Cardioides derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos como modelo para evaluar la administración de oligonucleótidos

Resumen

Este protocolo permite la generación de cardioides autoorganizados basados en cardiomiocitos a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas para la evaluación microscópica de la captación de oligonucleótidos marcados con fluorescencia.

Resumen

Las terapias basadas en oligonucleótidos representan una clase de fármacos en rápido avance con un potencial significativo para tratar enfermedades cardiovasculares; Sin embargo, lograr una administración eficiente en el tejido cardíaco sigue siendo un desafío crítico y sin resolver. Un obstáculo clave es la limitada disponibilidad de modelos humanos in vitro robustos y fisiológicamente relevantes, capaces de apoyar la evaluación cuantitativa de la captación celular de oligonucleótidos y su distribución intracelular. Se presenta un protocolo detallado y paso a paso para generar cardioides 3D autoorganizados a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSCs) y aplicarlos como plataforma para evaluar la absorción de oligonucleótidos marcados con fluorescencia. El protocolo guía a los usuarios a través de la diferenciación cardíaca dirigida en cultivo en suspensión mediante la modulación temporal de la señalización Wnt/β-catenina, permitiendo la especificación secuencial de iPSCs a través de las etapas progenitoras del mesodermo, del mesodermo cardíaco y del cardiomiocito. Bajo estas condiciones, las células se autoensamblan espontáneamente en estructuras tridimensionales que contienen cavidades y que expresan marcadores canónicos de cardiomiocitos. Los cardioides resultantes proporcionan una plataforma escalable y experimentalmente manejable para la evaluación basada en imágenes de la eficiencia de captación de oligonucleótidos, apoyando el desarrollo y la optimización de estrategias de administración para aplicaciones cardíacas.

Introducción

Las terapias basadas en oligonucleótidos, principalmente oligonucleótidos antisentido (ASO) y pequeños ARN interferentes (siRNA), están emergiendo rápidamente como un enfoque transformador y altamente específico para el tratamiento de una amplia gama de enfermedades, incluyendo tanto condiciones hereditarias como ^{adquiridas 1,2,3}. Estas modalidades permiten la modulación directa de la expresión génica a nivel de ARNm mediante la unión específica de secuencia a transcritos objetivo, lo que permite la corrección de silenciamiento génico o empalme de genes asociados a enfermedades que a menudo son inaccesibles para terapias convencionales de moléculas^{pequeñas 4,5}. Por ello, las terapias génicas basadas en oligonucleótidos proporcionan una plataforma versátil para atacar diversos mecanismos patógenos en múltiples áreas de enfermedad, incluyendo trastornos^{cardiovasculares 6}. Hasta la fecha, varios tratamientos basados en oligonucleótidos, incluidos ASOs, siRNAs y agentes de conmutación de empalmes, han sido aprobados para uso^{clínico 7}. A pesar de este progreso, su eficacia terapéutica tanto en entornos preclínicos como clínicos sigue limitada por una administración intracelular ineficiente⁸. Las estimaciones actuales indican que menos del 1% de los oligonucleótidos internalizados escapan de los compartimentos endosómicos para llegar al citosol y comprometer su ARN objetivo, limitando así la actividad^{funcional 9,10}. Esta limitación es especialmente pronunciada en el tejido cardíaco, donde la captación y el tráfico intracelular se comprenden poco.

Históricamente, la evaluación preclínica de terapias cardiovasculares se ha basado en gran medida en modelos animales, que siguen siendo indispensables para evaluar la farmacocinética, la biodistribución, la eficacia y la seguridad in vivo. Sin embargo, importantes diferencias entre especies en fisiología cardíaca, regulación génica y respuestas celulares a menudo limitan su capacidad para predecir con precisión la eficacia terapéutica y la toxicidad en humanos. Estas limitaciones han impulsado el desarrollo de modelos in vitro basados en humanos con mayor relevancia fisiológica. Entre ellas, la tecnología de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC) ha revolucionado la modelización de enfermedades cardiovasculares al proporcionar una fuente prácticamente ilimitada de células que pueden diferenciarse en linajes cardiovasculares. Los cardiomiocitos derivados de iPSC en humanos (iPSC-CM) recapitulan muchas de las propiedades moleculares, estructurales y funcionales del miocardio humano y se han convertido en una plataforma ampliamente adoptada para investigar mecanismos de enfermedades, respuestas a fármacos y modalidades terapéuticas^{emergentes 11}. Sin embargo, los cultivos bidimensionales convencionales de iPSC-CM humanos presentan limitaciones importantes. La mayoría de los protocolos de diferenciación generan cardiomiocitos que se asemejan a células fetales en lugar de adultas, mostrando propiedades estructurales, electrofisiológicas, metabólicas y contráctiles^inmaduras.

Además, los cultivos monocapa carecen de la arquitectura tisular tridimensional (3D), las interacciones multicelulares y la composición de la matriz extracelular que influyen en la función cardiomiocitaria in vivo. Para abordar estos desafíos, se han desarrollado modelos cardíacos 3D cada vez más^{sofisticados 13}. Entre ellos, los tejidos cardíacos modificados (EHT), generados mediante la incrustación de iPSC-CM en andamios de biomateriales y la aplicación de estimulación mecánica y eléctrica, promueven la maduración estructural y funcional mientras reproducen más fielmente el entorno biomecánico del miocardio^{nativo 13}. Aunque los EHT proporcionan plataformas altamente relevantes fisiológicamente para la modelización de enfermedades y pruebas de fármacos, su generación suele requerir conocimientos especializados en bioingeniería y equipos dedicados. En el otro extremo, las cortes cardíacos ex vivo conservan de forma más fiel la arquitectura y composición celular del tejido nativo, pero dependen del acceso al tejido cardíaco primario, tienen una viabilidad limitada en cultivo y no son fácilmente escalables.

