Este estudio investiga la lesión de la mucosa gástrica asociada al tratamiento con clopidogrel en ratas y células epiteliales gástricas, destacando su asociación con cambios moleculares relacionados con el estrés del retículo endoplásmico, apoptosis e inflamación sistémica.
Artículo de investigación
Lesión de la mucosa gástrica inducida por clopidogrel asociada al estrés del retículo endoplasmático en ratas
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
El clopidogrel se utiliza ampliamente como agente antiagregante plaquetario para la prevención y el tratamiento de enfermedades trombóticas arteriales, pero su aplicación clínica podría verse limitada por efectos adversos gastrointestinales, incluyendo lesión de la mucosa gástrica. Dado que la supervivencia de las células epiteliales es esencial para mantener la integridad de la mucosa gástrica, planteamos la hipótesis de que la lesión epitelial gástrica inducida por clopidogrel iría acompañada de alteraciones en los marcadores relacionados con el estrés del retículo endoplásmico (ER) y la apoptosis. Para comprobar esta hipótesis, se trataron células epiteliales gástricas humanas GES-1 con diferentes concentraciones de clopidogrel, y se evaluó la viabilidad celular, la apoptosis, la distribución del ciclo celular y los cambios moleculares mediante el ensayo con el kit de conteo celular-8 (CCK-8), citometría de flujo, reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) e inmunotransferencia Western. Paralelamente, se administró clopidogrel por sonda gástrica a ratas Sprague-Dawley para establecer un modelo de lesión gástrica in vivo. Los cambios patológicos en la mucosa gástrica se evaluaron mediante tinción con hematoxilina y eosina, y los niveles séricos de citocinas inflamatorias se midieron mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). El clopidogrel redujo la viabilidad de las células GES-1, promovió la apoptosis y alteró la progresión del ciclo celular. En las ratas, el clopidogrel indujo erosión, edema e infiltración de células inflamatorias en la mucosa gástrica, acompañado por un aumento en los niveles séricos de interleucina (IL)-1β, IL-6 y factor de necrosis tumoral-α (TNF-α). El clopidogrel también incrementó la expresión de los marcadores de estrés del retículo endoplásmico proteína homóloga a C/EBP (CHOP) y factor de transcripción activador 5 (ATF5), aumentó la expresión de la proteína Bcl-2 asociada a X (Bax), disminuyó la expresión de la linfoma de células B 2 (Bcl-2) y elevó la relación Bax/Bcl-2 tanto en tejidos gástricos como en células GES-1. Estos hallazgos sugieren que la lesión de la mucosa gástrica inducida por clopidogrel está asociada con un aumento en la expresión de marcadores relacionados con el estrés del retículo endoplásmico y con la alteración del equilibrio Bax/Bcl-2, aunque en este estudio no se estableció una relación causal directa entre la vía del estrés del retículo endoplásmico y la apoptosis mitocondrial.
Introducción
Los sistemas inmunitarios innato y adaptativo de la mucosa gástrica, que comprenden células epiteliales, células inmunitarias y moléculas de señalización, trabajan juntos para mantener la integridad de la mucosa y actúan como una barrera fisiológica crítica contra factores dañinos1,2. Esta función protectora es esencial para la homeostasis gastrointestinal, y su alteración puede contribuir al desarrollo de enfermedades gástricas, incluyendo la gastritis3. Clínicamente, la lesión de la mucosa gástrica inducida por fármacos es una complicación común, siendo los medicamentos antiinflamatorios no esteroideos y los agentes antiagregantes plaquetarios algunas de las causas más frecuentes4. La integridad de la mucosa gástrica depende de un equilibrio dinámico entre la proliferación celular y la apoptosis5. La exposición crónica a factores ambientales, incluyendo medicamentos, puede alterar este equilibrio, promover la apoptosis y provocar lesión de la mucosa6,7. El retículo endoplásmico desempeña un papel central en el mantenimiento de la homeostasis intracelular. Bajo condiciones de estrés celular, la acumulación de proteínas mal plegadas o desplegadas activa la respuesta de proteínas desplegadas, que incluye la señalización PERK/eIF2α/ATF4/CHOP, la cual puede promover la apoptosis y alterar la expresión de proteínas de la familia de linfoma de células B (Bcl-2)8. ATF5 también participa en las respuestas al estrés mitocondrial y en la interacción entre la disfunción mitocondrial y el estrés del retículo endoplásmico9. Evidencia clínica reciente indica que la terapia antiagregante continua, incluyendo clopidogrel, se asocia con una lesión progresiva de la mucosa gástrica e intestinal10.
El clopidogrel es un agente antiplaquetario ampliamente recetado que requiere una activación metabólica antes de unirse de forma irreversible a los receptores plaquetarios P2Y12, inhibiendo así la agregación plaquetaria mediada por difosfato de adenosina y produciendo efectos antitrombóticos11. Esta bioactivación ocurre principalmente a través de las enzimas hepáticas del citocromo P450. Por lo tanto, la exposición directa de células epiteliales gástricas cultivadas al compuesto progenitor del clopidogrel no reproduce el contexto metabólico y farmacocinético completo del tratamiento con clopidogrel in vivo. Sin embargo, hay evidencia creciente de que el tratamiento con clopidogrel podría estar asociado con úlceras gástricas recurrentes y hemorragia gastrointestinal, lo que resalta la importancia de equilibrar la eficacia antitrombótica con la seguridad gastrointestinal12,13,14. Aunque se han descrito estos efectos adversos, los mecanismos subyacentes a la lesión de la mucosa gástrica asociada al clopidogrel aún no se comprenden completamente, lo que limita el desarrollo de estrategias preventivas y terapéuticas específicas. En el presente estudio, investigamos los efectos del clopidogrel sobre la mucosa gástrica utilizando ratas Sprague–Dawley y células GES-1. Las ratas recibieron clopidogrel por gavaje, y se realizaron experimentos complementarios in vitro utilizando células GES-1. Se llevaron a cabo análisis histopatológicos, moleculares y celulares para investigar si la lesión de la mucosa gástrica inducida por clopidogrel está asociada con estrés del retículo endoplásmico y apoptosis. Por consiguiente, el presente estudio se centró en caracterizar los cambios moleculares asociados con la lesión gástrica inducida por clopidogrel, más que en establecer una vía de señalización causal. Nuestros hallazgos aportan información adicional sobre los cambios moleculares relacionados con la lesión de la mucosa gástrica inducida por clopidogrel y podrían contribuir a estudios futuros dirigidos a prevenir y manejar estos efectos adversos.
