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Artículo de investigación
* These authors contributed equally
β-sitosterol alivió la EPOC y potenciaba la eficacia de la dexametasona, mediando este efecto por el receptor de glucocorticoides. Además, el β-sitosterol redujo la inflamación, el estrés oxidativo y la senescencia celular tanto en células epiteliales bronquiales estimuladas por la ECS como en ratones con EPOC inducidos por el humo de cigarrillos.
La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es un trastorno respiratorio prevalente caracterizado por inflamación persistente, estrés oxidativo y deterioro progresivo de la función pulmonar. El potencial terapéutico del β-sitosterol en la EPOC sigue siendo incierto. Este estudio tenía como objetivo investigar los efectos protectores del β-sitosterol contra la EPOC y esclarecer su mecanismo subyacente. El cribado en bases de datos identificó el receptor glucocorticoide (GR) como un posible objetivo del β-sitosterol. Se estableció un modelo murino de EPOC inducido por humo de cigarrillo y un modelo de células BEAS-2B estimulado por extracto de humo de cigarrillo (CSE). Se evaluaron la función pulmonar, los marcadores relacionados con lesiones pulmonares, la inflamación, el estrés oxidativo y la senescencia celular utilizando (RT-qPCR), ensayos de sonda fluorescente DFH-DA y kits de detección de senescencia. También se evaluaron los efectos del β-sitosterol solo o en combinación con dexametasona (DEX). β-sitosterol mejoró significativamente la función pulmonar, normalizó los marcadores relacionados con lesiones pulmonares y atenuó la inflamación, el estrés oxidativo y la senescencia celular tanto en células BEAS-2B estimuladas por CSE como en ratones expuestos al humo de cigarrillo. Estos efectos protectores se acompañaron de un aumento en la expresión de la RG. Además, el β-sitosterol mejoró la respuesta a la DEX y el tratamiento combinado con β-sitosterol y DEX produjeron mejoras mayores en la función pulmonar, marcadores de lesión pulmonar, inflamación, niveles de especies reactivas de oxígeno y senescencia celular que el tratamiento por DEX por sí solo. En conjunto, estos hallazgos sugieren que el β-sitosterol alivia los cambios patológicos asociados a la EPOC, al menos en parte, al aumentar la expresión de la GR y mejorar la eficacia terapéutica de la DEX, destacando su potencial como estrategia adyuvante para el tratamiento de la EPOC.
La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una enfermedad respiratoria progresiva caracterizada por inflamación persistente de las vías respiratorias, daño alveolar y obstrucción irreversible del flujo de aire que afecta la función respiratoria y reduce la calidadde vida 1. Su prevalencia aumenta significativamente con la edad, y el riesgo para personas de sesenta y cinco años o más es aproximadamente cinco veces mayor que para personas menores decuarenta y dos. Esta tendencia demográfica está asociada con un aumento de la incidencia de enfermedades, mortalidad y discapacidad3. Las proyecciones epidemiológicas indican que para 2030, la EPOC podría convertirse en la cuarta causa principal de muerte a nivel mundial, representando alrededor del 5% de todas las muertes4, 5 y 6. Actualmente, los factores de riesgo identificados incluyen susceptibilidad genética, displasia pulmonar, exposición a partus, bronquitis crónica e infecciónrespiratoria 7.
Entre los factores de riesgo, el humo de cigarrillo es el patógeno más importante de laEPOC 8. Contiene miles de sustancias químicas que pueden causar daño epitelial bronquial, promover la infiltración de células inflamatorias y conducir a la remodelación del tejidopulmonar 9. La exposición prolongada puede inducir lesiones epiteliales persistentes e irreversibles, promover la liberación de un gran número de quimioquinas proinflamatorias, aumentar significativamente la producción (ROS) e inducir la apoptosis celular10. Muchos estudios han demostrado que los niveles elevados de quimiocinas proinflamatorias como la interleucina-8 (IL-8) y el factor de necrosis tumoral α (TNF-α), junto con una producción excesiva de ROS y senescencia celular, están estrechamente relacionados con la gravedad de laEPOC 11,12. Esto pone de manifiesto la necesidad de agentes que puedan modular eficaz y de forma segura estos factores patógenos clave para ejercer efectos protectores y terapéuticos en la EPOC.
