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Artículo de método

Ritmos circadianos en una placa de Petri: sincronización de células mHypoE-42 hipotalámicas de ratón para el análisis de la expresión de genes del reloj circadiano

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DOI:

10.3791/72039

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3 de septiembre de 2026

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1CNC-UC-Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, 2CiBB-Centre for Innovative Biomedicine and Biotechnology, University of Coimbra, 3Faculty of Pharmacy, University of Coimbra, 4Gene Therapy Center of Excellence (GeneT), University of Coimbra, 5Institute for Interdisciplinary Research (IIIUC), University of Coimbra

En este artículo

Resumen

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo práctico y reproducible para sincronizar células cultivadas, realizar un muestreo escalonado en un curso temporal de 24–72 h sin recolección nocturna y analizar la expresión de genes del reloj circadiano.

Resumen

Los ritmos circadianos son oscilaciones endógenas de aproximadamente 24 h que regulan una amplia gama de procesos celulares y fisiológicos, incluyendo la expresión génica, el metabolismo y el comportamiento. Estos ritmos surgen de bucles de retroalimentación transcricionales y traduccionales interconectados que responden a señales temporales y ambientales. Debido a que la regulación circadiana es altamente dinámica, incluso pequeñas variaciones experimentales pueden influir en la fase, la amplitud y la ritmicidad, lo que hace esencial contar con protocolos experimentales estandarizados para obtener resultados confiables y reproducibles. El objetivo del presente protocolo es proporcionar un procedimiento práctico y reproducible para sincronizar células en cultivo, realizar muestreos seriados en el tiempo y analizar la expresión de genes del reloj circadiano bajo condiciones de laboratorio estándar. El protocolo describe la sincronización basada en choque sérico, la recolección escalonada de muestras durante 24–72 h para evitar muestreos nocturnos, la extracción de ácido ribonucleico, la síntesis de ácido desoxirribonucleico complementario, la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real y el análisis de ritmos circadianos mediante enfoques estadísticos adecuados. El procedimiento también destaca consideraciones experimentales críticas, como las condiciones de sincronización, la evaluación de la calidad de las muestras, la selección de genes de referencia y el análisis de datos, con el fin de mejorar la reproducibilidad entre experimentos. Este método ofrece un enfoque accesible para investigar los mecanismos moleculares circadianos y evaluar la expresión génica rítmica en células cultivadas, facilitando estudios sobre la regulación circadiana en modelos experimentales fisiológicos y relacionados con enfermedades.

Introducción

Los ritmos circadianos son ciclos endógenos con un período de aproximadamente 24 h que regulan una amplia gama de procesos fisiológicos, metabólicos y celulares1. En los sistemas de mamíferos, estos ritmos están coordinados por un reloj central ubicado en el núcleo supraquiasmático (SCN) del hipotálamo y por relojes moleculares autosostenidos a nivel celular. Estos relojes consisten en bucles de retroalimentación transcricionales–traduccionales entrelazados que involucran genes reloj principales, incluyendo la proteína caput de ciclos de salida locomotora circadiana (Clock), helix-loop-helix básica similar al translocador nuclear del receptor de hidrocarburos aromáticos 1 (Bmal1), periodo (Per) y criptocromo (Cry)2. Dado el papel central del reloj circadiano en diversos procesos biológicos, los modelos celulares in vitro se han convertido en herramientas importantes para investigar los mecanismos moleculares de la regulación temporal en condiciones experimentales controladas.

El objetivo del presente protocolo es proporcionar un flujo de trabajo confiable, práctico y reproducible para sincronizar células cultivadas mediante un protocolo de choque sérico, realizar muestreos escalonados en un curso temporal y analizar la expresión de genes del reloj circadiano, evitando al mismo tiempo la recolección de muestras durante la noche. Al mejorar la viabilidad del muestreo circadiano sin comprometer la calidad de los datos, este flujo de trabajo tiene la finalidad de facilitar estudios sobre procesos biológicos rítmicos utilizando técnicas de laboratorio estándar.

