Farmacología en red e investigación experimental del β-sitosterol en el tratamiento de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica a través del receptor glucocorticoide

Resumen

β-sitosterol alivió la EPOC y potenciaba la eficacia de la dexametasona, mediando este efecto por el receptor de glucocorticoides. Además, el β-sitosterol redujo la inflamación, el estrés oxidativo y la senescencia celular tanto en células epiteliales bronquiales estimuladas por la ECS como en ratones con EPOC inducidos por el humo de cigarrillos.

Resumen

La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es un trastorno respiratorio prevalente caracterizado por inflamación persistente, estrés oxidativo y deterioro progresivo de la función pulmonar. El potencial terapéutico del β-sitosterol en la EPOC sigue siendo incierto. Este estudio tenía como objetivo investigar los efectos protectores del β-sitosterol contra la EPOC y esclarecer su mecanismo subyacente. El cribado en bases de datos identificó el receptor glucocorticoide (GR) como un posible objetivo del β-sitosterol. Se estableció un modelo murino de EPOC inducido por humo de cigarrillo y un modelo de células BEAS-2B estimulado por extracto de humo de cigarrillo (CSE). Se evaluaron la función pulmonar, los marcadores relacionados con lesiones pulmonares, la inflamación, el estrés oxidativo y la senescencia celular utilizando (RT-qPCR), ensayos de sonda fluorescente DFH-DA y kits de detección de senescencia. También se evaluaron los efectos del β-sitosterol solo o en combinación con dexametasona (DEX). β-sitosterol mejoró significativamente la función pulmonar, normalizó los marcadores relacionados con lesiones pulmonares y atenuó la inflamación, el estrés oxidativo y la senescencia celular tanto en células BEAS-2B estimuladas por CSE como en ratones expuestos al humo de cigarrillo. Estos efectos protectores se acompañaron de un aumento en la expresión de la RG. Además, el β-sitosterol mejoró la respuesta a la DEX y el tratamiento combinado con β-sitosterol y DEX produjeron mejoras mayores en la función pulmonar, marcadores de lesión pulmonar, inflamación, niveles de especies reactivas de oxígeno y senescencia celular que el tratamiento por DEX por sí solo. En conjunto, estos hallazgos sugieren que el β-sitosterol alivia los cambios patológicos asociados a la EPOC, al menos en parte, al aumentar la expresión de la GR y mejorar la eficacia terapéutica de la DEX, destacando su potencial como estrategia adyuvante para el tratamiento de la EPOC.

Introducción

La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una enfermedad respiratoria progresiva caracterizada por inflamación persistente de las vías respiratorias, daño alveolar y obstrucción irreversible del flujo de aire que afecta la función respiratoria y reduce la calidad^{de vida 1}. Su prevalencia aumenta significativamente con la edad, y el riesgo para personas de sesenta y cinco años o más es aproximadamente cinco veces mayor que para personas menores de^{cuarenta y dos}. Esta tendencia demográfica está asociada con un aumento de la incidencia de enfermedades, mortalidad y discapacidad³. Las proyecciones epidemiológicas indican que para 2030, la EPOC podría convertirse en la cuarta causa principal de muerte a nivel mundial, representando alrededor del 5% de todas las muertes^{4, 5 y 6}. Actualmente, los factores de riesgo identificados incluyen susceptibilidad genética, displasia pulmonar, exposición a partus, bronquitis crónica e infección^{respiratoria 7}.

Entre los factores de riesgo, el humo de cigarrillo es el patógeno más importante de la^{EPOC 8}. Contiene miles de sustancias químicas que pueden causar daño epitelial bronquial, promover la infiltración de células inflamatorias y conducir a la remodelación del tejido^{pulmonar 9}. La exposición prolongada puede inducir lesiones epiteliales persistentes e irreversibles, promover la liberación de un gran número de quimioquinas proinflamatorias, aumentar significativamente la producción (ROS) e inducir la apoptosis celular¹⁰. Muchos estudios han demostrado que los niveles elevados de quimiocinas proinflamatorias como la interleucina-8 (IL-8) y el factor de necrosis tumoral α (TNF-α), junto con una producción excesiva de ROS y senescencia celular, están estrechamente relacionados con la gravedad de la^{EPOC 11,12}. Esto pone de manifiesto la necesidad de agentes que puedan modular eficaz y de forma segura estos factores patógenos clave para ejercer efectos protectores y terapéuticos en la EPOC.

Los fitoesteroles son compuestos bioactivos naturales presentes de forma ubicua en las membranas celulares de las plantas. Entre ellos, el β-sitosterol es el más abundante y está ampliamente distribuido en alimentos de origen vegetal ricos en lípidos, como verduras, frutos secos, semillas y aceite de^{oliva 13,14,15,16}. Los estudios han confirmado que la administración de β-sitosterol en dosis de hasta 1000 mg/kg en ratas y ratones no está asociada con citotoxicidad ni^{genotoxicidad 17}. Además, las investigaciones han demostrado que el β-sitosterol presenta propiedades antioxidantes a través de sus efectos sobre enzimas antioxidantes y receptores de estrógenos humanos¹⁸.

β-sitosterol muestra un amplio espectro de actividades farmacológicas, incluyendo efectos^{antiinflamatorios 19}, antipiréticos²⁰,^{analgésicos 21} y^{antidiabéticos 13}. También ha demostrado potencial terapéutico en diversos modelos de enfermedad, como la colitis y la inflamación^{intestinal 22}, y posee propiedades antiateroscleróticas²³ e^{inmunomoduladoras 24}. Además, tiene un perfil de seguridad favorable. Dadas estas características, el β-sitosterol ha despertado un interés considerable como posible candidato a fármaco. Sin embargo, su papel preciso y los mecanismos subyacentes en la EPOC siguen siendo en gran medida poco claros.

