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Artículo de método

Cardioides derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos como modelo para evaluar la administración de oligonucleótidos

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DOI:

10.3791/72013

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11 de agosto de 2026

 ,  ,  ,  , 
1Gulbenkian Institute for Molecular Medicine, 2Novo Nordisk Center for Optimized Oligo Escape, University of Copenhagen, 3Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo permite la generación de cardioides autoorganizados basados en cardiomiocitos a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas para la evaluación microscópica de la captación de oligonucleótidos marcados con fluorescencia.

Resumen

Las terapias basadas en oligonucleótidos representan una clase de fármacos en rápido avance con un potencial significativo para tratar enfermedades cardiovasculares; Sin embargo, lograr una administración eficiente en el tejido cardíaco sigue siendo un desafío crítico y sin resolver. Un obstáculo clave es la limitada disponibilidad de modelos humanos in vitro robustos y fisiológicamente relevantes, capaces de apoyar la evaluación cuantitativa de la captación celular de oligonucleótidos y su distribución intracelular. Se presenta un protocolo detallado y paso a paso para generar cardioides 3D autoorganizados a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSCs) y aplicarlos como plataforma para evaluar la absorción de oligonucleótidos marcados con fluorescencia. El protocolo guía a los usuarios a través de la diferenciación cardíaca dirigida en cultivo en suspensión mediante la modulación temporal de la señalización Wnt/β-catenina, permitiendo la especificación secuencial de iPSCs a través de las etapas progenitoras del mesodermo, del mesodermo cardíaco y del cardiomiocito. Bajo estas condiciones, las células se autoensamblan espontáneamente en estructuras tridimensionales que contienen cavidades y que expresan marcadores canónicos de cardiomiocitos. Los cardioides resultantes proporcionan una plataforma escalable y experimentalmente manejable para la evaluación basada en imágenes de la eficiencia de captación de oligonucleótidos, apoyando el desarrollo y la optimización de estrategias de administración para aplicaciones cardíacas.

Introducción

Las terapias basadas en oligonucleótidos, principalmente oligonucleótidos antisentido (ASO) y pequeños ARN interferentes (siRNA), están emergiendo rápidamente como un enfoque transformador y altamente específico para el tratamiento de una amplia gama de enfermedades, incluyendo tanto condiciones hereditarias como adquiridas 1,2,3. Estas modalidades permiten la modulación directa de la expresión génica a nivel de ARNm mediante la unión específica de secuencia a transcritos objetivo, lo que permite la corrección de silenciamiento génico o empalme de genes asociados a enfermedades que a menudo son inaccesibles para terapias convencionales de moléculaspequeñas 4,5. Por ello, las terapias génicas basadas en oligonucleótidos proporcionan una plataforma versátil para atacar diversos mecanismos patógenos en múltiples áreas de enfermedad, incluyendo trastornoscardiovasculares 6. Hasta la fecha, varios tratamientos basados en oligonucleótidos, incluidos ASOs, siRNAs y agentes de conmutación de empalmes, han sido aprobados para usoclínico 7. A pesar de este progreso, su eficacia terapéutica tanto en entornos preclínicos como clínicos sigue limitada por una administración intracelular ineficiente8. Las estimaciones actuales indican que menos del 1% de los oligonucleótidos internalizados escapan de los compartimentos endosómicos para llegar al citosol y comprometer su ARN objetivo, limitando así la actividadfuncional 9,10. Esta limitación es especialmente pronunciada en el tejido cardíaco, donde la captación y el tráfico intracelular se comprenden poco.

