Perfilado de fibras elásticas en tejido pulmonar mediante análisis cuantitativos de imagen

Resumen

Aquí presentamos un protocolo que detalla la preparación del tejido para la visualización de fibras elásticas y el perfilado cuantitativo en tejido pulmonar murino. Este método permite una evaluación robusta de la arquitectura tisular, la organización espacial de fibras y la remodelación de la matriz extracelular en condiciones fisiológicas y patológicas.

Resumen

La remodelación de la matriz extracelular pulmonar (MEC) es una característica clave de las lesiones y enfermedades pulmonares. Las fibras elásticas son un componente central de la ECM pulmonar, proporcionando la resistencia y el retroceso necesarios para la función respiratoria normal, y su alteración contribuye a una mecánica tisular deteriorada. Este protocolo describe un flujo de trabajo robusto y reproducible para la preparación y análisis del tejido pulmonar murino, con un enfoque en la visualización y el perfilado cuantitativo de fibras elásticas. Describe métodos optimizados de procesamiento tisular y tinción histológica para preservar y detectar las estructuras de elastina. Además, el protocolo detalla una canalización de análisis de imágenes que permite la evaluación cuantitativa de la abundancia, organización y distribución espacial de fibras elásticas dentro del pulmón. El flujo de trabajo incorpora además la estimación del vector de tinción en QuPath, la deconvolución de color en Fiyi/ImageJ y el análisis de imágenes basado en TWOMBLI para permitir una evaluación cuantitativa de la abundancia de fibras elásticas, ramificación y complejidad de la red. Se incluyen estrategias para la adquisición de imágenes, selección de regiones de interés, optimización de parámetros y control de calidad para garantizar la reproducibilidad y minimizar el sesgo dependiente del usuario. Utilizando este flujo de trabajo, identificamos con éxito alteraciones en la organización de fibras elásticas y en la arquitectura de la red en los pulmones de ratones obesos, demostrando su aplicabilidad para detectar la remodelación de ECM asociada a enfermedades. En conjunto, estos enfoques proporcionan un marco integral para investigar la remodelación de fibras elásticas y su contribución a la arquitectura tisular en condiciones fisiológicas y patológicas. Este método facilita el estudio de los cambios estructurales impulsados por fibroblastos y apoya la comprensión mecanicista de las alteraciones de la ECM subyacentes a las enfermedades pulmonares.

Introducción

Las fibras elásticas son componentes esenciales de la matriz extracelular pulmonar (MEC), compuestas principalmente por elastina y proteínas microfibrilares asociadas que se ensamblan en redes altamente organizadas^{y resistentes.} En el pulmón, las fibras elásticas se disponen a lo largo de los septos alveolares y las estructuras peribronquiales, donde proporcionan la elasticidad y el retroceso necesarios para la mecánica respiratoria^{normal 1,2}. Como uno de los componentes estructurales de ECM más abundantes en tejidos como el pulmón, la aorta y el útero, su integridad es fundamental para mantener la adherencia^{tisular 1,2}. Se ha observado alteración de la organización de las fibras elásticas en diversas enfermedades pulmonares, incluyendo fibrosis, enfisema y enfermedades inflamatorias crónicas, donde la arquitectura alterada de las fibras contribuye a una función pulmonar deteriorada y a propiedades^{mecánicas 2,3}.

El matrisoma pulmonar ha sido caracterizado recientemente, revelando proteínas centrales de ECM como colágenos y lamininas, junto con componentes asociados al matrisoma como citocinas, reguladores de ECM y proteínas asociadas a ECM (por ejemplo, ligandos integrinosos, galectinas^)4,5. Más allá de proporcionar soporte estructural, estos componentes regulan activamente la función tisular y forman nichos especializados que apoyan células residentes y^{migratorias 6,7}. Cabe destacar que estudios recientes han destacado que condiciones metabólicas como la obesidad están asociadas con alteraciones significativas en la organización de las fibras elásticas, vinculando la desregulación metabólica sistémica con cambios en la arquitectura de la ECM pulmonar y la función^{de los fibroblastos 3}. Estos hallazgos subrayan la importancia de entender la remodelación de fibras elásticas como un proceso dinámico y relevante para la enfermedad.