Más recientemente, los organoides cardíacos han surgido como sistemas modelo 3D accesibles que recapitulan aspectos clave de la organización y función del tejido^{cardíaco 14}. Los cardioides son organoides cardíacos autoensamblados compuestos predominantemente por cardiomiocitos que sufren especificación intrínseca, patrón espacial y morfogénesis para formar estructuras en forma de cámara que contienen^{cavidades 15,16}. Los métodos para formar cardioides suelen depender de una activación inicial de la señalización Wnt para inducir la especificación del mesodermo, seguida de una inhibición posterior para promover el compromiso de la línea cardíaca. Los cardioides pueden generarse en cultivos estáticos o en suspensión agitada, que apoyan la producción escalable y mejoran la autoorganización^tisular 15,16,17,18,19. Los organoides cardíacos más complejos de múltiples líneas que incorporan tipos celulares endoteliales, epicárdicos u otros aumentan aún más la relevancia fisiológica, pero requieren protocolos de diferenciación más elaborados, periodos de cultivo más largos y una optimización^{extensa 13,14}.

Se presenta un protocolo sencillo, reproducible y eficiente para generar cardioides autoorganizados basados en cardiomiocitos a partir de iPSC humanos y aplicarlos para evaluar la absorción de oligonucleótidos marcados con fluorescencia. El protocolo debería resultar valioso para investigadores que buscan optimizar la química y las estrategias de administración de oligonucleótidos para aplicaciones cardiovasculares. Todos los materiales utilizados en este estudio están listados en la Tabla de Materiales.

Protocolo

1. Cultivo y preparación de iPSC para la diferenciación

PRECAUCIÓN: Realizar toda la manipulación al aire libre de células y medios en un gabinete de bioseguridad certificado Clase II. Lleva bata y guantes. Descontamina las superficies de trabajo y los residuos líquidos con un desinfectante adecuado.

1. Mantén iPSCs.
   1. Recubre las placas de cultivo con una matriz basal-membrana adecuada según las instrucciones del fabricante.
   2. Alimenta a los iPSC con un medio de células madre pluripotentes definido y libre de alimento y reemplaza el medio cada 24 horas.
   3. Mantener los cultivos por debajo de la sobreconfluencia y las células del paso cuando alcancen una confluencia del 70–80%.
      NOTA: Asegúrese de que los iPSC conserven una morfología de alta calidad e indiferenciada y que se confirme que están libres de micoplasma antes de iniciar la diferenciación.
2. Paso previo a la diferenciación.
   1. Descongelan iPSCs y expanden las células durante al menos dos vías antes de iniciar la diferenciación cardíaca.
   2. Células de pasaje utilizando un método de disociación sin enzimas, PBS-EDTA, compatibles con el mantenimiento de iPSC.
      PUNTO DE PAUSA: Mantener las iPSC en cultivo hasta alcanzar una confluencia del 70–80% y conservar la morfología típica sin signos de diferenciación espontánea.

2. Preparación de agregados iPSC en placas de micropozos

1. Disociar iPSCs a una suspensión unicelular.
   1. Aspira el medio y lava las células una vez con 1 mL de 1× PBS.
   2. Añadir la solución de desprendimiento celular (Accutasa) a 500 μL por pozo de una placa de 6 pozos e incubar a 37 °C durante 5–7 minutos.
   3. Añade 1,5 mL de medio de lavado por pozo y resuspende suavemente para obtener una suspensión de célula única.
   4. Transfiere la suspensión a un tubo cónico de 15 mL y centrifuga a 200 × g durante 3 minutos a temperatura ambiente.
   5. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet celular en un medio iPSC libre de alimentación, suplementado con inhibidor de ROCK (10 μM finales).
      NOTA: Ajusta el tiempo de incubación por disociación para cada línea de iPSC comprobando el desprendimiento a 5 minutos y extendiendo en pequeños incrementos si es necesario.
2. Cuenta las celdas y prepara la densidad de la placa.
   1. Cuenta las celdas viables usando un método estándar de conteo de celdas.
   2. Preparar una suspensión de celda única a 0,9 × 10⁶ células/mL para cada pozo de una placa de agregación de micropozos de 800 μm (formato de 24 pozos, ~300 micropozos/pozo).
      NOTA: Optimiza el número de celdas por pozo, ya que el tamaño agregado o la eficiencia de diferenciación varía entre líneas iPSC.
3. Imprima la placa del micropozo y quita las burbujas.
   1. Añadir 500 μL de medio iPSC libre de alimentador que contenga inhibidor de ROCK (los 10 μM finales) a cada pozo.
   2. Centrifuga la placa del micropozo a 300 × g durante 3 minutos a temperatura ambiente para eliminar las burbujas de aire de los micropozos.
      CRÍTICO: Eliminar completamente todas las burbujas para permitir una deposición celular uniforme en el fondo de cada micropozo y apoyar la formación eficiente de agregados.
4. Sembra iPSCs en micropozos.
   1. Añadir 1,0 mL de la suspensión de celda única preparada (0,9 × 10⁶ celdas/mL) a cada pozo, lo que corresponde a 0,9 × 10⁶ celdas por pozo.
   2. Resuspende suavemente dentro del pozo entre 3 y 5 veces usando una P1000 y evita introducir burbujas de aire.
   3. Centrifuga la placa a 200 × g durante 3 minutos a temperatura ambiente para pelletar las células en los micropozos.
   4. Verifica bajo el microscopio que las células se hayan asentado en los micropozos antes de colocar la placa a 37 °C con un 5% de CO₂ durante 24 horas.
      CRÍTICO: Manipula la placa con cuidado después de centrifugarla. No agites ni sacudas la placa, ya que esto puede hacer que las células se levanten de los micropozos.