Históricamente, la evaluación preclínica de terapias cardiovasculares se ha basado en gran medida en modelos animales, que siguen siendo indispensables para evaluar la farmacocinética, la biodistribución, la eficacia y la seguridad in vivo. Sin embargo, importantes diferencias entre especies en fisiología cardíaca, regulación génica y respuestas celulares a menudo limitan su capacidad para predecir con precisión la eficacia terapéutica y la toxicidad en humanos. Estas limitaciones han impulsado el desarrollo de modelos in vitro basados en humanos con mayor relevancia fisiológica. Entre ellas, la tecnología de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC) ha revolucionado la modelización de enfermedades cardiovasculares al proporcionar una fuente prácticamente ilimitada de células que pueden diferenciarse en linajes cardiovasculares. Los cardiomiocitos derivados de iPSC en humanos (iPSC-CM) recapitulan muchas de las propiedades moleculares, estructurales y funcionales del miocardio humano y se han convertido en una plataforma ampliamente adoptada para investigar mecanismos de enfermedades, respuestas a fármacos y modalidades terapéuticasemergentes 11. Sin embargo, los cultivos bidimensionales convencionales de iPSC-CM humanos presentan limitaciones importantes. La mayoría de los protocolos de diferenciación generan cardiomiocitos que se asemejan a células fetales en lugar de adultas, mostrando propiedades estructurales, electrofisiológicas, metabólicas y contráctilesinmaduras.

Además, los cultivos monocapa carecen de la arquitectura tisular tridimensional (3D), las interacciones multicelulares y la composición de la matriz extracelular que influyen en la función cardiomiocitaria in vivo. Para abordar estos desafíos, se han desarrollado modelos cardíacos 3D cada vez mássofisticados 13. Entre ellos, los tejidos cardíacos modificados (EHT), generados mediante la incrustación de iPSC-CM en andamios de biomateriales y la aplicación de estimulación mecánica y eléctrica, promueven la maduración estructural y funcional mientras reproducen más fielmente el entorno biomecánico del miocardionativo 13. Aunque los EHT proporcionan plataformas altamente relevantes fisiológicamente para la modelización de enfermedades y pruebas de fármacos, su generación suele requerir conocimientos especializados en bioingeniería y equipos dedicados. En el otro extremo, las cortes cardíacos ex vivo conservan de forma más fiel la arquitectura y composición celular del tejido nativo, pero dependen del acceso al tejido cardíaco primario, tienen una viabilidad limitada en cultivo y no son fácilmente escalables.

Más recientemente, los organoides cardíacos han surgido como sistemas modelo 3D accesibles que recapitulan aspectos clave de la organización y función del tejidocardíaco 14. Los cardioides son organoides cardíacos autoensamblados compuestos predominantemente por cardiomiocitos que sufren especificación intrínseca, patrón espacial y morfogénesis para formar estructuras en forma de cámara que contienencavidades 15,16. Los métodos para formar cardioides suelen depender de una activación inicial de la señalización Wnt para inducir la especificación del mesodermo, seguida de una inhibición posterior para promover el compromiso de la línea cardíaca. Los cardioides pueden generarse en cultivos estáticos o en suspensión agitada, que apoyan la producción escalable y mejoran la autoorganizacióntisular 15,16,17,18,19. Los organoides cardíacos más complejos de múltiples líneas que incorporan tipos celulares endoteliales, epicárdicos u otros aumentan aún más la relevancia fisiológica, pero requieren protocolos de diferenciación más elaborados, periodos de cultivo más largos y una optimizaciónextensa 13,14.

Se presenta un protocolo sencillo, reproducible y eficiente para generar cardioides autoorganizados basados en cardiomiocitos a partir de iPSC humanos y aplicarlos para evaluar la absorción de oligonucleótidos marcados con fluorescencia. El protocolo debería resultar valioso para investigadores que buscan optimizar la química y las estrategias de administración de oligonucleótidos para aplicaciones cardiovasculares. Todos los materiales utilizados en este estudio están listados en la Tabla de Materiales.

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Protocolo

1. Cultivo y preparación de iPSC para la diferenciación

PRECAUCIÓN: Realizar toda la manipulación al aire libre de células y medios en un gabinete de bioseguridad certificado Clase II. Lleva bata y guantes. Descontamina las superficies de trabajo y los residuos líquidos con un desinfectante adecuado.

