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Artículo de investigación
El presente estudio tiene como objetivo aclarar la relación entre el polimorfismo miR-146a rs2910164 y la susceptibilidad a la rinitis alérgica (RA). Niveles plasmáticos más bajos de miR-146a y el genotipo GG del rs2910164 se asocian con un mayor riesgo de RA, respuestas inflamatorias potenciadas y manifestaciones clínicas más graves en pacientes con RA.
La rinitis alérgica (RA) no representa una amenaza para la vida de los pacientes, pero afecta gravemente su calidad de vida. El microARN-146a (miR-146a) es fundamental para la regulación inmunitaria y las respuestas inflamatorias; sin embargo, la relación entre el polimorfismo miR-146a rs2910164 y la susceptibilidad a la RA aún no se comprende completamente. Este estudio de casos y controles se diseñó para investigar la influencia del polimorfismo miR-146a rs2910164 en la susceptibilidad a la RA. El estudio incluyó un total de 180 voluntarios sin RA y 211 pacientes con RA. La expresión de miR-146a en plasma se midió mediante RT-qPCR; el genotipo rs2910164 se detectó utilizando el método TaqMan-qPCR. Se empleó ELISA para detectar los niveles séricos de IgE, IL-4, IL-6 e IL-10. El análisis de correlación de Pearson evaluó las correlaciones lineales entre la expresión de miR-146a y la puntuación TNSS, la puntuación RQLQ, así como la concentración de factores séricos. Los factores de riesgo de la RA se identificaron mediante regresión logística. El genotipo GG y el alelo G del polimorfismo miR-146a rs2910164 fueron significativamente más frecuentes en pacientes con RA que en controles sanos. El nivel de miR-146a en plasma se redujo en los pacientes con RA. El nivel de miR-146a en plasma fue menor en los pacientes con RA portadores del genotipo GG, quienes presentaron respuestas alérgicas e inflamatorias más activas. La expresión de miR-146a estuvo estrechamente relacionada con los síntomas alérgicos y la gravedad de las manifestaciones clínicas. La regresión logística indica que los niveles séricos de IgE e IL-4 fueron factores de riesgo independientes para la RA, mientras que la IL-10 y la expresión de miR-146a fueron factores protectores independientes. Se observan bajos niveles de miR-146a en plasma en pacientes con RA, y el genotipo GG del polimorfismo miR-146a rs2910164 incrementa la susceptibilidad a la RA.
La rinitis alérgica (RA) es un trastorno inflamatorio no infeccioso mediado por alérgenos en la mucosa nasal. Los síntomas clínicos típicos de la RA incluyen picazón nasal, congestión nasal, secreción nasal clara y estornudos frecuentes1. En casos más graves, los pacientes también pueden presentar una disminución del sentido del olfato e incluso afectar la calidad del sueño. Datos epidemiológicos indican que la tasa de prevalencia global de RA aumenta año tras año, alcanzando entre el 10% y el 25%2. Aunque la RA no pone en peligro la vida de los pacientes, interrumpe gravemente el sueño, el aprendizaje y el trabajo, reduce significativamente la calidad de vida e impone una carga económica considerable tanto para los individuos como para la sociedad3. El estudio confirmó que la RA actúa como un factor de riesgo para el asma, y a medida que la enfermedad progresa, los pacientes tienen mayor probabilidad de desarrollar sinusitis o pólipos nasales, lo que aumenta aún más la carga de la enfermedad4,5. Por lo tanto, la prevención y el control de la RA se convierten en una tarea clave en el campo de las enfermedades respiratorias. Sin embargo, la patogénesis de la RA aún no se ha elucidado completamente. La exploración profunda del mecanismo fisiopatológico de la RA y el desarrollo de estrategias terapéuticas específicas tienen una importancia crucial. Asimismo, constituyen cuestiones científicas actuales que deben abordarse con urgencia.