Por ello, el presente estudio tuvo como objetivo investigar los posibles efectos terapéuticos y los mecanismos subyacentes del β-sitosterol en la EPOC. Específicamente, se utilizó un modelo de lesión de células BEAS-2B inducido por extracto de cigarrillo de cigarrillo (CSE) para evaluar si el β-sitosterol podía aliviar eficazmente el daño celular mediado por la ECS, identificando así una molécula candidata novedosa para estrategias terapéuticas de EPOC.

Protocolo

El estudio se llevó a cabo de acuerdo con las directrices de Farmacología Básica y Toxicología Clínica para estudios experimentales y^{clínicos 25}. Todos los protocolos experimentales con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Segundo Hospital Afiliado, Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang (Aprobación nº 20230102), y todos los experimentos se realizaron conforme a las directrices del Comité de Ética Animal. El estudio se llevó a cabo de acuerdo con las directrices de ARRIVE.

Cribado de componentes clave y objetivos mediante farmacología de redes

Componentes activos de Fritillaria cirrhosa D. Don, Lonicera japonica Thunb., Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq., y Adenophora stricta Miq. fueron recuperados de la Base de Datos de Farmacología de Sistemas de Medicina Tradicional China (TCMSP; consultado el 12 de marzo de 2024). Los compuestos candidatos fueron evaluados según los siguientes criterios ADME: biodisponibilidad oral (OB) ≥ 30%, semejanza del fármaco (DL) ≥ 0,18 y permeabilidad al Caco-2 ≥ −0,4²⁵. Los compuestos que cumplían los tres criterios se mantuvieron como ingredientes activos candidatos para análisis posteriores.

La estructura canónica del Sistema Simplificado de Entrada de Línea de Entrada Molecular (SMILES) del β-sitosterol se obtuvo de PubChem (consultado el 18 de marzo de 2024) y se importó en SwissTargetPrediction (consultado el 21 de marzo de 2024) para la predicción de objetivos. Homo sapiens fue seleccionado como especie objetivo. Los posibles objetivos se predijeron basándose en la similitud estructural 2D y 3D entre β-sitosterol y ligandos conocidos en la base de datos. Se conservaron los objetivos predichos con probabilidad mayor que 0 y se eliminaron las entradas duplicadas.

Los genes asociados a la EPOC se recuperaron de la Base de Datos de Objetivos Terapéuticos (TTD; consultada el 25 de marzo de 2024) y de la Base de Datos de Toxicogenómica Comparativa (CTD; consultada el 28 de marzo de 2024) utilizando la palabra clave "enfermedad pulmonar obstructiva crónica". Tras la eliminación de genes duplicados, los genes asociados a la EPOC se intersectaron con los objetivos predichos de β-sitosterol para identificar objetivos candidatos potencialmente implicados en los efectos terapéuticos del β-sitosterol contra la EPOC.

Acoplamiento molecular de β-sitosterol y RG

La estructura tridimensional del β-sitosterol en formato SDF fue recuperada de la base de datos PubChem (consultado el 2 de junio de 2026), mientras que la estructura cristalina del receptor glucocorticoide (GR) se obtuvo del Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank (RCSB PDB; consultado el 3 de junio de 2026). Tras la preparación estándar de las estructuras del ligando y receptor, se realizó el acoplamiento molecular utilizando la plataforma en línea CB-Dock2 (consultado el 3 de junio de 2026). Los archivos preparados de ligandos y receptores se subieron a la plataforma, y se realizaron cálculos de acoplamiento usando los parámetros por defecto.

Análisis de enriquecimiento funcional de la Ontología Génica (GO) y la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG)

Todos los genes objetivo predichos del β-sitosterol fueron sometidos a análisis de enriquecimiento funcional GO y de enriquecimiento de vías KEGG. Los resultados de enriquecimiento, incluyendo procesos biológicos significativamente enriquecidos, componentes celulares, funciones moleculares y vías de señalización, fueron clasificados y almacenados en el Archivo Suplementario 1 para su posterior análisis bioinformático.

Modelado y agrupación animal

El tamaño de la muestra se estableció en seis animales por grupo basándose en un estudio previo que realizó un análisis de potencia a priori usando el software G*Power (α = 0,05, potencia = 0,80) y demostró que n = 6 era suficiente para detectar diferencias biológicamente relevantes bajo condiciones experimentales^{comparables 26}. Los ratones machos C57BL/6 de edad 6–8 semanas (20 ± 2 g) fueron asignados aleatoriamente a cinco grupos: grupo de control, grupo modelo de EPOC, grupo EPOC + dexametasona (DEX), grupo EPOC + β-sitosterol y grupo EPOC + DEX + β-sitosterol. Los ratones fueron alojados bajo condiciones estándar de laboratorio (25 °C, ciclo claro/oscuro de 12 horas) con acceso libre a comida y agua estándar, y se les permitió aclimatarse durante 1 semana antes de la experimentación.

Para el establecimiento del modelo de EPOC, los ratones fueron colocados en una cámara de exposición corporal completa al humo de cigarrillo (63 cm × 55 cm × 45 cm) y expuestos al humo habitual durante 12 semanas. Cada cigarrillo contenía 10 mg de alquitrán, 0,9 mg de nicotina y 10 mg de monóxido de carbono. La exposición al humo se realizó dos veces al día (5 días a la semana) a las 9:30 a.m. y a las 15:00, con humo generado por 18 cigarrillos introducidos en la recámara durante 90 minutos por^{sesión 27}.