Se han realizado estudios circadianos en una amplia variedad de modelos in vitro, incluyendo líneas celulares de cáncer humano3, fibroblastos de rata-14, explantes de SCN 5 y organoides6. Aunque la mayoría de las células de mamíferos poseen relojes circadianos funcionales, la ausencia de señales sincronizadoras, como la luz, conduce rápidamente a una desincronización en cultivo, lo que limita el estudio de los ritmos circadianos in vitro7. Por lo tanto, las técnicas de sincronización son esenciales para investigar los mecanismos del reloj molecular y sus implicaciones en la salud y la enfermedad.

Se han desarrollado varias estrategias de sincronización para células mamíferas en cultivo. La sincronización basada en glucocorticoides mediante dexametasona es una de las estrategias más utilizadas porque restablece de manera robusta los ritmos circadianos en muchos tipos celulares, a la vez que reduce parte de la variabilidad asociada con la estimulación con suero8. De forma similar, la activación mediada por forskolina de la señalización del adenosín monofosfato cíclico se ha utilizado con éxito para sincronizar relojes periféricos en modelos celulares seleccionados9. Otros enfoques incluyen el tratamiento con señales transportadas por la sangre4, diferentes compuestos químicos8,10, intercambio del medio3, choque térmico11, ciclos de oxígeno12 y estimulación mecánica13. En conjunto, estos métodos han avanzado considerablemente la investigación circadiana; sin embargo, pueden requerir equipos especializados, condiciones experimentales específicas o una optimización adicional, lo que hace importante validar la estrategia de sincronización seleccionada para cada modelo biológico y aplicación experimental14.

El choque sérico es uno de los enfoques de sincronización más ampliamente establecidos y consiste en exponer células cultivadas a un estímulo de suero de corta duración y alta concentración4. Dado que el estímulo es transitorio, se minimiza la perturbación prolongada de las vías de señalización celular4, reduciendo así los posibles efectos confusos en los análisis posteriores. Por consiguiente, el choque sérico es particularmente adecuado para estudios de expresión génica circadiana y función del reloj molecular. Además, el procedimiento es sencillo de implementar y no requiere equipos especializados, lo que lo hace accesible y fácilmente reproducible entre laboratorios. Una limitación práctica de los experimentos con choque sérico, sin embargo, es el horario intensivo de muestreo necesario para caracterizar con precisión la ritmicidad circadiana. El análisis fiable de ritmos normalmente requiere la recolección de muestras a intervalos regulares, generalmente cada 2–6 h durante uno o más ciclos circadianos (24–72 h)14, lo que a menudo implica recolecciones nocturnas.

El flujo de trabajo descrito aquí aborda este desafío logístico al escalonar el inicio de la sincronización en varias placas de cultivo, lo que permite realizar un muestreo circadiano completo durante el horario laboral habitual y evitar la recolección de muestras durante la noche. En lugar de introducir una nueva estrategia de sincronización, este protocolo ofrece una implementación detallada y reproducible de un método establecido de choque con suero, combinado con un horario de muestreo práctico y un análisis posterior de la expresión génica. Este flujo de trabajo es especialmente adecuado para estudios de expresión génica circadiana en células cultivadas, utilizando técnicas de laboratorio ampliamente disponibles. Al adaptar el protocolo a otros modelos celulares, deben optimizarse y validarse los parámetros experimentales, como la densidad celular, las condiciones de sincronización, los intervalos de muestreo y la selección de genes de referencia, para cada tipo celular específico antes de su implementación.

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Protocolo

El siguiente protocolo describe un método validado de sincronización para la línea celular hipotalámica embrionaria de ratón mHypoE-42. Valide y optimice independientemente el protocolo de sincronización antes de aplicarlo a otros tipos celulares cultivados. Véase Figura 1 para una descripción general del flujo de trabajo y Figura Suplementaria 1 para el cronograma semanal de muestreo. Consulte la Tabla de Materiales para obtener todos los reactivos, equipos e instrumentos utilizados en este protocolo. Realice todos los procedimientos de cultivo celular en una cabina de seguridad biológica certificada, utilizando reactivos y equipos estériles.

