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	PEN-0002	pluma de barrera hidrofóbica
Marcador de ADN Trans2K	TransGen Biotech	BM101	escalera de ADN
Reactivo TRIzol	Ambion	15596026	extracción de ARN
Mezclador vortex	Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co., Ltd.	GL-88B	mezclador de laboratorio
Xileno	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.	N/A	deparaffinización