El inicio de la rinitis alérgica está relacionado con factores ambientales y genéticos6. La investigación actual sostiene generalmente que el efecto sinérgico de la susceptibilidad genética individual y el entorno de exposición a alérgenos es el factor impulsor principal del inicio de la rinitis alérgica. El equipo de Brozek confirmó además que la interacción entre la susceptibilidad genética del organismo y las exposiciones ambientales es la causa fundamental de la rinitis alérgica2. En el campo de la investigación sobre los mecanismos genéticos de la rinitis alérgica, el polimorfismo genético se ha convertido gradualmente en el foco de atención de los investigadores. Los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), como la forma predominante de polimorfismo genético, son la causa principal de la variación en la información genética de los organismos7. Evidencias crecientes indican que el genotipo TT en el sitio rs7044343 del gen IL-33 podría servir como un objetivo potencial para la prevención y el tratamiento de la rinitis alérgica8. Además, el genotipo TT en el sitio C-159T del promotor del gen CD14 actúa como un marcador predictivo del riesgo de rinitis alérgica9. Esto indica que los SNP clave en genes pueden servir como importantes dianas moleculares para evaluar el riesgo de rinitis alérgica, proporcionar alertas tempranas y lograr una prevención y un tratamiento precisos. Esto ofrece pistas cruciales para comprender más profundamente el mecanismo de susceptibilidad genética de la rinitis alérgica.
Numerosos estudios han revelado que la expresión anormal de microARNs (miARNs) es uno de los factores motores centrales en la aparición y desarrollo de una amplia gama de enfermedades10. Los miARNs poseen la característica de existir de forma estable en los fluidos corporales, lo que los convierte en marcadores moleculares altamente sensibles para el diagnóstico de enfermedades. El miR-146a es un tipo de molécula de ARN no codificante con funciones biológicas amplias11. El polimorfismo rs2910164 se encuentra dentro de la región del tallo-bucle del precursor de la secuencia de miR-146a. La variación en este sitio puede afectar la eficiencia del procesamiento y maduración del pre-miR-146a, alterando así el nivel de expresión del miR-146a maduro e influyendo en las respuestas inmunitarias e inflamatorias descendentes. Estudios previos han confirmado que la sobreexpresión del miR-146a puede reducir significativamente la hiperreactividad de las vías respiratorias en modelos de ratón con asma e inhibir la activación de linfocitos sensibilizados12. Al dirigirse e inhibir la actividad del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), el miR-146a puede aliviar eficazmente el daño inflamatorio de la sinusitis13. Además, la sobreexpresión del miR-146a también puede aliviar los síntomas patológicos del modelo de ratón con rinitis alérgica (AR) al bloquear la vía de señalización del receptor tipo Toll 4 (TLR4)14. Estas observaciones destacan el papel fundamental del miR-146a en la modulación de enfermedades del sistema respiratorio.
La evidencia existente de estudios de polimorfismos genéticos indica que la frecuencia del alelo G en el locus miR-146a rs2910164 está estrechamente relacionada con la hiperreactividad de las vías respiratorias15. Este SNP también se considera un biomarcador potencial del riesgo de asma en la población coreana15. Además, el equipo de Jimenez-Morales reveló que el genotipo CC en el locus miR-146a rs2910164 confiere protección contra el asma16. Sin embargo, no existen estudios relevantes que informen sobre la asociación entre el polimorfismo miR-146a rs2910164 y la susceptibilidad a la rinitis alérgica (AR). Por lo tanto, este estudio tiene como objetivo verificar la influencia del polimorfismo de miR-146a rs2910164 en la AR, aportando una nueva base teórica para la patogénesis, el diagnóstico clínico y el tratamiento de la AR.
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Declaración ética:
Todos los participantes fueron informados completamente sobre el propósito de nuestro experimento y firmaron el formulario de consentimiento informado. Esta investigación fue aprobada por el comité de ética del Hospital Afiliado Longyan de la Universidad Médica de Fujian (Número de aprobación: LYREC2023-k007-01). Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las directrices, regulaciones pertinentes y la Declaración de Helsinki.