Para evaluar los efectos terapéuticos de las intervenciones, se inició la administración de medicamentos tras 8 semanas de exposición al humo de cigarrillo y continuó durante las 4 semanas restantes. A partir de la semana 9, los ratones de los respectivos grupos de tratamiento recibieron administración intragástrica diaria de DEX (1 mg/kg)²⁸ o β-sitosterol (50 mg/kg)^29,30 1 hora antes de la exposición al humo de cigarrillo. Estudios farmacocinéticos previos han reportado una biodisponibilidad oral de aproximadamente el 4% para β-sitosterol en^{roedores 31}. Además, varios estudios en ratones han empleado dosis que van de 20 a 50 mg/^{kg 32}. Por ello, se seleccionó una dosis de 50 mg/kg para asegurar una exposición sistémica adecuada, manteniéndose dentro del rango comúnmente utilizado en estudios preclínicos.

Los ratones del grupo de control estuvieron expuestos al aire filtrado de la habitación, mientras que los ratones del modelo y del grupo de tratamiento recibieron un volumen equivalente de solución salina normal como vehículo. Al final del periodo experimental, los ratones fueron profundamente anestesiados con isoflurano hasta la pérdida del reflejo pedal y eutanasiados mediante exanguinación mediante la recogida de sangre de la aorta abdominal. La cavidad torácica se abrió de inmediato y se extirparon cuidadosamente los tejidos pulmonares bilaterales intactos, enjuagados con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y colocados sobre hielo. Para la recogida de líquido de lavado broncoalveolar (BALF), la tráquea fue canulada y lavada con PBS frío y estéril, que se instilló suavemente y se retiró repetidamente para recoger el líquido de lavado. Los tejidos pulmonares y las muestras de BALF se mantuvieron sobre hielo y posteriormente se procesaron para análisis aguas abajo.

Cultivo celular BEAS-2B

Las células epiteliales bronquiales humanas BEAS-2B se mantuvieron en el Medio Eagle Modificado/F12 (DMEM/F12) de Dulbecco, que contenía un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de penicilina/estreptomicina por debajo del 5% de CO₂ a 37 °C.

Preparación de CSE y exposición a células BEAS-2B

Las células BEAS-2B fueron lavadas con solución salina tamponada con fosfato y sembradas en placas de 24 pozos en triplicado a una densidad de 5 × 10⁴ células por pozo. Tras 12 horas de cultivo, las células alcanzaron aproximadamente el 60% de confluencia y luego fueron expuestas a la CSE. El CSE se preparó de forma fresca como se describió anteriormente, con modificaciones^{menores 33}. Brevemente, un cigarrillo comercial sin filtrar se quemaba continuamente y el humo principal se burbujeaba en 10 mL de medio libre de suero mediante una bomba de vacío a un caudal constante de 1,05 L/min (aproximadamente −11 kPa de presión negativa) durante aproximadamente 5 minutos hasta que el cigarrillo estaba completamente consumido. La solución obtenida se sometió primero a prefiltración para eliminar grandes impurezas particuladas, y luego se esterilizó mediante un filtro microporoso estéril de 0,22 μm para eliminar partículas residuales; la solución resultante de stock se definió como 100% CSE. Todo el CSE recién preparado se utilizaba para el tratamiento celular inmediatamente después de la filtración sin almacenamiento. Las células fueron estimuladas con un medio que contenía un 2,5% de CSE. Tras 24 horas de tratamiento con CSE, los supernacionantes del cultivo se recogieron y almacenaron a -40 °C para un análisis^{posterior 34}.

Reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa en tiempo real (RT-qPCR)

El ARN total se extrajo de las células BEAS-2B utilizando un kit de extracción total de ARN y se transcribió inversamente en ADNc mediante un kit de transcripción inversa según las instrucciones del fabricante. Posteriormente, la RT-qPCR se realizó utilizando un sistema de detección de PCR en tiempo real y una mezcla maestra qPCR basada en SYBR Green. Todos los experimentos RT-qPCR se realizaron con tres réplicas biológicas y tres réplicas técnicas por muestra para garantizar la fiabilidad de los datos.

Cada reacción qPCR se realizó en un volumen total de 20 μL, que contiene 10 μL de mezcla maestra SYBR Green qPCR, 0,4 μL de cebador directo, 0,4 μL de cebador inverso, 2 μL de plantilla de ADNc diluida y 7,2 μL de agua libre de RNasa. Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: desnaturalización inicial a 95 °C durante 3 minutos, seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 10 s y recocido/extensión a 60 °C durante 30 s. Los niveles relativos de expresión génica se calcularon utilizando el método 2^−ΔΔCt, con GAPDH como gen de referencia interno. Las secuencias de cebadores utilizadas en este estudio se mencionan en la Tabla Suplementaria 1.

Análisis de especies reactivas intracelulares de oxígeno (ROS)

La producción intracelular de ROS en células BEAS-2B se evaluó utilizando el diacetato de diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA) de sonda fluorogénica 2′,7′ y se analizó mediante citometría de flujo. Durante la adquisición de citometría en flujo, se aplicó una estrategia estándar de gating de dispersión directa (FSC) y dispersión lateral (SSC) para excluir residuos celulares y seleccionar células individuales intactas. Se adquirieron un total de 10.000 eventos celulares válidos para cada muestra. Las longitudes de onda de excitación y emisión se ajustaron a 488 nm y 525 nm, respectivamente. Posteriormente se analizaron datos citométricos de flujo para cuantificar la intensidad de fluorescencia intracelular ROS.

Determinación del nivel de malondialdehído (MDA)

El contenido intracelular de MDA se midió utilizando un kit de ensayo de peroxidación lipídica según las instrucciones del fabricante. Brevemente, se extrajeron y lisaron células BEAS-2B tratadas, luego se centrifugaron a baja temperatura para recoger el sobrenadante. A continuación, se realizó la reacción colorimétrica del ácido tiobarbitúrico (TBA), y se midió la absorbancia a 532 nm usando un lector de microplacas. Los niveles relativos de MDA se calcularon según la curva estándar.