3. Expansión de agregados iPSC en micropozos

1. Aspira cuidadosamente y reemplaza el medio sin alterar ni desprender los áridos.
   1. Inclina la placa y aspira lentamente aproximadamente 1,0 mL de medio de cada pozo usando una pipeta P1000, asegurando que los agregados permanezcan asentados en los micropozos.
   2. Aspira lentamente los ~500 μL restantes del medio usando una pipeta P1000.
   3. Añade 1,5 mL de medio iPSC sin alimentador a cada pozo dispensándolo lentamente por el lateral del pozo usando una pipeta serológica.
   4. Incubar a 37 °C, 5% de CO₂ y repetir el cambio de medio diariamente.
      CRÍTICO: Dispensa el medio sobre la pared del pozo y evita el flujo directo sobre los árcidos.

4. Diferenciación cardíaca de agregados de iPSC (Día 0 a Día 12)

1. Inducción del mesodermo (Día 0).
   1. Retirar el medio utilizando el método de aspiración suave descrito en los pasos 3.1.1–3.1.2.
   2. Añadir 1,5 mL por pozo de medio basal suplementado con un 2% de B27 menos insulina y el activador de la vía Wnt/β-catenina (CHIR99021, concentración final: 11 μM).
      NOTA: Prepara una solución de 10 mM de CHIR99021, un inhibidor de molécula pequeña de la glicógenosintasa quinasa-3 (GSK-3). Para lograr una concentración final de 11 μM, añadir 1,65 μL de la solución original a 1,5 mL de medio.
2. Cambio de medio tras la inducción (Día 1).
   1. A las 24 horas tras añadir CHIR99021, aspira suavemente el medio de cada pozo.
   2. Añadir 1,5 mL por pozo de medio basal fresco suplementado con un 2% de B27 menos insulina, y luego incubar durante 48 horas.
      CRÍTICO: Sigue estrictamente el tiempo de los pasos de modulación Wnt, ya que las desviaciones pueden comprometer la eficiencia de la diferenciación.
      NOTA: Se espera cierta muerte celular tras la exposición al activador de la vía Wnt/β-catenina. Si se observa una pérdida agregada generalizada, considere reducir la concentración del activador en futuros experimentos.
3. Ingreso cardíaco mediante inhibición de WNT (Día 3).
   1. Preparar el medio acondicionado transfiriendo 760 μL de medio gastado de cada pozo a un tubo cónico estéril de 50 mL.
   2. Para cada pozo, añadir 760 μL de medio basal fresco suplementado con un 2% de B27 menos insulina al tubo que contiene el medio acondicionado agrupado, y mezclar suavemente.
   3. Añadir el inhibidor de la vía Wnt, IWP4, al medio mezclado hasta una concentración final de 5 μM e invierte suavemente el tubo varias veces para mezclar.
   4. Aspira cuidadosamente el medio restante de cada pozo y luego añade 1,5 mL por pozo de medio acondicionado suplementado con IWP4.
   5. Incubar a 37 °C con un 5% de CO₂ durante 48 horas.
      NOTA: Prepara una solución de 1 mM del inhibidor de la vía Wnt IWP4. Para lograr una concentración final de 5 μM, se añaden 7,6 μL de la solución stock por cada 1,52 mL de medio total (760 μL de medio acondicionado + 760 μL de medio basal fresco) para cada pozo.
4. Cambio de medio en micropozos (día 5).
   1. Sustituye el medio usando el enfoque de aspiración suave descrito en los pasos 3.1.1–3.1.2.
   2. Añadir 1,5 mL de medio basal suplementado con un 2% de B27 menos insulina a cada pozo, y luego incubar a 37 °C con 5% de CO₂ durante 48 horas.
5. Transfiere los agregados de micropozos a placas de 6 pozos (día 7).
   1. Aspira cuidadosamente el medio de cada pozo utilizando el método de aspiración suave descrito en los Pasos 3.1.1–3.1.2.
   2. Añadir 1,0 mL de medio basal suplementado con un 2% de B27 con insulina a cada pozo de la placa del micropozo. Utilizando una pipeta P1000, haz una piqueta suave con el medio hacia arriba y abajo cinco veces mientras mueve la punta de la pipeta en círculos a lo largo de la superficie del pozo para desalojar los agregados de los micropozos y transferirlos a la suspensión.
   3. Transfiere la suspensión de agregados a un solo pozo de una placa de cultivo de 6 pozos no tratada.
   4. Enjuaga cada pozo de la placa de micropozos con 1,0 mL adicionales de medio fresco dos o tres veces para recuperar los agregados restantes, transferiendo cada enjuague al mismo pozo de la placa de 6 pozos.
   5. Incubar a 37 °C con un 5% de CO₂ durante 72 horas.
      NOTA: Se espera la presencia de células muertas y residuos celulares tras la transferencia de agregados. La mayoría de los residuos se eliminarán durante el cambio de medio posterior.
6. Cambio medio durante el cultivo de suspensión (día 10).
   1. Agita suavemente la placa para desalojar cualquier agregado que esté flojamente adherido.
   2. Inclina la placa para permitir que los agregados se asienten en el fondo del pozo por gravedad.
   3. Aspira cuidadosamente el medio gastado sin alterar ni aspirar los áridos.
   4. Añadir 2,0 mL de medio basal fresco suplementado con 2% de B27 con insulina a cada pozo e incubar a 37 °C con 5% de CO₂ durante 48–72 horas.
      NOTA: El golpe espontáneo suele observarse aproximadamente desde el día 10 en adelante.
      PUNTO DE PAUSA: Los cardioides de batido pueden mantenerse en cultivo en suspensión para una maduración prolongada reemplazando el medio cada 2–3 días.