Protocolo
Todos los procedimientos experimentales con animales fueron revisados y aprobados por el Comité de Ética en Experimentación Animal de Dr. Can Biotechnology (Zhejiang) Co., Ltd. El estudio se realizó de acuerdo con las directrices institucionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio. El número de aprobación de ética animal fue DRK-20251015210.
Animales y líneas celulares
La aprobación ética cubrió el uso de 20 ratas Sprague–Dawley de grado SPF. En el presente estudio se incluyeron un total de 12 ratas Sprague–Dawley de grado SPF, machos, de 6 a 8 semanas de edad y con un peso de 280 a 300 g al inicio del experimento. Las ratas fueron obtenidas de Hangzhou Ziyuan Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Hangzhou, China; Licencia de producción n.º SCXK [Zhejiang] 2024-0004) y asignadas aleatoriamente a los grupos control y tratado con clopidogrel, con seis ratas por grupo. Las ratas se mantuvieron en un ambiente controlado a aproximadamente 22 °C bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h, con acceso libre a alimento estándar y agua potable esterilizada. A todas las ratas se les permitió aclimatarse durante una semana antes del experimento. El hidrogenosulfato de clopidogrel se suspendió en carboximetilcelulosa sódica (CMC-Na) al 0,5 % a una concentración de 0,781 mg/mL. Las ratas del grupo tratado con clopidogrel recibieron hidrogenosulfato de clopidogrel por gavaje oral a 10 mL/kg de peso corporal (equivalente a 1 mL/100 g de peso corporal y a una dosis de 7,81 mg/kg) una vez al día durante 3 días consecutivos. Las ratas del grupo control recibieron un volumen igual de CMC-Na al 0,5 %. La dosis y la duración del tratamiento de 3 días se seleccionaron en base a un modelo previamente descrito en ratas para la administración oral aguda de clopidogrel. Tras el último gavaje en el día 3, se les retiró el alimento durante 12 h, mientras que el agua se proporcionó ad libitum. Las ratas fueron anestesiadas en una cámara de inducción con 3 % de isoflurano en oxígeno, y la anestesia se mantuvo con 1,5 %–2,0 % de isoflurano administrado mediante cono nasal. Se confirmó una profundidad anestésica adecuada por la ausencia de reflejos corneal y de retirada plantar. Se obtuvo sangre mediante punción cardíaca terminal bajo anestesia profunda. Mientras permanecían profundamente anestesiadas, las ratas fueron sacrificadas mediante exsanguinación seguida de toracotomía bilateral. Se confirmó la muerte por la ausencia de respiración espontánea y actividad cardíaca durante al menos 5 minutos, junto con la ausencia de reflejos corneal y de retirada plantar. Luego se extrajo rápidamente el estómago, se abrió a lo largo de la curvatura mayor y se enjuagó suavemente con solución salina fría.
La línea celular epitelial de la mucosa gástrica humana GES-1 fue obtenida de iCell Bioscience Inc. (Shanghai, China; N.º de catálogo iCell-h062) y fue autenticada mediante perfilado de repeticiones en tándem cortas por el proveedor. Las células se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina en un incubador humedecido a 37 °C con 5% de CO₂. Para los experimentos se utilizaron células de pasajes tempranos, entre los pasajes 3 y 10. Cuando el grado de confluencia celular alcanzó aproximadamente entre el 80% y el 90%, las células se subpasaron con una relación de división de 1:3. Para experimentos posteriores se utilizaron células en fase logarítmica de crecimiento. Para el ensayo CCK-8, las células se sembraron en placas de 96 pozos a una densidad de 6 × 103 células/pozo. Para los análisis de apoptosis y ciclo celular, las células se sembraron en placas de 6 pozos a aproximadamente 5 × 105 células/pozo y se dejaron adherir antes del tratamiento con clopidogrel.
Productos químicos y soluciones
Se utilizó clopidogrel hidrogenosulfato (n.º de cat. C874834; pureza ≥ 99 %) para los experimentos con animales y células. Se preparó una solución stock de clopidogrel disolviendo 100 mg de polvo de clopidogrel en dimetilsulfóxido (DMSO) para obtener una solución stock de 1 M. La solución stock se diluyó posteriormente a las concentraciones de trabajo requeridas antes de su uso. La solución stock de 1 M se diluyó seriadamente con DMSO para preparar soluciones de dosificación 1000× a concentraciones de 10, 100, 200, 400, 600, 800 y 1000 mM. Inmediatamente antes del tratamiento, cada solución de dosificación 1000× se añadió al medio de cultivo completo en una proporción de 1:1000 (v/v) para obtener concentraciones finales de clopidogrel de 0,01, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 y 1,0 mM, respectivamente. El grupo control de vehículo recibió un volumen igual de DMSO sin clopidogrel. Por lo tanto, la concentración final de DMSO se mantuvo en 0,1 % (v/v) en todos los grupos. Las células GES-1 en cultivo no reproducen la bioactivación mediada por citocromo P450 hepático del clopidogrel. Por consiguiente, se utilizó el tratamiento directo con clopidogrel como un modelo exploratorio de exposición al compuesto parental. El rango de concentraciones se seleccionó para caracterizar las respuestas celulares dependientes de la concentración bajo las condiciones experimentales y no debe interpretarse como equivalente a concentraciones plasmáticas o tisulares gástricas clínicamente alcanzables.