Evaluación de la senescencia celular

La senescencia celular se evaluó mediante un ensayo de detección de senescencia basado en la actividad de β-galactosidasa asociada a la senescencia (SA-β-gal). Las células SA-β-gal-positivas fueron cuantificadas mediante citometría de flujo. Paralelamente, los niveles de expresión de ARNm de los marcadores asociados a la senescencia p53 y p21 fueron determinados por RT-qPCR.

Ensayo de proliferación celular

La proliferación celular se evaluó utilizando un kit de ensayo de viabilidad celular colorimétrica. La absorbancia se midió a 450 nm usando un lector de microplacas.

Ensayo de desmontado de la relatividad general

La transfección celular se realizó utilizando un reactivo de transfección a base de lípidos. Se transfectaron los siguientes oligonucleótidos: ARN pequeño interferente dirigido al receptor de glucocorticoides (si-GR) y ARN pequeño interferente de control negativo (si-NC). Las secuencias de siRNA candidatas dirigidas a la RG fueron diseñadas utilizando la plataforma de bioinformática en línea siDirect 2.0. Tras la transfección, se cultivaron células durante 48 horas y se utilizaron todos los siRNA a una concentración final de 50 nM. La eficiencia del knockdown se verificó midiendo la expresión del ARNm de la GR usando RT-qPCR.

Se incluyeron grupos de control de vehículos tanto en el tratamiento con β-sitosterol como en los experimentos de transfección. Para la intervención β-sitosterol, las células tratadas únicamente con disolvente del vehículo sirvieron como grupo de control del vehículo (denotado como CSE+0). El análisis estadístico confirmó que no se observaron diferencias significativas entre los grupos de control del vehículo y de los grupos de control en blanco.

Análisis estadístico

Todos los resultados cuantitativos se expresaron como media ± desviación estándar de tres experimentos in vitro biológicamente independientes. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando software de análisis estadístico. La prueba de Shapiro–Wilk se utilizó para examinar la normalidad de la distribución del conjunto de datos antes de las pruebas estadísticas; Se adoptó la corrección post-hoc de Bonferroni para ajustar los valores de P en comparaciones múltiples tras el análisis de varianza (ANOVA). Las comparaciones entre dos grupos se evaluaron mediante un test t de Student no emparejado, mientras que para comparaciones multigrupos se empleó ANOVA unidireccional o bivíal. Se consideró estadísticamente significativo un valor p ≤ 0,05.

Resultados

β-sitosterol era un posible producto natural para tratar la EPOC

Debido a los efectos curativos reportados de Fritillaria cirrhosa D. Don, flor seca de Lonicera japonica Thunb., raíz seca de Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq., y Adenophora stricta Miq. en el tratamiento de enfermedades^pulmonares 35,36,37,38, este estudio utilizó la base de datos TCMSP para identificar sistemáticamente los componentes activos de estas hierbas de la Medicina Tradicional China (MTC). El β-sitosterol fue identificado como un ingrediente activo importante compartido por estas hierbas de la MTC (Figura 1A). Para explorar sistemáticamente el mecanismo molecular subyacente del β-sitosterol, su información estructural SMILES fue recuperada de la base de datos PubChem e importada a la base de datos SwissTargetPrediction para la predicción de objetivos; todos los objetivos predichos con probabilidad predictiva superior a 0 se conservaron para análisis posteriores. La red de interacción ingrediente-objetivo resultante entre β-sitosterol y sus objetivos candidatos fue visualizada y presentada en la Figura 1B. Un total de 43 genes objetivo putativos del β-sitosterol fueron predichos utilizando la base de datos SwissTargetPrediction. Posteriormente, se realizaron análisis de enriquecimiento funcional GO y de enriquecimiento de vías KEGG sobre los genes objetivo del β-sitosterol, y todos los conjuntos de datos completos de enriquecimiento se archivaron en el Archivo Suplementario 1. Cabe destacar que los procesos metabólicos de los esteroides fueron identificados como una de las vías más enriquecidas significativamente. La literatura acumulada ha demostrado la estrecha correlación entre el metabolismo aberrante de los esteroides y la resistencia a los glucocorticoides en la^{EPOC 39}. Además, la RG se enriqueció claramente dentro de los clústeres funcionales relacionados con el metabolismo de los esteroides. Este hallazgo proporciona un apoyo bioinformático fundamental para nuestros experimentos celulares posteriores que investigan el mecanismo por el cual el β-sitosterol mejora la sensibilidad a la DEX y altera los niveles de expresión de la GR.

Los genes relacionados con la EPOC se recuperaron de las bases de datos de TTD y CTD. El análisis posterior de intersección de Venn (Figura 1C) reveló dos genes superpuestos entre dianas de β-sitosterol y genes relacionados con la EPOC derivados de la DTT, otros dos genes superpuestos entre dianas de β-sitosterol y genes relacionados con la EPOC derivados de la ECOC, y cinco genes compartidos de EPOC entre los conjuntos de datos de la DTT y la ECT. Finalmente, la RG fue el único gen común a los tres conjuntos de datos y se definió como el objetivo principal del β-sitosterol frente a la EPOC. Los datos numéricos detallados del análisis de Venn se listan en el Archivo Suplementario 2. Para una verificación adicional de la afinidad de unión, se realizó el acoplamiento molecular de β-sitosterol con GR (Figura 1D). Se consideró que los bolsillos de unión con puntuaciones de Vina inferiores a −7,0 kcal/mol exhibían afinidad de unión favorable. Las puntuaciones de Vina de los bolsillos C1 y C5 fueron de −8,8 y −7,2 kcal/mol, respectivamente, lo que indica una fuerte interacción predicha entre β-sitosterol y la RG.

