Expresión de la proteína lectora de m6A YTHDC2 en cáncer de pulmón de células no pequeñas en una cohorte clínica china

Resumen

Este estudio evalúa la expresión de YTHDC2 en el cáncer de pulmón de células no pequeñas mediante bioinformática y qRT-PCR. Si bien los análisis de bases de datos sugieren una regulación negativa y relevancia pronóstica, la validación clínica no muestra diferencias significativas. Los hallazgos destacan inconsistencias, lo que indica una precisión diagnóstica limitada y la necesidad de una mayor validación antes de su aplicación clínica.

Resumen

El cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) sigue siendo una de las principales causas de mortalidad relacionada con el cáncer en todo el mundo, con biomarcadores limitados disponibles para el diagnóstico temprano y el pronóstico. La modificación del ARN por N6-metiladenosina (m6A) y sus proteínas lectoras, como YTHDC2, desempeñan funciones cruciales en la regulación génica y la tumorigénesis. Este estudio tiene como objetivo evaluar el perfil de expresión de YTHDC2 en tejidos de NSCLC mediante bioinformática y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR), analizar la relación entre YTHDC2 y las características clínico-patológicas, y explorar su posible relevancia clínica y biológica para investigaciones futuras. Se analizaron datos de expresión génica y supervivencia procedentes de bases de datos para evaluar la precisión pronóstica. La expresión de YTHDC2 se cuantificó en tejidos de NSCLC de una cohorte clínica china, y se analizaron las características clínico-patológicas. Los análisis de bases de datos públicas mostraron que YTHDC2 estaba subregulado en tejidos de NSCLC (p < 0,05) y se asociaba con la supervivencia del paciente, aunque su rendimiento pronóstico fue pobre (AUC ≈ 0,5). El análisis mediante qRT-PCR de 19 tejidos pareados de tumor y tejido normal adyacente no mostró diferencias estadísticamente significativas (p = 0,537) en la expresión de YTHDC2 entre los tejidos cancerosos y adyacentes. En conjunto, los análisis de bases de datos públicas sugieren que YTHDC2 podría estar subregulado y tener una posible relevancia pronóstica en el NSCLC, pero la validación clínica independiente en nuestra cohorte no confirmó una expresión diferencial significativa. Estos hallazgos destacan una heterogeneidad sustancial entre conjuntos de datos a gran escala y cohortes del mundo real, lo que indica que YTHDC2 probablemente no sirva como biomarcador diagnóstico o pronóstico fiable por sí solo y podría requerir integración con otros marcadores moleculares para su aplicabilidad clínica.

Introducción

El cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP), que incluye el carcinoma de células escamosas y el adenocarcinoma, es el tipo de cáncer de pulmón más frecuentemente diagnosticado y una de las principales causas de mortalidad oncológica mundial¹. Las estadísticas mundiales sobre el cáncer indican que esta enfermedad es una de las principales causas de muerte por cáncer². Los avances recientes en el diagnóstico, la cirugía, la radioterapia y la terapia dirigida molecular no han mejorado significativamente el pronóstico del CPCNP, ya que el diagnóstico inicial suele producirse en una etapa avanzada y la enfermedad frecuentemente es asintomática en sus fases iniciales³. Esto resalta la necesidad de nuevos biomarcadores para identificar, predecir el pronóstico y evaluar la eficacia del tratamiento en pacientes con CPCNP.

m6A es la primera modificación del ARN identificada y la más abundante en eucariotas, y se ha implicado en la estabilidad del ARN, la traducción y la transcripción⁴. Las modificaciones m6A son dinámicas y reversibles, facilitadas por metiltransferasas (escritores), desmetilasas (borradores) y proteínas de unión específicas (lectores)⁵. Entre estas, YTHDC2, una proteína lectora principal de m6A, modula la estabilidad del ARN y la tasa de traducción⁶. Estudios recientes indican que YTHDC2 está implicado en la regulación de múltiples tipos de cáncer, ya sea suprimiendo el crecimiento celular y la invasión o induciendo la muerte celular⁷. También se ha destacado la relevancia clínica de otras proteínas lectoras de m6A, incluyendo YTHDF1, YTHDF2 y YTHDC1, en la progresión del cáncer de pulmón, la regulación inmunitaria y el pronóstico, lo que subraya la importancia de evaluar sistemáticamente cada lector de m6A en cohortes independientes de pacientes^8,9,10. En el CPHN, los niveles de YTHDC2 son significativamente bajos, lo que se ha asociado con estadios tumorales avanzados, metástasis en ganglios linfáticos y mal pronóstico para los pacientes, lo que sugiere que podría ser un factor antitumoral¹¹. Experimentos in vitro e in vivo también revelan que la alta expresión de YTHDC2 inhibe la proliferación celular y la metástasis en el cáncer de pulmón⁷.

En este estudio, se investigó la regulación de YTHDC2 en el CPHN mediante análisis computacionales integrados y validación experimental mediante qRT-PCR. También se examinó la relación entre la expresión de YTHDC2 y las características clínico-patológicas y el pronóstico del paciente. A pesar de la creciente evidencia proveniente de bases de datos públicas que sugieren una desregulación de YTHDC2 en el CPHN, los estudios publicados han reportado hallazgos inconsistentes respecto a la magnitud y el significado clínico de esta desregulación, y la validación independiente en cohortes clínicas bien caracterizadas del mundo real, particularmente en poblaciones asiáticas, sigue siendo limitada. Además, la mayoría de los estudios previos se han basado predominantemente en conjuntos de datos transcriptómicos públicos o modelos experimentales, con relativamente pocos que integren hallazgos de bioinformática con validación clínica independiente. Al combinar análisis transcriptómicos públicos a gran escala con validación independiente mediante qRT-PCR en una cohorte clínica china, este estudio tuvo como objetivo evaluar la reproducibilidad de hallazgos previos y abordar la brecha traslacional entre los análisis de bases de datos públicas y las muestras clínicas del mundo real. Por lo tanto, este estudio buscó evaluar sistemáticamente la expresión de YTHDC2 mediante enfoques integrados de bioinformática y validación clínica, y determinar su posible relevancia biológica y clínica en el CPHN. Se planteó la hipótesis de que la expresión de YTHDC2 está desregulada en el CPHN, y de que la integración de análisis de bioinformática con validación clínica independiente proporcionaría una evaluación más confiable de su significado diagnóstico y pronóstico que cualquiera de los enfoques por separado.

Protocolo

El estudio fue aprobado por el Comité Ético de la Universidad Médica de Hainan (número de aprobación HMC1984.24) y se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki (revisada en 2013).

