Un novedoso método de biopsia a escala permite la recogida de células de leucemia linfoblástica aguda de peces cebra vivos. Los resultados muestran abundantes linfocitos en escamas de peces de tipo salvaje (WT) y un aumento drástico de linfocitos en escamas de peces con LLA (leucemia linfoblástica aguda). Esta técnica permite un estudio mínimamente invasivo de linfocitos epidérmicos normales y malignos.
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Artículo de método
Un método novedoso de biopsia a escala para recoger linfocitos malignos y no malignos de pez cebra
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Resumen
Resumen
El pez cebra (Danio rerio) es un modelo potente para estudiar la linfopoiesis y los cánceres linfóides, ya que el pez cebra y los humanos comparten sistemas inmunitarios adaptativos similares, incluyendo las células B y T. Se describen varios modelos de leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL) de D. rerio , incluyendo peces que expresan MYC humano específico de linfoblastos (hMYC). Informamos que los peces rag2:hMYC también desarrollan leucemia linfoblástica aguda de células B (B-ALL), lo que los hace útiles para estudiar ambos tipos de TODOS los tipos. Una limitación de los modelos de ALL de pez cebra es que no existen métodos no letales para el muestreo serial de ALL. Para abordar esto, fuimos pioneros en un novedoso método de 'biopsia a escala' para recoger TODAS las células de peces cebra vivos. Sin embargo, el conocimiento sobre qué linfocitos residen en las escamas normales del pez cebra es escaso. Así, para definir las identidades normales de los linfocitos epidérmicos, realizamos biopsias a escala en líneas transgénicas marcadas por linfocitos que carecían de rag2:hMYC. Utilizamos microscopía convencional y confocal para analizar escamas, revelando abundantes linfocitos epidérmicos. También analizamos escamas de peces con T- y B-ALL, que mostraron un aumento notable de linfocitos en láminas confluentes de células ALL en muchas escamas. A continuación, utilizamos la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para purificar linfocitos no malignos y TODOS a partir de escalas para estudios ex vivo . Los análisis citométricos de flujo y de expresión de células ALL de escamas u otros tejidos del mismo pez mostraron que la expresión génica de TODAS las células en escala se asemeja a la de las células ALL en otras partes. También cuantificamos el número de células normales T, B, T-ALL y B-ALL que podían purificarse por escala. En general, la biopsia a escala proporciona una técnica mínimamente invasiva y no letal para estudiar linfocitos epidérmicos de pez cebra, permitiendo estudios ex vivo , incluyendo análisis de muestras malignas.
Introducción
Se establece la función barrera de la piel de los mamíferos y sus roles en la inmunidad 1,2,3. Los linfocitos de los mamíferos contribuyen a la inmunidad cutánea, con células T citotóxicas residiendo en la epidermis, y células B, T y natural killer (NK) presentes en ladermis 1,3,4,5. Los peces cebra tienen estos linfocitos, con inmunoglobulinas superficiales, receptores de células T, receptores del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), citocinas y sus receptores, y otras moléculas inmunes, compartiendo así la mayoría de las características inmunológicas de losmamíferos 6,7,8,9. Estudios recientes sobre piel y escamas de pez cebra demostraron diversas poblaciones cutáneas de linfocitos, incluyendo células T y Bepiteliales 10,11, y una red linfoide que facilita el tráfico de células T y la vigilanciade antígenos 12. Las similitudes entre los linfocitos de peces teleósteos y mamíferos hacen de D. rerio un modelo in vivo potente para estudiar la linfopoiesis, la función linfocitiva y las enfermedades linfóides, incluyendo la leucemia linfoblástica aguda (ALL)8,10,13,14,15,16,17,18,19,20.