Reclutamiento de participantes, criterios de elegibilidad y recopilación de muestras
Un total de 211 individuos diagnosticados con RA y 180 participantes sanos (no RA) fueron reclutados del departamento de otorrinolaringología ambulatoria del Hospital Afiliado Longyan de la Universidad Médica de Fujian entre enero de 2023 y mayo de 2025. Los criterios de diagnóstico para la RA se adoptaron a partir de las Guías de la Sociedad China de Alergia para el Diagnóstico y Tratamiento de la Rinitis Alérgica17. Se requería que los pacientes presentaran no menos de dos síntomas clínicos de RA, incluyendo picazón nasal, estornudos, congestión nasal o rinorrea. Además, el examen de la mucosa nasal debía demostrar palidez y edema, y el resultado de la prueba cutánea de prick (SPT) o la prueba sérica de IgE debía ser positivo. La prueba cutánea de prick se realizó por personal especializado en la sala ambulatoria de pruebas de alérgenos para garantizar la precisión y la consistencia de los resultados. Todos los pacientes con RA completaron el Cuestionario de Calidad de Vida en Rinoconjuntivitis (RQLQ) y la Evaluación del Puntaje Total de Síntomas Nasales (TNSS) con la ayuda del personal médico, y los puntajes se registraron para su posterior análisis.
Se reclutaron como grupo sin RA a voluntarios sanos que se sometían a exámenes físicos de rutina en el hospital. Los participantes elegibles no tenían antecedentes personales ni familiares de RA, ni historial de asma u otras enfermedades alérgicas, ni sinusitis crónica u otras enfermedades inflamatorias de la cavidad nasal, ni infección del tracto respiratorio en el mes anterior. Además, se excluyeron del estudio a individuos con antecedentes de enfermedades graves cardíacas, hepáticas, pulmonares o renales, o de cualquier tumor maligno.
Se recogieron muestras de sangre venosa periférica de los dos grupos de voluntarios. Una porción de la sangre venosa anticoagulada se utilizó para la extracción de ADN y para extraer ARN plasmático. Otra porción de la sangre venosa se separó para obtener suero, el cual se utilizó para la detección de factores relacionados con el suero (inmunoglobulina E (IgE), interleucina-4 (IL-4), IL-6 e IL-10).
Extracción de ADN:
Se extrajo ADN de 200 µL de muestras de sangre venosa periférica utilizando un kit de extracción de ADN genómico de sangre completa (consulte la Tabla de materiales). Las muestras de sangre se recolectaron en tubos anticoagulantes con heparina de litio y luego se alícuotaron y congelaron a -20 °C para su almacenamiento. Los procedimientos operativos específicos deben seguir estrictamente las instrucciones del kit. Finalmente, se utilizaron 100 µL de tampón de elución para eluir el ADN. La pureza de la muestra de ADN extraída se determinó mediante un analizador de ácidos nucleicos/proteínas (espectrofotómetro) (la relación OD₂₆₀/OD₂₈₀ estuvo entre 1,8 y 2,0). Las muestras de ADN tras el análisis se almacenaron a -20 °C para su uso posterior en experimentos de genotipificación.
Detección del genotipo
El kit de genotipificación SNP TaqMan estaba disponible para detectar la distribución de los genotipos miR-146a rs2910164. La información del kit se ha ingresado en la lista de materiales de consumo. El volumen total de reacción de PCR fue de 10 µL, que contenía 5 µL de mezcla maestra, 0,5 µL de mezcla de cebadores y sonda de tipificación, 10 ng de ADN molde y agua libre de RNasa. La amplificación de ADN se realizó utilizando el instrumento de PCR cuantitativa en tiempo real Roche LightCycler 480 II con detección de fluorescencia. Condiciones de la reacción: pre-desnaturalización a 95 °C durante 10 min; 40 ciclos (95 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 1 min), y la lectura de fluorescencia FAM/VIC a 60 °C. Una vez finalizada la amplificación, las señales de doble fluorescencia FAM/VIC recopiladas se analizaron mediante el software LightCycler 480, y los datos de genotipo se procesaron estadísticamente. Una señal única de FAM representa un genotipo homocigoto, una señal única de VIC representa otro genotipo homocigoto, y la presencia de ambas señales indica un genotipo heterocigoto. Las muestras con señales anormales o resultados inconsistentes tras la repetición se volverán a analizar. Cada experimento se realizó incluyendo un control sin molde y un control positivo para control de calidad. Todas las muestras se sometieron a tres réplicas técnicas.