β-sitosterol protegía a las células BEAS-2B del daño al CSE, lo que puede estar asociado con una expresión elevada de la GR

β-sitosterol mostró un efecto protector significativo en el modelo de lesión de células BEAS-2B inducida por el CSE. El grupo CSE + 0 fue diseñado como un vehículo de control que recibía CSE más un volumen igual de disolvente de fármaco sin β-sitosterol. Como era de esperar, no se encontraron diferencias significativas entre los grupos CSE y CSE + 0. El compuesto inhibía la producción inducida por el CSE de TNF-α e IL-6 de manera dependiente de la concentración (Figura 2A). También redujo los niveles intracelulares de ROS (Figura 2B). β-sitosterol también redujo significativamente el contenido de MDA (Figura 2C), suprimió la senescencia celular inducida por el CSE (Figura 2D) y redujo los marcadores relacionados con la senescencia p53 y p21 (Figura 2E). Estos efectos se acompañaron de una expresión alzada del ARNm de la RG (Figura 2F), lo que sugiere que su función protectora podría estar estrechamente vinculada a la regulación alcista transcripcional de la RG. Dentro del rango de concentraciones probado, el β-sitosterol no ejerció una citotoxicidad evidente sobre la viabilidad de las células BEAS-2B (Figura 2G), lo que indica una tolerancia celular favorable a este compuesto. Dado que 20 μg/mL (aproximadamente 48,2 μM) presentaban los efectos inhibidores más potentes, esta dosis se seleccionó para experimentos posteriores. Aunque no se observó diferencia estadísticamente significativa entre los grupos de 10 μg/mL y 20 μg/mL en cuanto a la supresión de citocinas proinflamatorias, el 20 μg/mL de β-sitosterol mostró una ligera tendencia a la baja en los niveles de factores inflamatorios. Además, en comparación con 10 μg/mL, 20 μg/mL logró una eficacia superior para inhibir la acumulación de ROS y MDA inducida por el CSE, reducir la senescencia celular y aumentar la expresión del ARNm de la GR. Esto apoyó la selección de 20 μg/mL como concentración óptima de trabajo para los ensayos de rescate posteriores.

Los resultados de RT-qPCR (Figura 2H) confirmaron el éxito de la reducción de la GR. Los niveles de ARNm de RG en el grupo si-GR se redujeron aproximadamente un 78% en comparación con el control si-NC, verificando la eficacia del silenciamiento de RG para ensayos posteriores de rescate. Tras la reducción de la GR, los efectos inhibitorios del β-sitosterol sobre los factores inflamatorios y los ROS se revirtieron significativamente (Figuras 2I, J). De manera similar, la atenuación de la senescencia celular por β-sitosterol también fue abrogada (Figura 2K). En conjunto, estos resultados mostraron que el β-sitosterol desempeñaba un papel protector frente a lesiones inducidas por el CSE en células epiteliales bronquiales mediante mecanismos antiinflamatorios, antioxidantes y antienvejecimiento mediados por la GR.

β-sitosterol mejoró los efectos terapéuticos de la DEX sobre la función pulmonar e inflamación en un modelo murino de EPOC

En un modelo murino de EPOC establecido por exposición al humo de cigarrillo, el tratamiento con β-sitosterol, DEX o su combinación ejercieron evidentes efectos protectores. Las comparaciones estadísticas entre varios grupos se analizaron utilizando ANOVA unidireccional seguida de la prueba post-hoc de Tukey. Se aplicaron cinco estilos de símbolos distintos para distinguir cohortes experimentales: círculos para el grupo de control, triángulos para el grupo Modelo, asteriscos para el grupo Modelo + DEX, cuadrados para el grupo Modelo + β-sitosterol y diamantes para el grupo Modelo + DEX + β-sitosterol. Cada corchete horizontal representa una comparación estadística entre dos grupos experimentales vinculados.

En comparación con el grupo de control, los ratones del grupo modelo de EPOC mostraron reducciones notables en el volumen espiratorio forzado en 0,1 s (FEV₀.₁), capacidad vital forzada (FVC), flujo espiratorio máximo (PEF) y la relación FEV₀.₁/FVC. Como se muestra en la Figura 3A–D, una relación FEV₀.₁/FVC por debajo del 70% confirmó el establecimiento exitoso del modelo de EPOC. La administración de DEX o β-sitosterol por sí sola revirtió significativamente estos deterioros de la función pulmonar en comparación con ratones modelo, y el tratamiento combinado condujo a mejoras adicionales respecto a la administración de agente único. Además, una relación MMP-9/TIMP-1 alterada es un marcador molecular característico de la remodelación de las vías respiratorias, y una expresión elevada de MUC5AC representa una hipersecreción excesiva^{de moco 40,41}. Además, detectamos los niveles de ARNm de MMP-9, TIMP-1 y el marcador mucoso MUC5AC, y calculamos la relación MMP-9/TIMP-1 (Figura 3E, F). El grupo modelo mostró una relación MMP-9/TIMP-1 marcadamente aumentada y una expresión elevada de MUC5AC. DEX o β-sitosterol por sí solos redujeron eficazmente ambos parámetros, y el tratamiento combinado logró una eficacia inhibitoria superior en comparación con la monoterapia.

Los ratones modelo de EPOC mostraron elevaciones pronunciadas en los niveles de BALF de TNF-α e IL-6, así como un aumento del contenido de ROS pulmonar en comparación con los ratones control. DEX o β-sitosterol por sí solo redujeron notablemente tanto los niveles inflamatorios de citoquinas como el estrés oxidativo, y el tratamiento combinado produjo efectos inhibitorios más fuertes (Figuras 3G, H). Además, la expresión pulmonar de ARNm de la GR se vio notablemente reducida en ratones modelo de EPOC. DEX o β-sitosterol por sí solos aumentaron significativamente la expresión de la GR, y el tratamiento combinado elevó aún más los niveles de la GR (Figura 3I).