En nuestro trabajo previo se mostró que tanto los linajes T como B (t-all, b-all) surgen en peces cebra transgénicos rag2:hMYC, lo que hace útil esta línea para estudiar ambos tiposALL 13, 15, 21 y 22. Una limitación importante de los modelos de ALL de D. rerio, especialmente en estudios de expresión longitudinal o estudios de pruebas de drogas, es la falta de métodos para recoger muestras de ALL en serie de animales individuales. Métodos anteriores, como la extracción de sangre retroorbital, son técnicamente complicados debido al pequeño tamaño de D. rerio, lo que dificulta la toma de muestras de sangre enserie 23. Por ello, la mayoría de los investigadores sacrifican pez cebra para obtener TODAS las células. Esto ha sido una práctica común en el laboratorio y en la mayoría del campo, pero impide la posibilidad de realizar experimentos longitudinales en animales vivos. Para superar esto, recientemente describimos linfocitos epiteliales T y B en escamas de pez cebra que se recogieron utilizando una estrategia de biopsia no letalde escamas 10. Otro estudio reciente demostró un reservorio de células T en o cerca de la superficie del pez cebra, entre las escamasadyacentes 12. D. rerio alberga cientos de escamas, que se regeneran rápidamente pocos días después de laretirada 24. En conjunto, estos hallazgos y características indican que las escamas del pez cebra son una fuente de linfocitos que no requieren eutanasia, lo que permite estudios longitudinales en peces vivos.
Aquí describimos un método de biopsia a escala para la recogida de linfocitos epidérmicos de pez cebra de peces con marcadores fluoróforos específicos de linfocitos, con o sin LLA. Para estudiar las células de la línea T, utilizamos peces bien establecidos lck:GFP y una línea similar de lck:mCherry; ambos etiquetan las células T y T-ALL 10,13,15,20. Para estudiar las células de la línea B, utilizamos peces transgénicos cd79a:GFP y cd79b:GFP con células B y B-ALL marcadasfluorescentemente 10,13,17. Cada una de estas líneas permite la visualización mediante microscopía fluorescente y la purificación de células citométricas de flujo13. Examinamos las escamas tras la biopsia, generando imágenes de alta resolución de linfocitos en escamas, identificando la expresión génica epidérmica de linfocitos mediante qRT-PCR, comparándola con la de linfocitos de otros tejidos linfoides del mismo pez y cuantificando linfocitos por escama mediante citometría de flujo y clasificación celular activada por fluorescencia. En resumen, el protocolo describe un método sencillo y práctico para obtener linfocitos de peces cebra vivos, incluyendo muestreos individuales de animales longitudinalmente a través de múltiples puntos temporales en una secuencia experimental. Este método está destinado a estudiar la biología de los linfocitos del pez cebra, la progresión de la leucemia, las respuestas a fármacos u otros diseños experimentales longitudinales que requieran muestreos repetidos de peces cebra individuales. Desarrollamos el protocolo utilizando peces cebra transgénicos adultos con poblaciones de linfocitos marcadas fluorescentemente y lo validamos para aplicaciones posteriores, incluyendo microscopía de fluorescencia, citometría de flujo/clasificación celular activada por fluorescencia, análisis de expresión de ARN y otros estudios ex vivo que requirieron linfocitos viables.
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Protocolo
Todos los procedimientos animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Oklahoma (protocolos 24-028-EAH y 25-068-CHACHA). Este protocolo presenta un enfoque para aislar y analizar linfocitos normales y/o malignos de las escamas de peces cebra vivos, con detalles sobre el propósito, la ejecución y los principios que subyacen a estos procedimientos.
PRECAUCIÓN: MS-222 es un anestésico químico peligroso y debe manejarse con el equipo de protección individual (EPP) adecuado, como guantes de laboratorio, protección ocular y bata de laboratorio. Deshacerse de las soluciones MS-222 cumpliendo con las directrices institucionales de residuos químicos. Ten precaución al manipular agujas y pinzas para evitar lesiones punzantes. Considerar todas las muestras biológicas potencialmente biopeligrosas y eliminar los residuos de acuerdo con los procedimientos institucionales de bioseguridad.