Diagrama del proceso de sincronización celular, método de choque sérico, cronograma, configuración experimental, intervalos CT.
Figura 1. Vista esquemática del protocolo de sincronización mediante choque sérico escalonado. Esquema que ilustra el flujo de trabajo utilizado para sincronizar células mHypoE-42 mediante choque sérico en dos conjuntos experimentales escalonados. El diseño escalonado permite la recolección de muestras circadianas durante el horario laboral habitual, evitando así el muestreo nocturno. Posteriormente, las muestras se procesan para la extracción de ARN, la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) y el análisis del ritmo circadiano. Creado con Biorender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Cultivo celular

  1. Cultive células adherentes mHypoE-42 en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), con alta concentración de glucosa (4500 mg/L), suplementado con 10% (v/v) de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS), 3,7 g/L de bicarbonato de sodio y 1% de solución antibiótica.
  2. Mantenga las células a 37°C en un incubador humedecido que contenga 95% de aire y 5% de dióxido de carbono (CO2), utilizando frascos de cultivo T75 con un volumen final de cultivo de 10 mL.
    NOTA: Pruebe cada nuevo lote de FBS antes de comenzar los experimentos, ya que los lotes de suero pueden variar.
  3. Subcultive las células cuando alcancen aproximadamente entre 80% y 90% de confluencia. Lave las células con solución salina tamponada con fosfato estéril 1× (PBS; pH 7,4), agregue 3 mL de solución de tripsina al 0,5% e incube durante 3–5 minutos para desprender las células.
  4. Agregue al menos el doble del volumen de tripsina de medio de cultivo completo que contenga 10% (v/v) de FBS para neutralizar la tripsina.
  5. Diluya las células con medio de crecimiento fresco en una proporción de hasta 1:2.
    NOTA: Evite usar células que hayan sido pasadas excesivamente (por ejemplo, pasajes superiores a 40 para células mHypoE-42). Precaliente todas las soluciones antes de su uso. Realice pruebas periódicas de contaminación por micoplasma en los cultivos.
  6. Proceda con los ensayos de sincronización 24 h después de sembrar las células a 2,0 × 105 células por pocillo, como se describe en el Paso 2. Mantenga los cultivos celulares de rutina aproximadamente entre 80% y 90% de confluencia antes del pasaje.