La evaluación convencional de fibras elásticas suele basarse en una evaluación histológica cualitativa, sistemas de puntuación semicuantitativa o mediciones de abundancia de elastina, que proporcionan información limitada sobre la organización de la fibra, conectividad y complejidad^{de la red 8,9}. Aunque estos enfoques son útiles para detectar alteraciones graves en el contenido de elastina, pueden no captar cambios arquitectónicos sutiles asociados a la remodelación tisular. Los análisis cuantitativos basados en imágenes tienen el potencial de superar estas limitaciones al permitir la caracterización objetiva y reproducible de redes de fibras elásticas y facilitar comparaciones entre condiciones y estudios experimentales. Para abordar esto, el protocolo descrito aquí permite un análisis integrado de la organización pulmonar de la ECM con un enfoque específico en la arquitectura de fibras elásticas. Además de los enfoques establecidos para la caracterización^{de ECM 4,5}, este flujo de trabajo incorpora tinción con Elastica y una cadena de análisis^{de 10} imágenes basada en TWOMBLI, optimizada para la arquitectura del tejido pulmonar. Al combinar la tinción con Elastica con análisis cuantitativo de redes, este flujo de trabajo va más allá de la evaluación histológica convencional y permite una caracterización detallada de la abundancia de fibras, fragmentación, organización espacial y complejidad estructural. El protocolo es especialmente adecuado para estudios que investigan fibrosis, enfisema, remodelación pulmonar asociada a la obesidad, enfermedades inflamatorias pulmonares, envejecimiento y otras condiciones caracterizadas por la remodelación extracelular de la matriz pulmonar.

Protocolo

Todos los experimentos con ratones descritos aquí se realizaron conforme a la aprobación del Comité de Ética Animal del estado de Renania del Norte-Westfalia, Alemania (AZ: 81-02.04.2021.A221).

NOTA: Lleva el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, guantes, protección ocular) durante todo el procedimiento.

1. Muestreo y preparación de tejido pulmonar murino

NOTA: Los ratones fueron eutanasiados por sobredosis de isoflurano según las directrices institucionales y gubernamentales antes de la recogida de tejidos.

1. Abre cuidadosamente la cavidad torácica con una incisión en la línea media, luego corta el diafragma a lo largo de su unión y expone suavemente los pulmones.
2. Extirpa todo el pulmón extirpando juntos los lóbulos derecho e izquierdo, cuidando de mantener todos los lóbulos intactos.
3. Colocar los lóbulos pulmonares individualmente en un tubo de 5 mL que contiene 2 mL de formalina neutral tamponada al 10% e incubar durante 15–20 horas a 4 °C.
   NOTA: La fijación preserva la arquitectura tisular para análisis histológicos y de fibras elásticas posteriores. Dado que el objetivo principal de este flujo de trabajo era la visualización y evaluación cuantitativa de la organización de las fibras elásticas, en lugar de análisis morfométricos alveolares, los pulmones no se fijaban en la inflación antes del procesamiento del tejido.
   PRECAUCIÓN: La formalina neutral amortiguada contiene formaldehído, que es tóxico, cancerígeno y puede causar irritación en la piel, los ojos y las vías respiratorias. Manipula formalina en una campana extractora certificada mientras llevas el equipo de protección personal adecuado, incluyendo guantes, bata de laboratorio y gafas de seguridad.
4. Incrustar el tejido pulmonar fijo en parafina usando un protocolo histológico estándar¹¹.
   NOTA: Asegurar la deshidratación completa y la infiltración de parafina para mantener la morfología tisular para la posterior tinción. Para minimizar la variabilidad entre muestras y garantizar la compatibilidad entre condiciones experimentales, utiliza siempre los mismos lóbulos pulmonares en cada análisis. Se recomienda usar el lóbulo izquierdo para histología.
5. Corta tejido pulmonar FFPE en secciones de 5–7 μm de grosor usando un microtomo y móntalas sobre portaobjetos de vidrio estándar. Hornear las láminas a 60 °C durante 1 hora antes de proceder con las aplicaciones aguas abajo. Los portaobjetos pueden almacenarse en RT en un ambiente libre de polvo durante varias semanas o a 4 °C para almacenamiento a largo plazo.
   NOTA: Evita la exposición a humedad durante el almacenamiento, ya que la humedad puede causar oxidación de parafina y comprometer la calidad de las manchas. Guarda los portaobjetos en una caja plástica sellada con desecante si se necesita almacenamiento a largo plazo.
   Punto de pausa: Guarda las láminas a RT o 4 °C hasta que se teñen.