1. Preparación de medios de clasificación
- Suplementa 1× solución de medio RPMI 1640 con suero fetal bovino (FBS) al 1% y 1% penicilina/estreptomicina.
NOTA: Los medios RPMI 1640 mantienen la viabilidad linfocitaria ex vivo. El RPMI 1640 puede ser reemplazado por un PBS de 0,9×. El suero bovino fetal (FBS) suministra factores de crecimiento para promover la viabilidad celular. La penicilina y la estreptomicina limitan la contaminación bacteriana. - Medios alicuotas en tubos microcentrífugas de 1,5 mL en volúmenes de 500 μL, con cada tubo destinado a escalas de 10 a 20 grados. Mantén los tubos de clasificación sobre hielo.
2. Anestesia de pez cebra, cribado de microscopía de fluorescencia e imagen
- Anestesiar D. rerio con metanosulfonato de tricaína al 0,02% tamponado preparado según las directrices institucionales de cuidado animal utilizando agua del sistema de peces.
- Una vez sedado, coloque suavemente el pez en un recipiente de cultivo celular con suficiente agua del sistema (más 0,02% de MS-222) para mantener la humedad durante el manejo posterior.
- Examina e imagina los peces anestesiados usando un microscopio epifluorescente para detectar la fluorescencia del(los) transgén(es). Este paso identifica las escamas fluorescentes para biopsias.
NOTA: Las líneas que carecen de transgenes fluorescentes pueden observarse mediante microscopía óptica estándar. - Utiliza fluorescencia para identificar células T (lck:GFP o lck:mPeces cereza) o T-ALL (rag2:hMYC + lck:GFP o lck:mPeces cereza). Las células de la línea T son brillantemente fluorescentes en estas líneas; Las células B-ALL son tenuemente fluorescentes en los fondos lck:GFP y lck:mCherry 13,15,21.
- Examina peces marcados por la línea B (cd79a:GFP o cd79b:GFP (con o sin rag2:hMYC) para detectar células B epidérmicas y/o B-ALL, utilizando GFP para seleccionar las escalas para la biopsia.
- Practica posicionar a pez cebra y ajustar la configuración del microscopio antes de la biopsia, si se desea la imagen
NOTA: La imagen y la biopsia requieren entre 5 y 7 minutos de sedación mediante MS-222 al 0,02%. Monitoriza el movimiento opercular de forma continua. Si el movimiento opercular se ralentiza notablemente o cesa, transfiere inmediatamente el pez a un sistema de agua libre de anestesia y aborte la biopsia. Reaplicar ~50–100 μL de agua de pescado con anestésico en la piel, el opérculo y las branquias cada 1–2 minutos durante la imagen y la biopsia para mantener la humedad superficial.
3. Recogida y preparación de la báscula
- Para colocar al pez para la biopsia, coloca al pez sedado de lado en un plato de cultivo celular.
- Para evitar que el pez se deslice durante la biopsia, utiliza una esponja húmeda con un recorte lineal o en forma de V y colócala en el recipiente de cultivo celular para sostener al pez.
- Alternativamente, asegúrate de que el nivel del agua del sistema apenas cubra el fondo del plato de cultivo celular (lo suficiente para mantener la superficie húmeda) y así permitir que la tensión superficial estabilice al pez.
- Periódicamente, aplicar ~50–100 μL de MS-222 al 0,02% preparado en agua del sistema al opérculo y branquias para mantener la humedad y sostener la anestesia durante la imagen y la biopsia.
- Realizar biopsia mediante microscopía de epifluorescencia para seleccionar escamas altamente fluorescentes enriquecidas con linfocitos o células LL.
- Recoge entre 10 y 20 escamas adyacentes de una sola región altamente fluorescente, preferiblemente dentro de la primera o segunda franja pigmentada horizontal.