Sujetos del estudio

Se realizó un estudio con 50 pacientes con cáncer de pulmón diagnosticados entre 2017 y 2024 en el Hospital Central de Sanya, en la provincia de Hainan, utilizando las Guías Clínicas de la Asociación Médica China para el Diagnóstico y Tratamiento del Cáncer de Pulmón (Edición 2024). La estadificación CSCO (2024) se alineó con la 8.ª edición del AJCC para permitir la comparabilidad entre estudios, tal como se ha validado en cohortes chinas¹², con revisiones independientes por dos oncólogos para garantizar la consistencia. El proceso de selección de pacientes, la disponibilidad de tejidos, la evaluación de la calidad del ARN y la inclusión final de muestras para el análisis mediante qRT-PCR se resumen en la Figura 1.

Datos del estudio

Este estudio utilizó bioinformática para analizar los niveles de expresión de YTHDC2 en el CPHN y su relación con características clínico-patológicas, aportando información sobre posibles mecanismos. Los análisis bioinformáticos se realizaron exclusivamente utilizando datos públicos de secuenciación de ARN del Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA), incluyendo muestras de adenocarcinoma de pulmón (LUAD), carcinoma de células escamosas de pulmón (LUSC) y tejidos pulmonares normales correspondientes descargados a través del Portal de Datos GDC (https://portal.gdc.cancer.gov/). El conjunto de datos descargado incluyó datos de expresión de ARN por secuenciación junto con variables clínicas disponibles (identificador del paciente, identificador de la muestra, edad, sexo, estadio patológico, estado de supervivencia y tiempo de supervivencia global) para los casos elegibles de TCGA-LUAD y TCGA-LUSC. Las muestras que carecían de información sobre expresión génica o supervivencia fueron excluidas de los análisis posteriores de supervivencia y ROC. El conjunto de datos utilizado en este estudio se proporciona como Archivo Suplementario 1. No se utilizaron especímenes clínicos recolectados en el Hospital Central de Sanya para los análisis bioinformáticos. Los procedimientos detallados para los análisis GEPIA, Kaplan-Meier Plotter y survivalROC se proporcionan en la sección Análisis bioinformático a continuación. El flujo de trabajo completo de bioinformática, que incluye la adquisición de datos, preprocesamiento, análisis de expresión génica, análisis de supervivencia y análisis ROC, se resume en Figura 2.

Criterios de inclusión y exclusión

Los criterios de inclusión y exclusión de los pacientes se presentan en la Tabla 1. Un análisis de potencia realizado con software de análisis estadístico determinó que al menos 26 casos por grupo proporcionarían una potencia del 80 % para detectar un tamaño del efecto moderado (d = 0,8, α = 0,05, bilateral). Aunque la inscripción inicial tenía como objetivo incluir 50 pares en el grupo de cáncer de pulmón, el análisis final de qRT-PCR incluyó 30 muestras tumorales y 19 muestras de tejido adyacente normal tras las exclusiones por calidad del tejido o del ARN. Esta reducción en el tamaño de la muestra refleja las limitaciones clínicas del mundo real y resalta la importancia de la integridad del ARN y la disponibilidad del tejido en estudios traslacionales. Con n = 19 para las comparaciones, el tamaño mínimo del efecto detectable es d = 1,0 (80 % de potencia, α = 0,05). Por lo tanto, el experimento tuvo potencia suficiente para detectar diferencias grandes, pero no pequeñas a moderadas, en la expresión de YTHDC2.

Espécimenes de tejido y PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)

Los diagnósticos patológicos se determinaron de forma doble ciega por dos patólogos diferentes. La pureza tumoral fue estimada por los patólogos (>70% de células malignas) y confirmada mediante ESTIMATE (TCGA). Los tejidos normales adyacentes se macrodisectaron para minimizar la contaminación estromal. Los tipos histológicos de cáncer de pulmón incluyeron adenocarcinoma de pulmón y carcinoma de células escamosas, con 26 casos de adenocarcinoma de pulmón y 4 casos de carcinoma de células escamosas. La estadificación clínica de los 50 pacientes con cáncer de pulmón se realizó según los criterios de estadificación descritos en las "Guías Clínicas de la Asociación Médica China para el Cáncer de Pulmón (Edición 2024)". Los especímenes de CPHN confirmados patológicamente (n = 50) representaron distribuciones clínicas típicas (véase Tabla 2). De los 50 pacientes inicialmente incluidos, 30 muestras de tejido tumoral y 19 muestras apareadas de tejido normal adyacente cumplieron con los criterios de calidad del ARN. Dado que el análisis estadístico apareado requiere especímenes apareados del mismo paciente, la comparación de la expresión en tejido tumoral frente al tejido normal adyacente se realizó utilizando los 19 pares apareados disponibles. Estos especímenes clínicos se utilizaron exclusivamente para la validación experimental mediante qRT-PCR y se analizaron independientemente de los conjuntos de datos públicos de TCGA empleados para el análisis bioinformático. Estos especímenes seleccionados se procesaron inmediatamente después de la confirmación patológica y se manipularon en condiciones libres de RNasas antes de la extracción de ARN. Este subconjunto refleja los casos en los que se pudo obtener tanto una cantidad adecuada de tejido como ARN total de alta calidad (número de integridad del ARN, RIN >7,0). La concentración y pureza del ARN total se midieron antes de la transcripción inversa, y solo se incluyeron para el análisis posterior las muestras con calidad adecuada de ARN (RIN >7,0). Cantidades iguales de ARN total se transcribieron inversamente a ADN complementario (ADNc) según el protocolo del fabricante antes de la PCR cuantitativa. Este proceso aseguró la validez de los datos de expresión génica analizados. Los experimentos de qRT-PCR se llevaron a cabo en un termociclador de PCR en tiempo real utilizando un ensayo de PCR cuantitativa basado en sondas. Todas las reacciones se realizaron por triplicado, junto con controles sin plantilla para garantizar la reproducibilidad analítica. La amplificación por PCR se realizó bajo las siguientes condiciones de ciclado: una etapa inicial de activación/desnaturalización de la enzima a 95 °C durante 10 min, seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 15 s y hibridación/extensión a 60 °C durante 60 s. Las señales de fluorescencia se adquirieron al final de cada ciclo de amplificación. Todos los reactivos y materiales desechables se obtuvieron de proveedores comerciales (véase Tabla de Materiales). Las secuencias de los cebadores y sondas utilizadas en la qRT-PCR se proporcionan en la Tabla 3.