2. Tinción de fibras elásticas

1. Realizar tinción con Elastica (resorcina-fucsina) en secciones de tejido pulmonar embebido con parafina de 5–7 μm para visualizar fibras elásticas dentro de las estructuras alveolares y vasculares.
   NOTA: Solo teñir tantas láminas como sea posible manipular simultáneamente para asegurar una intensidad y reproducibilidad de tinción consistentes entre muestras.
   1. La deparaffinata se desliza sumergiendo las láminas en xileno (isómeros mixtos) dos veces durante 5 minutos cada una.
      PRECAUCIÓN: El xileno es tóxico e inflamable. Maneja con una campana extractora química y usa el equipo de protección adecuado.
   2. Rehidrata las láminas en una serie descendente de etanol hasta un 80% de etanol.
      1. Incuba el portaobjetos durante 3 minutos en RT en una cámara de tinción llena de etanol al 100%.
      2. Transfiere el portaobjetos a etanol fresco al 100% e incuba 3 minutos en RT.
      3. Transfiere la lámina al etanol al 95% e incuba durante 3 minutos en RT.
      4. Transfiere la lámina al 80% de etanol e incuba durante 3 minutos en RT.
   3. Transfiere la lámina a una nueva cámara de tinción que contenga solución de Resorcina-Fucisina e incubar durante 20–30 minutos en RT.
      NOTA: La solución de tinción de resorcina-fucisina puede usarse varias veces y es estable en RT.
      PRECAUCIÓN: La solución de tinción de resorcina y fucsina contiene sustancias químicas potencialmente peligrosas, incluyendo ácidos concentrados y colorantes, que pueden causar irritación en la piel y los ojos. Manipula la solución en un área bien ventilada o en una campana extractora y lleva el equipo de protección individual adecuado según las directrices de seguridad institucional.
   4. Coloca el portaobjetos en una cámara de tinción bajo agua destilada corriendo y lávalo durante 1 minuto.
   5. Diferenciar en etanol al 95–96%: 15–60 s, monitorizar bajo el microscopio.
      NOTA: Cese cuando las fibras elásticas permanecen de un violeta púrpura intenso y el fondo esté adecuadamente despejado. Las fibras elásticas teñidas aparecen de un púrpura oscuro. Las fibras de colágeno permanecen intactas y suelen parecer pálidas. El exceso de manchas puede aumentar el fondo; Ajusta el tiempo de incubación según el grosor y la fijación del tejido.
   6. Detener la diferenciación transfiriendo el portaobjetos inmediatamente a agua bidestilada y enjuagándolo durante 30 segundos. Opcional: Se puede realizar contratinción si es necesario para una evaluación pulmonar adicional, pero puede reducir la eficiencia de segmentación de fibras. Recomendamos realizar tinciones H&E para evaluar el pulmón en los cortes adyacentes.
   7. Deshidrata las láminas secuencialmente en etanol al 95% durante 1–2 minutos, seguido de etanol al 100% dos veces durante 1–2 minutos cada una para eliminar el agua residual.
   8. Despeja las secciones en xileno 2 veces durante 3 minutos hasta que el tejido parezca ópticamente transparente.
   9. Montar las cubiertas usando una resina sintética permanente compatible con xileno y permitir que las láminas se sequen planas en RT.
      NOTA: La deshidratación y limpieza completas son esenciales para evitar la turbiedad y asegurar la conservación a largo plazo de las zonas manchadas.
      Punto de pausa: Guarda las láminas montadas con teñido en RT hasta la imagen.