NOTA: Una sola escala suele ser suficiente para la imagen. Una colección de 10–20 escalas suele arrojar >1.000 linfocitos de peces WT y se recomienda para análisis posteriores como citometría de flujo y qRT-PCR. - Mano dominante (aguja): Utiliza una aguja de jeringuilla calibre 31, coloca suavemente la punta de la aguja bajo el borde posterior de una báscula y gírala hacia adelante (es decir, cefálida). Usa una aguja estéril diferente para cada pez. Limpia las pinzas entre los peces; Esteriliza si los procedimientos institucionales lo requieren.
NOTA: Elevar la báscula con una aguja es preferible a usar solo pinzas, ya que eleva la báscula para minimizar el raspado superficial. Esto garantiza que la delicada capa epidérmica bajo la escama permanezca adherida a la superficie de la escamita, lo cual es fundamental para maximizar el rendimiento celular. - Mano no dominante (pinza): Sujetando la báscula en posición inclinada hacia adelante con la aguja, agarra la superficie exterior rígida de la báscula con pinzas. Con un movimiento suave, saca la escama de su bolsillo.
NOTA: Puede producirse un sangrado leve en los lugares de extracción de escamas, que normalmente es autolimitado. - Si hay un sangrado excesivo, aplica una presión suave con pinzas y enjuaga brevemente con un 0,02% de MS-222 en agua del sistema.
NOTA: La hemostasia puede lograrse en cuestión de segundos antes de pasar a la siguiente escala. - Para biopsiar múltiples escamas, recoge entre 10 y 20 escamas por pez, eliminando escamas adyacentes de una región contigua en una sola franja pigmentada horizontal, en lugar de varias regiones del cuerpo o ambos lados del animal.
- Arranca las escamas individuales secuencialmente y reténlas en las puntas de las pinzas durante la recogida con la superficie medial hacia arriba.
- Para evitar la interferencia de las escamas acumuladas con la posterior eliminación de escamas, primero se inclina cada escama hacia adelante y luego agárrala por su borde posterior. Transfiere las básculas a un tubo que contenga medios de clasificación después de recoger cada 5 escamas, o siempre que no se puedan retener escamas adicionales de forma segura en las puntas de las pinzas.
- Tras la recogida de la escama, procesa las muestras lo más rápido posible. Transfiere inmediatamente las escamas desde las pinzas a tubos de 1,5 mL que contienen 500 μL de medio de clasificación en frío sobre hielo para preservar la viabilidad celular. Descontaminar las pinzas entre peces usando etanol al 70% antes de recoger las muestras posteriores. Procesa las escamas de cada pez en tubos separados durante la recogida, disociación y análisis aguas abajo.
- Tras la recogida de escamas, transfiere inmediatamente el pez a un tanque de recuperación con agua del sistema dulce sin MS-222.
- Monitoriza el movimiento opercular y el comportamiento de natación hasta que se restablezca la respiración y la postura normales. Observa el lugar de la biopsia en busca de sangrados persistentes o signos de malestar antes de devolver el pez al sistema de recirculación.
- Devuelve el pez a su acuario de origen tras el equilibrio normal y la reanudación de la natación.
4. Disociación celular y filtrado
- Revisa las básculas en la parte inferior del tubo. Las escamas son fácilmente visibles a simple vista antes de la disociación. Disocia las escamas usando un homogeneizador de mano de microtubos de plástico estéril aplicando una presión manual suave y controlada durante 30–60 segundos.
- Utiliza movimientos rotacionales lentos y de arriba abajo para liberar células epidérmicas, evitando el corte excesivo de escamas.
- Continúa disociando hasta que los medios de selección se vuelvan visiblemente turbios.
NOTA: El éxito del procedimiento se indica en que el medio se vuelve turbio, lo que indica una alta concentración de células liberadas en suspensión. - Pasar muestras homogeneizadas a través de un filtro de malla de nylon de 35 μm para eliminar residuos y generar suspensiones de célula única para citometría de flujo y clasificación celular activada por fluorescencia.