Análisis de bioinformática

Análisis de la expresión del gen YTHDC2 mediante la base de datos GEPIA

Se utilizó la base de datos GEPIA para analizar la expresión de YTHDC2 en el CPHN. Se accedió al servidor web de GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/) mediante un navegador web. Se seleccionó el módulo Expression DIY, se introdujo el símbolo del gen "YTHDC2", se seleccionaron los conjuntos de datos LUAD y LUSC, se mantuvieron los parámetros de normalización predeterminados y se generaron directamente mediante la interfaz de GEPIA los diagramas de caja de expresión diferencial. La significancia estadística se definió como p < 0,05.

Base de datos del trazador de Kaplan-Meier para el análisis de supervivencia de pacientes con cáncer de pulmón

El estudio analizó la relación entre la expresión de YTHDC2 y el pronóstico en pacientes con cáncer de pulmón utilizando la base de datos Kaplan-Meier Plotter. Se seleccionó el conjunto de datos de cáncer de pulmón, se introdujo el símbolo del gen "YTHDC2", se aplicó la opción de corte óptimo seleccionada automáticamente y se generaron curvas de Kaplan-Meier para la supervivencia global y la supervivencia tras la progresión utilizando la configuración predeterminada del análisis. Los pacientes se estratificaron automáticamente en grupos de alta y baja expresión mediante el valor de corte óptimo determinado por la plataforma Kaplan-Meier Plotter, y se calcularon riesgos relativos con sus intervalos de confianza del 95 % correspondientes utilizando la configuración predeterminada de la plataforma.

Ejecución de paquetes de R en el software R para la elaboración de curvas ROC

Se descargaron del Portal de Datos GDC los datos de expresión de secuenciación de ARN y los metadatos clínicos correspondientes para los casos elegibles de TCGA-LUAD y TCGA-LUSC. Los conjuntos de datos descargados se fusionaron por identificador de paciente e importados a R para análisis posteriores. Se utilizó el paquete survivalROC para generar curvas ROC dependientes del tiempo en puntos de predicción a 1, 3 y 5 años, y se calcularon los valores correspondientes del área bajo la curva (AUC) para evaluar el desempeño pronóstico de la expresión de YTHDC2. Solo se incluyeron en el análisis de ROC de supervivencia los pacientes con datos disponibles de expresión por ARN-seq e información de supervivencia de TCGA-LUAD y TCGA-LUSC. La cohorte clínica local no se utilizó para la predicción de supervivencia porque no había datos disponibles de seguimiento a largo plazo.

Expresión tisular de YTHDC2 mediante qRT-PCR

Para analizar los niveles de expresión génica, se realizó una qRT-PCR. Se agregaron volúmenes iguales de ADNc a cada reacción según las condiciones recomendadas por el fabricante. La amplificación se llevó a cabo utilizando un ensayo de PCR cuantitativa basado en sondas, y los datos de fluorescencia se recopilaron automáticamente al final de cada ciclo de amplificación. Breve­mente, el proceso de extracción de ARN incluyó varios pasos, entre ellos la preparación de la muestra, desparafinización, eliminación del líquido residual, digestión con proteinasa K, incubación, centrifugación, tratamiento con DNasa, adición de DNasa I y precipitación con etanol. Luego, la muestra se unió a una columna de purificación de ARN basada en sílice y se centrifugó a 8.000 × g durante 30 s. A continuación, la columna se lavó con tampón de lavado 1, tampón de lavado 2 y tampón de lavado 2 diluido con etanol, y se secó a 13.000 × g durante 2 min. El ARN se eluyó entonces añadiendo 70 µL de Agua Libre de RNasa al centro de la membrana de la columna, seguido de una centrifugación a 13.000 × g durante 1 min. Cada par de cebadores mostró un único producto de amplificación, lo cual se confirmó mediante análisis de la curva de fusión antes de calcular la expresión génica relativa. La eficiencia de los cebadores (90–110 %) se validó utilizando curvas estándar antes del análisis de las muestras. Los análisis de la curva de fusión confirmaron la presencia de amplicones únicos y la ausencia de dímeros de cebadores. La expresión relativa de YTHDC2 se calculó mediante el método 2^-ΔCt, en el cual los valores de Ct se normalizaron respecto al gen de referencia endógeno GAPDH. Dado que los valores de expresión se presentaron como niveles de expresión normalizados en lugar de cambios en el número de copias respecto a una muestra calibradora, los resultados se reportan como valores de 2^−ΔCt. Se seleccionó GAPDH como gen de referencia porque su expresión mostró una variabilidad mínima (CV < 5 %) en comparación con las alternativas evaluadas (ACTB, CV = 12 %; 18S ARNr, CV = 18 %), lo cual es consistente con los criterios de selección de genes de referencia en estudios de m6A.

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando software estadístico, incluida la creación de gráficos y diagramas. Para analizar los datos cuantitativos y categóricos sobre la expresión del gen YTHDC2 en pacientes con carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), se utilizó el software R para los análisis bioinformáticos y la generación de curvas ROC. Las curvas ROC y el área bajo la curva (AUC) se utilizaron para evaluar el rendimiento diagnóstico de la expresión de YTHDC2 en la predicción de la supervivencia. En los análisis basados en regresión, se informaron las estimaciones del efecto (razones de momios) junto con sus intervalos de confianza del 95 % correspondientes, cuando fue aplicable. Se utilizó la prueba de Wilcoxon de rangos con signo para comparar la expresión de YTHDC2 entre muestras pareadas de tejido tumoral y tejido normal adyacente, mientras que el análisis de correlación de Pearson se empleó para evaluar la asociación entre la expresión de YTHDC2 y las características clínico-patológicas. Se informaron los coeficientes de correlación (r) y los valores p correspondientes. Dado que los datos de qRT-PCR consistían en muestras pareadas de tejido tumoral y tejido normal adyacente provenientes de los mismos pacientes, y que los datos de expresión génica no presentaban distribución normal, se utilizó la prueba de Wilcoxon de rangos con signo para comparar los niveles de expresión de YTHDC2 entre los tejidos pareados. Esta prueba no asume normalidad de los datos y se utiliza comúnmente con datos biológicos asimétricos. Todas las pruebas estadísticas fueron bilaterales, y se consideró estadísticamente significativo un valor de p <0,05. Las variables continuas se evaluaron previamente para determinar su normalidad antes del análisis. Las variables continuas se presentan como media ± desviación estándar o mediana (rango intercuartílico), según correspondiera.

Resultados

Expresión del gen YTHDC2 en tumores según la base de datos TCGA

Figura 3 ilustra la asociación entre el carcinoma de pulmón no microcítico y YTHDC2 mediante el análisis de los niveles de expresión de YTHDC2 en diferentes tipos de cáncer utilizando la herramienta GDC en la base de datos TCGA.