Subcultivo de Células
El medio completo se preparó suplementando el medio de cultivo basal con suero bovino fetal (FBS) y penicilina-estreptomicina. Cuando la confluencia celular alcanzó aproximadamente el 80 %, se eliminó el medio de cultivo y las células se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS). A continuación, las células se digirieron con una solución de tripsina-etilendiaminotetraacético (EDTA) durante aproximadamente 1–2 min. Tras la desprendimiento parcial de las células, se añadió medio completo para detener la digestión. La suspensión celular se centrifugó a 1.200 × g durante 3 min. Tras la eliminación del sobrenadante, el sedimento celular se resuspendió en 1–2 mL de medio completo y se sembró en nuevas placas de cultivo según los requisitos del experimento.
Ensayo de viabilidad celular CCK-8
Las células GES-1 en fase de crecimiento logarítmico se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 6 × 103 células/pocillo y se cultivaron durante la noche para permitir la adhesión celular. Tras la adhesión, las células se trataron con diferentes concentraciones de clopidogrel (0, 0,01, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 y 1,0 mM) durante 24 h. Al grupo control se le administró la misma concentración final de vehículo. Después del tratamiento, se añadió solución CCK-8 a cada pocillo y se incubó a 37 °C según las instrucciones del kit. Se midió la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas. La viabilidad celular se calculó como un porcentaje respecto al grupo control. En función de los resultados de la curva concentración-respuesta, se seleccionó el tratamiento con 0,1 mM de clopidogrel durante 24 h para los análisis posteriores de apoptosis, ciclo celular, qPCR y Western blot.
Análisis de citometría de flujo
Las células GES-1 se sembraron en placas de 6 pocillos y se trataron con clopidogrel 0,1 mM durante 24 h tras la adhesión celular. Tras el tratamiento, se recolectaron tanto las células en suspensión como las adherentes. Las células adherentes se digirieron con tripsina sin EDTA, se lavaron dos veces con PBS frío y se resuspendieron en tampón de enlace. Las células se tiñeron utilizando un Kit de Apoptosis Annexina V-FITC/PI siguiendo las instrucciones del fabricante. Tras la incubación a temperatura ambiente y en oscuridad, las células apoptóticas se detectaron mediante un citómetro de flujo RaiseCyte 2L6C. Los datos se adquirieron con el software RaiseFlower y se analizaron con el software FlowJo (versión 10.8.1). Las poblaciones de células apoptóticas tempranas, tardías y el total de células apoptóticas se cuantificaron utilizando el software FlowJo.
Análisis citométrico de flujo de la distribución del ciclo celular
Las células GES-1 se sembraron en placas de 6 pocillos y se trataron con clopidogrel 0,1 mM durante 24 h. Después del tratamiento, las células se recolectaron, lavaron con PBS y fijaron en etanol al 70 % previamente enfriado a 4 °C. Las células fijadas se lavaron luego para eliminar el etanol residual e incubadas con solución de tinción de RNasa A y yoduro de propidio a oscuras según las instrucciones del fabricante. La distribución del ciclo celular se analizó mediante citometría de flujo. Los datos se adquirieron utilizando el software de adquisición y se analizaron con el software FlowJo. Las distribuciones del ciclo celular se ajustaron utilizando el modelo de Watson, y se calcularon los porcentajes de células en las fases G0/G1, S y G2/M.
Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR)
Se extrajo ARN total de las células GES-1 y de muestras de tejido gástrico de rata utilizando un kit de extracción de ARN según las instrucciones del fabricante. Para las muestras de tejido, los tejidos de la mucosa gástrica se recolectaron rápidamente, se homogenizaron en condiciones de baja temperatura y se sometieron a la extracción de ARN. La concentración y pureza del ARN se determinaron midiendo la absorbancia a 260 y 280 nm. Cantidades iguales de ARN se transcribieron inversamente a ADN complementario (cADN) utilizando un kit de transcripción inversa con eliminación de ADN genómico. Se realizó PCR cuantitativa en tiempo real utilizando una mezcla maestra de PCR basada en SYBR Green. Cada reacción se llevó a cabo en un volumen total de 20 µL que contenía 10 µL de mezcla maestra 2×, 1 µL de cADN, 0,4 µL del cebador directo, 0,4 µL del cebador inverso y 8,2 µL de agua ddH₂O libre de RNasa. Las condiciones del ciclo térmico fueron las siguientes: desnaturalización inicial a 95 °C durante 10 min, seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 10 s, hibridación a 60 °C durante 30 s y extensión a 72 °C durante 30 s. Se determinaron los niveles de expresión de CHOP, ATF5, Bcl-2 y Bax. Se utilizó GAPDH como gen de referencia interno. La expresión génica relativa se calculó mediante el método 2−ΔΔCt. Las secuencias de los cebadores se listan en Tabla Suplementaria 1.
Western Blot
Se extrajo la proteína total de células GES-1 y muestras de tejido gástrico de rata. Para las muestras celulares, las células GES-1 tratadas se lavaron con PBS frío y se lisaron utilizando un tampón de lisis RIPA (ensayo de inmunoprecipitación con radioinmunoensayo) que contenía un inhibidor de proteasas. Para las muestras de tejido, los tejidos de la mucosa gástrica se homogenizaron en tampón RIPA bajo condiciones de baja temperatura y luego se centrifugaron para recoger el sobrenadante. Las concentraciones de proteína se determinaron mediante un ensayo de proteína BCA. Se separaron 20 µg de proteína por pocillo mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Después de bloquear con albúmina sérica bovina (BSA), las membranas se incubaron durante toda la noche a 4°C con anticuerpos primarios contra CHOP (1:1000), ATF5 (1:1000), Bcl-2 (1:1000), Bax (1:1000) y β-actina (1:5000). Tras lavarlas, las membranas se incubaron con los correspondientes anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (1:10000). Las bandas proteicas se visualizaron utilizando un reactivo de quimioluminiscencia mejorado y se capturaron con un sistema de imagen de quimioluminiscencia. Las intensidades de las bandas se cuantificaron mediante software de análisis de imágenes y se normalizaron respecto a β-actina.