- Si hay agregados celulares visibles tras la filtración inicial, pasar la muestra por un nuevo filtro de malla de 35 μm inmediatamente antes del análisis citométrico de flujo. Repite la filtración no más de 2 veces el total para minimizar la pérdida celular.
5. Análisis citométrico de flujo
- Analizar muestras mediante citometría de flujo.
NOTA: La citometría de flujo puede realizarse antes de la purificación de células activadas por fluorescencia o la extracción de ARN para evaluar la composición de la muestra. - Analizar suspensiones de célula única utilizando un citómetro de flujo equipado con un láser de 488 nm para detección de GFP y un láser de 561 nm para detección de mCherry.
- Excluye los escombros utilizando parámetros de dispersión directa (FSC) y dispersión lateral (SSC). Identificar los linfocitos utilizando la compuerta linfocitivadescrita anteriormente 10,13,21.
- Excluye los agregados celulares mediante parámetros de gating singlet (es decir, área de SSC [SSC-A] frente a altura de SSC [SSC-H]).
- Evalúa la viabilidad celular usando yoduro de propidio (PI) o un colorante vivo/muerto equivalente. Excluir las células PI-positivas de análisis y procedimientos de clasificación posteriores.
- Establecer compuertas de fluorescencia utilizando controles de pez cebra no transgénicos y controles transgénicos fluorescentes de un solo color. Defina las poblaciones GFP-positivas y mCherry-positivas en relación con los controles negativos.
- Exportar archivos estándar de citometría de flujo (FCS) y analizar datos utilizando software de análisis de citometría de flujo.
6. Clasificación celular activada por fluorescencia
- Para clasificar las células, se utiliza un sistema de clasificación de células activado por fluorescencia equipado con láseres de 488 nm y/o 561 nm para la detección de GFP y mCherry.
- Linfocitos con puerta secuencial (FSC/SSC), singlets (SSC-A frente a SSC-H) y células viables (PI-negativas) antes de la clasificación basada en fluorescencia.
- Defina las poblaciones deGFP lo, GFPhi y mCherry-positivas utilizando compuertas de fluorescencia establecidas a partir de muestras control negativas.
- Clasifica las poblaciones deGFP lo, GFPhi y mCherry-positivas en tubos de recogida que contengan medios de clasificación refrigerados.
NOTA: En este trabajo con la línea lck:GFP, las células de GFP alta (GFP hi) frente a las bajas de GFP (GFPlo) son linajes linfocitos distintos, como se describióanteriormente 10,13,15,21. - Mantener las muestras clasificadas sobre hielo y proceder inmediatamente a aplicaciones aguas abajo, como el aislamiento de ARN.
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Resultados
Siguiendo los pasos anteriores, anestesiamos y examinamos a los peces cebra adultos para detectar linfocitos fluorescentes o ALL mediante microscopía. Los peces tipo salvaje (WT) lck:GFP mostraron fluorescencia principalmente en la región tímica, mientras que los peces cd79b:GFP mostraron fluorescencia en la región cabeza/branquia, consistente con observacionesprevias 10 (Figura 1A, izquierda). En cambio, los peces <...
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Discusión
Este protocolo describe un método de biopsia a escala no letal para la recogida de linfocitos epidérmicos de pez cebra, incluyendo tanto linfocitos no malignos como células de leucemia linfoblástica aguda (LLA). Los peces cebra son modelos bien establecidos para la linfopoyesis y las malignidades linfóides, pero la mayoría de los enfoques para obtener linfocitos requieren eutanasia y disecciones tisulares, impidiendo estudios longitudinales en animalesindividuales...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de interés económicos.