5. Caracterización microscópica de cardioides

NOTA: Este método proporciona un flujo de trabajo para la caracterización histológica de los cardioides mediante criosecciones. Las secciones resultantes pueden utilizarse para una variedad de análisis histológicos, incluyendo la tinción de hematoxilina y eosina (H&E) para evaluar la arquitectura general del tejido y el marcaje de inmunofluorescencia para evaluar la identidad del cardiomiocito.

1. Fijación y criosección.
   1. Coloca los cardioides con paraformaldehído al 4% durante la noche a 4 °C.
      PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es tóxico y probablemente un carcinógeno; Maneja la cámara con una campana extractora química mientras llevas el equipo de protección personal adecuado. Recoger todos los residuos que contengan paraformaldehído (fijadores y lavados) en un recipiente claramente etiquetado para aldehído/residuos químicos peligrosos, y deshacerse de ellos conforme a los procedimientos institucionales de residuos peligrosos.
      SEGURIDAD: Realizar toda la fijación y manipulación del paraformaldehído en una campana extractora química mientras se lleva el equipo de protección personal adecuado.
   2. Lava tres veces con PBS y crioprotege los cardioides fijos en un 30% (p/v) de sacarosa en PBS durante la noche a 4 °C.
   3. Incrusta los cardioides en gelatina, congela y corta criosecciones de 10 μm de grosor en portaobjetos de microscopio. Guarda las secciones a −20 °C hasta su uso.
2. Inmunomarcaje.
   1. Descongela las secciones durante 15 minutos a temperatura ambiente.
   2. Lava las secciones en PBS a 37 °C durante 10 minutos, dos veces.
   3. Rodea el área de interés en cada lámina con un bolígrafo hidrofóbico para crear un pozo que retenga las soluciones de bloqueo y anticuerpos.
   4. Rehidratar las secciones durante 2–3 minutos en un tampón de permeabilización (PB; PBS que contienen 0,1% Tween-20) en un tarro de Coplin.
   5. Quita los portaobjetos de PB, drena el exceso de solución y coloca los portaobjetos en una cámara húmeda.
      CRÍTICO: A partir de este momento, es fundamental no dejar que las secciones se sequen.
   6. Bloquear las secciones con 200–300 μL de PB que contengan suero fetal bovino (FBS) al 5% durante 90 minutos a temperatura ambiente en una cámara húmeda.
   7. Retirar la solución bloqueante e incubar las secciones durante la noche a 4 °C con 100 μL de anticuerpo primario (anti-cMYBP-C; 1:50) diluido en solución bloqueante (PB que contiene 1% de FBS).
   8. Lava las láminas tres veces con PB e incuba durante 2 horas a temperatura ambiente con un anticuerpo secundario fluorescente verde anti-ratón (1:200), faloidina fluorescente de rojo lejano (1:400) e DAPI (1 μg/mL).
   9. Lava tres veces en PB y monta con un medio de montaje antifade.
      PRECAUCIÓN: Recoger todas las soluciones que contengan colorantes fluorescentes (anticuerpos secundarios, faloidina y soluciones de tinción DAPI y los lavados correspondientes) en un recipiente y deséchalas como residuos químicos según las directrices institucionales.
3. Adquisición de imágenes.
   1. Adquirir imágenes confocales utilizando un microscopio confocal de escaneo láser equipado con un detector de matriz para obtener imágenes de superresolución con objetivos de inmersión en aceite de 10×× y 63/1,40.
   2. Excita el fluoróforo rojo lejos, el fluoróforo verde y la tinción nuclear usando líneas láser de 639 nm, 488 nm y 405 nm con transmisión láser del 4,0%, 4,0% y 1,0%, respectivamente.
   3. Adquirir secciones ópticas individuales con un tamaño de píxel de 0,0353 × 0,0353^{μm 2}, escaneo unidireccional, velocidad de escaneo 6, zoom 1,7, promedio de línea 1 y tiempo de permanencia de píxeles de 0,935 μs por píxel.
   4. Aplicar procesamiento de imágenes de superresolución con detector de matriz usando filtrado automático de Wiener.