Evaluación histopatológica
Se recolectaron muestras de tejido gástrico de ratas Sprague–Dawley tras el tratamiento con clopidogrel y se fijaron en formalina tamponada neutra al 10%. Las muestras se deshidrataron, aclararon, embebieron en parafina y seccionaron con un grosor de 4 µm. Los cortes en parafina se tiñeron con hematoxilina y eosina. Los cambios histopatológicos se evaluaron cualitativamente mediante microscopía óptica basándose en la morfología de la mucosa, la integridad epitelial, el edema y la infiltración de células inflamatorias. Se capturaron imágenes representativas. No se aplicó ningún sistema de puntuación histológica.
Inmunohistoquímica
Las secciones de tejido gástrico embebido en parafina se desparafinizaron en xileno y se rehidrataron mediante una serie graduada de etanol. Se realizó la recuperación de antígenos inducida por calor en tampón citrato. La actividad peroxidásica endógena se bloqueó con peróxido de hidrógeno al 3 % durante 10 minutos, y el enlace no específico se bloqueó con suero de cabra normal durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra CHOP, ATF5, Bcl-2 y Bax. Después de lavar con PBS, las secciones se incubaron con el anticuerpo secundario correspondiente conjugado con peroxidasa de rábano picante. Las señales inmunorreactivas se visualizaron utilizando una solución cromógena de DAB, seguido de contraste con hematoxilina. Las secciones se deshidrataron, aclararon, montaron y examinaron al microscopio óptico. Se capturaron imágenes representativas, y el área de tinción positiva se cuantificó mediante software de análisis de imágenes.
Tinción por inmunofluorescencia
Las secciones de tejido gástrico embebido en parafina se desparafinizaron, rehidrataron y sometieron a recuperación de antígenos inducida por calor en tampón citrato. Después de bloquear con suero de cabra normal durante 30 min, las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra CHOP (1:50), ATF5 (1:100), Bcl-2 (1:50) y Bax (1:200). Tras lavar con PBS, las secciones se incubaron con los anticuerpos secundarios fluorescentes correspondientes (1:500) durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad y luego se contratiñeron con DAPI. Las imágenes se capturaron mediante un microscopio de fluorescencia a un aumento de ×200. Se analizaron tres campos seleccionados aleatoriamente y no superpuestos de cada animal utilizando Image-Pro Plus 6.0, y la intensidad de fluorescencia se expresó como IOD/Área. En el análisis se incluyeron tres animales por grupo.
Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)
Se recolectaron muestras de sangre de ratas Sprague–Dawley después del tratamiento y se dejaron coagular a temperatura ambiente. El suero se separó mediante centrifugación y se almacenó a −80 °C hasta el análisis. Los niveles séricos de IL-1β, IL-6 y TNF-α se midieron utilizando kits de ELISA según las instrucciones del fabricante. La absorbancia se midió usando un lector de microplacas, y las concentraciones de citocinas se calcularon según las curvas estándar.
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando software de análisis estadístico. Los datos se presentan como media ± DE. La normalidad y la homogeneidad de la varianza se evaluaron mediante la prueba de Shapiro-Wilk y la prueba de Levene, respectivamente. Las comparaciones entre dos grupos se realizaron utilizando la prueba t de Student. Las comparaciones entre múltiples grupos se realizaron mediante un análisis de varianza unidireccional seguido de la prueba post hoc de Dunnett. Un valor de P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Todos los experimentos con células se realizaron con al menos tres réplicas biológicas independientes.
Resultados
El clopidogrel reduce la viabilidad de las células GES-1 y aumenta la apoptosis In Vitro
Primero investigamos si el clopidogrel afecta la viabilidad celular y la apoptosis en células GES-1. Los ensayos CCK-8 mostraron que el tratamiento con clopidogrel redujo significativamente la viabilidad de las células GES-1 (Figura 1A,B), lo que indica una disminución en la viabilidad celular. Con base en la reducción general de la viabilidad celular en el rango de concentraciones ensayado, se seleccionó una concentración de 0,1 mM de clopidogrel durante 24 h para todos los experimentos celulares posteriores. Posteriormente, se realizó citometría de flujo para analizar la apoptosis y la distribución del ciclo celular (Figura 1C–F). El análisis por citometría de flujo mostró un aumento en la proporción de células en fase S, acompañado de una reducción en la población G0/G1 y sin un aumento evidente en la población G2/M, lo que indica una acumulación en fase S en lugar de una detención en fase G2/M. Los resultados demostraron que el clopidogrel aumentó significativamente la apoptosis y alteró la distribución del ciclo celular en células GES-1 en comparación con el grupo control. En conjunto, estos hallazgos indican que el clopidogrel reduce la viabilidad de las células GES-1 y se asocia con un aumento en la apoptosis y cambios en la progresión del ciclo celular. Estos resultados demuestran respuestas citotóxicas tras la exposición directa al compuesto parental clopidogrel bajo las condiciones experimentales seleccionadas. No se establece que efectos comparables ocurran a niveles de exposición clínicamente relevantes ni que las respuestas observadas estén mediadas por el metabolito activo del clopidogrel.