  1. Mantén iPSCs.
    1. Recubre las placas de cultivo con una matriz basal-membrana adecuada según las instrucciones del fabricante.
    2. Alimenta a los iPSC con un medio de células madre pluripotentes definido y libre de alimento y reemplaza el medio cada 24 horas.
    3. Mantener los cultivos por debajo de la sobreconfluencia y las células del paso cuando alcancen una confluencia del 70–80%.
      NOTA: Asegúrese de que los iPSC conserven una morfología de alta calidad e indiferenciada y que se confirme que están libres de micoplasma antes de iniciar la diferenciación.
  2. Paso previo a la diferenciación.
    1. Descongelan iPSCs y expanden las células durante al menos dos vías antes de iniciar la diferenciación cardíaca.
    2. Células de pasaje utilizando un método de disociación sin enzimas, PBS-EDTA, compatibles con el mantenimiento de iPSC.
      PUNTO DE PAUSA: Mantener las iPSC en cultivo hasta alcanzar una confluencia del 70–80% y conservar la morfología típica sin signos de diferenciación espontánea.

2. Preparación de agregados iPSC en placas de micropozos

  1. Disociar iPSCs a una suspensión unicelular.
    1. Aspira el medio y lava las células una vez con 1 mL de 1× PBS.
    2. Añadir la solución de desprendimiento celular (Accutasa) a 500 μL por pozo de una placa de 6 pozos e incubar a 37 °C durante 5–7 minutos.
    3. Añade 1,5 mL de medio de lavado por pozo y resuspende suavemente para obtener una suspensión de célula única.
    4. Transfiere la suspensión a un tubo cónico de 15 mL y centrifuga a 200 × g durante 3 minutos a temperatura ambiente.
    5. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet celular en un medio iPSC libre de alimentación, suplementado con inhibidor de ROCK (10 μM finales).
      NOTA: Ajusta el tiempo de incubación por disociación para cada línea de iPSC comprobando el desprendimiento a 5 minutos y extendiendo en pequeños incrementos si es necesario.
  2. Cuenta las celdas y prepara la densidad de la placa.
    1. Cuenta las celdas viables usando un método estándar de conteo de celdas.
    2. Preparar una suspensión de celda única a 0,9 × 106 células/mL para cada pozo de una placa de agregación de micropozos de 800 μm (formato de 24 pozos, ~300 micropozos/pozo).
      NOTA: Optimiza el número de celdas por pozo, ya que el tamaño agregado o la eficiencia de diferenciación varía entre líneas iPSC.
  3. Imprima la placa del micropozo y quita las burbujas.
    1. Añadir 500 μL de medio iPSC libre de alimentador que contenga inhibidor de ROCK (los 10 μM finales) a cada pozo.
    2. Centrifuga la placa del micropozo a 300 × g durante 3 minutos a temperatura ambiente para eliminar las burbujas de aire de los micropozos.
      CRÍTICO: Eliminar completamente todas las burbujas para permitir una deposición celular uniforme en el fondo de cada micropozo y apoyar la formación eficiente de agregados.
  4. Sembra iPSCs en micropozos.
    1. Añadir 1,0 mL de la suspensión de celda única preparada (0,9 × 106 celdas/mL) a cada pozo, lo que corresponde a 0,9 × 106 celdas por pozo.
    2. Resuspende suavemente dentro del pozo entre 3 y 5 veces usando una P1000 y evita introducir burbujas de aire.
    3. Centrifuga la placa a 200 × g durante 3 minutos a temperatura ambiente para pelletar las células en los micropozos.
    4. Verifica bajo el microscopio que las células se hayan asentado en los micropozos antes de colocar la placa a 37 °C con un 5% de CO₂ durante 24 horas.
      CRÍTICO: Manipula la placa con cuidado después de centrifugarla. No agites ni sacudas la placa, ya que esto puede hacer que las células se levanten de los micropozos.

3. Expansión de agregados iPSC en micropozos

  1. Aspira cuidadosamente y reemplaza el medio sin alterar ni desprender los áridos.
    1. Inclina la placa y aspira lentamente aproximadamente 1,0 mL de medio de cada pozo usando una pipeta P1000, asegurando que los agregados permanezcan asentados en los micropozos.
    2. Aspira lentamente los ~500 μL restantes del medio usando una pipeta P1000.
    3. Añade 1,5 mL de medio iPSC sin alimentador a cada pozo dispensándolo lentamente por el lateral del pozo usando una pipeta serológica.
    4. Incubar a 37 °C, 5% de CO₂ y repetir el cambio de medio diariamente.
      CRÍTICO: Dispensa el medio sobre la pared del pozo y evita el flujo directo sobre los árcidos.