2. Sincronización de la línea celular mHypoE-42

  1. Preparación de células
    1. Después de la tripsinización, centrifugar las células a 700 × g durante 5 min.
    2. Descartar el sobrenadante y resuspender el botón celular en 10 mL de medio de cultivo fresco.
    3. Mezclar la suspensión celular con colorante azul de tripano en una proporción 1:1 (20 μL de volumen total) y determinar la concentración celular utilizando un hemocitómetro.
      NOTA: Desechar las soluciones que contienen azul de tripano según las normas institucionales de eliminación de residuos químicos. No desechar el colorante sin usar en el fregadero.
  2. Siembra celular y diseño experimental escalonado
    1. Siembra 2,0 × 105 células por pocillo en placas de 6 pocillos o en placas de cultivo de 35 mm. Incubar los cultivos a 37°C durante 24 h.
      NOTA: Iniciar la sincronización con suero 24 h después de la siembra celular. Por lo tanto, no se requiere un porcentaje predeterminado de confluencia antes de la sincronización. En cambio, examinar los cultivos microscópicamente para confirmar que las células estén completamente adheridas y muestren una morfología adecuada antes de comenzar el procedimiento de sincronización.
    2. Dividir aleatoriamente las placas de cultivo en dos conjuntos experimentales. Utilizar el primer conjunto para generar los puntos temporales circadianos (CT) CT0, CT4, CT8, CT24, CT28 y CT32. Utilizar el segundo conjunto para generar CT12, CT16, CT20, CT36, CT40, CT44 y CT48 (Figura 1; Figura Suplementaria 1).
    3. Aumentar el número de pocillos o placas según sea necesario para incluir réplicas técnicas.
      NOTA: Minimizar la variabilidad preparando todas las placas a partir de la misma suspensión celular, manteniendo densidades de siembra y condiciones de cultivo idénticas, y realizando la sincronización con los mismos reactivos y condiciones experimentales. Ajustar el formato del recipiente de cultivo y la densidad de siembra según sea necesario para otros tipos celulares. Cuando se utilicen placas de 6 pocillos, combinar los CT recolectados simultáneamente para optimizar el uso de las placas.
  3. Sincronización
    1. Después de 24 h, aspirar el medio del primer conjunto de placas y añadir 1 mL de DMEM sin suero. Incubar durante 12 h para inducir el ayuno de suero.
    2. Preparar inmediatamente antes de usar una solución al 50% (v/v) de suero de caballo en DMEM con alta concentración de glucosa.
    3. Aspirar el medio de ayuno del primer conjunto y exponer las células a 1 mL de la solución recién preparada al 50% de suero de caballo durante 2 h.
    4. Simultáneamente, aspirar el medio del segundo conjunto de placas y reemplazarlo con 1 mL de DMEM sin suero. Incubar durante 12 h.
    5. Después del choque de suero de 2 h, aspirar el medio y añadir 1 mL de DMEM con alta glucosa suplementado con 10% (v/v) de FBS inactivado por calor. Designar este punto temporal como CT0.
  4. Recolección de muestras
    1. Colocar las placas de cultivo sobre hielo. Aspirar el medio, lavar las células dos veces con 1 mL de PBS 1× estéril frío, desechar la solución de lavado y lisar las células mecánicamente utilizando hasta 1 mL de reactivo de lisis.
      ADVERTENCIA: El reactivo de lisis contiene sustancias químicas peligrosas. Realizar todos los pasos de manipulación en una campana extractora de gases certificada, utilizando el equipo de protección personal adecuado. Desechar los residuos según las normas institucionales de seguridad química.
    2. Transferir cada lisado a un tubo estéril y almacenar las muestras a −80°C hasta la extracción de ARN.
    3. Repetir los pasos 2.4.1 y 2.4.2 para recolectar muestras en CT4 y CT8.
    4. En CT8, repetir el paso 2.3.2 para el segundo conjunto experimental con el fin de sincronizar las otras células.
    5. Después de 2 h de choque de suero, finalizar la sincronización del segundo conjunto experimental reemplazando el medio con 1 mL de DMEM con alta glucosa suplementado con 10% (v/v) de FBS inactivado por calor.
    6. Recolectar muestras alternadamente de los dos conjuntos experimentales para obtener CT12, CT24, CT16, CT28, CT20 y CT32. Al día siguiente, repetir el procedimiento de recolección para obtener CT36, CT40, CT44 y CT48.
      NOTA: El ayuno de suero y la sincronización se iniciaron según la cronología experimental después de la siembra celular, y no en un porcentaje predeterminado de confluencia. Confirmar que las células estén completamente adheridas y muestren una morfología adecuada antes de comenzar la sincronización. Aunque los CT consecutivos difieren en 4 h, las recolecciones no se realizan a intervalos de 4 h. Consultar la Figura Suplementaria 1 para obtener el calendario completo de recolección semanal.

3. Procesamiento de la muestra: extracción de ARN

NOTA: Los protocolos pueden variar según el contexto experimental y la aplicación. El siguiente flujo de trabajo describe un ejemplo de un procedimiento efectivo para la extracción de ARN, la síntesis de ADN complementario (ADNc) y la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Extraiga el ARN total utilizando un método combinado de lisis basado en fenol y separación de fases, seguido de la purificación con columnas giratorias de sílice.