3. Imagen de fibra elástica y análisis de redes

1. Adquisición de imágenes
   1. Obtén imágenes de campo claro de alta resolución de secciones de tejido pulmonar usando un escáner de diapositivas con un objetivo del 40×. Asegúrate de que la exposición y el balance de blancos sean consistentes en todas las muestras.
      NOTA: Las imágenes se obtuvieron utilizando configuraciones idénticas del escáner durante todo el estudio, incluyendo aumento, resolución espacial (0,25 μm/píxel), iluminación y exposición.
   2. Dibuja una región de interés (ROI) que abarque toda la sección del tejido pulmonar para asegurar una cobertura completa durante la exploración.
   3. Define un área de referencia de fondo sin tejido para medir y restar la intensidad del fondo durante el análisis de la imagen.
   4. Utiliza la detección automática de enfoque del escáner para asignar un número óptimo de puntos focales en el tejido, asegurando una nitidez y calidad de imagen uniformes.
   5. Adquiere la imagen usando una iluminación y ajustes de exposición uniformes.
      NOTA: Si el enfoque automático falla en regiones densas o desiguales, utilice ajuste manual de enfoque fino para asegurar que todas las estructuras tisulares, incluidas las áreas alveolares y vasculares, estén captadas con precisión.
2. Deconvolución de imágenes: estimación del vector de tinción en QuPath¹². Los vectores de tinción representan los valores específicos de absorbancia RGB de cada tinte histológico, permitiendo la separación de tintes superpuestos durante la deconvolución de color.
   NOTA: En este protocolo, los vectores de tinción se definieron en QuPath, ya que los vectores de tinción predefinidos para resorcina-fucisina no están disponibles en Fiyi.
   1. Abre la imagen en QuPath y selecciona el tipo de imagen de campo claro.
      NOTA: Para minimizar el sesgo, calcular los vectores de tinción usando imágenes representativas del conjunto de datos y aplicar los mismos valores a todas las imágenes.
   2. Dibuja una región de interés (ROI) que contenga predominantemente fibras elásticas para definir el primer componente de tinción.
   3. En la pestaña Imagen, navega a las secciones del vector de tinte.
   4. Haz clic en Tinte 1, luego configura el vector de tinción desde el ROI para definir el vector de color para fibras elásticas (normalmente púrpura-violeta).
   5. Selecciona un ROI que contenga tejido no elástico (por ejemplo, fondo o colágeno) y haz clic en tinción 2, luego establece el vector de tinción desde el ROI para definir el componente de color secundario.
   6. QuPath calcula automáticamente el Tinte 3, correspondiente al fondo.
   7. Un ejemplo de vectores calculados y aplicados en Fiyi: Resorcin-Fuchsin R:0.6201225, G:0.6541292, B:0.43308553; Señal inespecífica R:0.31585205; G:0.815618; B:0.48477295; Antecedentes R:-0.105005614, G:-0.4780256, B:0.87204665.
      NOTA: Estos valores se teñieron solo para imágenes teñidas solo con resorcina-fucsina. Si hay una contratinción presente, hay que calcular nuevos vectores de tinción.
   8. Guárdalos como vectores de tinción personalizados y aplícalos para una deconvolución de color consistente en todas las muestras.
      NOTA: Definir vectores de tinción personalizados a partir de regiones representativas mejora la precisión de la deconvolución de color, especialmente para la tinción de resorcina-fucsina, donde los tonos de elastina y fondo pueden variar entre lotes.
3. Deconvolución de color de imagen en Fiji^13,14.
   1. Abre Fiji (ImageJ) y carga la imagen del campo claro de la sección de tejido teñido.
   2. Opcional: Transforma la imagen a formato RGB (Tipo → imagen → color RGB) solo si la imagen no está ya en RGB (por ejemplo, imágenes de 8 bits). Este paso abre una nueva ventana de imagen; Guárdalo para preservar los datos originales en bruto.
   3. Realiza la deconvolución de color seleccionando Imagen > Deconvolución de color > color > valores de usuario.
   4. Aquí entra el vector de tinción personalizado que se obtuvo previamente de QuPath.
   5. Ejecuta el plugin para generar tres imágenes en escala de grises separadas correspondientes a fibras elásticas, tejido excluyendo fibras elásticas y fondo.
   6. Usa imágenes directamente para TWOMBLI sin preprocesamiento adicional. TWOMBLI requiere imágenes nítidas con resolución suficiente; se debe evitar el suavizado (por ejemplo, desenfoque gaussiano) para preservar los detalles estructurales.
      NOTA: Asegúrese de que las regiones seleccionadas en QuPath para la estimación vectorial sean representativas de la tinción típica, ya que estos vectores personalizados se aplicarán de forma uniforme en todas las imágenes para una comparación consistente.
   7. Guarda el canal de fibra elástica como archivo TIFF para cuantificación y análisis posteriores.
4. Selección de ROI para análisis de fibra
   1. Para cada sección pulmonar, selecciona cinco ROI cuadrados no sesgados en la región alveolar y cinco ROI en la región peribronquiolar (100 μm x 100 μm cada uno).
   2. Duplica cada ROI en la imagen raw (Imagen > Duplicar) para preservar los datos originales.
   3. Duplica los mismos ROIs en el análisis de fibras elásticas desconvolutas.
   4. Guarda todos los ROIs duplicados como archivos TIFF individuales para análisis posteriores.
      NOTA: Se excluyeron del análisis las regiones que contenían pliegues tisulares, artefactos de sección, desgarros, grandes vasos sanguíneos o arquitectura alveolar mal conservada. Solo los ROI de fibra elástica deconvoluzada se usaron como entrada para el análisis TWOMBLI, mientras que los duplicados de imágenes en bruto correspondientes se conservaron como archivos de referencia para el control de calidad y la inspección visual. Las regiones de interés (ROI) deben seleccionarse mediante muestreo aleatorio sistemático para asegurar una representación imparcial del tejido. Para minimizar aún más el sesgo del operador, se proporciona un script automatizado de selección de ROI compatible con QuPath en el Archivo Suplementario 1 y el Archivo Suplementario 2, y su implementación se describe en la Sección 3.5.
5. Aplicar la selección automatizada de ROI en QuPath usando un script automatizado de selección de ROI.