Los fitoesteroles son compuestos bioactivos naturales presentes de forma ubicua en las membranas celulares de las plantas. Entre ellos, el β-sitosterol es el más abundante y está ampliamente distribuido en alimentos de origen vegetal ricos en lípidos, como verduras, frutos secos, semillas y aceite deoliva 13,14,15,16. Los estudios han confirmado que la administración de β-sitosterol en dosis de hasta 1000 mg/kg en ratas y ratones no está asociada con citotoxicidad nigenotoxicidad 17. Además, las investigaciones han demostrado que el β-sitosterol presenta propiedades antioxidantes a través de sus efectos sobre enzimas antioxidantes y receptores de estrógenos humanos18.
β-sitosterol muestra un amplio espectro de actividades farmacológicas, incluyendo efectosantiinflamatorios 19, antipiréticos20,analgésicos 21 yantidiabéticos 13. También ha demostrado potencial terapéutico en diversos modelos de enfermedad, como la colitis y la inflamaciónintestinal 22, y posee propiedades antiateroscleróticas23 einmunomoduladoras 24. Además, tiene un perfil de seguridad favorable. Dadas estas características, el β-sitosterol ha despertado un interés considerable como posible candidato a fármaco. Sin embargo, su papel preciso y los mecanismos subyacentes en la EPOC siguen siendo en gran medida poco claros.
Por ello, el presente estudio tuvo como objetivo investigar los posibles efectos terapéuticos y los mecanismos subyacentes del β-sitosterol en la EPOC. Específicamente, se utilizó un modelo de lesión de células BEAS-2B inducido por extracto de cigarrillo de cigarrillo (CSE) para evaluar si el β-sitosterol podía aliviar eficazmente el daño celular mediado por la ECS, identificando así una molécula candidata novedosa para estrategias terapéuticas de EPOC.
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El estudio se llevó a cabo de acuerdo con las directrices de Farmacología Básica y Toxicología Clínica para estudios experimentales yclínicos 25. Todos los protocolos experimentales con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Segundo Hospital Afiliado, Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang (Aprobación nº 20230102), y todos los experimentos se realizaron conforme a las directrices del Comité de Ética Animal. El estudio se llevó a cabo de acuerdo con las directrices de ARRIVE.
Cribado de componentes clave y objetivos mediante farmacología de redes
Componentes activos de Fritillaria cirrhosa D. Don, Lonicera japonica Thunb., Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq., y Adenophora stricta Miq. fueron recuperados de la Base de Datos de Farmacología de Sistemas de Medicina Tradicional China (TCMSP; consultado el 12 de marzo de 2024). Los compuestos candidatos fueron evaluados según los siguientes criterios ADME: biodisponibilidad oral (OB) ≥ 30%, semejanza del fármaco (DL) ≥ 0,18 y permeabilidad al Caco-2 ≥ −0,425. Los compuestos que cumplían los tres criterios se mantuvieron como ingredientes activos candidatos para análisis posteriores.
La estructura canónica del Sistema Simplificado de Entrada de Línea de Entrada Molecular (SMILES) del β-sitosterol se obtuvo de PubChem (consultado el 18 de marzo de 2024) y se importó en SwissTargetPrediction (consultado el 21 de marzo de 2024) para la predicción de objetivos. Homo sapiens fue seleccionado como especie objetivo. Los posibles objetivos se predijeron basándose en la similitud estructural 2D y 3D entre β-sitosterol y ligandos conocidos en la base de datos. Se conservaron los objetivos predichos con probabilidad mayor que 0 y se eliminaron las entradas duplicadas.
Los genes asociados a la EPOC se recuperaron de la Base de Datos de Objetivos Terapéuticos (TTD; consultada el 25 de marzo de 2024) y de la Base de Datos de Toxicogenómica Comparativa (CTD; consultada el 28 de marzo de 2024) utilizando la palabra clave "enfermedad pulmonar obstructiva crónica". Tras la eliminación de genes duplicados, los genes asociados a la EPOC se intersectaron con los objetivos predichos de β-sitosterol para identificar objetivos candidatos potencialmente implicados en los efectos terapéuticos del β-sitosterol contra la EPOC.