Expresión del gen YTHDC2 en el CPHN en la base de datos GEPIA

Se obtuvieron 483 muestras de tejido de adenocarcinoma pulmonar, 347 muestras de tejido pulmonar normal, 486 muestras de tejido de carcinoma de células escamosas de pulmón y 338 muestras de tejido pulmonar normal mediante un cribado adicional de los niveles de expresión de YTHDC2 en adenocarcinoma pulmonar (LUAD) y carcinoma de células escamosas de pulmón (LUSC) dentro de la base de datos GEPIA. Mediante análisis estadísticos, se encontró que tanto los tejidos de adenocarcinoma pulmonar como los de carcinoma de células escamosas de pulmón exhiben niveles considerablemente más bajos de expresión de YTHDC2 en comparación con los tejidos pulmonares normales (p < 0.05), como se ilustra en la Figura 4.

Análisis GEPIA de la expresión de YTHDC2 en las distintas etapas patológicas

Se utilizó la base de datos GEPIA (Análisis Interactivo de Perfiles de Expresión Génica) para generar un gráfico por etapas con el fin de evaluar la expresión diferencial de YTHDC2 en las distintas etapas del CPHN. Como se muestra en la Figura 5, no se observaron diferencias estadísticamente significativas en la expresión de YTHDC2 entre las etapas patológicas del CPHN (p = 0.644).

Análisis de Kaplan-Meier de YTHDC2 y supervivencia en cáncer de pulmón

Se utilizó la base de datos Kaplan-Meier Plotter para realizar un análisis de supervivencia de Kaplan-Meier del gen YTHDC2. Según los resultados, los pacientes con alta expresión de YTHDC2 tuvieron una supervivencia general (OS) significativamente mayor que aquellos con baja expresión (p < 0,05). Como se muestra en Figura 6A (OS), los pacientes con cáncer de pulmón que expresaron niveles más altos de YTHDC2 tuvieron un mejor pronóstico, y esta diferencia fue estadísticamente significativa (p < 0,05). Según la Figura 6B (PPS), el grupo con alta expresión de YTHDC2 tuvo un mejor pronóstico que el grupo con baja expresión en el conjunto de datos de Supervivencia Post-Progressión (PPS); la diferencia fue estadísticamente significativa (p < 0,05).

Modelo de predicción de la tasa de supervivencia de YTHDC2

El análisis ROC dependiente del tiempo basado en los datos de expresión de ARN-seq y supervivencia de TCGA reveló una capacidad predictiva limitada de la expresión de YTHDC2 por sí sola para la supervivencia en el CPHN, con valores de AUC de 0,50 (IC del 95 %: 0,38-0,62), 0,51 (IC del 95 %: 0,39-0,63), 0,52 (IC del 95 %: 0,40-0,64) y 0,52 (IC del 95 %: 0,39-0,65) a 1, 3, 5 y 8 años, respectivamente (Figura 7). Todos los intervalos de confianza del AUC incluyeron el valor 0,5, lo que indica un rendimiento equivalente al azar. Estos hallazgos indican que la expresión de YTHDC2 por sí sola carece de poder discriminatorio para la predicción de la supervivencia y no debería considerarse un biomarcador pronóstico independiente. La integración con variables clínico-patológicas o firmas de múltiples genes podría mejorar el rendimiento predictivo.

Expresión de YTHDC2 en tejidos tumorales frente a tejidos normales mediante qRT-PCR

Se investigó la expresión del gen YTHDC2 en tejidos malignos y adyacentes normales de pacientes con NSCLC mediante qRT-PCR. La expresión normalizada de YTHDC2 (2^−ΔCt) fue de 3,24 ± 2,34 en los tejidos malignos y de 3,60 ± 1,70 en los tejidos normales cercanos. No hubo una diferencia significativa en la expresión de YTHDC2 entre 19 tejidos tumorales de NSCLC emparejados y sus tejidos normales adyacentes correspondientes (p = 0,537), como se muestra en Figura 8. Aunque el análisis bioinformático de grandes conjuntos de datos sugirió una regulación negativa significativa de YTHDC2 en NSCLC, la qRT-PCR en nuestra cohorte no mostró diferencias significativas, lo que resalta posibles discrepancias debidas al tamaño de la cohorte, la heterogeneidad de las muestras y la variabilidad técnica. Además, el bajo valor de AUC (0,5) indica que YTHDC2 por sí solo carece de precisión diagnóstica o pronóstica.

Expresión de YTHDC2 y características clínico-patológicas en el CPNM

Este estudio incluyó a 50 individuos con carcinoma de pulmón no microcítico (NSCLC). Hubo 32 pacientes hombres (64,00 %) y 18 pacientes mujeres (36,00 %), con una edad media de 63,10 ± 9,85 años. Su edad oscilaba entre 37 y 86 años. De los pacientes, 25 habían fumado en el pasado y 25 nunca habían fumado. Entre los tipos patológicos se encontraron nueve casos de carcinoma de células escamosas (18,00 %) y cuarenta y un casos de adenocarcinoma de pulmón (82,0 %). Veintidós pacientes se encontraban en estadios III-IV (44,00 %) y 28 en estadios I-II (56,00 %) según la clasificación clínica de CSCO. Veinticuatro pacientes no presentaban metástasis en ganglios linfáticos, mientras que veintiséis individuos (54,00 %) sí las tenían. Nueve pacientes tenían cánceres poco diferenciados (18,00 %), mientras que 41 pacientes tenían tumores bien a moderadamente diferenciados (82,00 %).

Se examinó la asociación entre las características clínico-patológicas y los niveles de expresión de YTHDC2 en tejidos de CPHN. Se observaron diferencias en la expresión de YTHDC2 entre los subtipos patológicos y según el estado de metástasis en ganglios linfáticos (p < 0,05). Sin embargo, dado que solo se dispuso de cuatro muestras de carcinoma de células escamosas, la comparación entre subtipos patológicos debe interpretarse con cautela y considerarse exploratoria. Como se muestra en las Figuras 9A,B, la expresión de YTHDC2 fue significativamente mayor en el carcinoma de células escamosas que en el adenocarcinoma de pulmón, y significativamente mayor en los tejidos de CPHN con metástasis en ganglios linfáticos que en aquellos sin metástasis (5,70 ± 2,53 frente a 3,83 ± 0,91, p = 0,027). No obstante, debido a que solo se incluyeron cuatro muestras de carcinoma de células escamosas, la comparación entre subtipos patológicos debe interpretarse con precaución y considerarse preliminar hasta su validación en cohortes más grandes. Una expresión más alta de YTHDC2 en pacientes con metástasis en ganglios linfáticos podría indicar una posible asociación entre YTHDC2 y el estado metastásico en ganglios linfáticos; sin embargo, este hallazgo debe interpretarse con cautela debido al tamaño limitado de la muestra y requiere validación en cohortes independientes más grandes. Por otro lado, la edad, la historia de tabaquismo, la etapa clínica CSCO y la diferenciación histológica no afectaron significativamente la expresión de YTHDC2 (p > 0,05). Se incluye información adicional en la Tabla 4, la Tabla 5 y la Figura 9.