  1. Preparación de la muestra y separación de fases
    1. Descongele las muestras, rehomogenice los lisados e incúbelos a temperatura ambiente durante 5 min.
    2. Añada 200 μL de cloroformo por cada 1 mL de reactivo de lisis.
      ADVERTENCIA: El cloroformo es volátil y tóxico. Realice todos los procedimientos que involucren cloroformo en una campana extractora de gases químicos certificada, utilizando equipo de protección personal adecuado.
    3. Agite los tubos vigorosamente durante 15 s e incúbelos a temperatura ambiente durante 3 min.
    4. Centrifugue las muestras a 12,000 × g durante 15 min a 4°C. Permita que las muestras se separen en tres fases: una fase inferior de fenol-cloroformo que contiene proteínas, una interfase blanca que contiene ADN y una fase acuosa superior enriquecida en ARN.
    5. Transfiera cuidadosamente la fase acuosa a un nuevo tubo estéril sin perturbar la interfase. Almacene la fase orgánica a 4°C si se planea el aislamiento posterior de proteínas o ADN.
      NOTA: Realice el aislamiento de proteínas o ADN según el protocolo correspondiente si se van a recuperar estas biomoléculas a partir de la fase orgánica.
  2. Purificación de ARN
    1. Añada un volumen igual de etanol al 70% (preparado con agua libre de RNasas) a la fase acuosa y vortexee dos veces durante 15 s para favorecer la unión del ARN.
    2. Cargue la muestra en una columna de centrifugación de sílice y purifique el ARN según el procedimiento de purificación en columna.
    3. Digiera el ADN genómico contaminante con DNasa durante 15 min a temperatura ambiente.
    4. Lave la columna utilizando los tampones de lavado suministrados.
    5. Realice un lavado adicional con 100 μL de tampón de lavado y centrifugue a 11,000 × g durante 2 min para secar la membrana de sílice.
    6. Transfiera la columna de centrifugación a un tubo microcentrífugo limpio. Eluya el ARN con 40–60 μL de agua libre de RNasas aplicando el agua directamente al centro de la membrana de sílice y centrifugando a 11,000 × g durante 1 min.
      NOTA: Seleccione el volumen de elución según el rendimiento y la concentración de ARN deseados. Un volumen de elución de 60 μL generalmente proporciona una recuperación más completa del ARN a partir de la membrana de sílice, pero produce una solución de ARN más diluida. En contraste, un volumen de elución de 40 μL produce una preparación de ARN más concentrada, pero puede reducir la recuperación total de ARN. Optimice el volumen de elución según las recomendaciones del fabricante y los requisitos de la aplicación posterior.
  3. Evaluación de la calidad del ARN
    1. Coloque las muestras de ARN en hielo y transfiera 5 μL de cada muestra a un nuevo tubo microcentrífugo estéril para la evaluación de calidad.
    2. Evalúe la integridad del ARN utilizando electroforesis en gel de agarosa al 1.5% o electroforesis capilar. Confirme la presencia de bandas ribosomales de ARN 28S y 18S bien definidas.
    3. Determine la concentración y pureza del ARN midiendo la absorbancia con un espectrofotómetro.
      NOTA: Deseche los residuos que contengan fenol según las normas institucionales de eliminación de residuos químicos. No deseche residuos químicos peligrosos por el desagüe. Para muestras de células cultivadas, las concentraciones de ARN suelen oscilar entre 200 y 1000 ng/μL y son adecuadas para la síntesis de ADNc y qRT-PCR. Acepte muestras de ARN con una relación A260/230 entre 2.0 y 2.2 y una relación A260/280 de aproximadamente 2.0 (véase Tabla Suplementaria 1).
  4. Almacenamiento del ARN
    1. Almacene las muestras de ARN purificadas a −80°C hasta la síntesis de ADNc.

4. Procesamiento de la muestra: síntesis de ADNc

NOTA: Sintetice ADNc a partir de 1 μg de ARN total utilizando un kit de síntesis de la primera cadena de ADNc. Ajuste los volúmenes de reacción y las condiciones de incubación según las instrucciones del fabricante.

  1. Transcripción inversa
    1. Descongele las muestras de ARN sobre hielo. Prepare una reacción de transcripción inversa de 20 μL que contenga 1 μg de ARN total, 10 μL de Mezcla Maestra 2× (que contiene inhibidor de ribonucleasa, hexámeros aleatorios, cebadores de oligo(deoxitimidina), iones magnesio [Mg2+] y trifosfatos de desoxinucleótidos), 2 μL de mezcla enzimática (que contiene transcriptasa inversa) y agua tratada con pirocarbonato de dietilo hasta un volumen final de 20 μL.
    2. Incube la reacción en un termociclador durante 10 min a 25°C para el apareamiento de los cebadores, seguido de 30 min a 50°C para la síntesis de ADN complementario (cADN). Inactive la transcriptasa inversa incubando la reacción a 85°C durante 5 min.
    3. Añada 1 μL de RNasa H e incube la reacción durante 20 min a 37°C para degradar la cadena de ARN del híbrido ARN-ADN.
    4. Diluya la preparación de cADN hasta 1:20 con agua estéril, según los requisitos de optimización del ensayo, y almacene el cADN diluido a −20°C hasta su análisis mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR).