6. Ensayo de captación de oligonucleótidos fluorescentes

1. Preparar una solución estándar del oligonucleótido marcado con fluorescencia conjugado al ácido palmítico para aumentar la lipofilialidad.
   1. Reconstituir el oligonucleótido liofilizado marcado con fluorescencia en agua libre de nucleasas hasta una concentración final de 1 mM. Un vórtice breve y centrifugación a 3.000 × g durante 30 segundos para recoger la solución en el fondo del tubo.
   2. Prepara alicotas de un solo uso de la solución de 1 mM y guárdalas a −20 °C protegidas de la luz.
   3. El día del experimento, añadir 1 μL del material de 1 mM a 1 mL de medio de cultivo cardioide para obtener una concentración final de oligonucleótidos de 1 μM. Mezclar mediante una suave agitación de placas.
2. Incubar los cardioides con el oligonucleótido marcado con fluorescencia (concentración final de 1 μM) en un medio libre de suero a 37 °C con un 5% de CO₂ durante 24 horas.
3. Lava los cardioides tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar el oligonucleótido extracelular.
4. Fija los cardioides en paraformaldehído al 4% durante 20 minutos a temperatura ambiente, lava tres veces con PBS y continúa con el marcaje fluorescente antes de la imagen.
5. Incubar cardioides fijos intactos durante la noche a 4 °C, protegidos de la luz, en PBS que contenga 5 μg/mL de aglutinina germinal de trigo (WGA) conjugada con un fluoróforo verde y 1 μg/mL de DAPI. Lava tres veces en PBS y monta con un medio antifade.
   PRECAUCIÓN: Recoger todos los medios y lavados que contengan oligonucleótidos y colorantes fluorescentes, incluyendo el medio de incubación marcado con oligonucleótidos del paso 6.2 y la solución de tinción WGA/DAPI, en un recipiente separado y deséchalos como residuos químicos/biopeligrosos según las directrices institucionales.
6. Adquirir imágenes confocales de la absorción y distribución de oligonucleótidos.
   1. Adquirir imágenes confocales utilizando un microscopio confocal de barrido láser equipado con un detector de matriz para imágenes de superresolución y un objetivo de inmersión en agua del 40×. Adquirir imágenes como pilas en z de 8 secciones con un tamaño de paso z de 2 μm, cubriendo una profundidad total de 16 μm.
   2. Excitar la tinción nuclear, el marcador de membrana y el oligonucleótido marcado fluorescentemente de color rojo lejano usando líneas láser de 405 nm, 488 nm y 639 nm con transmisión láser del 0,9%, 0,2% y 3,0%, respectivamente.
   3. Adquirir imágenes con un tamaño de vóxel de 0,0449 × 0,0449 × 2^{μm 3}, escaneo bidireccional, velocidad de escaneo 5, promedio de línea 1 y tiempo de permanencia de píxel de 1,51 μs por píxel. Aplica Airyscan/procesamiento de imagen super-resolución usando filtrado automático de Wiener.
   4. Mantén todos los ajustes de adquisición (potencia láser, ganancia del detector, paso z y tamaño del voxel) constantes en todas las posiciones z y en todas las muestras para permitir una comparación válida de la señal de oligonucleótidos entre condiciones.

Resultados

La Figura 1 resume el flujo de trabajo de diferenciación e ilustra los cambios morfológicos característicos esperados en cada etapa del protocolo, desde la agregación de iPSC hasta la formación de cardioides autoorganizados. La agregación de micropozos basada en suspensión proporciona un enfoque sencillo y estandarizado para la generación paralela de grandes cantidades de cardioides controlados por tamaño. La diferenciación exitosa se caracteriza por la generación de agregados de tamaño uniforme, seguida por el desarrollo de cavidades internas y el inicio de golpes espontáneos, típicamente a partir del día 10 en adelante. En conjunto, estas características morfológicas proporcionan puntos prácticos de control de calidad para evaluar la eficiencia y reproducibilidad de la generación de cardioides.

La arquitectura cardioide y la organización tisular pueden evaluarse mediante análisis histológico de criosecciones. Como se muestra en la Figura 2, la tinción por hematoxilina y eosina (H&E) de cardioides diferenciados con éxito revela tejidos tridimensionales bien organizados que contienen una o más cavidades internas rodeadas por capas celulares compactas, consistentes con una organización en forma de cámara. Los cardioides exitosos suelen mostrar no regiones necróticas y una fragmentación estructural mínima. En cambio, las diferenciaciones subóptimas producen frecuentemente estructuras irregulares o colapsadas sin cavidades discernibles, indicativo de una autoorganización tisular deteriorada.

La diferenciación de cardiomiocitos puede evaluarse más a fondo mediante la tinción por inmunofluorescencia de criosecciones. Como se ilustra en la Figura 3A–B, los cardioides exitosos muestran una expresión generalizada del marcador sarcómico cMYBP-C, organizados en estrías periódicas altamente ordenadas características de los sarcómeros. Estas estructuras estriadas están ampliamente distribuidas por todo el tejido y a menudo están alineadas a lo largo del eje longitudinal de los cardiomiocitos, reflejando una diferenciación cardíaca eficiente. En cambio, los cardioides subóptimos presentan tinción sarcómica débil, irregular o regionalmente restringida, frecuentemente confinada a regiones periféricas, con áreas extensas sin señal detectable, lo que indica una diferenciación ineficiente de los cardiomiocitos.

La captación de oligonucleótidos marcados con fluorescencia puede evaluarse mediante imágenes de células vivas o microscopía confocal de cardioides fijos. Como se muestra en la Figura 4, la captación exitosa se caracteriza por una fluorescencia asociada a oligonucleótidos intracelulares fácilmente detectable distribuida como puntos discretos, consistentes con la localización endosómica. WGA delimita las membranas celulares y DAPI contracolorea los núcleos, permitiendo confirmar la localización intracelular de oligonucleótidos. Además de proporcionar una visualización cualitativa de la captación de oligonucleótidos, los stacks de imágenes adquiridos pueden utilizarse para análisis cuantitativos, incluyendo la intensidad de fluorescencia por punto, el número de puntos por célula y el porcentaje de células positivas para oligonucleótidos. Como se muestra en la Figura 5A–C, la imagen por pila en Z permite además evaluar la distribución de oligonucleótidos en todo el tejido tridimensional, detectando fluorescencia en múltiples secciones ópticas que se extienden desde la superficie hasta el interior del cardioide, indicando una penetración efectiva del tejido.