Figura 1. El clopidogrel reduce la viabilidad de las células GES-1 y aumenta la apoptosis. (A) La viabilidad celular de la línea de células epiteliales gástricas humanas GES-1 se evaluó mediante el ensayo CCK-8 tras el tratamiento con concentraciones crecientes de clopidogrel (0–1,0 mM) durante 24 h. (B) Comparación cuantitativa de la viabilidad celular entre el grupo control y el grupo tratado con clopidogrel 0,1 mM durante 24 h. (C) Perfiles representativos del ciclo celular analizados mediante citometría de flujo utilizando el modelo de Watson. (D) Cuantificación de los porcentajes de células en las fases G0/G1, S y G2/M. El tratamiento con clopidogrel aumentó la población en fase S sin un aumento evidente en la población G2/M. (E) Gráficos de dispersión representativos de citometría de flujo para apoptosis tras tinción con anexina V-isotiocianato de fluoresceína (FITC) y yoduro de propidio (PI). (F) Cuantificación de la población total de células apoptóticas. Todos los experimentos celulares se realizaron con tres réplicas biológicas independientes (n = 3). Los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE). La significancia estadística se determinó mediante comparación con el grupo control. ***P < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
La lesión gástrica inducida por clopidogrel está asociada con inflamación sistémica
Las ratas Sprague–Dawley se dividieron aleatoriamente en dos grupos (n = 6 por grupo): un grupo control y un grupo tratado con clopidogrel que recibió una administración diaria por sonda. La dosis de clopidogrel y el régimen de tratamiento de 3 días se seleccionaron en función de un modelo de rata previamente descrito de lesión gástrica inducida por clopidogrel16. Después de 3 días, se recolectaron tejidos gástricos para tinción con hematoxilina y eosina (H&E). El examen histopatológico reveló erosiones de la mucosa gástrica, edema e infiltración de células inflamatorias en el grupo tratado con clopidogrel en comparación con el grupo control (Figura 2A). Los niveles séricos de citocinas inflamatorias se midieron mediante ELISA. El grupo tratado con clopidogrel mostró niveles séricos significativamente más altos de interleucina (IL)-1β, IL-6 y factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) que el grupo control (Figura 2B–D). Estos hallazgos indican que el tratamiento con clopidogrel se asocia con lesión de la mucosa gástrica y respuestas inflamatorias sistémicas aumentadas15,16.
Figura 2. El clopidogrel induce lesión de la mucosa gástrica y aumenta los niveles circulantes de citocinas inflamatorias en ratas. (A) Secciones representativas teñidas con hematoxilina y eosina (H&E) de la mucosa gástrica de ratas Sprague–Dawley control y tratadas con clopidogrel. El examen histológico muestra una arquitectura de la mucosa gástrica preservada en el grupo control y alteraciones morfológicas en el grupo tratado con clopidogrel. Las flechas amarillas indican células epiteliales de la mucosa gástrica, las flechas rojas indican congestión focal dentro de la capa mucosa y las flechas negras indican infiltración leve de células inflamatorias. Aumento original, ×200; barra de escala = 100 µm. n = 6 animales por grupo. (B–D) Las concentraciones séricas de interleucina (IL)-1β, IL-6 y factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) se midieron mediante ensayo inmunoenzimático (ELISA). Los datos se presentan como media ± DE; n = 6 animales por grupo. ***P < 0,001 en comparación con el grupo control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El clopidogrel altera los marcadores relacionados con el estrés del retículo endoplásmico y la apoptosis en la mucosa gástrica de ratas
Para investigar los cambios moleculares asociados con la lesión gástrica inducida por clopidogrel, se realizó tinción inmunohistoquímica en secciones de tejido gástrico. Las imágenes representativas mostraron una tinción más intensa de CHOP, ATF5 y Bax en el grupo tratado con clopidogrel en comparación con el grupo control, mientras que la tinción de Bcl-2 apareció más débil (Figura 3A). El análisis cuantitativo de IOD/área demostró que la tinción de CHOP, ATF5 y Bax aumentó significativamente tras el tratamiento con clopidogrel (Figura 3B,C,E). La tinción de Bcl-2 mostró una tendencia decreciente, aunque la diferencia no alcanzó significancia estadística (Figura 3D). Estos resultados indican que el tratamiento con clopidogrel se asocia con una expresión alterada de proteínas relacionadas con el estrés y la apoptosis en la mucosa gástrica de ratas. El análisis de inmunofluorescencia mostró señales más intensas de CHOP y ATF5 en el tejido de la mucosa gástrica del grupo tratado con clopidogrel. El análisis cuantitativo confirmó aumentos significativos en CHOP (Figuras 4A y 5A) y ATF5 (Figuras 4B y 5B), mientras que Bcl-2 (Figuras 4C y 5C) y Bax (Figuras 4D y 5D) mostraron tendencias decreciente y creciente, respectivamente, sin alcanzar significancia estadística. En conjunto, estos hallazgos indican que el tratamiento con clopidogrel se asocia con una expresión alterada de marcadores relacionados con el estrés del retículo endoplásmico y la apoptosis en la mucosa gástrica de ratas.