Acoplamiento molecular de β-sitosterol y RG
La estructura tridimensional del β-sitosterol en formato SDF fue recuperada de la base de datos PubChem (consultado el 2 de junio de 2026), mientras que la estructura cristalina del receptor glucocorticoide (GR) se obtuvo del Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank (RCSB PDB; consultado el 3 de junio de 2026). Tras la preparación estándar de las estructuras del ligando y receptor, se realizó el acoplamiento molecular utilizando la plataforma en línea CB-Dock2 (consultado el 3 de junio de 2026). Los archivos preparados de ligandos y receptores se subieron a la plataforma, y se realizaron cálculos de acoplamiento usando los parámetros por defecto.
Análisis de enriquecimiento funcional de la Ontología Génica (GO) y la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG)
Todos los genes objetivo predichos del β-sitosterol fueron sometidos a análisis de enriquecimiento funcional GO y de enriquecimiento de vías KEGG. Los resultados de enriquecimiento, incluyendo procesos biológicos significativamente enriquecidos, componentes celulares, funciones moleculares y vías de señalización, fueron clasificados y almacenados en el Archivo Suplementario 1 para su posterior análisis bioinformático.
Modelado y agrupación animal
El tamaño de la muestra se estableció en seis animales por grupo basándose en un estudio previo que realizó un análisis de potencia a priori usando el software G*Power (α = 0,05, potencia = 0,80) y demostró que n = 6 era suficiente para detectar diferencias biológicamente relevantes bajo condiciones experimentalescomparables 26. Los ratones machos C57BL/6 de edad 6–8 semanas (20 ± 2 g) fueron asignados aleatoriamente a cinco grupos: grupo de control, grupo modelo de EPOC, grupo EPOC + dexametasona (DEX), grupo EPOC + β-sitosterol y grupo EPOC + DEX + β-sitosterol. Los ratones fueron alojados bajo condiciones estándar de laboratorio (25 °C, ciclo claro/oscuro de 12 horas) con acceso libre a comida y agua estándar, y se les permitió aclimatarse durante 1 semana antes de la experimentación.
Para el establecimiento del modelo de EPOC, los ratones fueron colocados en una cámara de exposición corporal completa al humo de cigarrillo (63 cm × 55 cm × 45 cm) y expuestos al humo habitual durante 12 semanas. Cada cigarrillo contenía 10 mg de alquitrán, 0,9 mg de nicotina y 10 mg de monóxido de carbono. La exposición al humo se realizó dos veces al día (5 días a la semana) a las 9:30 a.m. y a las 15:00, con humo generado por 18 cigarrillos introducidos en la recámara durante 90 minutos porsesión 27.
Para evaluar los efectos terapéuticos de las intervenciones, se inició la administración de medicamentos tras 8 semanas de exposición al humo de cigarrillo y continuó durante las 4 semanas restantes. A partir de la semana 9, los ratones de los respectivos grupos de tratamiento recibieron administración intragástrica diaria de DEX (1 mg/kg)28 o β-sitosterol (50 mg/kg)29,30 1 hora antes de la exposición al humo de cigarrillo. Estudios farmacocinéticos previos han reportado una biodisponibilidad oral de aproximadamente el 4% para β-sitosterol enroedores 31. Además, varios estudios en ratones han empleado dosis que van de 20 a 50 mg/kg 32. Por ello, se seleccionó una dosis de 50 mg/kg para asegurar una exposición sistémica adecuada, manteniéndose dentro del rango comúnmente utilizado en estudios preclínicos.