4. Diferenciación cardíaca de agregados de iPSC (Día 0 a Día 12)

  1. Inducción del mesodermo (Día 0).
    1. Retirar el medio utilizando el método de aspiración suave descrito en los pasos 3.1.1–3.1.2.
    2. Añadir 1,5 mL por pozo de medio basal suplementado con un 2% de B27 menos insulina y el activador de la vía Wnt/β-catenina (CHIR99021, concentración final: 11 μM).
      NOTA: Prepara una solución de 10 mM de CHIR99021, un inhibidor de molécula pequeña de la glicógenosintasa quinasa-3 (GSK-3). Para lograr una concentración final de 11 μM, añadir 1,65 μL de la solución original a 1,5 mL de medio.
  2. Cambio de medio tras la inducción (Día 1).
    1. A las 24 horas tras añadir CHIR99021, aspira suavemente el medio de cada pozo.
    2. Añadir 1,5 mL por pozo de medio basal fresco suplementado con un 2% de B27 menos insulina, y luego incubar durante 48 horas.
      CRÍTICO: Sigue estrictamente el tiempo de los pasos de modulación Wnt, ya que las desviaciones pueden comprometer la eficiencia de la diferenciación.
      NOTA: Se espera cierta muerte celular tras la exposición al activador de la vía Wnt/β-catenina. Si se observa una pérdida agregada generalizada, considere reducir la concentración del activador en futuros experimentos.
  3. Ingreso cardíaco mediante inhibición de WNT (Día 3).
    1. Preparar el medio acondicionado transfiriendo 760 μL de medio gastado de cada pozo a un tubo cónico estéril de 50 mL.
    2. Para cada pozo, añadir 760 μL de medio basal fresco suplementado con un 2% de B27 menos insulina al tubo que contiene el medio acondicionado agrupado, y mezclar suavemente.
    3. Añadir el inhibidor de la vía Wnt, IWP4, al medio mezclado hasta una concentración final de 5 μM e invierte suavemente el tubo varias veces para mezclar.
    4. Aspira cuidadosamente el medio restante de cada pozo y luego añade 1,5 mL por pozo de medio acondicionado suplementado con IWP4.
    5. Incubar a 37 °C con un 5% de CO₂ durante 48 horas.
      NOTA: Prepara una solución de 1 mM del inhibidor de la vía Wnt IWP4. Para lograr una concentración final de 5 μM, se añaden 7,6 μL de la solución stock por cada 1,52 mL de medio total (760 μL de medio acondicionado + 760 μL de medio basal fresco) para cada pozo.
  4. Cambio de medio en micropozos (día 5).
    1. Sustituye el medio usando el enfoque de aspiración suave descrito en los pasos 3.1.1–3.1.2.
    2. Añadir 1,5 mL de medio basal suplementado con un 2% de B27 menos insulina a cada pozo, y luego incubar a 37 °C con 5% de CO₂ durante 48 horas.
  5. Transfiere los agregados de micropozos a placas de 6 pozos (día 7).
    1. Aspira cuidadosamente el medio de cada pozo utilizando el método de aspiración suave descrito en los Pasos 3.1.1–3.1.2.
    2. Añadir 1,0 mL de medio basal suplementado con un 2% de B27 con insulina a cada pozo de la placa del micropozo. Utilizando una pipeta P1000, haz una piqueta suave con el medio hacia arriba y abajo cinco veces mientras mueve la punta de la pipeta en círculos a lo largo de la superficie del pozo para desalojar los agregados de los micropozos y transferirlos a la suspensión.
    3. Transfiere la suspensión de agregados a un solo pozo de una placa de cultivo de 6 pozos no tratada.
    4. Enjuaga cada pozo de la placa de micropozos con 1,0 mL adicionales de medio fresco dos o tres veces para recuperar los agregados restantes, transferiendo cada enjuague al mismo pozo de la placa de 6 pozos.
    5. Incubar a 37 °C con un 5% de CO₂ durante 72 horas.
      NOTA: Se espera la presencia de células muertas y residuos celulares tras la transferencia de agregados. La mayoría de los residuos se eliminarán durante el cambio de medio posterior.
  6. Cambio medio durante el cultivo de suspensión (día 10).
    1. Agita suavemente la placa para desalojar cualquier agregado que esté flojamente adherido.
    2. Inclina la placa para permitir que los agregados se asienten en el fondo del pozo por gravedad.
    3. Aspira cuidadosamente el medio gastado sin alterar ni aspirar los áridos.
    4. Añadir 2,0 mL de medio basal fresco suplementado con 2% de B27 con insulina a cada pozo e incubar a 37 °C con 5% de CO₂ durante 48–72 horas.
      NOTA: El golpe espontáneo suele observarse aproximadamente desde el día 10 en adelante.
      PUNTO DE PAUSA: Los cardioides de batido pueden mantenerse en cultivo en suspensión para una maduración prolongada reemplazando el medio cada 2–3 días.