Regresión logística binaria de metástasis en ganglios linfáticos en el CCRP

De acuerdo con el análisis de correlación, la expresión de YTHDC2 se asoció significativamente con metástasis en ganglios linfáticos (p < 0,05). Utilizando la metástasis en ganglios linfáticos como variable dependiente y la edad, el sexo, los antecedentes de tabaquismo, la etapa tumoral, el tipo histopatológico, el nivel de expresión de YTHDC2 y el grado de diferenciación como variables independientes, se realizó un análisis de regresión logística binaria en pacientes con carcinoma de pulmón no microcítico (NSCLC). Los resultados mostraron que la expresión de YTHDC2 en pacientes con NSCLC se asoció significativamente con metástasis en ganglios linfáticos (p = 0,027, OR = 2,286, IC del 95 %: 1,101–4,748).

En los datos clínicos generales, la etapa tumoral de los pacientes con CPNM se correlacionó estadísticamente de manera significativa con la metástasis en ganglios linfáticos (p = 0.007, OR = 27, IC del 95 %: 2,504-291,186). Sin embargo, la edad, el sexo, la historia de tabaquismo, el tipo histopatológico y el grado de diferenciación no mostraron una correlación significativa con la metástasis en ganglios linfáticos en el CPNM (p > 0,05), como se muestra en la Tabla 6.

Disponibilidad de datos: Los conjuntos de datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el repositorio Zenodo (DOI: 10.5281/zenodo.21409961). El repositorio incluye los metadatos clínicos de TCGA, anotaciones de muestras, especificaciones de recuperación de datos y el manifiesto de análisis utilizados para los análisis de bioinformática. Datos adicionales están disponibles por solicitud razonable al autor correspondiente.

Figura 1: Diagrama de flujo de la selección de pacientes y la inclusión de tejidos para el análisis de qRT-PCR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Flujo de trabajo de los análisis bioinformáticos realizados para evaluar la expresión y el significado pronóstico de YTHDC2 en el CPHN Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Expresión del gen YTHDC2 en la base de datos TCGA. Los niveles de expresión del gen YTHDC2 en adenocarcinoma de pulmón (LUAD) y carcinoma de pulmón de células escamosas (LUSC) se compararon con los de tejidos pulmonares normales utilizando datos de secuenciación de ARN obtenidos de The Cancer Genome Atlas (TCGA) a través del portal de datos Genomic Data Commons (GDC) y analizados mediante la plataforma web GEPIA. Los datos fueron analizados a través de la plataforma GEPIA. La significancia estadística se determinó con un valor de p < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Expresión diferencial de YTHDC2 en el CPHN según el análisis de la base de datos GEPIA. Los niveles de expresión de YTHDC2 en adenocarcinoma de pulmón (LUAD) y carcinoma de pulmón de células escamosas (LUSC) se compararon con los de tejidos pulmonares normales utilizando datos de los proyectos The Cancer Genome Atlas (TCGA) y Genotype-Tissue Expression (GTEx) mediante la plataforma GEPIA. Los gráficos de caja representan niveles normalizados de expresión génica. La significancia estadística se determinó con un valor p < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Análisis de expresión por etapas de YTHDC2 en el CPHN utilizando la base de datos GEPIA. Los niveles de expresión de YTHDC2 se analizaron en diferentes estadios patológicos (I-IV) del CPHN mediante la plataforma GEPIA. El gráfico por estadios muestra la variación en la expresión génica a través de las etapas del tumor. No se observaron diferencias estadísticamente significativas en la expresión de YTHDC2 entre los estadios (p = 0.644). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Análisis de supervivencia de Kaplan-Meier de la expresión de YTHDC2 en pacientes con CPHN (Kaplan-Meier Plotter). (A) Supervivencia global (SG): curvas de supervivencia de Kaplan-Meier que comparan la supervivencia global en pacientes con CPHN estratificados en grupos de alta (n = 140) y baja (n = 364) expresión de YTHDC2, utilizando el punto de corte óptimo proporcionado por la herramienta Kaplan-Meier Plotter (“auto-select best cutoff”). Se utilizó la prueba log-rank para evaluar la significancia estadística (p = 0,0093); razón de riesgo (HR) = 0,61; intervalo de confianza del 95 % (IC): 0,42–0,89. Una expresión elevada de YTHDC2 se asocia con una supervivencia global significativamente mejor. (B) Supervivencia tras la progresión (STP): curvas de supervivencia de Kaplan-Meier que comparan la supervivencia tras la progresión en pacientes con CPHN estratificados en grupos de alta (n = 181) y baja (n = 296) expresión de YTHDC2, utilizando el punto de corte óptimo (“auto-select best cutoff”) proporcionado por la herramienta Kaplan-Meier Plotter. Se utilizó la prueba log-rank para la comparación estadística (p = 4,2 × 10⁻⁵); razón de riesgo (HR) = 0,63 (intervalo de confianza del 95 %: 0,51–0,79). Una expresión alta de YTHDC2 se asocia con una supervivencia tras la progresión significativamente más larga. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Modelo de predicción de la tasa de supervivencia de YTHDC2. Curvas de característica operativa del receptor (ROC) que evalúan la precisión predictiva de YTHDC2 para la supervivencia global en pacientes con TCGA-LUAD y TCGA-LUSC con datos disponibles de expresión mediante RNA-seq y datos de supervivencia en puntos temporales de 1, 3, 5 y 8 años. Valores de AUC: 1 año = 0.50, 3 años = 0.51, 5 años = 0.52 y 8 años = 0.52. La línea diagonal punteada indica azar aleatorio (AUC = 0.5). El análisis se realizó utilizando el paquete survival ROC en R. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Expresión de YTHDC2 en tejidos tumorales de CPHN y tejidos normales adyacentes apareados medida mediante qRT-PCR. La expresión relativa de YTHDC2 se calculó utilizando el método 2^–ΔCt y se normalizó respecto a GAPDH. Los valores de expresión representan niveles de expresión normalizados, no cambios en el número de copias respecto a una muestra calibradora. El análisis estadístico se realizó utilizando los 19 pares apareados de tejidos tumorales y normales adyacentes disponibles para comparación apareada. Los datos se presentan como observaciones apareadas individuales con media ± desviación estándar. Las diferencias entre muestras apareadas se analizaron mediante la prueba de rangos con signo de Wilcoxon (p = 0.537). Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 9: Asociación entre la expresión de YTHDC2 y las características clinicopatológicas en pacientes con CPNM. (A) Expresión de YTHDC2 en diferentes tipos histopatológicos, que muestra una expresión mayor en el carcinoma de células escamosas que en el adenocarcinoma (p < 0,05). (B) Expresión de YTHDC2 según el estado de metástasis en ganglios linfáticos, que demuestra una expresión mayor en pacientes con metástasis en ganglios linfáticos que en aquellos sin metástasis (p < 0,05). (C) Expresión de YTHDC2 en diferentes grados de diferenciación histológica, sin diferencias estadísticamente significativas (p = 0,181). (D) Expresión de YTHDC2 según las etapas clínicas del CSCO, sin diferencias estadísticamente significativas (p = 0,08). Los niveles de expresión de YTHDC2 se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) y se calcularon utilizando el método 2^–ΔCt, normalizados respecto a GAPDH. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE). Las comparaciones estadísticas se realizaron utilizando la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. *Se consideró estadísticamente significativo un valor de p < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