Figura 1: Flujo de trabajo para la generación de cardioides derivados de iPSC en humanos. Las células madre pluripotentes inducidas en humanos (iPSCs) se agregan en placas de micropozo (Day−2) y se someten a una diferenciación cardíaca dirigida mediante la modulación temporal de la señalización Wnt. La inducción del mesodermo se inicia el día 0 mediante tratamiento con el activador de la vía Wnt CHIR99021 en un medio basal suplementado con B27 menos insulina, seguido de la retirada del activador en el día 1. La especificación cardíaca se induce en el día 3 mediante tratamiento con el inhibidor de la vía Wnt IWP4, que se elimina en el día 5. En el día 7, los agregados se transfieren a placas de 6 pozos y se mantienen en un medio basal suplementado con insulina que contiene B27. Para el día 14, los cardioides autoorganizados ya están establecidos y son adecuados para aplicaciones posteriores, incluyendo ensayos de captación de oligonucleótidos. Esta imagen ha sido creada por los autores usando Biorender, y se adjunta la licencia de derechos de autor requerida. Las imágenes representativas de campo claro adquiridas en los puntos temporales indicados ilustran la progresión morfológica esperada desde agregados iPSC de tamaño uniforme hasta cardioides cavitados y autoorganizados. Barra de escala = 500 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Caracterización histológica de cardioides humanos derivados de iPSC. Criosecciones representativas coloreadas con hematoxilina y eosina (H&E) de cardioides del día 14 que muestran cavidades internas rodeadas de capas celulares compactas, consistentes con una organización tejicular en forma de cámara. Las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio de imagen. La cuantificación de los resultados de diferenciación mostró que el 94,0 ± el 2,6 % de los cardioides presentaban latidos espontáneos y el 60,3 ± el 20,6 % contenían una o más cavidades internas visibles. Los datos se presentan como media ± DS a partir de tres diferenciaciones independientes, con aproximadamente 115 cardioides analizados por diferenciación. Barra de escala = 100 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Caracterización por inmunofluorescencia de la diferenciación de cardiomiocitos. Criosecciones representativas de los cardioides del día 14. (A) Tinción DAPI que muestra la distribución de los núcleos celulares. (B) Imagen de inmunofluorescencia que muestra núcleos marcados con DAPI (azul) y sarcómeros marcados con un anticuerpo contra la proteína C que se une a la miosina cardíaca (cMYBP-C, verde), demostrando estructuras sarcómicas organizadas en cardiomiocitos diferenciados. Las imágenes se obtuvieron mediante microscopía de fluorescencia confocal de barrido láser utilizando un objetivo en seco 10×/0,30 (izquierda) y un objetivo de inmersión en aceite 63×/1,40 (derecha). Barras de escala = 10 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Imagen de la captación de oligonucleótidos por cardioides. Imágenes confocales que muestran la localización intracelular de oligonucleótidos antisentido marcados con fluorescencia (ASOs, amarillos) en cardioides del día 14. Las membranas celulares están marcadas con aglutinina germinal fluorescente del trigo (WGA, magenta), y los núcleos se tiñen con DAPI (azul). La fluorescencia asociada a ASO se detecta como puntos intracelulares discretos (flechas). Los paneles inferiores muestran cardioides de control negativos que no fueron incubados con ASOs fluorescentes. Las imágenes en los paneles derechos corresponden a vistas de mayor aumento de las regiones encapsuladas en los paneles izquierdos. Se adquirieron imágenes representativas mediante microscopía confocal de barrido láser con imágenes de superresolución con detector de matriz utilizando un objetivo de inmersión en agua del 40×. Barras de escala = 10 μm (izquierda) y 5 μm (derecha). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5: Evaluación de la penetración de oligonucleótidos a lo largo de los cardioides. (A) Esquema que ilustra la adquisición de secciones ópticas a profundidades crecientes dentro del cardioide. Esta imagen ha sido creada por los autores usando Biorender, y se adjunta la licencia de derechos de autor requerida. (B) Imágenes confocales representativas que muestran la distribución de ASOs marcados con fluorescencia en posiciones z de 0 μm, 6 μm y 10 μm respecto a la superficie del tejido. Los ajustes de imagen se mantuvieron constantes en todas las posiciones z. Barra de escala = 10 μm. (C) La cuantificación del porcentaje de células que contienen al menos una señal puntual asociada a ASO en cada profundidad de imagen mostró una captación comparable de oligonucleótidos en todo el tejido, con 83,1 ± 2,5%, 84,9 ± 4,5 % y 84,0 ± 4,5 % de células ASO positivas a 0 μm, 6 μm y 10 μm, respectivamente. Los datos se presentan como media ± DE de tres cardioides, con tres secciones ópticas analizadas por cardioide y un total de 1.305 células cuantificadas. Se adquirieron imágenes representativas mediante microscopía confocal de barrido láser con imágenes de superresolución con detector de matriz utilizando un objetivo de inmersión en agua del 40×. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Vídeo 1: Secuencia en time-lapse. Un vídeo adquirido a 40 fotogramas por segundo demuestra actividad contráctil espontánea en los cardioides. La imagen se realizó utilizando un microscopio de campo amplio equipado con una cámara sCMOS. Por favor, haz clic aquí para descargar este vídeo.

Discusión

Las terapias basadas en oligonucleótidos han surgido como una clase poderosa de modalidades de dirigimiento génico, respaldadas por décadas de avances en la química de oligonucleótidos que han mejorado la especificidad del objetivo, la estabilidad metabólica y la tolerabilidad^{inmunogénica 7,8}. A pesar del creciente número de terapias de ARN aprobadas clínicamente, su aplicación más amplia sigue limitada por una administración intracelular ineficiente ^7,8. Debido a su tamaño, carga e hidrofilicidad, los oligonucleótidos no pueden difundirse pasivamente a través de la membrana plasmática y, en su lugar, se internalizan mediante vías^{endocíticas 9,10}. Tras la absorción, la gran mayoría (~99%) de los oligonucleótidos internalizados permanecen secuestrados dentro de los compartimentos^{endosómicos 9,10}. El tráfico endosomal avanza a través de un proceso de maduración desde endosomas tempranos hasta finales y, finalmente, lisosomas; Sin embargo, los compartimentos precisos desde los que los oligonucleótidos escapan al citosol permanecen incompletamente comprendidos y pueden involucrar a múltiples poblaciones^{endosómicas.} Esta liberación citosólica limitada representa una barrera crítica limitante de la tasa y subraya la necesidad de sistemas experimentales fisiológicamente relevantes que permitan la evaluación cuantitativa de la captación de oligonucleótidos, el tráfico intracelular y el escape^{endosomal 20}.