5. Caracterización microscópica de cardioides

NOTA: Este método proporciona un flujo de trabajo para la caracterización histológica de los cardioides mediante criosecciones. Las secciones resultantes pueden utilizarse para una variedad de análisis histológicos, incluyendo la tinción de hematoxilina y eosina (H&E) para evaluar la arquitectura general del tejido y el marcaje de inmunofluorescencia para evaluar la identidad del cardiomiocito.

  1. Fijación y criosección.
    1. Coloca los cardioides con paraformaldehído al 4% durante la noche a 4 °C.
      PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es tóxico y probablemente un carcinógeno; Maneja la cámara con una campana extractora química mientras llevas el equipo de protección personal adecuado. Recoger todos los residuos que contengan paraformaldehído (fijadores y lavados) en un recipiente claramente etiquetado para aldehído/residuos químicos peligrosos, y deshacerse de ellos conforme a los procedimientos institucionales de residuos peligrosos.
      SEGURIDAD: Realizar toda la fijación y manipulación del paraformaldehído en una campana extractora química mientras se lleva el equipo de protección personal adecuado.
    2. Lava tres veces con PBS y crioprotege los cardioides fijos en un 30% (p/v) de sacarosa en PBS durante la noche a 4 °C.
    3. Incrusta los cardioides en gelatina, congela y corta criosecciones de 10 μm de grosor en portaobjetos de microscopio. Guarda las secciones a −20 °C hasta su uso.
  2. Inmunomarcaje.
    1. Descongela las secciones durante 15 minutos a temperatura ambiente.
    2. Lava las secciones en PBS a 37 °C durante 10 minutos, dos veces.
    3. Rodea el área de interés en cada lámina con un bolígrafo hidrofóbico para crear un pozo que retenga las soluciones de bloqueo y anticuerpos.
    4. Rehidratar las secciones durante 2–3 minutos en un tampón de permeabilización (PB; PBS que contienen 0,1% Tween-20) en un tarro de Coplin.
    5. Quita los portaobjetos de PB, drena el exceso de solución y coloca los portaobjetos en una cámara húmeda.
      CRÍTICO: A partir de este momento, es fundamental no dejar que las secciones se sequen.
    6. Bloquear las secciones con 200–300 μL de PB que contengan suero fetal bovino (FBS) al 5% durante 90 minutos a temperatura ambiente en una cámara húmeda.
    7. Retirar la solución bloqueante e incubar las secciones durante la noche a 4 °C con 100 μL de anticuerpo primario (anti-cMYBP-C; 1:50) diluido en solución bloqueante (PB que contiene 1% de FBS).
    8. Lava las láminas tres veces con PB e incuba durante 2 horas a temperatura ambiente con un anticuerpo secundario fluorescente verde anti-ratón (1:200), faloidina fluorescente de rojo lejano (1:400) e DAPI (1 μg/mL).
    9. Lava tres veces en PB y monta con un medio de montaje antifade.
      PRECAUCIÓN: Recoger todas las soluciones que contengan colorantes fluorescentes (anticuerpos secundarios, faloidina y soluciones de tinción DAPI y los lavados correspondientes) en un recipiente y deséchalas como residuos químicos según las directrices institucionales.
  3. Adquisición de imágenes.
    1. Adquirir imágenes confocales utilizando un microscopio confocal de escaneo láser equipado con un detector de matriz para obtener imágenes de superresolución con objetivos de inmersión en aceite de 10×× y 63/1,40.
    2. Excita el fluoróforo rojo lejos, el fluoróforo verde y la tinción nuclear usando líneas láser de 639 nm, 488 nm y 405 nm con transmisión láser del 4,0%, 4,0% y 1,0%, respectivamente.
    3. Adquirir secciones ópticas individuales con un tamaño de píxel de 0,0353 × 0,0353μm 2, escaneo unidireccional, velocidad de escaneo 6, zoom 1,7, promedio de línea 1 y tiempo de permanencia de píxeles de 0,935 μs por píxel.
    4. Aplicar procesamiento de imágenes de superresolución con detector de matriz usando filtrado automático de Wiener.