RT-qPCR
La extracción de miARN total del plasma se realizó a partir de 100 µL de plasma utilizando un kit específico para la extracción de miARN. La información del kit se ha ingresado en la lista de material de consumo. La concentración de ARN se determinó mediante un espectrofotómetro. La relación OD₂₆₀/OD₂₈₀ de las muestras de miARN extraídas y calificadas osciló entre 1,8 y 2,0. Se utilizaron 200 ng de ARN para la transcripción inversa y la síntesis de ADNc, siguiendo el procedimiento estándar del kit. La transcripción inversa se llevó a cabo en un volumen total de 20 µL, incluyendo una incubación a 42 °C durante 60 min y una inactivación a 85 °C durante 5 min. La reacción de qPCR se preparó según el protocolo establecido, con un volumen total de 20 µL. La mezcla de reacción se configuró de la siguiente manera: 10 µL de mezcla previa para qPCR, 0,4 µL del cebador directo, 0,4 µL del cebador inverso, 1 µL de la plantilla de ADNc y 8,2 µL de agua libre de RNasas. Se utilizaron cebadores específicos para miR-146a y el gen de referencia interna U6. La amplificación se completó utilizando el instrumento de PCR cuantitativa en tiempo real Roche LightCycler 480 II. Las condiciones del ciclo térmico de qPCR fueron: pre-desnaturalización a 95 °C durante 30 s, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 5 s y hibridación y extensión a 60 °C durante 30 s. Todas las muestras se analizaron por triplicado técnico. Los datos experimentales se analizaron utilizando el software LightCycler 480. Utilizando U6 como referencia interna para corregir la variación entre muestras, primero se calculó ΔCt (el valor de Ct de miR-146a menos el valor de Ct de U6), luego se calculó ΔΔCt (el ΔCt del grupo experimental menos el ΔCt del grupo control), y finalmente se obtuvo el nivel de expresión relativo de miR-146a mediante 2⁻ΔΔCt.
ELISA
Los niveles séricos de IgE, IL-4, IL-6 e IL-10 se detectaron mediante kits de ELISA. Los procedimientos experimentales se basaron en el manual de instrucciones. Los pasos específicos fueron los siguientes: en primer lugar, la solución concentrada de lavado se diluyó, y los estándares se diluyeron de forma gradual para preparar las soluciones de trabajo para la curva patrón. En segundo lugar, se añadieron 50 µL de diluyente, solución estándar y la muestra por analizar a los pocillos y se incubaron a 37 °C durante 60 min. Tras la incubación, los pocillos se lavaron tres veces con tampón de lavado. Posteriormente, se añadieron 50 µL de la solución de trabajo del anticuerpo conjugado con enzima, y las placas se incubaron a 37 °C durante 30 min. Una vez finalizada la incubación, se descartó el líquido y los pocillos se lavaron nuevamente, seguido de la adición de la solución cromógena y una incubación de 15 min a 37 °C en la oscuridad. Tras añadir la solución de parada, se midió la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas. Las concentraciones de las muestras se calcularon según la curva patrón. Cada muestra se analizó tres veces. Se consideraron válidos los datos con un coeficiente de variación inferior al 10 %. Durante el experimento se establecieron pocillos en blanco y pocillos de control para el control de calidad. El rango de detección y la sensibilidad del kit cumplieron con las especificaciones indicadas en el manual del fabricante.
Estadísticas de los datos
Los datos experimentales se analizaron utilizando los programas SPSS y GraphPad Prism 9. Los datos se presentaron como media ± desviación estándar (media ± DE). La prueba de Shapiro-Wilk se utilizó para evaluar la normalidad de las variables continuas, y la prueba de Levene se aplicó para evaluar la homogeneidad de varianza. La comparación de variables continuas entre los dos grupos se analizó mediante la prueba t para muestras independientes. Para comparaciones entre múltiples grupos, se realizó un ANOVA de un factor seguido de la prueba post-hoc de Tukey, y se aplicó un ANOVA de dos factores para evaluar los efectos principales de dos factores independientes y su efecto de interacción. Los valores atípicos se identificaron y excluyeron según la regla de las 3 desviaciones estándar. En este estudio no se detectaron datos faltantes. La curva de característica operativa del receptor (ROC) se utilizó para analizar la eficacia diagnóstica de miR-146a para AR. Se calcularon los parámetros relevantes de la curva ROC y los intervalos de confianza del 95 % mediante algoritmos estadísticos integrados. El análisis de correlación de Pearson se utilizó para medir la correlación lineal entre la expresión de miR-146a y los niveles de factores séricos relacionados. Se realizaron análisis de regresión logística univariante y multivariante para identificar factores de riesgo para AR. Las variables con p < 0,05 en el análisis univariante se incluyeron en el modelo de regresión logística multivariante. Se consideró estadísticamente significativo un valor de p < 0,05.