Figura 3. Detección inmunohistoquímica de proteínas relacionadas con el estrés del retículo endoplásmico y la apoptosis en tejido gástrico. (A) Imágenes representativas de tinción inmunohistoquímica de la proteína homóloga a C/EBP (CHOP), el factor de transcripción activador 5 (ATF5), la linfoma de células B 2 (Bcl-2) y la proteína asociada a Bcl-2 X (Bax) en tejido de la mucosa gástrica de ratas Sprague–Dawley del grupo control y tratadas con clopidogrel. La tinción marrón indica inmunorreactividad positiva, y los núcleos se contratinjeron con hematoxilina. Las imágenes mostradas son representativas de todas las muestras analizadas, con tres animales incluidos en cada grupo. Aumento original, ×200; barra de escala = 100 µm. (B–E) Análisis cuantitativo de la densidad óptica integrada por unidad de área (IOD/Area) para CHOP, ATF5, Bcl-2 y Bax, respectivamente. Los datos se presentan como media ± DE. *P < 0,05 y **P < 0,01 en comparación con el grupo control. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 4. Detección por inmunofluorescencia de proteínas relacionadas con el estrés del retículo endoplásmico y la apoptosis en tejido gástrico. Imágenes representativas de inmunofluorescencia que muestran la localización de la proteína homóloga a C/EBP (CHOP), el factor de transcripción activador 5 (ATF5), la linfoma de células B 2 (Bcl-2) y la proteína asociada a Bcl-2 X (Bax) en el tejido de la mucosa gástrica de ratas Sprague–Dawley control y tratadas con clopidogrel. Los núcleos se contratinjeron con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (azul), y la tinción positiva de inmunofluorescencia se muestra en rojo. Las imágenes fusionadas se presentan en la columna derecha. (A) CHOP. (B) ATF5. (C) Bcl-2. (D) Bax. Aumento original, ×200; barra de escala = 100 µm. Las imágenes mostradas son representativas de todas las muestras analizadas, con n = 3 animales por grupo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Análisis cuantitativo de la inmunofluorescencia de proteínas relacionadas con el estrés del retículo endoplásmico y la apoptosis en tejido gástrico. (A–D) Cuantificación de la densidad óptica integrada por unidad de área (IOD/Area) de la proteína homóloga de C/EBP (CHOP), el factor de transcripción activador 5 (ATF5), la linfoma de células B 2 (Bcl-2) y la proteína asociada a Bcl-2 X (Bax) en el tejido de la mucosa gástrica de ratas Sprague–Dawley control y tratadas con clopidogrel. Para cada animal, se analizaron tres campos microscópicos seleccionados al azar y no superpuestos por corte de tejido mediante software de análisis de imágenes, y se utilizó el valor medio para el análisis estadístico. Los datos se presentan como media ± DE; n = 3 animales por grupo. *P < 0,05 y **P < 0,01 en comparación con el grupo control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El clopidogrel altera la expresión génica y proteica relacionada con el estrés del retículo endoplásmico y la apoptosis en células GES-1 y tejido gástrico de rata
Estudios previos han indicado que el estrés del retículo endoplásmico desempeña un papel clave en las respuestas celulares al estrés y en la apoptosis17,18. Para evaluar los cambios en los marcadores relacionados con el estrés del retículo endoplásmico tras el tratamiento con clopidogrel, se analizó la expresión de CHOP y ATF5 en células GES-1. La qRT-PCR mostró un aumento en la expresión de ARNm de CHOP y ATF5 tras el tratamiento con clopidogrel. El análisis por inmunotransferencia confirmó además un incremento en la expresión proteica de CHOP y ATF5 (Figura 6A–E). Posteriormente, se evaluó la expresión de proteínas relacionadas con la apoptosis en células GES-1 y tejido gástrico de rata. En comparación con el grupo control, el tratamiento con clopidogrel aumentó la expresión de Bax y disminuyó la expresión de Bcl-2, lo que resultó en una mayor relación Bax/Bcl-2 (Figura 6A–J). Estos patrones de expresión se observaron consistentemente tanto a nivel de ARNm como de proteína en células GES-1 y tejido gástrico de rata. En conjunto, estos hallazgos demuestran que el tratamiento con clopidogrel se asocia con una alteración en la expresión de marcadores relacionados con el estrés del retículo endoplásmico y la apoptosis en ambos modelos experimentales.
Figura 6. Expresión de marcadores relacionados con el estrés del retículo endoplásmico y la apoptosis en células GES-1 y tejido gástrico de rata tras el tratamiento con clopidogrel. (A–D) Expresión relativa de ARN mensajero (mRNA) de la proteína homóloga a C/EBP (CHOP), el factor de transcripción activador 5 (ATF5), la linfoma de células B 2 (Bcl-2) y la proteína asociada a Bcl-2 X (Bax) en la línea celular epitelial gástrica humana GES-1, determinada mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). (E) Imágenes representativas de inmunotransferencia (Western blot) con la cuantificación densitométrica correspondiente de la expresión proteica de CHOP, ATF5, Bcl-2 y Bax en células GES-1. Los niveles de expresión proteica se normalizaron respecto a β-actina. Los experimentos en células se realizaron con tres réplicas biológicas independientes (n = 3). (F–I) Expresión relativa de mRNA de CHOP, ATF5, Bcl-2 y Bax en tejido gástrico de rata determinada mediante qRT-PCR. (J) Imágenes representativas de inmunotransferencia con la cuantificación densitométrica correspondiente de la expresión proteica de CHOP, ATF5, Bcl-2 y Bax en tejido gástrico de rata. Los niveles de expresión proteica se normalizaron respecto a β-actina. Los experimentos en tejido incluyeron n = 3 animales por grupo. Los datos se presentan como media ± DE. La significancia estadística se determinó mediante comparación con el grupo control. *P < 0,05, **P < 0,01 y ***P < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En conjunto, los resultados demuestran que el tratamiento con clopidogrel redujo la viabilidad de las células GES-1, aumentó la apoptosis, alteró la expresión de marcadores relacionados con el estrés del retículo endoplásmico y la apoptosis, y se asoció con lesión de la mucosa gástrica acompañada de niveles elevados de citocinas inflamatorias circulantes en ratas. Estos hallazgos respaldan la hipótesis del estudio de que el tratamiento con clopidogrel está asociado con lesión de la mucosa gástrica y cambios concurrentes en los marcadores relacionados con el estrés del retículo endoplásmico y la apoptosis.
Disponibilidad de datos:
Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y en sus materiales suplementarios. Las secuencias de cebadores utilizadas para la RT-PCR se proporcionan en la Tabla Suplementaria 1. Los datos brutos que respaldan todas las figuras y los paneles individuales de las figuras, incluidos los conjuntos de datos experimentales originales y los archivos fuente, se proporcionan en el archivo suplementario adjunto Datos Brutos (archivo comprimido).