Los ratones del grupo de control estuvieron expuestos al aire filtrado de la habitación, mientras que los ratones del modelo y del grupo de tratamiento recibieron un volumen equivalente de solución salina normal como vehículo. Al final del periodo experimental, los ratones fueron profundamente anestesiados con isoflurano hasta la pérdida del reflejo pedal y eutanasiados mediante exanguinación mediante la recogida de sangre de la aorta abdominal. La cavidad torácica se abrió de inmediato y se extirparon cuidadosamente los tejidos pulmonares bilaterales intactos, enjuagados con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y colocados sobre hielo. Para la recogida de líquido de lavado broncoalveolar (BALF), la tráquea fue canulada y lavada con PBS frío y estéril, que se instilló suavemente y se retiró repetidamente para recoger el líquido de lavado. Los tejidos pulmonares y las muestras de BALF se mantuvieron sobre hielo y posteriormente se procesaron para análisis aguas abajo.
Cultivo celular BEAS-2B
Las células epiteliales bronquiales humanas BEAS-2B se mantuvieron en el Medio Eagle Modificado/F12 (DMEM/F12) de Dulbecco, que contenía un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de penicilina/estreptomicina por debajo del 5% de CO₂ a 37 °C.
Preparación de CSE y exposición a células BEAS-2B
Las células BEAS-2B fueron lavadas con solución salina tamponada con fosfato y sembradas en placas de 24 pozos en triplicado a una densidad de 5 × 104 células por pozo. Tras 12 horas de cultivo, las células alcanzaron aproximadamente el 60% de confluencia y luego fueron expuestas a la CSE. El CSE se preparó de forma fresca como se describió anteriormente, con modificacionesmenores 33. Brevemente, un cigarrillo comercial sin filtrar se quemaba continuamente y el humo principal se burbujeaba en 10 mL de medio libre de suero mediante una bomba de vacío a un caudal constante de 1,05 L/min (aproximadamente −11 kPa de presión negativa) durante aproximadamente 5 minutos hasta que el cigarrillo estaba completamente consumido. La solución obtenida se sometió primero a prefiltración para eliminar grandes impurezas particuladas, y luego se esterilizó mediante un filtro microporoso estéril de 0,22 μm para eliminar partículas residuales; la solución resultante de stock se definió como 100% CSE. Todo el CSE recién preparado se utilizaba para el tratamiento celular inmediatamente después de la filtración sin almacenamiento. Las células fueron estimuladas con un medio que contenía un 2,5% de CSE. Tras 24 horas de tratamiento con CSE, los supernacionantes del cultivo se recogieron y almacenaron a -40 °C para un análisisposterior 34.
Reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa en tiempo real (RT-qPCR)
El ARN total se extrajo de las células BEAS-2B utilizando un kit de extracción total de ARN y se transcribió inversamente en ADNc mediante un kit de transcripción inversa según las instrucciones del fabricante. Posteriormente, la RT-qPCR se realizó utilizando un sistema de detección de PCR en tiempo real y una mezcla maestra qPCR basada en SYBR Green. Todos los experimentos RT-qPCR se realizaron con tres réplicas biológicas y tres réplicas técnicas por muestra para garantizar la fiabilidad de los datos.
Cada reacción qPCR se realizó en un volumen total de 20 μL, que contiene 10 μL de mezcla maestra SYBR Green qPCR, 0,4 μL de cebador directo, 0,4 μL de cebador inverso, 2 μL de plantilla de ADNc diluida y 7,2 μL de agua libre de RNasa. Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: desnaturalización inicial a 95 °C durante 3 minutos, seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 10 s y recocido/extensión a 60 °C durante 30 s. Los niveles relativos de expresión génica se calcularon utilizando el método 2−ΔΔCt, con GAPDH como gen de referencia interno. Las secuencias de cebadores utilizadas en este estudio se mencionan en la Tabla Suplementaria 1.
Análisis de especies reactivas intracelulares de oxígeno (ROS)
La producción intracelular de ROS en células BEAS-2B se evaluó utilizando el diacetato de diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA) de sonda fluorogénica 2′,7′ y se analizó mediante citometría de flujo. Durante la adquisición de citometría en flujo, se aplicó una estrategia estándar de gating de dispersión directa (FSC) y dispersión lateral (SSC) para excluir residuos celulares y seleccionar células individuales intactas. Se adquirieron un total de 10.000 eventos celulares válidos para cada muestra. Las longitudes de onda de excitación y emisión se ajustaron a 488 nm y 525 nm, respectivamente. Posteriormente se analizaron datos citométricos de flujo para cuantificar la intensidad de fluorescencia intracelular ROS.