En conjunto, estos hallazgos indicaron que el β-sitosterol protegía contra alteraciones patológicas relacionadas con la EPOC en ratones al mantener la función pulmonar, inhibir la inflamación, aliviar el estrés oxidativo y elevar la expresión de la RG. Además, la administración combinada de β-sitosterol fortaleció la eficacia protectora de la DEX en este modelo.

Eficacia terapéutica mejorada por β-sitosterol en DEX, potencialmente mediante la regulación de la vía GR en el modelo de células BEAS-2B inducidas por CSE

En el modelo de células BEAS-2B inducidas por CSE, la monoterapia DEX redujo significativamente la expresión de ARNm de citocinas proinflamatorias, redujo los niveles intracelulares de ROS y MDA, y redujo la proporción de células senescentes así como la expresión de los marcadores de senescencia p53 y p21. Estos resultados confirman las actividades antiinflamatorias, antioxidantes y antisenescentes de DEX. Cabe destacar que la coadministración de β-sitosterol aumentó aún más los efectos protectores de la DEX, resultando en una mayor supresión de la inflamación, el estrés oxidativo y la senescencia celular en comparación con la monoterapia con DEX. Tras el knockdown de la RG (si-GR) en el grupo de cotratamiento DEX + β-sitosterol, la respuesta celular a la terapia combinada se vio notablemente atenuada. Como se muestra en la Figura 4A–E, la inhibición comediada por DEX y β-sitosterol de inflamación, estrés oxidativo y senescencia se revirtió significativamente, lo que indica que la deficiencia de GR debilitó los efectos beneficiosos del β-sitosterol sobre la eficacia de DEX.

En conjunto, estos hallazgos demostraron que el β-sitosterol mejoró la eficacia de la DEX, posiblemente regulando procesos relacionados con la RG, aumentando así los efectos protectores de la DEX frente a la lesión de células bronquiales inducidas por la ECS.

DISPONIBILIDAD DE DATOS:

Todos los datos en bruto que respaldan los hallazgos de este estudio se proporcionan en los materiales complementarios (Archivo Suplementario 1, Archivo Suplementario 2).

Figura 1: Papel clave del β-sitosterol en la terapia de EPOC. (A) Componentes activos en Fritillaria cirrhosa D. Don, flor seca de Lonicera japonica Thunb. y raíz seca de Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq. y Adenophora stricta Miq. se revisaban a través de la base de datos TCMSP. (B) Los posibles objetivos del β-sitosterol. (C) Análisis de intersección de dianas aguas abajo de β-sitosterol y genes relacionados con la EPOC. (D) Análisis de acoplamiento molecular entre β-sitosterol y la proteína GR. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Implicación de la GR en la protección relacionada con β-sitosterol contra la lesión celular inducida por la ECS. (A) Modulación dependiente de la concentración de mediadores inflamatorios inducidos por la ECS (TNF-α, IL-6) mediante β-sitosterol. (B)Efectos de la dosis de β-sitosterol en el nivel de ROS en células expuestas a CSE. (C) Efectos del β-sitosterol en el contenido de MDA regulado al aumento del CSE. (D) La influencia del β-sitosterol en la senescencia celular promovida por la ECS. (E) Modulación de p53 y p21 relacionados con la senescencia mediante β-sitosterol bajo estimulación de la CSE. (F) Regulación de la expresión de la GR dependiente de la concentración de β-sitosterol bajo estimulación del CSE. (G) Viabilidad celular del β-sitosterol en concentraciones probadas en células BEAS-2B. (H) Detección RT-qPCR de la expresión de ARNm de la RG para verificar la eficiencia de reducción tras la transfección de siRNA dirigida a la RG. (I) Asociación regulatoria entre la RG y el β-sitosterol contra los factores inflamatorios inducidos por el CSE. (J) Asociación regulatoria entre la GR y el β-sitosterol frente a la acumulación de ROS inducida por el CSE. (K) Asociación reguladora entre la RG y el β-sitosterol frente a la senescencia celular inducida por la ECS. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001; Ns, no es significativo. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Efectos del β-sitosterol combinado con DEX sobre la función pulmonar, inflamación, estrés oxidativo y expresión de GR en ratones modelo de EPOC. (A) Cambios en el volumen espiratorio forzado en 0,1 s (FEV₀.₁) en ratones con EPOC. (B) Alteraciones en la capacidad vital forzada (CVF) en ratones con EPOC. (C) Efectos sobre el flujo espiratorio máximo (PEF) en ratones con EPOC. (D)Relación FEV₀.₁/FVC en ratones modelo EPOC. (E) Relación relativa de ARNm de MMP-9/TIMP-1 reflejando la remodelación de las vías respiratorias. (F) La expresión relativa de ARNm de MUC5AC indica hipersecreción de moco en los tejidos pulmonares del ratón. (G) Niveles de TNF-α e IL-6 en el líquido de lavado broncoalveolar (BALF). (H)Producción de ROS en el tejido pulmonar de ratones con EPOC. (I) Expresión relativa de ARNm de la RG en tejido pulmonar de ratón. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Efecto del β-sitosterol sobre la resistencia a DEX mediada por GR en células BEAS-2B inducidas por CSE. (A) Expresión relativa de ARNm de factores inflamatorios (TNF-α, IL-6) en cada grupo. (B) Nivel ROS en cada grupo. (C)Contenido MDA en cada grupo experimental. (D) Porcentaje de células BEAS-2B senescentes en cada grupo. (E) Niveles relativos de ARNm de los marcadores asociados a la senescencia p53 y p21. **p < 0,01; p < 0,001. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Tabla suplementaria 1: Secuencias de cebadores utilizadas para el análisis RT-qPCR. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 1: Conjuntos completos de datos de análisis de enriquecimiento GO y KEGG para genes objetivo de β-sitosterol. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 2: Resultados numéricos detallados del análisis de Venn que identifican los objetivos superpuestos entre β-sitosterol y EPOC. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