5. Procesamiento de muestras: reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)

NOTA: Mida la expresión de los genes del reloj circadiano mediante qRT-PCR. Consulte la Tabla Suplementaria 2 para obtener las secuencias de cebadores validadas, temperaturas de hibridación y concentraciones de cebadores.

  1. Optimización del ensayo
    1. Valide y optimice la concentración de cebadores, la temperatura de hibridación y la cantidad de ADNc utilizando muestras de ADNc agrupadas y una curva estándar antes de analizar las muestras experimentales. Realice la optimización y validación del ensayo como se ha descrito previamente15,16.
  2. Preparación de la reacción
    1. Prepare cada reacción de qRT-PCR de 10 μL combinando 5 μL de mezcla maestra 2×, 0,4 μL de cada cebador (directo e inverso), 0,2 μL de agua tratada con pirocarbonato de dietilo y 4 μL de molde de ADNc en una placa de PCR de 96 pocillos.
    2. Selle la placa con una película o tapa ópticamente transparente. Centrifugue la placa a 700 × g durante hasta 5 min a 4°C para eliminar burbujas y recoger la mezcla de reacción en el fondo de cada pocillo.
    3. Analice todas las muestras de ADNc para determinar la expresión de los genes diana Bmal1 y Per2.
    4. Analice el gen de referencia seleccionado (B2m) utilizando la misma dilución de ADNc para normalizar la expresión génica entre las muestras.
  3. Ciclos térmicos
    1. Realice la qRT-PCR utilizando las siguientes condiciones de ciclado: desnaturalización inicial y activación de la ADN polimerasa con inicio en caliente a 95°C durante 2 min, seguido de 39 ciclos de 95°C durante 5 s y 60°C durante 30 s.
    2. Realice el análisis de la curva de disociación calentando las reacciones a 95°C durante 5 s, seguido de incrementos de 0,5°C hasta alcanzar 95°C, manteniendo 5 s en cada incremento.
      NOTA: Ajuste los tiempos de mantenimiento y los parámetros de la curva de disociación según las recomendaciones del fabricante de la mezcla maestra cuando sea necesario.
  4. Validación del gen de referencia
    NOTA: En experimentos de sincronización con suero, evalúe los genes de referencia candidatos, ya que el tratamiento con suero puede alterar la expresión de los genes de mantenimiento17. Evalúe la estabilidad de la expresión mediante métodos como BestKeeper18, geNorm19, NormFinder20 o el método comparativo ΔCt21. Seleccione el (los) gen(es) más estable(s) para la normalización. En este estudio, se evaluaron β-actina (Actb) y β-2-microglobulina (B2m) utilizando el software RefFinder22, que integra múltiples algoritmos de validación de genes de referencia. B2m mostró la mayor estabilidad de expresión a lo largo del curso circadiano y, por lo tanto, se seleccionó para la normalización.
  5. Verificación del producto
    1. Verifique la especificidad de la amplificación analizando los productos de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%.
      NOTA: Determine la temperatura de hibridación óptima probando múltiples temperaturas (por ejemplo, 58°C, 60°C y 62°C). Seleccione la temperatura que produzca el valor más bajo del ciclo de cuantificación (Cq), manteniendo un único pico en la curva de disociación y sin evidencia de formación de dímeros de cebadores.
      NOTA: Acepte ensayos con eficiencias de amplificación entre 90% y 110% y un coeficiente de determinación (R2) igual o superior a 0,99. Confirme que las temperaturas de fusión no difieran en más de 0,5°C entre réplicas técnicas. Acepte únicamente réplicas técnicas con una diferencia de Cq ≤0,5 para el análisis y utilice estos valores para calcular los niveles medios de expresión. Realice todas las reacciones en réplicas técnicas (por ejemplo, triplicados) e incluya tanto un control sin molde como un control sin transcriptasa inversa.