   1. Abre la imagen en QuPath y pon el tipo de imagen en Brightfield.
   2. Desde el menú de herramientas , selecciona la herramienta de anotación deseada para crear las anotaciones iniciales. Se recomiendan anotaciones cuadradas.
   3. Dibuja anotaciones cuadradas dentro del tejido pulmonar. Cada anotación debe abarcar solo una región de interés (ROI) para su análisis, ya sea una región alveolar o un área peribronquial.
   4. Una vez creadas las anotaciones, navega a Anotaciones y selecciona Anotaciones de bloqueo para evitar movimientos o modificaciones accidentales.
   5. Añade las clases "alvéolos" y "área peribronquial" a la lista de clases haciendo clic en el botón "+" junto a Lista de clases en el panel de anotaciones.
   6. Asigna cada anotación a la clase correspondiente. Selecciona una anotación, elige la clase correspondiente y haz clic en Establecer seleccionada. El color de la anotación cambiará y la clase asignada ("alvéolos" o "área peribronquial") se mostrará en el panel de propiedades de anotación.
   7. Abre el script correspondiente y ejecútalo. Al completarse, un mensaje indicará que los ROIs se han generado con éxito. Los ROI recién creados aparecerán en la jerarquía de anotaciones como anotaciones hijos de la anotación original que define la clase.
   8. Para exportar los ROIs, seleccionalos y navega a Archivo → Exportar Imágenes → Píxeles Originales. Guarda los retornos de inversión exportados como archivos TIFF.
      NOTA: Las prescripciones están diseñadas para reconocer solo los nombres de clase "alvéolos" y "área peribronquial". Estos nombres deben introducirse exactamente como se especifica. Por defecto, los scripts generan aleatoriamente cinco ROIs cuadrados no solapados que miden 100 μm × 100 μm dentro de cada anotación. Los ROI de los candidatos solo se aceptan si sus esquinas y centro están completamente contenidos dentro de los límites de anotación, asegurando la inclusión completa dentro de la región seleccionada. Tanto el número como las dimensiones de los ROI pueden modificarse dentro del script para adaptarse a requisitos experimentales específicos. Se recomiendan al menos tres réplicas biológicas y un mínimo de cinco ROIs por muestra para los análisis.
6. Análisis de TWOMBLI
   1. Guarda todas las imágenes de ROI de fibras elásticas en una carpeta dedicada para su análisis.
   2. Crea dos subcarpetas dentro del directorio de trabajo: a. Carpeta de máscaras – para máscaras binarias generadas por TWOMBLI. b. carpeta HDM – para imágenes de matriz de alta densidad (HDM) generadas por TWOMBLI.
   3. Ejecuta el plugin TWOMBLI: Open Fiji y lanza TWOMBLI (Plugins -> Macros -> Run).
   4. Selecciona el archivo de parámetros de análisis apropiado. Los siguientes parámetros TWOMBLI se utilizaron para el análisis de fibras elásticas, listados en la Tabla 1.
      NOTA: Estos parámetros pueden variar según la intensidad de la tinción. Los parámetros se optimizaron empíricamente utilizando múltiples imágenes representativas de secciones de tejido pulmonar teñidas bajo condiciones estandarizadas. La optimización se realizó comparando las máscaras generadas con el patrón de tinción original y seleccionando los ajustes que proporcionan la mejor superposición entre la máscara segmentada y la red subyacente de fibra elástica. Una vez establecida, se aplicaron los mismos parámetros a todas las imágenes dentro del conjunto de datos.
   5. Elige la opción "fibras oscuras sobre fondo claro".
   6. Genera y guarda máscaras binarias en la carpeta Mask.
   7. Genera y guarda imágenes binarias en la carpeta HDM.
   8. Extrae parámetros cuantitativos de la red como longitud de la fibra, puntos de rama, curvatura, densidad y alineación.
      NOTA: El análisis TWOMBLI requiere imágenes nítidas y de alta resolución (>1 píxel/μm). Una mala deconvolución de color, regiones desenfocadas o compresión de imagen pueden comprometer la precisión de la cuantificación de la red de fibra.
7. Cuantificación y análisis estadístico
   1. Exportar parámetros de red TWOMBLI como archivo CSV.
   2. Importa los datos CSV en bruto en GraphPad Prism para análisis estadístico y visualización.
      NOTA: Se recomienda el siguiente parámetro: Enmascarar la longitud total, que refleja la cantidad total de fibras elásticas dentro del ROI, permitiendo cuantificar la abundancia y pérdida de fibras. Extremos de la fibra indica el grado de fragmentación de la fibra; un mayor número de puntos finales sugiere fibras alteradas o rotas. Los Puntos de Ramificación de la Fibra miden lo interconectadas que están las fibras, reflejando la complejidad estructural e integridad de la red ECM. Un mayor número de puntos de ramificación indica una red más compleja e interconectada. La lacunaridad cuantifica la homogeneidad de la distribución de fibras a lo largo del ROI. Una lacunaridad baja indica una red uniforme con huecos de tamaño similar, mientras que una lacunaridad alta refleja una red heterogénea con tamaños variables de brechas que describen una estructura más compleja. La dimensión fractal de conteo de cajas captura la complejidad de la arquitectura de fibra. Valores de dimensión fractal más altos indican redes más intrincadas y detalladas, mientras que valores más bajos reflejan estructuras más simples o perturbadas.
   3. Genera gráficos columnas que muestren la media ± SEM para cada parámetro cuantificado de la red (por ejemplo, longitud de la fibra, ramificación, curvatura y densidad).
   4. Normalidad de datos de prueba usando la prueba de Shapiro-Wilk. Para datos paramétricos, aplica una prueba t de Student no emparejada de dos colas. Para datos no paramétricos, aplica una prueba Mann-Whitney U. Para comparaciones que involucren a más de dos grupos experimentales, debe aplicarse un análisis unidireccional de varianza (ANOVA) seguido de una prueba de comparación múltiple post hoc adecuada, o una prueba de Kruskal–Wallis para datos no paramétricos.
      NOTA: Mantén todos los archivos CSV en bruto sin alterar para garantizar la reproducibilidad y la trazabilidad de los datos. Informa el número de retornos de inversión y réplicas biológicas analizadas para cada condición en las leyendas de las figuras.