Tabla suplementaria 1. Secuencias de cebadores utilizadas para el análisis de RT-PCR. Se enumeran las secuencias de cebadores directos (F) e inversos (R) utilizadas en este estudio para el análisis de RT-PCR de GAPDH, CHOP, ATF5, Bcl-2 y Bax en orientación 5′–3′.Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discusión
El clopidogrel se utiliza ampliamente para la prevención y el tratamiento de enfermedades cardiovasculares; sin embargo, su uso clínico se asocia con riesgos de hemorragia y complicaciones gastrointestinales, incluyendo úlceras pépticas, hemorragia y perforación19. Por lo tanto, comprender los cambios moleculares asociados con la lesión gástrica inducida por clopidogrel es importante para mejorar la prevención y el manejo de estos efectos adversos. En el presente estudio, investigamos los efectos del clopidogrel sobre células epiteliales gástricas y tejido gástrico de rata, y observamos cambios en la viabilidad celular, apoptosis, respuestas inflamatorias y la expresión de marcadores relacionados con el estrés del retículo endoplásmico y la apoptosis. Estos hallazgos sugieren que la lesión de la mucosa gástrica inducida por clopidogrel está asociada con alteraciones en la expresión de marcadores relacionados con el estrés del retículo endoplásmico y la apoptosis. Sin embargo, dado que no se realizaron experimentos farmacológicos de rescate ni experimentos genéticos de pérdida de función, estos hallazgos no establecen una relación causal entre el estrés del retículo endoplásmico y la apoptosis.
Estudios previos han indicado que el clopidogrel podría deteriorar la reparación de la mucosa gástrica y retrasar la cicatrización de las úlceras gástricas20. En el presente estudio, los ensayos CCK-8 mostraron que el clopidogrel redujo la viabilidad de las células GES-1, y la citometría de flujo demostró un aumento de la apoptosis y alteraciones en la progresión del ciclo celular (Figura 1). Estos hallazgos son coherentes con informes anteriores sobre la apoptosis inducida por clopidogrel en células epiteliales gástricas21. Estas observaciones sugieren que el tratamiento con clopidogrel se asocia con una viabilidad celular epitelial gástrica deteriorada y un incremento de la apoptosis, lo cual podría contribuir a la lesión de la mucosa gástrica11. En el modelo con ratas, la tinción con H&E mostró lesión de la mucosa gástrica tras el tratamiento con clopidogrel (Figura 2A). Los niveles séricos de IL-1β, IL-6 y TNF-α también aumentaron significativamente (Figura 2B–D), lo que indica una respuesta inflamatoria asociada con la lesión de la mucosa gástrica22. Además, los análisis inmunohistoquímicos e inmunofluorescentes mostraron una expresión alterada de marcadores relacionados con el estrés del retículo endoplásmico y la apoptosis en el tejido gástrico de ratas tratadas con clopidogrel en comparación con el grupo control (Figura 3, Figura 4, Figura 5).
CHOP, ATF5, Bcl-2 y Bax son reguladores importantes de las respuestas al estrés celular y de la apoptosis23,24,25,26. En este estudio, el tratamiento con clopidogrel se asoció con un aumento en la expresión de CHOP y ATF5 y con una expresión alterada de Bax y Bcl-2 tanto en células GES-1 como en tejido gástrico de rata (Figura 6). Estos hallazgos indican alteraciones simultáneas en marcadores relacionados con el estrés y la apoptosis. Sin embargo, el presente estudio evaluó únicamente cambios en la expresión y no determinó si estas moléculas median directamente la lesión de la mucosa gástrica inducida por clopidogrel. Asimismo, aunque se observó un aumento en la relación Bax/Bcl-2, el estudio no demostró directamente la activación de la vía mitocondrial de apoptosis. Por lo tanto, estos hallazgos deben interpretarse como asociaciones, más que como evidencia de un mecanismo de señalización causal.
El presente estudio combina un modelo in vivo en ratas con experimentos exploratorios de exposición directa en células GES-1 para evaluar los cambios morfológicos y moleculares asociados con el tratamiento con clopidogrel. El modelo in vivo proporciona la evidencia principal de lesión de la mucosa gástrica, mientras que los experimentos en GES-1 aportan evidencia complementaria sobre las respuestas celulares tras la exposición directa al compuesto original. La combinación de análisis histopatológico, medición de citocinas inflamatorias, inmunohistoquímica, inmunofluorescencia, qRT-PCR y Western blot permite la evaluación integral de los cambios morfológicos y moleculares asociados con la lesión gástrica. Este enfoque experimental podría ser útil para investigar los efectos gastrointestinales de los agentes antiagregantes plaquetarios y para evaluar posibles intervenciones protectoras en estudios futuros.
Se deben reconocer varias limitaciones. El clopidogrel es un profármaco que requiere activación metabólica hepática, mientras que la exposición directa de las células GES-1 al compuesto parental no reproduce este proceso ni refleja completamente la farmacocinética clínica. Además, las concentraciones relativamente altas utilizadas in vitro podrían haber causado citotoxicidad no específica. Por lo tanto, los experimentos con células GES-1 deben considerarse como evidencia exploratoria de las respuestas celulares bajo condiciones de exposición directa. El ensayo CCK-8 no incluyó un control positivo para la viabilidad celular reducida, lo que limita la verificación independiente del desempeño del ensayo. No se investigaron los mecanismos upstream responsables de los cambios relacionados con el estrés del retículo endoplásmico observados, y no se realizaron experimentos con inhibición farmacológica, silenciamiento génico o eliminación génica para determinar si el estrés del retículo endoplásmico regula directamente el equilibrio Bax/Bcl-2 y la apoptosis. Los estudios futuros deberían comparar el compuesto parental con su metabolito activo, incorporar un sistema adecuado de activación metabólica y realizar experimentos de intervención funcional para aclarar estas relaciones. Además, en el ensayo de Annexina V-FITC/PI no se incluyó un control positivo bien establecido que induzca apoptosis. Por lo tanto, aunque el tratamiento con clopidogrel se asoció con un aumento en la población de células positivas para Annexina V en comparación con el control vehicular, el desempeño técnico del ensayo de apoptosis no fue verificado independientemente mediante una condición de control positivo. Los estudios futuros deberían incluir un inductor de apoptosis, como la estaurosporina, en el mismo lote experimental.