N.º	Criterios de inclusión	Criterios de exclusión
1	Edad ≥18 años, independientemente del sexo.	Diagnóstico de otras neoplasias malignas.
2	Diagnóstico confirmado de CPHN según las Guías Clínicas de la Asociación Médica China para el Cáncer de Pulmón (Edición 2024).	Presencia de enfermedades respiratorias o cardiovasculares crónicas (por ejemplo, EPOC, cor pulmonale, insuficiencia cardíaca).
3	Disponibilidad de datos clínicos completos, incluyendo detalles demográficos, marcadores tumorales séricos e imágenes de tomografía computarizada torácica con contraste, junto con consentimiento informado firmado.	Disfunción grave de órganos, incluyendo insuficiencia renal (TFGe <30 ml/min/1.73m²) o cirrosis hepática.
4	Pacientes sin tratamiento previo y sin terapias dirigidas al tumor previas.	Poblaciones especiales, incluyendo mujeres embarazadas o en período de lactancia (confirmado mediante prueba de β-hCG cuando sea aplicable).
5	Disponibilidad de muestras adecuadas de tejido tumoral y/o adyacente, aptas para análisis molecular.	Calidad deficiente de la muestra, incluyendo tejido insuficiente o ARN degradado (confirmado mediante revisión por el patólogo).

Tabla 1: Criterios de inclusión y exclusión para pacientes con CPNM en el estudio

Tipo de tejido	Muestras emparejadas analizadas (n)	Expresión relativa (Media ± DE)
Tejido tumoral	19	3.24 ± 2.34
Tejido normal adyacente emparejado	19	3.60 ± 1.70

Tabla 2: Expresión de YTHDC2 en tejidos tumorales de CPHN y tejidos normales adyacentes apareados. La expresión relativa de YTHDC2 se midió utilizando el método 2^–ΔCt y se normalizó respecto a GAPDH. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE). Se realizó la comparación estadística de los 19 pares apareados de tejidos tumorales y normales adyacentes mediante la prueba de rangos con signo de Wilcoxon (p = 0.537).

Gen diana	Primer/sonda	Secuencia (5′→3′)
YTHDC2	Directo (F)	CCTGTCACCAATAAAGAGCG
	Inverso (R)	CACTGGAATCTGAGGTATGCC
	Sonda (P)	AGCAAGACAAGTGGGCGACTCAA
GAPDH	Directo (F)	AATCCCATCACCATCTTCCAG
	Inverso (R)	ATGACCCTTTTGGCTCCC
	Sonda (P)	CCAGCATCGCCCCACTTGATTTT

Tabla 3: Secuencias de cebadores y sondas utilizadas para la PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). La expresión de YTHDC2 se cuantificó utilizando la química TaqMan, con GAPDH como control interno.

Característica	Categoría	n	%
Tipo patológico	Adenocarcinoma	41	82
	Carcinoma de células escamosas	9	18
Estadificación CSCO	I–II	28	56
	III–IV	22	44
Metástasis en ganglios linfáticos	No	24	48
	Sí	26	52
Grado de diferenciación	Baja diferenciación	9	18
	Diferenciación moderada–alta	41	82
Edad	≥60 años	36	72
	<60 años	14	28
Género	Hombre	32	64
	Mujer	18	36
Historial de tabaquismo	Sí	25	50
	No	25	50

Tabla 4: Características clínicas y patológicas de pacientes con CPNM. Los datos se presentan como números (n) y porcentajes (%) según la población total del estudio (n = 50).

Característica clinicopatológica	Grupo	n	Expresión de YTHDC2 (Media ± DE)	Valor p
Tipo de tejido	Tumoral	30	3.24 ± 2.34	0.537
	Normal adyacente	19	3.60 ± 1.70
Tipo patológico	Adenocarcinoma	26	4.13 ± 1.29	0.022*
	Carcinoma de células escamosas	4	7.50 ± 3.41
Estadificación CSCO	I–II	22	4.29 ± 1.94	0.08
	III–IV	8	5.05 ± 1.51
Metástasis en ganglios linfáticos	No	19	3.83 ± 0.91	0.027*
	Sí	11	5.70 ± 2.53
Diferenciación histológica	Moderadamente–bien diferenciado	25	4.33 ± 1.90	0.181
	Pobremente diferenciado	5	5.18 ± 1.60
Edad	≥60 años	20	4.62 ± 2.10	0.835
	<60 años	10	4.16 ± 1.12
Antecedente de tabaquismo	Sí	12	4.62 ± 2.40	0.845
	No	18	4.38 ± 1.40

Tabla 5: Asociación entre la expresión de YTHDC2 y las características clinicopatológicas en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). La expresión de YTHDC2 se midió mediante qRT-PCR y se calculó utilizando el método 2^–ΔCt, normalizado respecto a GAPDH. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE). Los tamaños de los grupos (n) representan el número de muestras válidas analizadas. Las comparaciones estadísticas entre grupos se realizaron utilizando la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. *p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Variable	β	Wald	Valor p	OR	IC 95%
Edad (≥60 vs <60)	0.07	0.01	0.93	1.08	0.20–5.68
Género (Femenino vs Masculino)	0.53	0.4	0.525	1.7	0.33–8.67
Antecedente de tabaquismo (Sí vs No)	0.54	0.46	0.496	1.71	0.36–8.09
Estadio del tumor (III–IV vs I–II)	3.3	7.38	0.007*	27	2.50–291.18
Diferenciación (Pobre vs Moderada–buena)	–1.29	1.62	0.204	0.28	0.04–2.02
Expresión de YTHDC2	0.83	4.91	0.027*	2.29	1.10–4.75

Tabla 6: Análisis de regresión logística multivariante de los factores asociados con metástasis en ganglios linfáticos en pacientes con cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC). Se realizó una regresión logística binaria utilizando la metástasis en ganglios linfáticos como variable dependiente. Se reportan las odds ratios (OR) con intervalos de confianza del 95 % (IC). Categorías de referencia: edad (<60 años), sexo (masculino), antecedente de tabaquismo (no), estadio tumoral (I–II) y diferenciación (moderada–bien diferenciada). *p < 0,05 indica significancia estadística.