6. Ensayo de captación de oligonucleótidos fluorescentes

  1. Preparar una solución estándar del oligonucleótido marcado con fluorescencia conjugado al ácido palmítico para aumentar la lipofilialidad.
    1. Reconstituir el oligonucleótido liofilizado marcado con fluorescencia en agua libre de nucleasas hasta una concentración final de 1 mM. Un vórtice breve y centrifugación a 3.000 × g durante 30 segundos para recoger la solución en el fondo del tubo.
    2. Prepara alicotas de un solo uso de la solución de 1 mM y guárdalas a −20 °C protegidas de la luz.
    3. El día del experimento, añadir 1 μL del material de 1 mM a 1 mL de medio de cultivo cardioide para obtener una concentración final de oligonucleótidos de 1 μM. Mezclar mediante una suave agitación de placas.
  2. Incubar los cardioides con el oligonucleótido marcado con fluorescencia (concentración final de 1 μM) en un medio libre de suero a 37 °C con un 5% de CO₂ durante 24 horas.
  3. Lava los cardioides tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar el oligonucleótido extracelular.
  4. Fija los cardioides en paraformaldehído al 4% durante 20 minutos a temperatura ambiente, lava tres veces con PBS y continúa con el marcaje fluorescente antes de la imagen.
  5. Incubar cardioides fijos intactos durante la noche a 4 °C, protegidos de la luz, en PBS que contenga 5 μg/mL de aglutinina germinal de trigo (WGA) conjugada con un fluoróforo verde y 1 μg/mL de DAPI. Lava tres veces en PBS y monta con un medio antifade.
    PRECAUCIÓN: Recoger todos los medios y lavados que contengan oligonucleótidos y colorantes fluorescentes, incluyendo el medio de incubación marcado con oligonucleótidos del paso 6.2 y la solución de tinción WGA/DAPI, en un recipiente separado y deséchalos como residuos químicos/biopeligrosos según las directrices institucionales.
  6. Adquirir imágenes confocales de la absorción y distribución de oligonucleótidos.
    1. Adquirir imágenes confocales utilizando un microscopio confocal de barrido láser equipado con un detector de matriz para imágenes de superresolución y un objetivo de inmersión en agua del 40×. Adquirir imágenes como pilas en z de 8 secciones con un tamaño de paso z de 2 μm, cubriendo una profundidad total de 16 μm.
    2. Excitar la tinción nuclear, el marcador de membrana y el oligonucleótido marcado fluorescentemente de color rojo lejano usando líneas láser de 405 nm, 488 nm y 639 nm con transmisión láser del 0,9%, 0,2% y 3,0%, respectivamente.
    3. Adquirir imágenes con un tamaño de vóxel de 0,0449 × 0,0449 × 2μm 3, escaneo bidireccional, velocidad de escaneo 5, promedio de línea 1 y tiempo de permanencia de píxel de 1,51 μs por píxel. Aplica Airyscan/procesamiento de imagen super-resolución usando filtrado automático de Wiener.
    4. Mantén todos los ajustes de adquisición (potencia láser, ganancia del detector, paso z y tamaño del voxel) constantes en todas las posiciones z y en todas las muestras para permitir una comparación válida de la señal de oligonucleótidos entre condiciones.