El protocolo descrito aquí se desarrolló para responder a esta necesidad combinando cardioides derivados de iPSC humanos con lecturas basadas en imágenes de la captación de oligonucleótidos. La robustez de este sistema se basa en varios pasos críticos que influyen directamente en la reproducibilidad y los resultados experimentales. En primer lugar, la calidad de los cultivos iniciales de iPSC es un factor clave para el éxito de la diferenciación cardíaca. Los autores recomiendan análisis periódicos de cariotipos para asegurar la estabilidad genómica a largo plazo y la evaluación rutinaria de la morfología, integridad y dinámica de crecimiento de las colonias. Las culturas de alta calidad se caracterizan por colonias compactas y bien definidas con bordes suaves, diferenciación espontánea mínima y proliferación constante. Los cultivos que presenten bordes irregulares de colonia, morfología celular heterogénea o áreas de diferenciación deben descartarse y sustituirse por stocks congelados de paso bajo antes de iniciar la diferenciación.

Un segundo paso crítico es la formación controlada de agregados iPSC utilizando placas de micropozo, lo que promueve la generación de estructuras tridimensionales uniformes y definidas por tamaño, esenciales para la diferenciación cardíaca^{reproducible 21}. La agregación basada en micropozos genera cuerpos embrionarios con diámetros definidos (óptimamente 200–230 μm), estandarizando así las interacciones célula-célula y la exposición a gradientes de morfógenos durante la modulación temporal de la señalización Wnt. En nuestra experiencia, este tamaño se logra consistentemente sembrando aproximadamente 3.000 celdas por micropozo individual (Paso 2.2), una condición que fue optimizada empíricamente y validada en múltiples líneas iPSC humanas, incluyendo líneas comerciales disponibles y líneas reprogramadas internamente. Sin embargo, dado que las tasas de proliferación de iPSC pueden variar, la densidad óptima de siembra puede requerir un ajuste para mantener el tamaño deseado del agregado. No controlar estos parámetros puede conducir a estructuras heterogéneas, viabilidad reducida y una eficiencia de diferenciación deteriorada.

El análisis histológico, como se muestra en la Figura 2, proporciona una evaluación conveniente de control de calidad de la formación de cardioides. En particular, la ausencia de cavidades internas o la presencia de estructuras colapsadas o fragmentadas puede indicar una formación de agregados subóptima o un control temporal inadecuado de la señalización Wnt durante los pasos de diferenciación (Pasos 4.1–4.3). En algunas diferenciaciones fallidas, surgen poblaciones celulares no contráctiles dentro o alrededor de los cardioides. Estas células suelen parecer amarillentas según la microscopía de campo claro y tienden a adherirse a placas de cultivo de baja adherencia, mientras que los cardioides ricos en cardiomiocitos suelen ser grises, permanecen como estructuras compactas tridimensionales y no se adhieren fácilmente. Si una proporción sustancial de los agregados presenta este fenotipo adherente y no contráctil, la diferenciación debe considerarse subóptima. En ese caso, la solución de problemas debe comenzar revisando la morfología de la colonia iPSC antes de la diferenciación, confirmando el tamaño agregado entre el Día −1 y el Día 0 y, si es necesario, reoptimizando la densidad de siembra y las concentraciones de CHIR99021 e IWP4 para la línea específica de iPSC.

El batido espontáneo bajo o ausente entre los días 10 y 12 suele reflejar una inducción ineficiente del mesodermo o especificación cardíaca, normalmente debido a una concentración o sincronización inadecuada del modulador Wnt, o a una muerte celular excesiva tras CHIR99021 tratamiento (Paso 4.2). En nuestra experiencia, la titulación CHIR99021 dentro de un rango de 9–13 μM para cada línea iPSC y verificar la concentración y actividad de las soluciones stock puede mejorar sustancialmente la eficiencia de la diferenciación. El análisis de inmunofluorescencia de la organización de proteínas sarcómicas, como se muestra en la Figura 3, proporciona una evaluación conveniente de control de calidad de la diferenciación de cardiomiocitos. La tinción débil o parcheada de proteínas sarcómicas, especialmente cuando se restringe a las regiones periféricas del cardioide, generalmente indica una diferenciación cardiomiocítica incompleta o heterogénea. En estos casos, se recomienda extender el periodo de maduración en suspensión-cultivo (Paso 4.6 y Punto de Pausa) antes de la fijación y verificar las condiciones de fijación y tinción de anticuerpos.

Aunque este modelo cardioide proporciona un microambiente cardíaco humano tridimensional que mejora sustancialmente los cultivos bidimensionales convencionales de cardiomiocitos, no recapitula completamente la complejidad del corazón humano adulto. Los cardioides representan una etapa temprana del desarrollo cardíaco humano, con los cardiomiocitos manteniendo un fenotipo¹⁴ inmaduro, similar a un fetal. Además, los tejidos carecen de perfusión vascular, inervación, células inmunitarias residentes y la arquitectura específica de cámara completa del miocardio maduro. Por lo tanto, aunque esta plataforma es adecuada para investigar la captación celular y la distribución intracelular de oligonucleótidos bajo condiciones experimentales controladas, debe prestarse precaución al extrapolar la cinética de captación y los mecanismos de entrega directamente al entorno in vivo . La incorporación futura de nuevos tipos celulares cardíacos, redes vasculares y estrategias de maduración tisular debería aumentar aún más la relevancia fisiológica de esta plataforma.

