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Un modelo de laceración hepática murina que simplifica la cuantificación de la coagulopatía por hemorragia inducida por trauma, la inflamación y la supervivencia

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DOI:

10.3791/72215

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25 de septiembre de 2026

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1Division of Hematology and Cellular Therapy, Department of Medicine, University of California San Diego

En este artículo

Resumen

Presentamos un modelo reproductible de laceración hepática en ratón con hemorragia profunda que integra la pérdida de sangre, la coagulopatía inducida por trauma y los resultados de supervivencia. Este modelo permite la evaluación de intervenciones hemostáticas, incluyendo el factor VIIa recombinante y el ácido tranexámico, junto con evaluaciones de coagulación, fibrinólisis y mortalidad, proporcionando una plataforma rentable y escalable para la investigación mecanicista y traslacional de la hemorragia.

Resumen

La hemorragia incontrolada sigue siendo una de las principales causas de muerte prevenible en pacientes traumatizados, y la coagulopatía inducida por trauma (TIC) es un determinante importante de la mortalidad temprana. Los modelos experimentales que reproducen de manera confiable la hemorragia y las respuestas coagulopáticas asociadas son esenciales para estudios mecanicistas y la evaluación de intervenciones dirigidas. Aquí describimos un modelo murino estandarizado de hemorragia profunda mediante una laceración hepática (LL) reproducible que provoca hemorragia, la cual puede cuantificarse con precisión, al tiempo que se rastrea simultáneamente la coagulopatía sistémica, los marcadores inflamatorios y la mortalidad.

Los ratones se someten a una laparotomía media estandarizada seguida de LL, y la pérdida de sangre se cuantifica mediante esponjas impregnadas de sangre. Los marcadores sistémicos de coagulación, fibrinólisis y marcadores inflamatorios se obtienen mediante punción sanguínea retroorbital antes y en intervalos seriados preespecificados después del procedimiento. LL con pérdida de sangre produce de forma confiable TIC (caracterizada por alargamiento del tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT), aumento del complejo trombina-antitrombina (TAT), depleción selectiva de los factores de coagulación (F) V y VIII y activación de la fibrinólisis). Paralelamente, la activación inflamatoria se evidencia por el aumento de la interleucina-6 (IL-6). Además, el modelo permite realizar análisis de supervivencia tras la reparación de la incisión media.

Como aplicación traslacional, el rhFVIIa y el ÁCT se utilizan para demostrar que el modelo es sensible al rescate ante hemorragias mediante la modulación farmacológica de los parámetros de coagulación y fibrinólisis. En comparación con los modelos en animales grandes, este sistema murino ofrece una oportunidad económica, versátil y fácilmente escalable para estudiar intervenciones innovadoras y dirigidas frente a la hemorragia traumática.

Introducción

El trauma es una causa principal de muerte y discapacidad en adultos jóvenes (edad < 45 años)1,2, siendo la hemorragia incontrolada una causa importante de mortalidad temprana3. Un factor crítico en los malos resultados de los pacientes gravemente heridos es el desarrollo de coagulopatía inducida por trauma (TIC)4,5. La TIC es una alteración compleja y multifactorial de la hemostasia, caracterizada por el agotamiento de los factores de coagulación V y VIII6,7, fibrinólisis disregulada7,8,9 y activación inflamatoria sistémica10. La TIC contribuye a la hemorragia persistente y se asocia con mayores necesidades de transfusión11, fallo orgánico5 y mortalidad, a pesar de los avances en la reanimación de control de daños y las intervenciones terapéuticas5.

Por lo tanto, los modelos experimentales que reproducen de manera confiable el shock hemorrágico con los cambios coagulopáticos asociados son esenciales para la investigación mecanicista y la evaluación de intervenciones hemostáticas dirigidas. Los modelos de hemorragia controlada emplean extracción estandarizada de sangre, lo cual puede no causar lesión tisular, un factor que contribuye a la respuesta coagulopática sistémica observada en el trauma clínico12. Por consiguiente, los modelos de hemorragia que incorporan lesión de órganos sólidos deberían ofrecer una mayor relevancia clínica, siempre que se puedan evaluar cuantitativamente la hemorragia sostenida y las respuestas sistémicas13,14,15,16. Modelos más complejos de coagulopatía inducida por trauma (TIC) incluyen combinaciones de lesión cerebral traumática, fracturas de huesos largos o extremidades, lesión de tejidos blandos, laparotomía y shock hemorrágico controlado, con el fin de reproducir múltiples componentes del trauma grave17,18. Aunque estos enfoques proporcionan una representación más completa del politrauma, sus múltiples procedimientos de lesión y manipulaciones fisiológicas pueden aumentar la complejidad técnica y la variabilidad experimental.