Resultados

Este protocolo proporciona parámetros cuantitativos de la red de fibras elásticas a través de diferentes regiones pulmonares y condiciones experimentales. El análisis TWOMBLI, como se describió anteriormente, proporciona parámetros como la longitud de la fibra, densidad de ramificación, lacunaridad y dimensión fractal para la evaluación de matriz^{extracelular 10}. A partir de este marco, nuestro enfoque permite una caracterización integral de la organización de las fibras elásticas, permitiendo evaluar los cambios en la abundancia, conectividad, uniformidad y complejidad estructural tanto en los tejidos pulmonares fisiológicos como patológicos.

En el tejido pulmonar sano, las fibras elásticas forman redes largas, continuas y bien alineadas a lo largo de los tabos alveolares y las estructuras peribronquiales. En cambio, los pulmones patológicos o metabólicamente alterados, como los de ratones obesos, suelen mostrar un aumento de ramificación y una mayor complejidad de la red, reflejando alteraciones en la organización de las fibras^{elásticas 3}. Las salidas representativas, incluyendo máscaras binarias y parámetros cuantitativos, se representan en la Figura 1A y B. Estos resultados pueden integrarse con análisis histológicos y moleculares para evaluar la integridad de la ECM y el grado de^{remodelación 3}. La lacunaridad y el relleno de huecos se ejemplifican en tejido pulmonar sano para visualizar diferencias en la organización de la ECM (Figura 1C). En combinación con otras métricas cuantitativas, estos parámetros capturan la complejidad de la red y revelan cambios en la arquitectura tisular impulsados por la reorganización de la ECM, proporcionando información sobre patrones distintos de remodelación estructural dentro de la red de fibras elásticas.