Discusión

YTHDC2, la proteína de unión a N6-metiladenosina (m6A) más grande de la familia YTH, es única por su actividad de helicasa de ARN dependiente de ATP, lo que la distingue como un regulador clave del metabolismo del ARN¹³. A diferencia de otros miembros de la familia YTH, YTHDC2 se encuentra tanto en el núcleo como en el citoplasma, donde regula la traducción del ARNm y la estabilidad del ARN¹⁴. Estudios experimentales previos han demostrado que YTHDC2 suprime la progresión del adenocarcinoma de pulmón (LUAD) al inhibir la expresión de los ARNm ADIRF y MRPL12, aumentar la apoptosis y reducir la proliferación celular y la metástasis^15,16. Estudios experimentales previos también han sugerido que YTHDC2 estabiliza ARNlnc como ZNRD1-AS1 para suprimir la proliferación del LUAD y modula ARNm modificados por m6A, tales como CYLD y SLC7A11, inhibiendo la vía de señalización NF-κB, la captación de cisteína y los procesos antioxidantes, mientras promueve la ferroptosis y la actividad antitumoral^17,18.

En este estudio, se investigó la expresión y el significado clínico de la proteína lectora de m6A YTHDC2 en el carcinoma de pulmón de no pequeño tamaño (NSCLC) mediante un enfoque integrador que combina análisis de bioinformática y validación experimental. Este análisis de bioinformática de las bases de datos TCGA y GEPIA reveló una regulación negativa significativa de YTHDC2 en tejidos tumorales de NSCLC en comparación con tejidos pulmonares normales, y una expresión más alta de YTHDC2 se asoció con una mejor supervivencia general y supervivencia post-progresión, lo que sugiere un posible papel pronóstico. Curiosamente, nuestros experimentos de qRT-PCR utilizando las 19 muestras pareadas disponibles de tejido tumoral y tejido normal adyacente en la cohorte actual no lograron mostrar una diferencia estadísticamente significativa en la expresión de YTHDC2 entre el tejido tumoral y el tejido normal adyacente. Esta discordancia resalta los desafíos de trasladar hallazgos de conjuntos de datos públicos a gran escala a cohortes clínicas independientes y subraya la necesidad de una interpretación cautelosa de los análisis in silico. Comprender las razones detrás de estas diferencias es fundamental para evaluar con precisión la utilidad de YTHDC2 como biomarcador y diana terapéutica en NSCLC. El enfoque del presente estudio en YTHDC2 concuerda con su actividad helicasa única entre las proteínas lectoras de YTH¹⁹, aunque análisis pancáncer recientes revelan funciones dependientes del contexto para otros miembros de la familia. Por ejemplo, Li et al. demostraron que YTHDF1/2 están regulados positivamente en la mayoría de los cánceres (por ejemplo, LIHC, LUAD) y se correlacionan con un mal pronóstico, mientras que YTHDC1/2 muestran efectos supresores de tumores en KIRC y BRCA²⁰. Destacable es que el papel oncogénico de YTHDF1 mediante la activación de la vía Wnt/β-catenina contrasta con la función antimetastásica de YTHDC2 en NSCLC, lo que resalta la necesidad de estrategias de biomarcadores específicas por subtipo. En comparación con marcadores pronósticos establecidos (por ejemplo, PD-L1 para la respuesta a inmunoterapia), el poder predictivo de YTHDC2 podría mejorarse combinándolo con otros reguladores de m6A (por ejemplo, METTL3, YTHDF1) o genes de puntos de control inmunitario, como lo sugieren análisis de infiltración inmunitaria pancáncer. Aunque estudios previos sugieren que YTHDC2 regula la vía NF-κB/CYLD¹², el presente estudio se vio limitado por la ausencia de validación a nivel proteico mediante inmunohistoquímica o inmunotransferencia (Western blotting), así como por la falta de validación funcional. Trabajos futuros deberían combinar ensayos de silenciamiento génico (knockdown) con secuenciación de m6A para mapear los blancos directos.

Análisis previos revelaron que la expresión de YTHDC2 está regulada a la baja en tejidos de CPHN y se correlaciona con un mal pronóstico²¹. El análisis de Kaplan-Meier indicó una mayor supervivencia en pacientes con alta expresión de YTHDC2, pero el análisis de la curva ROC sugirió un poder predictivo limitado para la supervivencia²⁰. El análisis de supervivencia mediante curva ROC en el presente estudio se realizó utilizando datos de expresión por RNA-seq y de supervivencia de TCGA, ya que no se disponía de información de seguimiento a largo plazo para nuestra cohorte clínica local. Es importante destacar que los bajos valores de AUC (~0,5) observados en este estudio sugieren que la expresión de YTHDC2 carece de sensibilidad y especificidad suficientes para su uso clínico como biomarcador independiente²². Esta limitación concuerda con evidencia emergente que indica que los biomarcadores basados en un solo gen suelen ser insuficientes para enfermedades complejas como el CPHN, en las que se requieren cada vez más enfoques de multi-ómica y paneles integrados de biomarcadores para lograr un rendimiento predictivo clínicamente significativo. Se observó una expresión más alta de YTHDC2 en tejidos de CPHN con metástasis en ganglios linfáticos, lo que sugiere una posible asociación entre la expresión de YTHDC2 y el estado metastásico en ganglios linfáticos en la presente cohorte. Aunque también se observaron diferencias en la expresión de YTHDC2 entre adenocarcinoma y carcinoma de células escamosas, esta comparación debe interpretarse con cautela, ya que solo se dispuso de 4 muestras de carcinoma de células escamosas para el análisis, lo que limita considerablemente el poder estadístico de esta comparación por subgrupos. No se observaron diferencias significativas en la etapa clínica, grado de diferenciación, edad ni antecedentes de tabaquismo, probablemente debido a limitaciones del estudio, incluido el tamaño de la muestra y el diseño monocéntrico. Aunque la asociación observada entre la reducción de la expresión de YTHDC2 y la metástasis en ganglios linfáticos sugiere un posible papel biológico en el CPHN, su bajo poder discriminatorio (AUC ~0,5) y su detección inconsistente mediante qRT-PCR excluyen su uso como marcador clínico independiente. Estudios futuros deberían explorar si la combinación de YTHDC2 con otras proteínas relacionadas con m6A mejora el valor predictivo.