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Características de los participantes y distribución del genotipo
Se analizaron estadísticamente los datos clínicos basales de los dos grupos de sujetos. Los resultados indicaron que los niveles séricos de IgE, IL-4, IL-6 e IL-10 mostraron diferencias significativas. En comparación con el grupo de voluntarios sin RA, la concentración sérica de IgE, IL-4 e IL-6 en el grupo de pacientes con RA aumentó, mientras que el nivel de IL-10 disminuyó (Tabla 1). La distribución del genotipo de m...
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La rinitis alérgica (RA) es una enfermedad inflamatoria alérgica crónica del tracto respiratorio. El mecanismo fundamental de la RA consiste en que, tras la exposición del organismo a alérgenos, las lesiones inflamatorias en la mucosa nasal están mediadas por IgE17,18. Los síntomas clínicos principales incluyen picazón nasal, congestión nasal, estornudos y secreción nasal clara, que afectan gravemente la calidad de vida de los pacientes. Estudios epidemiológicos ...
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No hay divulgación en este artículo.
Disponibilidad de datos:
Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo como archivo complementario. Las solicitudes adicionales pueden dirigirse al autor correspondiente.
Contribución del autor:
YMY realizó contribuciones sustanciales a la concepción y diseño, adquisición de datos o análisis e interpretación de los datos, e intervino en la redacción del manuscrito. YYH colaboró en la adquisición de datos, análisis de datos y análisis estadístico. GML y JCW contribuyeron con la interpretación de los resultados y revisaron críticamente el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.
No aplicable.
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| tubo cónico de centrífuga de 15 mL | Corning | 430791 | Para la separación de plasma, subembalaje de muestras y extracción de ácidos nucleicos |
| Applied Biosystems TaqMan Genotyping Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4371355 | 2× mezcla maestra concentrada optimizada para genotipificación de SNP, que contiene polimerasa Taq con activación térmica, dNTPs, iones de magnesio, tampón de reacción y colorante ROX de referencia. No requiere preparación manual del sistema. Compatible con el ensayo de genotipificación de SNP TaqMan mencionado anteriormente, proporciona un sistema enzimático estable para la amplificación de SNP y la genotipificación fluorescente con buena reproducibilidad y resultados claros de agrupamiento. |
| Applied Biosystems TaqMan SNP Genotyping Assay (rs2910164, miR-146a) | Thermo Fisher Scientific | C__15946974_10 | Mezcla pre-diseñada de cebadores y sondas para la genotipificación de SNP en el locus miR-146a rs2910164 humano. Contiene cebadores específicos para PCR y dos sondas fluorescentes MGB. La etiqueta VIC marca el alelo C y la etiqueta FAM marca el alelo G. Puede distinguir con precisión los tres genotipos (CC, CG, GG) en un solo tubo de reacción, adecuado para la discriminación alélica en punto final en instrumentos de PCR cuantitativa. |
| Tubos para la recolección de sangre con anticoagulante heparina de litio BD | BD Vacutainer | 367884 | Bioquímica clínica, pruebas de emergencia e investigación en hematología |
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| Kit ELISA de interleucina-10 (IL-10) | Jiancheng | H010-1-2 | Aplicación: Inflamación, regulación inmune, investigación de biomarcadores clínicos |
| Kit ELISA de interleucina-4 (IL-4) | Jiancheng | H005-1-2 | Área de investigación: Inflamación, respuesta inmunitaria Th2, reacción alérgica |
| Kit ELISA de interleucina-6 (IL-6) | Jiancheng | H007-1-2 | Aplicación: Investigación sobre inflamación, regulación inmune y biomarcadores clínicos |
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