Determinación del nivel de malondialdehído (MDA)
El contenido intracelular de MDA se midió utilizando un kit de ensayo de peroxidación lipídica según las instrucciones del fabricante. Brevemente, se extrajeron y lisaron células BEAS-2B tratadas, luego se centrifugaron a baja temperatura para recoger el sobrenadante. A continuación, se realizó la reacción colorimétrica del ácido tiobarbitúrico (TBA), y se midió la absorbancia a 532 nm usando un lector de microplacas. Los niveles relativos de MDA se calcularon según la curva estándar.
Evaluación de la senescencia celular
La senescencia celular se evaluó mediante un ensayo de detección de senescencia basado en la actividad de β-galactosidasa asociada a la senescencia (SA-β-gal). Las células SA-β-gal-positivas fueron cuantificadas mediante citometría de flujo. Paralelamente, los niveles de expresión de ARNm de los marcadores asociados a la senescencia p53 y p21 fueron determinados por RT-qPCR.
Ensayo de proliferación celular
La proliferación celular se evaluó utilizando un kit de ensayo de viabilidad celular colorimétrica. La absorbancia se midió a 450 nm usando un lector de microplacas.
Ensayo de desmontado de la relatividad general
La transfección celular se realizó utilizando un reactivo de transfección a base de lípidos. Se transfectaron los siguientes oligonucleótidos: ARN pequeño interferente dirigido al receptor de glucocorticoides (si-GR) y ARN pequeño interferente de control negativo (si-NC). Las secuencias de siRNA candidatas dirigidas a la RG fueron diseñadas utilizando la plataforma de bioinformática en línea siDirect 2.0. Tras la transfección, se cultivaron células durante 48 horas y se utilizaron todos los siRNA a una concentración final de 50 nM. La eficiencia del knockdown se verificó midiendo la expresión del ARNm de la GR usando RT-qPCR.
Se incluyeron grupos de control de vehículos tanto en el tratamiento con β-sitosterol como en los experimentos de transfección. Para la intervención β-sitosterol, las células tratadas únicamente con disolvente del vehículo sirvieron como grupo de control del vehículo (denotado como CSE+0). El análisis estadístico confirmó que no se observaron diferencias significativas entre los grupos de control del vehículo y de los grupos de control en blanco.
Análisis estadístico
Todos los resultados cuantitativos se expresaron como media ± desviación estándar de tres experimentos in vitro biológicamente independientes. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando software de análisis estadístico. La prueba de Shapiro–Wilk se utilizó para examinar la normalidad de la distribución del conjunto de datos antes de las pruebas estadísticas; Se adoptó la corrección post-hoc de Bonferroni para ajustar los valores de P en comparaciones múltiples tras el análisis de varianza (ANOVA). Las comparaciones entre dos grupos se evaluaron mediante un test t de Student no emparejado, mientras que para comparaciones multigrupos se empleó ANOVA unidireccional o bivíal. Se consideró estadísticamente significativo un valor p ≤ 0,05.
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β-sitosterol era un posible producto natural para tratar la EPOC
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La EPOC impone una carga global considerable de enfermedades y sigue siendo un gran desafío para la saludmundial 1. El manejo actual de la EPOC abarca tanto intervenciones farmacológicas como nofarmacológicas 42. Entre los tratamientos farmacológicos, los glucocorticosteroides (GC) se utilizan ampliamente en trastornos inflamatorios crónicos. Actúan uniéndose a la RG y reclutando la histona desacetilasa 2 en complejos transcripcionales para...
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El/los Autor(es) declaran(los) que no existe conflicto de intereses.
Los autores no tienen reconocimientos.