La EPOC impone una carga global considerable de enfermedades y sigue siendo un gran desafío para la salud^{mundial 1}. El manejo actual de la EPOC abarca tanto intervenciones farmacológicas como no^{farmacológicas 42}. Entre los tratamientos farmacológicos, los glucocorticosteroides (GC) se utilizan ampliamente en trastornos inflamatorios crónicos. Actúan uniéndose a la RG y reclutando la histona desacetilasa 2 en complejos transcripcionales para revertir la acetilación de la^{histona 43}. Sin embargo, múltiples estudios han demostrado una reducción de la sensibilidad a la GC en pacientes con EPOC^44,45, y las investigaciones han proporcionado evidencia de resistencia a la GC en esta^{enfermedad 46}. Estos hallazgos indican que superar la resistencia a la GC supone un desafío clínico importante, lo que pone de manifiesto la necesidad de nuevos agentes terapéuticos. Por tanto, identificar opciones terapéuticas más efectivas para la EPOC es de gran importancia.

Estudios previos han demostrado que el γ-sitosterol ejerce un efecto antiproliferativo sobre las células epiteliales bronquiales en la^{EPOC 47}. Como el γ-sitosterol y el β-sitosterol son componentes bioactivos comunes de los fitoesteroles, el presente estudio amplía la comprensión actual de las acciones de los fitosteroles en la EPOC y destaca el potencial valor protector del β-sitosterol en la patogénesis de enfermedades. Nuestros hallazgos revelaron que el β-sitosterol inhibía significativamente la liberación de factores inflamatorios, reducía el estrés oxidativo y suprimía la senescencia celular. Esto es coherente con informes anteriores que muestran que el β-sitosterol suprime eficazmente la regulación alza de mediadores inflamatorios inducidos por lipopolisacáridos, como la IL-6, la síntesa inducible de óxido nítrico y el TNF-α⁴⁸. Estos hallazgos confirman su actividad antiinflamatoria y respaldan su consistencia entre diferentes modelos inflamatorios.

Los GC inhalados son agentes antiinflamatorios eficaces para controlar la inflamación de las vías respiratorias. Actúan principalmente vinculándose y activando el GR⁴⁹. Sin embargo, una característica patológica clave de la EPOC es la menor sensibilidad de las células a los efectos antiinflamatorios de los^{GCs 44}. La regulación a la baja o el deterioro funcional de la RG se considera un mecanismo principal subyacente al desarrollo de la resistencia a la GC en pacientes con^EPOC. Estudios previos han demostrado que ciertos fármacos pueden aumentar la sensibilidad a la GC. Por ejemplo, la combinación de azitromicina y budesonida produce un efecto inhibitorio significativamente mayor sobre la producción de IL-4 y CXCL8 que cualquiera de los dos agentes^{por sí solos, el 51}.

Cabe destacar que el presente estudio encontró que tanto en modelos murinos de EPOC expuestos al humo de cigarrillo como en modelos de células BEAS-2B inducidas por CSE, la combinación de β-sitosterol con DEX produjo efectos inhibitorios significativamente más fuertes sobre factores inflamatorios, estrés oxidativo y senescencia celular que DEX por sí sola. Esta combinación también aumentó significativamente la eficacia protectora de DEX frente a los cambios patológicos relacionados con la EPOC y la lesión de células epiteliales bronquiales en ratones. Este resultado sugiere que el β-sitosterol puede mejorar la sensibilidad de las células epiteliales bronquiales a la DEX, proporcionando un enfoque novedoso para abordar la insensibilidad o resistencia a la GC en algunos pacientes con EPOC. De acuerdo con los resultados de la PCR cuantitativa in vitro , el β-sitosterol eleva los niveles de ARNm de la RG de forma dependiente de la concentración en lugar de actuar directamente como agonista o antagonista de la RG. La eficiencia verificada de reducción de la SI-GR y los ensayos de rescate funcional posteriores confirman además que el β-sitosterol mejora la respuesta celular a la GC al aumentar los niveles intracelulares totales de GR en lugar de activarla directamente, generando así efectos terapéuticos mejorados cuando se combina con DEX, un agonista canónico de la GR. Por tanto, los cambios en la expresión de la RG pueden estar relacionados con la acción del β-sitosterol, lo cual es coherente con observaciones previas de una reducción significativa de la RG y su isoforma activa GRα en células musculares lisas de las vías respiratorias en pacientes con^{EPOC 52}. Es importante destacar que los experimentos de knockdown con GR revelaron aún más el papel central de este receptor en la citoprotección mediada por β-sitosterol, lo que indica que algunas de las funciones biológicas del β-sitosterol dependen de la integridad de la vía de la RG.

En conjunto, el presente estudio no solo revela que la RG puede servir como mediador clave del β-sitosterol en la intervención de la EPOC, sino que también ofrece un posible nuevo enfoque para superar el desafío clínico de la resistencia a la DEX, sentando las bases experimentales para el desarrollo de terapias complementarias naturales dirigidas a la vía de la RG.