Agradecimientos
Agradecemos a Ameera Hasan, M.B.B.S., Ph.D., y Brashé Wood por sus contribuciones a este proyecto. Los estudios contaron con el apoyo del Programa Piloto de Subvenciones del Centro de Cáncer Stephenson de la OUHSC, el Centro de Investigación con Células Madre Adultas de Oklahoma (OCASCR), los programas de Ciencia y Subvenciones Semilla de la Fundación de Salud Presbiteriana, y la Fundación Familiar W.J. Jones. El FACS del Centro de Cáncer Stephenson del OUHSC Molecular Biology and Cytometry Research Core fue financiado por la beca de apoyo del Centro de Cáncer del NCI P30 CA225520. Este estudio fue financiado en parte por fondos de la Sociedad Americana del Cáncer (ACS-POST-BACC-23-1156971-01-DPBACC). Iman Owens es becaria del programa "STRONG" post-bachillerato de la ACS.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivos y consumibles: | |||
| Tricaína metansulfonato (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | Agente anestésico |
| Medio RPMI 1640 | ThermoFisher | 11875093 | Medio para la viabilidad de linfocitos |
| Suero bovino fetal | Sigma-Aldrich | F2442 | Para la viabilidad celular |
| Penicilina-Estreptomicina | ThermoFisher | 15140122 | Limitar la contaminación bacteriana |
| Etanol al 70% | ThermoScientific | T038181000 | Para esterilizar forceps |
| CellPro 1x PBS | VWR | 104027-280 | Diluir a 0.9x con agua estéril |
| Yoduro de propidio | Invitrogen | P1304MMP | Discriminación de células vivas/muertas para flujo/FACS |
| Cut Goods Misc-Pn; Tamaño: 12 x 12 PULGADAS 35um de papel filtro Lab Pak 03-35/16 | Sefar | Para clasificación celular Referencia: Burroughs-Garcia, J., Hasan, A., Park, G., Borga, C., Frazer, J. K. Aislamiento de células b malignas y no malignas de lck:Egfp zebrafish. J Vis Exp. 10.3791/59191 (144), (2019). | |
| Alternativa para papel filtro: EASYstrainer Cell Sieves, Greiner Bio-One | Greiner | 89508-342 | Para clasificación celular |
| Eppendorf® Flex-Tubes® Microtubos, 1.5 ml | Eppendorf® | 20901-551 | Microcentrifugado para clasificación celular |
| Jeringas de insulina VetRx U-100 UltiCare 3/10cc 31G x 5/16" Marcado de media unidad | UltiCare | 9436 | Para biopsias de escamas |
| Placa de Petri profunda de 100 x 25 mm | USA Scientific | 8609-0625 | Para biopsias de escamas |
| Morillos desechables Bel-Art® | Bel-Art® | BAF199230001 | Para disociación de escamas |
| Juego de pinzas E-Z Pik de 6 piezas | Aven | 18480EZ | Para biopsias de escamas |
| Diapositivas de microscopio Corning®, una cara esmerilada, un extremo | Sigma-Aldrich | CLS294875X25 | Para imágenes |
| Portaobjetos | Sigma-Aldrich | C8181 | Para imágenes |
| SlowFade™ Glass Soft-set Antifade Mountant, con DAPI | ThermoFisher | S36920 | Para montar escamas en portaobjetos |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Para extracción de ARN |
| Equipo: | |||
| Microscopio Nikon AZ100 y cámara DS-Qi1MC | Nikon | Microscopio de fluorescencia & cámara | |
| Sistema CFX96 Touch-PCR | Bio-Rad | 3600037 | |
| CytoFLEX | Beckman-Coulter | Análisis de citometoría de flujo | |
| Leica SP8 | Leica | Microscopio confocal | |
| Software: | |||
| Software de análisis Kaluza versión 2.1 | Beckman-Coulter | Análisis de citometoría de flujo Referencia: https://www.beckman.com/flow-cytometry/software/kaluza/downloads | |
| Software LAS-X versión 3.7.4.23463 | Leica | Microscopio confocal Referencia: https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/ |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