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Resultados

La Figura 1 resume el flujo de trabajo de diferenciación e ilustra los cambios morfológicos característicos esperados en cada etapa del protocolo, desde la agregación de iPSC hasta la formación de cardioides autoorganizados. La agregación de micropozos basada en suspensión proporciona un enfoque sencillo y estandarizado para la generación paralela de grandes cantidades de cardioides controlados por tamaño. La diferenciación exitosa se caracteriza por la gene...

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Discusión

Las terapias basadas en oligonucleótidos han surgido como una clase poderosa de modalidades de dirigimiento génico, respaldadas por décadas de avances en la química de oligonucleótidos que han mejorado la especificidad del objetivo, la estabilidad metabólica y la tolerabilidadinmunogénica 7,8. A pesar del creciente número de terapias de ARN aprobadas clínicamente, su aplicación más amplia sigue limitada por una administración int...

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Divulgaciones

Los autores no declaran intereses en competencia.

Agradecimientos

Agradecemos a los miembros del Novo Nordisk Foundation Challenge Center for Optimized Oligo Escape, en particular a Knud Jensen por el diseño y síntesis de oligonucleótidos, y a Nikos S. Hatzakis y Tomas Kirchhausen por la valiosa orientación sobre imágenes cuantitativas y análisis de tráfico intracelular. Este trabajo fue financiado por el Novo Nordisk Foundation Challenge Center for Optimized Oligo Escape (NNF23OC0081287). M.F. recibió una beca de la Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal (2020.04836.BD). Agradecemos a GIMM Bioimaging y a las Plataformas de Histopatología GIMM (Lisboa, Portugal) por la asistencia técnica.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
4', 6-diamidino-2'-phenylindole, dihydrochlorideThermo Scientific62248DAPI
10× dry objectiveZeissEC Plan-Neofluar 10×/0.30
40× water objectiveZeissLD C-Apochromat 40×/1.10 Corr
63× oil-immersion objectiveZeissPlan-Apochromat 63×/1.40 Oil DIC M27 
800-µm microwell aggregation plateSTEMCELL Technologies34815AggreWell 800
Andor Neo 5.5 sCMOS camera AndorAndor Neo 5.5 
Antifade mounting mediumVector LaboratoriesH-1000-10VECTASHIELD Antifade Mounting Medium
B27 supplement minus insulin, 50×GibcoA18956-01B27 Minus Insulin 50×
B27 supplement with insulin, 50×Gibco17504-044B27 Supplement 50×
Basal MediumGibco21875-034RPMI 1640
Basement-membrane matrixGibco / CorningA14132-02 / 354230Geltrex LDEV-Free / Matrigel LDEV-Free
brightfield microscope EVOSEVOS XL Core Imaging Microscope
Cell detachment solutionSTEMCELL Technologies07922ACCUTASE
confocal microscopeZEISSZEISS LSM 980 with Airyscan 2 Microscope
Defined feeder-free iPSC maintenance mediumSTEMCELL Technologies100-0276mTeSR Plus
DMEM/F12Gibco31331-028DMEM/F12
Non-treated 6-well plateAvantor (VWR)734-2777Untreated 6-well Plate
PhalloidinThermo ScientificA22287Phalloidin Labeling Probes ALexa 647
Phosphate-buffered saline (1× PBS)Gibco14190-144DPBS 1×
primary antibody c-MYBPC3Santa Cruzsc-137181MYBPC3 Antibody (F-1)
ROCK inhibitorSTEMCELL Technologies72304ROCK Inhibitor (Y-27632)
Secondary antibody (green)Thermo ScientificA-11017F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Washing medium supplementGibco10828028KnockOut Serum Replacement
WGA, Alexa Fluor™ 488 conjugateInvitrogen W11261WGA
widefield microscopeNikonNikon Eclipse Ti 
WNT pathway inhibitorSTEMCELL Technologies72552IWP4
Wnt/β-catenin pathway activatorSigmaSML1046CHIR99021

Referencias

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