6. Análisis de datos

  1. Análisis de expresión génica
    1. Calcule el promedio de los réplicas técnicos para cada muestra antes del análisis posterior.
    2. Calcule el valor ΔCq para cada muestra y punto de tiempo utilizando la siguiente ecuación:
      ΔCq   = Cqgen diana  -  Cqgen de mantenimiento
    3. Calcule el valor ΔΔCq para cada muestra y punto de tiempo utilizando la siguiente ecuación:
      ΔΔCq   = ΔCqmuestra  -  ΔCqcontrol  
      NOTA: Para el cálculo de ΔΔCq, ΔCqcontrol se definió como el valor medio de ΔCq obtenido al promediar todas las muestras de control en todos los CT.
    4. Evalúe los parámetros circadianos, incluyendo la estadística estimada de la línea media del ritmo (MESOR), amplitud, pico y fase, utilizando CircaCompare23. Realice el análisis utilizando la aplicación en línea o la implementación del paquete en R.
  2. Análisis en línea con CircaCompare
    NOTA: La implementación en línea informa estimaciones completas de parámetros circadianos solo cuando el conjunto de datos cumple con los criterios estadísticos de ritmicidad. Cuando la ritmicidad es débil o no estadísticamente significativa, utilice la implementación en R para obtener estimaciones de parámetros para todos los conjuntos de datos.
    1. Prepare un archivo de valores separados por comas (.csv).
      1. Ingrese la variable de tiempo (numérica; horas) en la columna 1.
      2. Ingrese la variable de agrupamiento (solo dos grupos experimentales) en la columna 2.
      3. Ingrese la variable de resultado (numérica; ΔΔCq) en la columna 3.
    2. Suba el archivo .csv a la aplicación en línea CircaCompare.
    3. Asigne las variables de tiempo, grupo y resultado a las columnas correspondientes.
    4. Seleccione Ejecutar para realizar el análisis.
  3. Análisis CircaCompare en R
    1. Realice el análisis utilizando R versión 4.5.1 y el paquete CircaCompare versión 0.2.024.
    2. Instale los paquetes de R requeridos.
      1. Instale el paquete devtools (versión 2.5.2).
      2. Instale el paquete circacompare (versión 0.2.0).
      3. Instale el paquete ggplot2 (versión 4.0.3).
      4. Instale el paquete svglite (versión 2.2.2).
    3. Suba el archivo .csv de entrada.
    4. Ejecute el análisis CircaCompare después de establecer alpha_threshold = 1.
      NOTA: Establecer alpha_threshold = 1 reporta estimaciones de parámetros circadianos para todas las oscilaciones ajustadas, independientemente de su significancia estadística. Sin embargo, solo las oscilaciones con un valor p < 0,05 deben interpretarse como rítmicas y estadísticamente significativas.
    5. Personalice el Archivo Suplementario 1 antes de ejecutar el script.
      1. Reemplace “XXX.csv” con el nombre del archivo de datos de entrada.
      2. Reemplace “YYY.csv” con el nombre deseado del archivo de resultados.
      3. Reemplace “ZZZ.svg” con el nombre deseado del archivo de gráfico.
      4. Ajuste los límites del eje y (ylim) y cualquier otro parámetro adicional de graficación según el conjunto de datos.
    6. Consulte la Tabla Suplementaria 3 para ver un ejemplo de archivo de entrada.

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Resultados

La sincronización exitosa se indica mediante la ritmicidad circadiana estadísticamente significativa de los genes reloj analizados en la condición de control (p < 0,05). En este estudio se realizaron tres experimentos biológicos independientes, utilizando dimetilsulfóxido al 0,1 % como control negativo. Bmal1 y Per2 fueron seleccionados como marcadores circadianos representativos porque son componentes centrales del reloj circadiano molecular y presentan un patrón de expresión antifásico bie...