La evaluación fiable de la captación de oligonucleótidos por los cardioides descritos en este protocolo requiere optimización y estandarización de la concentración de ASO, el tiempo de incubación y los ajustes de adquisición de imágenes, como se muestra en las Figuras 4 y 5. La elección del fluoróforo es especialmente importante, ya que los tintes difieren en brillo, fotoestabilidad y sensibilidad a los efectos ambientales. En este estudio, utilizamos Janelia Fluor 646 (JF646)²², un fluoróforo de silicio-rodamina de un rojo lejano con alta luminosidad y fotoestabilidad que proporciona una detección robusta de señales minimizando la autofluorescencia tisular en muestras tridimensionales. Estas propiedades lo hacen muy adecuado para la captación de oligonucleótidos en cardioides vivos o fijos. Cabe destacar que la conjugación de fluoróforos puede influir en el comportamiento de los oligonucleótidos, incluyendo la captación y el tráfico, y por lo tanto debe validarse para cada sistema experimental.

En su forma actual, este protocolo proporciona una evaluación tanto cualitativa como cuantitativa de la absorción de oligonucleótidos. La imagen confocal de puntos intracelulares asociados a ASO permite la visualización de la localización de oligonucleótidos dentro de los cardioides, mientras que la eficiencia de captación se cuantifica determinando manualmente el porcentaje de células ASO-positivas usando el plugin Cell Counter en Fiji/ImageJ. Aunque este enfoque es adecuado para los análisis de rendimiento moderado presentados aquí, el análisis manual de imágenes requiere mucho trabajo y puede estar sujeto a sesgos por parte del observador, especialmente cuando se aplica a grandes conjuntos de datos. Los avances recientes en el aprendizaje profundo auto-supervisado para microscopía tridimensional ofrecen oportunidades prometedoras para superar estas limitaciones. El análisis de imágenes basado en IA puede segmentar, identificar y rastrear con precisión estructuras subcelulares heterogéneas en entornos tridimensionales complejos, permitiendo la cuantificación automatizada de la captación de oligonucleótidos y el tráfico intracelular, incluida la dinámica^{endosómica 23}. La incorporación de estos enfoques en futuras implementaciones del protocolo debería mejorar el rendimiento, la reproducibilidad y la precisión analítica.

De cara al futuro, la integración de cardioides derivados de iPSC humanos con imágenes cuantitativas, análisis de imágenes basados en aprendizaje automático y metodologías de partícula única ofrece un marco potente para investigar los mecanismos que rigen la administración de oligonucleótidos en el tejido cardíaco humano. Combinar modelos cardíacos tridimensionales fisiológicamente relevantes con herramientas analíticas avanzadas capaces de resolver la organización y dinámica subcelular permitirá una caracterización cuantitativa exhaustiva de la captación de oligonucleótidos, el tráfico intracelular y, con ensayos complementarios apropiados, el escape endosómico. Se espera que estos enfoques integrados faciliten la identificación sistemática de factores que determinan la eficiencia de la administración, apoyen la optimización racional de las químicas y vehículos de administración de oligonucleótidos, y proporcionen una plataforma escalable para evaluar terapias emergentes con oligonucleótidos en el contexto de las enfermedades cardiovasculares.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
4', 6-diamidino-2'-phenylindole, dihydrochloride	Thermo Scientific	62248	DAPI
10× dry objective	Zeiss		EC Plan-Neofluar 10×/0.30
40× water objective	Zeiss		LD C-Apochromat 40×/1.10 Corr
63× oil-immersion objective	Zeiss		Plan-Apochromat 63×/1.40 Oil DIC M27
800-µm microwell aggregation plate	STEMCELL Technologies	34815	AggreWell 800
Andor Neo 5.5 sCMOS camera	Andor		Andor Neo 5.5
Antifade mounting medium	Vector Laboratories	H-1000-10	VECTASHIELD Antifade Mounting Medium
B27 supplement minus insulin, 50×	Gibco	A18956-01	B27 Minus Insulin 50×
B27 supplement with insulin, 50×	Gibco	17504-044	B27 Supplement 50×
Basal Medium	Gibco	21875-034	RPMI 1640
Basement-membrane matrix	Gibco / Corning	A14132-02 / 354230	Geltrex LDEV-Free / Matrigel LDEV-Free
brightfield microscope	EVOS		EVOS XL Core Imaging Microscope
Cell detachment solution	STEMCELL Technologies	07922	ACCUTASE
confocal microscope	ZEISS		ZEISS LSM 980 with Airyscan 2 Microscope
Defined feeder-free iPSC maintenance medium	STEMCELL Technologies	100-0276	mTeSR Plus
DMEM/F12	Gibco	31331-028	DMEM/F12
Non-treated 6-well plate	Avantor (VWR)	734-2777	Untreated 6-well Plate
Phalloidin	Thermo Scientific	A22287	Phalloidin Labeling Probes ALexa 647
Phosphate-buffered saline (1× PBS)	Gibco	14190-144	DPBS 1×
primary antibody c-MYBPC3	Santa Cruz	sc-137181	MYBPC3 Antibody (F-1)
ROCK inhibitor	STEMCELL Technologies	72304	ROCK Inhibitor (Y-27632)
Secondary antibody (green)	Thermo Scientific	A-11017	F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Washing medium supplement	Gibco	10828028	KnockOut Serum Replacement
WGA, Alexa Fluor™ 488 conjugate	Invitrogen	W11261	WGA
widefield microscope	Nikon		Nikon Eclipse Ti
WNT pathway inhibitor	STEMCELL Technologies	72552	IWP4
Wnt/β-catenin pathway activator	Sigma	SML1046	CHIR99021