Sin embargo, el presente estudio tenía varias limitaciones. En primer lugar, se evaluó la función pulmonar solo para confirmar el establecimiento exitoso del modelo murino de EPOC, y no se realizó la tinción de hematoxilina-eosina (HE) y Masson para verificar más en profundidad características patológicas típicas, incluyendo enfisema, remodelación de las vías respiratorias e hipersecreción de moco. Como todos los pulmones fijos se consumieron en experimentos previos, la reconstrucción del modelo murino de EPOC inducido por humo de cigarrillo a 12 semanas no fue factible dentro del periodo disponible del estudio. Para abordar parcialmente esta limitación, se cuantificaron la relación MMP-9/TIMP-1 y los niveles de expresión de ARNm MUC5AC utilizando muestras de ARN pulmonar preservadas. En segundo lugar, solo se evaluó in vivo una dosis combinada de β-sitosterol y DEX, y no se investigaron sistemáticamente los efectos dosis-respuesta o sinérgicos. Se requieren estudios adicionales que incorporen combinaciones de dosis múltiples para caracterizar posibles interacciones sinérgicas. Tercero, debido a limitaciones experimentales y costes de investigación, solo se incluyeron seis ratones en cada grupo. El tamaño relativamente pequeño de la muestra pudo haber aumentado la susceptibilidad a la variabilidad entre animales y limitado la robustez estadística de los hallazgos. Se necesitan estudios futuros con muestras más grandes para validar aún más los resultados actuales. Cuarto, no se establecieron líneas celulares resistentes a la DEX estables; Por lo tanto, la capacidad del β-sitosterol para revertir la resistencia establecida a los glucocorticoides no pudo evaluarse directamente. Se requieren estudios adicionales utilizando modelos validados resistentes a glucocorticoides para investigar más a fondo este posible mecanismo.

En conclusión, estos hallazgos sugieren que la señalización de la RG podría estar implicada en los efectos protectores del β-sitosterol frente a la lesión inducida por CSE en células BEAS-2B, incluyendo la inhibición de la liberación de factores inflamatorios, el estrés oxidativo y la senescencia celular, así como mejoras en la función pulmonar y los biomarcadores de lesión pulmonar. Además, el β-sitosterol aumentó la sensibilidad terapéutica de estas células a la DEX. En conjunto, estos hallazgos identifican al β-sitosterol como una posible molécula candidata natural que podría contribuir al desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para la EPOC.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Células epiteliales bronquiales humanas BEAS-2B	SunnCell, China	SC-0218	Línea celular epitelial bronquial humana para estudio in vitro
Ratas C57BL/6	Vital River Laboratories, China	213	Modelo animal para experimento in vivo de EPOC
CB-DOCK2	China	https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php	para simulación de acoplamiento molecular entre ligando y proteína receptora
Kit de conteo celular Cell Counting Kit-8 (CCK-8)	Beyotime Biotechnology, China	C0038	Detección de viabilidad y proliferación celular
Kit de detección de senescencia verde CellEvent™	Thermo Fisher, USA	C10851	Detección de senescencia celular
Cigarrillos	Hongta, China	No proporcionado	Cigarrillo utilizado para exposición al humo y preparación de CSE
CTD	USA	https://ctdbase.org/	para obtener genes relacionados con la EPOC
Sonda fluorescente DCFH-DA	Sigma-Aldrich, USA	D6883-50MG	Detección del nivel de ROS intracelular
Dexametasona (DEX)	Yeasen, China	40323ES03	Glucocorticoide para intervención combinada
Medio DMEM/F12	Gibco, USA	11330032	Medio basal para cultivo celular BEAS-2B
Suero fetal bovino (FBS)	Gibco, USA	10270106	Suplemento para medio de cultivo celular
GraphPad Prism	GraphPad Software, USA	9.3.1	Análisis estadístico de datos y elaboración de gráficos
Isoflurano	RWD Life Science, China	R510-22-10	Anestésico inhalado para eutanasia animal
Kit de ensayo de peroxidación lipídica MDA	Beyotime Biotechnology, China	S0131S	Detección del contenido de malondialdehído (MDA) intracelular
Lipofectamina 2000	Thermo Fisher, USA	11668030	Reactivo de transfección para la entrega de siRNA
Lector de microplacas multimodo	Thermo Fisher, USA	VL0000D0	Detección de valor de absorbancia y fluorescencia
Citómetro de flujo Navios EX	Beckman Coulter, USA	B80912	Análisis de ROS y células senescentes
Penicilina/estreptomicina	HyClone, USA	SV30010	Antibióticos para prevenir la contaminación bacteriana
Power SYBR™ Green Master Mix	Thermo Fisher, USA	4367659	Amplificación de PCR cuantitativa fluorescente
Kit de reactivo RT PrimeScript™	Takara, Japón	RR037Q	Transcripción inversa para síntesis de cDNA
Base de datos PubChem	USA	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/	para obtener la secuencia de SMILES canónica y descargar información estructural 3D SDF del beta-sitosterol
Instrumento de PCR en tiempo real QuantStudio Dx	Thermo Fisher, USA	4479889	Detección de RT-qPCR en tiempo real
RCSB PDB	USA	https://www.rcsb.org/	para obtener el archivo de estructura 3D del cristal GR
Kit de aislamiento de ARN/proteína	Beyotime Biotechnology, China	R0018S	Extracción de ARN total de células y tejido pulmonar
si-GR	Diseño in silico mediante siDirect 2.1	Síntesis personalizada	Guía: 5′-UUUUGAAUGGGUGUAGCAA-3′; Pasajero: 5′-GCUUUCACCCAUUCAAAAGG-3′, knockdown para GR
si-NC	Thermo Fisher, USA	4390843	utilizado como control de transfección negativa para ensayos celulares y in vivo
Base de datos SwissTargetPrediction	Suiza	http://swisstargetprediction.ch/	para la predicción in silico de posibles objetivos proteicos relacionados con fármacos
Base de datos TCMSP	China	https://www.tcmsp-e.com/	para el cribado de ingredientes herbales y la predicción de objetivos
TTD	Singapur	https://db.idrblab.net/ttd/	para la recopilación de genes de enfermedades asociadas a EPOC validados
Cámara de exposición a humo de todo el cuerpo	Teague Enterprise, USA	TE-2	Establecimiento del modelo de EPOC inducido por el humo de los cigarrillos
β-sitosterol	ChemicalBook, China	83-46-5	Fitosterol activo para el tratamiento con fármacos