Los análisis de bioinformática sugirieron que la expresión de YTHDC2 se reduce en el CPHN y podría estar asociada con mejores resultados en los pacientes. Aunque también se observó una expresión reducida en pacientes con metástasis en ganglios linfáticos y se notaron diferencias entre los subtipos patológicos, estos hallazgos en subgrupos deben interpretarse con cautela debido al tamaño limitado de la muestra, particularmente en el carcinoma de células escamosas. Sin embargo, estos hallazgos no fueron confirmados mediante análisis de qRT-PCR en nuestra cohorte clínica, lo que posiblemente refleje diferencias en las características de la cohorte, el tamaño de la muestra, la variabilidad técnica, la regulación postranscripcional o la ausencia de validación a nivel proteico. Investigaciones futuras deberían explorar los mecanismos de YTHDC2 en otros subtipos de cáncer de pulmón mediante experimentos in vitro e in vivo. Dichos estudios podrían aclarar aún más el papel biológico de YTHDC2 y determinar si tiene alguna utilidad clínica como parte de un enfoque multimarcador, en lugar de como biomarcador independiente.

Limitaciones

Este estudio tiene varias limitaciones. Fue un estudio retrospectivo de un solo centro con un tamaño de muestra relativamente pequeño, lo que podría limitar la generalización. El uso de tejidos incluidos en parafina (FFPE) pudo haber afectado la calidad del ARN y la sensibilidad de la qRT-PCR. Además, solo se evaluó la expresión del ARNm de YTHDC2, y no se realizó validación a nivel proteico mediante inmunohistoquímica (IHC) ni mediante inmunotransferencia (Western blotting). Dado que la expresión del ARNm no necesariamente se correlaciona con la abundancia proteica debido a la regulación postranscripcional, esto podría explicar parcialmente la discrepancia entre nuestros hallazgos clínicos y los análisis de bases de datos públicas. El estudio tampoco contó con datos de seguimiento a largo plazo, y los análisis por subgrupos (por ejemplo, carcinoma de células escamosas) tuvieron poca potencia estadística.

Posibles direcciones futuras

La investigación futura debe explorar los mecanismos de YTHDC2 en el carcinoma de pulmón no microcítico (NSCLC) mediante experimentos in vitro e in vivo para comprender mejor su función. Se requieren estudios multicéntricos con tamaños de muestra más grandes para validar los hallazgos y mejorar su generalización. Además, la integración de YTHDC2 con otros reguladores relacionados con m6A y variables clínico-patológicas podría aumentar su utilidad predictiva y pronóstica. Son necesarios estudios adicionales que incorporen enfoques de multi-ómica, incluyendo transcriptómica, proteómica y epigenómica, para aclarar los mecanismos biológicos subyacentes a la disregulación de YTHDC2. También se debe realizar la validación a nivel de proteína mediante inmunohistoquímica (IHC) o inmunotransferencia (Western blotting) para evaluar la concordancia entre la expresión de ARNm y de proteína. La estandarización de los procedimientos de procesamiento de muestras y de las técnicas de validación será asimismo fundamental para garantizar la reproducibilidad y la aplicabilidad clínica.

Conclusión

Este estudio proporciona una evaluación exploratoria de la expresión de YTHDC2 en el CPHN mediante la integración de análisis de bioinformática con la validación clínica mediante qRT-PCR. Sin embargo, su detección inconsistente entre las distintas plataformas analíticas y su precisión diagnóstica limitada (AUC ≈0.5) actualmente impiden su uso como biomarcador clínico independiente. Aunque los análisis de bioinformática sugieren una posible relevancia pronóstica, la validación clínica independiente no respalda su fiabilidad para aplicaciones diagnósticas o pronósticas. Estos hallazgos deben interpretarse con cautela y requieren validación en cohortes más grandes y multicéntricas, junto con estudios a nivel proteico y funcionales, antes de que pueda considerarse cualquier aplicación clínica.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Primers y sondas personalizados	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	Síntesis personalizada	Las secuencias de los primers y sondas se indican en la Tabla 6
DNasa I	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China	DNasa I (HiPure FFPE RNA Kit)	Eliminación de contaminación por ADN genómico
Algoritmo ESTIMATE	Yoshihara et al.	Paquete R (Versión 1.0.13)	Estimación de pureza tumoral
Kit de extracción de ARN de FFPE	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China	HiPure FFPE RNA Kit (R4130-02)	Extracción de ARN de tejido FFPE
Portal de Datos GDC	Instituto Nacional del Cáncer (NCI), NIH, EE. UU.	https://portal.gdc.cancer.gov	Descarga de conjuntos de datos de TCGA
Servidor web GEPIA	Universidad de Pekín, China	http://gepia.cancer-pku.cn	Análisis de expresión génica
Plotter de Kaplan–Meier	Universidad Semmelweis, Hungría	https://kmplot.com	Análisis de supervivencia
Microcentrífuga	Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania	5424 R	Procedimientos de purificación de ARN
Espectrofotómetro NanoDrop	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.	NanoDrop 2000/2000c	Cuantificación de ARN
Mezcla maestra para qPCR basada en sondas	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.	TaqMan Universal PCR Master Mix II (4440040)	Amplificación de PCR cuantitativa
Software estadístico R	Foundation for Statistical Computing, Viena, Austria	Versión 4.4.1	Análisis estadísticos y análisis ROC
Sistema de PCR en tiempo real	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE. UU.	CFX Opus 96	PCR cuantitativa en tiempo real
Kit de transcripción inversa	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.	RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (K1622)	Síntesis de ADNc
Columna de purificación de ARN	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China	HiPure Mini Column I	Columna de purificación de ARN con membrana de sílice
Agua libre de RNasas	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China	Agua libre de RNasas	Elución de ARN
SPSS Statistics	IBM Corp., Armonk, NY, EE. UU.	IBM SPSS Statistics Versión 27.0	Análisis estadísticos
Paquete survivalROC	CRAN (R Foundation for Statistical Computing)	Versión 1.0.3.1	Análisis ROC dependiente del tiempo
Base de datos TCGA	Instituto Nacional del Cáncer (NCI), NIH, EE. UU.	https://portal.gdc.cancer.gov	Base de datos pública de genómica del cáncer
Tampón de lavado RW1	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China	Tampón RW1	Tampón de lavado para purificación de ARN
Tampón de lavado RW2	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China	Tampón RW2	Tampón de lavado para purificación de ARN