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Discusión

Los ritmos circadianos son ciclos endógenos de aproximadamente 24 h que regulan una amplia gama de procesos fisiológicos, metabólicos y celulares mediante mecanismos moleculares conservados del reloj biológico1,2. Los modelos de sincronización in vitro proporcionan un entorno experimental controlado para investigar estos mecanismos y se han convertido en herramientas valiosas para estudiar la regulación circadiana en condiciones normales y patológicas, i...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue cofinanciado por la Facilidad de Recuperación y Resiliencia de la Unión Europea (UE) y fondos nacionales portugueses a través de la FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia en los proyectos LA/P/0058/2020 (DOI: 10.54499/LA/P/0058/2020), UID/04539/2025, UID/PRR/04539/2025 (DOI: 10.54499/UID/PRR/04539/2025) y UID/PRR2/04539/2025 (DOI: 10.54499/UID/PRR2/04539/2025); por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) a través del Programa Operativo Regional Centro 2030 en el proyecto CENTRO2030-FEDER-02360200; y por fondos nacionales portugueses a través de la FCT en las subvenciones 2023.17896.ICDT (DOI: 10.54499/2023.17896.ICDT), 2023.12355.PEX (DOI: 10.54499/2023.12355.PEX), 2021.02220.CEECIND/CP1656/CT0008 (DOI: 10.54499/2021.02220.CEECIND/CP1656/CT0008), 2020.04850.BD (DOI: 10.54499/2020.04850.BD) y 2021.05334.BD (DOI: 10.54499/2021.05334.BD).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placa de cultivo celular de 6 pocillosNest Biotechnology15140122Placa de cultivo celular
AgarosaNZYtechMB02702Evaluación de la calidad del ARN
Mezcla de antibióticos (penicilina/estreptomicina)Gibco, Thermo Fisher ScientificD5648Suplemento para cultivo celular
Kit de síntesis de ADNc (primera cadena)NZYtechMB12502Transcripción inversa
CloroformoSigma-AldrichA5256701Reactivo para separación de fases
DMEM, alta glucosa (4500 mg/L de glucosa, L-glutamina)Sigma-Aldrich26050088Medio de cultivo celular
Tubos microcentrífugos EppendorfEppendorf30120086Almacenamiento de muestras
Etileno (96 %)Fisher Bioreagents15552393Purificación de ARN
Suero bovino fetal, inactivado por calorGibco, Thermo Fisher ScientificJ62692.K7Suplemento para cultivo celular
Placa PCR de 96 pocillos de alta resistenciaBio-Rad LaboratoriesHSP9601Placa para qRT-PCR
Suero de caballo, inactivado por calorGibco, Thermo Fisher Scientific15400054Sincronización mediante choque de suero
Línea celular mHypoE-42 (CVCL_D443)CELLutions Biosystems Inc.MB13402Línea celular hipotalámica embrionaria de ratón
Primeros oligonucleotídicosNZYtechMB12501Primeros para qRT-PCR
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Thermo Fisher ScientificMB18502Lavado de células
Mezcla maestra verde para qPCR (2×)NZYtechMB22403Reactivo para qRT-PCR
Sistema de detección de PCR en tiempo realBio-Rad LaboratoriesEP0030108116Instrumento para qRT-PCR
Kit de aislamiento de ARNNZYtech288306Purificación mediante columna giratoria de sílice
Reactivo de lisis de ARNNZYtechMB18502Reactivo de extracción de ARN basado en fenol
Bicarbonato de sodioSigma-AldrichMB22401Suplemento para medio de cultivo celular
Placa de cultivo estéril de 35 mmThermo Fisher Scientific121VPlaca de cultivo celular
Ciclador térmico T100Bio-Rad Laboratories1861096Síntesis de ADNc
Matraz de cultivo de tejidos T75Corning430641URecipiente para cultivo celular
Solución de azul de tripano (0,4 %)Gibco, Thermo Fisher Scientific15250061Recuento celular
Tripsina-EDTA (0,5 %)Gibco, Thermo Fisher Scientific15400054Disociación celular

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