La interpretación precisa de estos resultados cuantitativos depende críticamente de la adquisición y procesamiento de imágenes de alta calidad. Condiciones de imagen o procesamiento subóptimas, incluyendo enfoque deficiente, iluminación inconsistente o estimación inexacta del vector de tinción, pueden resultar en máscaras fragmentadas o ruidosas y, en consecuencia, en resultados cuantitativos poco fiables (Figura 1D). Por ello, una inspección visual cuidadosa de las imágenes en bruto y los resultados de segmentación es esencial para garantizar la calidad de los datos antes de la interpretación. Las máscaras subóptimas suelen reconocerse por fragmentación excesiva de fibras continuas, segmentación discontinua o incompleta, incorporación de ruido de fondo como estructuras de fibra, o mala superposición entre el patrón de tinción original y la máscara generada, lo que indica que deben reevaluarse los parámetros de adquisición de imagen, estimación del vector de tinción o segmentación. Para ilustrar estas características, se analizaron intencionadamente secciones con contratinción, lo que interfiere con la identificación de fibras elásticas y resulta en una segmentación subóptima. Un ejemplo de una máscara de baja calidad se muestra en la Figura 1E. Para evaluar aún más la robustez y reproducibilidad del flujo de trabajo, dos investigadores analizaron de forma independiente conjuntos de datos de imágenes utilizando los mismos parámetros optimizados de análisis (Figura 2A). Además, se incluyeron muestras derivadas de animales independientes para evaluar la variabilidad biológica (Figura 2B). Se obtuvieron resultados cuantitativos comparables entre operadores y réplicas biológicas, apoyando la reproducibilidad e independencia del usuario de la cadena de análisis de imágenes propuesta. En conjunto, estos análisis demuestran que el flujo de trabajo permite una evaluación robusta de la organización de las fibras elásticas y facilita la comparación entre condiciones fisiológicas y patológicas.

Figura 1. Flujo de trabajo de análisis de tinción elástica. (A) Imagen representativa en bruto, señal de fibra elástica aislada obtenida por deconvolución de imagen, máscara binaria generada usando TWOMBLI y superposición de las fibras elásticas originales con la máscara correspondiente, demostrando segmentación precisa. (B) Parámetros cuantitativos representativos generados por el análisis de TWOMBLI. (C) Ejemplos de análisis de lacunaridad y relleno de huecos en tejido pulmonar murino sano para ilustrar diferencias en la organización de la matriz extracelular. (D) Ilustración de máscaras fragmentadas y ruidosas resultantes de una adquisición o procesamiento de imágenes subóptimo. (E) Sección tisular contra-teñida con hematoxilina y eosina, demostrando una identificación deficiente de fibras elásticas y una generación de mascarillas subóptima. Se indican áreas que muestran una mala correspondencia entre el patrón original de tinción y la máscara generada. Barra de escala A, D = 100 μm, E = 50 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2. Reproducibilidad y robustez del flujo de trabajo de análisis de fibras elásticas. (R) Los conjuntos de datos de imágenes fueron analizados de forma independiente por dos investigadores utilizando parámetros de análisis TWOMBLI para evaluar la reproducibilidad entre operadores. Se muestran métricas cuantitativas derivadas de TWOMBLI. A y B indican los dos operadores independientes. (B) Se analizaron muestras derivadas de animales independientes para evaluar la variabilidad biológica. Se muestran métricas cuantitativas derivadas de TWOMBLI, que demuestran resultados comparables entre réplicas biológicas y apoyan la robustez de la cadena de análisis. M1, M2 y M3 indican animales sanos individuales. n = 3, El análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Parámetros	Valores
Saturación de contraste	0.75
Ancho mínimo de línea	5
Ancho máximo de línea	10
Ventana de curvatura mínima	20
Ventana de curvatura máxima	80
Longitud mínima de rama	10
Pantalla HDM Maximun	175
Diámetro mínimo de la brecha	0

Tabla 1: Resumen de los parámetros cuantitativos derivados de TWOMBLI. Visión general de los parámetros generados por TWOMBLI y su interpretación para la evaluación de la arquitectura de fibras elásticas en tejido pulmonar. Las métricas incluyen medidas de abundancia de fibra, ramificación, alineación, conectividad y organización de la red.

Archivo suplementario 1: Alvéolos de retorno imparcial por favor haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 2: ROI imparcial área peribronquial. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo robusto y reproducible para investigar la arquitectura de la matriz extracelular pulmonar murina (ECM), con especial atención a la remodelación de fibras elásticas impulsadas por fibroblastos. Las fibras elásticas son esenciales para mantener la adherencia pulmonar y el retroceso, y su alteración es una característica distintiva de múltiples enfermedades pulmonares, incluyendo fibrosis, lesiones pulmonares, envejecimiento y trastornos^{metabólicos 2}. A pesar de su papel funcional central, la evaluación cuantitativa de la organización y ensamblaje de fibras elásticas ha seguido siendo limitada. El flujo de trabajo cubre esta carencia permitiendo una caracterización sistemática y cuantitativa de la arquitectura de redes de fibra elástica.