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Células epiteliales bronquiales humanas BEAS-2B | SunnCell, China | SC-0218 | Línea celular epitelial bronquial humana para estudio in vitro |
| Ratas C57BL/6 | Vital River Laboratories, China | 213 | Modelo animal para experimento in vivo de EPOC |
| CB-DOCK2 | China | https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php | para simulación de acoplamiento molecular entre ligando y proteína receptora |
| Kit de conteo celular Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | Beyotime Biotechnology, China | C0038 | Detección de viabilidad y proliferación celular |
| Kit de detección de senescencia verde CellEvent™ | Thermo Fisher, USA | C10851 | Detección de senescencia celular |
| Cigarrillos | Hongta, China | No proporcionado | Cigarrillo utilizado para exposición al humo y preparación de CSE |
| CTD | USA | https://ctdbase.org/ | para obtener genes relacionados con la EPOC |
| Sonda fluorescente DCFH-DA | Sigma-Aldrich, USA | D6883-50MG | Detección del nivel de ROS intracelular |
| Dexametasona (DEX) | Yeasen, China | 40323ES03 | Glucocorticoide para intervención combinada |
| Medio DMEM/F12 | Gibco, USA | 11330032 | Medio basal para cultivo celular BEAS-2B |
| Suero fetal bovino (FBS) | Gibco, USA | 10270106 | Suplemento para medio de cultivo celular |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, USA | 9.3.1 | Análisis estadístico de datos y elaboración de gráficos |
| Isoflurano | RWD Life Science, China | R510-22-10 | Anestésico inhalado para eutanasia animal |
| Kit de ensayo de peroxidación lipídica MDA | Beyotime Biotechnology, China | S0131S | Detección del contenido de malondialdehído (MDA) intracelular |
| Lipofectamina 2000 | Thermo Fisher, USA | 11668030 | Reactivo de transfección para la entrega de siRNA |
| Lector de microplacas multimodo | Thermo Fisher, USA | VL0000D0 | Detección de valor de absorbancia y fluorescencia |
| Citómetro de flujo Navios EX | Beckman Coulter, USA | B80912 | Análisis de ROS y células senescentes |
| Penicilina/estreptomicina | HyClone, USA | SV30010 | Antibióticos para prevenir la contaminación bacteriana |
| Power SYBR™ Green Master Mix | Thermo Fisher, USA | 4367659 | Amplificación de PCR cuantitativa fluorescente |
| Kit de reactivo RT PrimeScript™ | Takara, Japón | RR037Q | Transcripción inversa para síntesis de cDNA |
| Base de datos PubChem | USA | https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ | para obtener la secuencia de SMILES canónica y descargar información estructural 3D SDF del beta-sitosterol |
| Instrumento de PCR en tiempo real QuantStudio Dx | Thermo Fisher, USA | 4479889 | Detección de RT-qPCR en tiempo real |
| RCSB PDB | USA | https://www.rcsb.org/ | para obtener el archivo de estructura 3D del cristal GR |
| Kit de aislamiento de ARN/proteína | Beyotime Biotechnology, China | R0018S | Extracción de ARN total de células y tejido pulmonar |
| si-GR | Diseño in silico mediante siDirect 2.1 | Síntesis personalizada | Guía: 5′-UUUUGAAUGGGUGUAGCAA-3′; Pasajero: 5′-GCUUUCACCCAUUCAAAAGG-3′, knockdown para GR |
| si-NC | Thermo Fisher, USA | 4390843 | utilizado como control de transfección negativa para ensayos celulares y in vivo |
| Base de datos SwissTargetPrediction | Suiza | http://swisstargetprediction.ch/ | para la predicción in silico de posibles objetivos proteicos relacionados con fármacos |
| Base de datos TCMSP | China | https://www.tcmsp-e.com/ | para el cribado de ingredientes herbales y la predicción de objetivos |
| TTD | Singapur | https://db.idrblab.net/ttd/ | para la recopilación de genes de enfermedades asociadas a EPOC validados |
| Cámara de exposición a humo de todo el cuerpo | Teague Enterprise, USA | TE-2 | Establecimiento del modelo de EPOC inducido por el humo de los cigarrillos |
| β-sitosterol | ChemicalBook, China | 83-46-5 | Fitosterol activo para el tratamiento con fármacos |
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