En conclusión, el tratamiento oral con clopidogrel provocó lesión de la mucosa gástrica en ratas y se asoció con cambios en los marcadores relacionados con el estrés del retículo endoplásmico y la apoptosis. La exposición directa de las células GES-1 al compuesto madre clopidogrel también redujo la viabilidad celular y alteró los marcadores moleculares relacionados en las condiciones experimentales. Sin embargo, dado que el modelo celular no reproduce la bioactivación hepática y se utilizaron concentraciones relativamente altas, los hallazgos in vitro no pueden extrapolarse directamente a la exposición clínica, y no puede descartarse una citotoxicidad inespecífica. En conjunto, los resultados indican que la lesión de la mucosa gástrica inducida por clopidogrel está asociada con alteraciones en la expresión de marcadores relacionados con el estrés del retículo endoplásmico y la apoptosis, aunque se requieren estudios mecanicistas adicionales para establecer relaciones causales.
Divulgaciones
Declaración de intereses particulares:
Los autores declaran que no tienen intereses financieros competitivos conocidos ni relaciones personales que pudieran haber parecido influir en el trabajo descrito en este estudio.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el proyecto «Investigación Fundamental sobre la Vía de Señalización CHOP/ATF5/Bcl-2 en la Apoptosis de las Células Epiteliales de la Mucosa Gástrica Inducida por Clopidogrel» (Número de Proyecto 2023BWKY009).
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Kit de detección de apoptosis por V-FITC/PI de anexina | Elabscience | E-CK-A211 | Kit para detección de apoptosis |
| Anticuerpo contra ATF5 | Proteintech | 67066-1-AP | Anticuerpo primario |
| Kit de ensayo de proteína BCA | Solarbio | PC0020 | Ensayo de concentración de proteína |
| Anticuerpo contra Bax | Proteintech | 50599-1-AP | Anticuerpo primario |
| Anticuerpo contra Bcl-2 | Proteintech | 26593-1-AP | Anticuerpo primario |
| β-actina, anticuerpo | Proteintech | 66009-1-Ig | Anticuerpo primario |
| Tampón bloqueante | Beyotime | P0252 | Solución bloqueante para inmunotransferencia |
| Kit de recuento celular CCK-8 | KeyGen Biotech | KGA317 | Ensayo de viabilidad celular |
| Kit de síntesis de ADNc | TransGen Biotech | AU341 | Kit de síntesis de ADNc de primera cadena con eliminación de ADN genómico |
| Kit de detección del ciclo celular | Lianke Biotechnology | CCS012 | Kit para análisis del ciclo celular |
| Anticuerpo contra CHOP | Proteintech | 15204-1-AP | Anticuerpo primario |
| Hidrogenosulfato de clopidogrel (Pureza ≥99 %) | Macklin | C874834 | Fármaco experimental |
| Kit cromógeno DAB | Beyotime | P0201M | Sustrato para inmunohistoquímica |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | MedChemExpress | HY-Y0320C | Disolvente |
| Reactivo de quimioluminiscencia mejorado (ECL) | Meilunbio | MA0186 | Sustrato quimioluminiscente |
| Suero bovino fetal (FBS) | Gibco | 10099-141 | Suplemento para cultivo celular |
| Línea celular epitelial gástrica humana GES-1 | iCell Bioscience | iCell-h062 | Línea celular epitelial gástrica humana |
| Kit de tinción con hematoxilina y eosina (H&E) | Beyotime | C0105S | Tinción histológica |
| Anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) | Proteintech | RGAM001/RGAR001 | Anticuerpo secundario |
| Solución de peróxido de hidrógeno | Absin | ABS9333-100mL | Reactivo bloqueante de peroxidasa endógena |
| Kit ELISA para IL-1β | MEIMIAN | MM-0047R2 | Ensayo de citocina sérica |
| Kit ELISA para IL-6 | MEIMIAN | MM-0190R2 | Ensayo de citocina sérica |
| Lector de microplacas | Beijing Liuyi Biotechnology | WD-2102B | Medición de absorbancia |
| Solución de penicilina-estreptomicina | Solarbio | P1400 | Solución de antibiótico |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Servicebio | G4202-500ML | PBS 1× |
| Membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) | Millipore | IPVH00010 | Membrana para inmunotransferencia |
| Diluyente para anticuerpos primarios | Beyotime | P0023A | Diluyente de anticuerpos |
| Marcador de peso molecular proteico | Yeasen | WJ103 | Escala de proteínas preteñidas |
| Mezcla maestra para PCR cuantitativa en tiempo real (SYBR Green) | CWBio | CW3008 | Reactivo para qPCR |
| Tampón de lisis RIPA (Radioimmunoprecipitation Assay) | Solarbio | R0010 | Tampón de extracción de proteínas |
| RNasa A | Lianke Biotechnology | CCS012 | Reactivo para análisis del ciclo celular |
| Medio RPMI-1640 | Servicebio | G4535-500ML | Medio basal de cultivo celular |
| Ratas Sprague-Dawley | Hangzhou Ziyuan Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | N/A | Grado SPF |
| Kit ELISA para TNF-α | MEIMIAN | MM-0180R2 | Ensayo de citocina sérica |
| Kit de extracción de ARN total | TransGen Biotech | ER501-01 | Kit de extracción de ARN |
| Solución de tripsina-EDTA | Solarbio | T1300 | Reactivo de disociación celular |
Referencias
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