Una de las principales fortalezas de este método radica en integrar un flujo de trabajo de imagen cuantitativa con el análisis histológico estructural. Aunque los enfoques convencionales suelen evaluar la composición o las características histológicas de la ECM por separado, este protocolo permite la cuantificación objetiva de la organización de fibras elásticas, incluyendo la longitud de la fibra, el ramificado y la complejidad de la red. Esto permite la comparación directa entre condiciones fisiológicas y patológicas y proporciona información sobre la remodelación de ECM mediada por^{fibroblastos 3}.

Sin embargo, varios aspectos técnicos son fundamentales para garantizar la consistencia experimental y la calidad de los datos. La tinción por resorcina–fucisina es sensible a variables como el tiempo de fijación, el grosor de la sección y la consistencia del reactivo, por lo que la estandarización es esencial para la reproducibilidad. Los resultados cuantitativos de TWOMBLI dependen de la calidad de imagen, la resolución y la selección consistente de la región de interés, por lo que deben interpretarse junto con la evaluación histológica y validarse en múltiples muestras. Además, la densidad y morfología de las fibras difieren entre regiones alveolares y peribronquiales, requiriendo optimización específica de cada región. Este enfoque captura la organización global de la red de fibras elásticas en dos dimensiones y no resuelve características ultraestructurales, que requieren técnicas de mayor resolución como la microscopía electrónica. Las modalidades de imagen tridimensional, incluyendo microscopía confocal o multifotónica, pueden mejorar aún más el análisis de la geometría y conectividad de las fibras.

Varios pasos dentro del flujo de trabajo son especialmente críticos para garantizar resultados fiables y reproducibles. La fijación del tejido, la calidad de la sección y la tinción constante de resorcina-fucisina influyen sustancialmente en la visualización de fibras elásticas y, por tanto, deben estandarizarse cuidadosamente.  Una baja intensidad de tinción, una tinción desigual o un fondo alto pueden deberse a una calidad variable de los reactivos, condiciones de tinción inconsistentes o una conservación inadecuada del tejido. Además, se recomienda la inclusión de tejidos pulmonares sanos y enfermos, controles técnicos de tinción y muestras de referencia procesadas en lotes experimentales para monitorizar la consistencia de la tinción y la robustez analítica. Los tejidos ricos en fibras elásticas pueden servir además como controles positivos para validar los procedimientos de adquisición y segmentación de imágenes. La estimación precisa del vector de tinción durante la deconvolución de la imagen es otro paso esencial, ya que la selección inadecuada de vectores puede llevar a una extracción incompleta de fibras y a máscaras fragmentadas. Dependiendo de la pregunta experimental, el flujo de trabajo puede modificarse ajustando el tamaño y el número del ROI, adaptando parámetros de procesamiento de imágenes o integrando enfoques de imagen tridimensional para investigar más a fondo la organización de fibras elásticas.

En conjunto, este método representa una plataforma versátil para estudiar la remodelación de la ECM tanto en contextos fisiológicos como patológicos. Como la integridad de las fibras elásticas está directamente vinculada a la adherencia pulmonar y a la función mecánica, este enfoque es especialmente importante para entender cómo los cambios estructurales en la ECM se traducen en alteraciones en la función pulmonar. Es muy adecuado para investigar cambios estructurales impulsados por fibroblastos y ofrece nuevas oportunidades para comprender mejor la remodelación de la ECM y su contribución a la progresión de la enfermedad y la función tisular. El enfoque también puede extenderse a otros tejidos, incluyendo tejidos cardiovasculares, piel, útero, trastornos del tejido conectivo, órganos fibróticos y muestras humanas, o combinarse con técnicas avanzadas de imagen espacial y de alta resolución para ampliar aún más su aplicabilidad.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Axio CS2 Slide Scanner	Carl Zeiss
Coplin Glass Staining jar	Sigma-Aldrich	S6016
DPX Mountant	Sigma-Aldrich	6522
Ethanol (100%) for histology	Carl Roth	9065.4
Fiji		https://imagej.net/software/fiji/	version 1.54t
Formalin solution, neutral buffered 10%	Sigma	HT501128
HISTOSETTE I Tissue Processing/Embedding Cassettes	Sigma-Aldrich	H0542
microtome	Thermo Fischer Scietific	HM355S
Micrsocope Slides	VWR	631-0108
Mouse: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:000664	Strain #:000664
paraffin embedding system	Epredia HistoStar embedding module
Prism		https://www.graphpad.com	version 11
Qupath		https://qupath.github.io	version 0.7.0
Resorcin-Fuchsin	Waldeck	2.00E-30
TWOMBLI plugin		https://github.com/wershofe/TWOMBLI
Xylene	Applichem GmBH	14020172