A pesar de décadas de investigación, los modelos experimentales clínicamente relevantes y reproducibles de la CCI siguen siendo limitados y heterogéneos. Las revisiones han enfatizado la necesidad de modelos robustos que reproduzcan con mayor precisión la secuencia clínica de lesión tisular y shock hemorrágico, y que permitan evaluar intervenciones terapéuticas17,19. Los modelos complejos que requieren instrumentación extensa, incluyendo cateterización cardíaca y monitorización hemodinámica continua, pueden proporcionar información fisiológica detallada, pero también necesitan equipos especializados y manipulaciones procedimentales adicionales. Para eliminar barreras en la investigación del trauma, parece fundamental simplificar el enfoque experimental manteniendo las características clave de la CCI. Aquí describimos un modelo murino estandarizado que induce un shock hemorrágico no controlado14 mediante una lesión hepática (LL) reproducible que provoca una hemorragia profunda y recapitula características esenciales de la CCI. Este modelo permite evaluar las respuestas de coagulación e inflamatorias, incluyendo medidas generales de coagulación (TCA y generación de trombina), el agotamiento selectivo de factores de coagulación (FV y FVIII) como sello distintivo de la CCI, marcadores de fibrinólisis y el perfil de citocinas. Para demostrar la sensibilidad y relevancia de este modelo respecto al trauma humano, evaluamos los efectos del rhFVIIa (agente prohemostático) y del ácido tranexámico (TXA, agente antifibrinolítico), utilizados en la reanimación tras el trauma, sobre la gravedad de la hemorragia, la progresión de la coagulopatía y los resultados de supervivencia.

El modelo además permite el muestreo sanguíneo serial y terminal, posibilitando la evaluación longitudinal de las trayectorias de coagulación e inflamación en relación con la gravedad de la lesión y la intervención terapéutica. En conjunto, el modelo proporciona un sistema murino reproducible y escalable para estudiar la coagulopatía inducida por trauma (TIC) en el contexto de hemorragia severa, y para evaluar intervenciones hemostáticas y tratamientos farmacológicos dirigidos mediante puntos finales clínicamente relevantes, incluyendo pérdida sanguínea, coagulopatía, fibrinólisis, inflamación y supervivencia.

En comparación con los modelos previamente publicados de laceración hepática en ratones, incluido el protocolo descrito por Dyer et al.13, este método introduce varios avances metodológicos clave. Estos incluyen la medición gravimétrica cuantitativa de la pérdida sanguínea, la estandarización de la gravedad de la lesión mediante la normalización de la masa hepática lacerada respecto al peso corporal, y el perfilado exhaustivo de la coagulopatía inducida por trauma (TIC), la fibrinólisis y la inflamación. Además, el modelo permite muestreos seriados, modulación farmacológica y análisis de supervivencia que detallan técnicas de cierre abdominal, posibilitando la recuperación física en lugar de la eutanasia. Todos los procedimientos pueden realizarse dentro de un único enfoque experimental, proporcionando una plataforma escalable y traslacional para el estudio de la hemorragia y las intervenciones hemostáticas dirigidas.

Protocolo

El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California en San Diego (UCSD) aprobó todos los protocolos con animales. Los ratones C57BL/6J se criaron y mantuvieron en las instalaciones internas de cría de UCSD. En los experimentos se utilizaron ratones macho y hembra de entre 8 y 10 semanas de edad. En la Figura Suplementaria 1 se proporciona una descripción esquemática del flujo de trabajo experimental y su cronograma.

NOTA: Los tamaños de las muestras se determinaron en función de experimentos preliminares, la variabilidad esperada de los puntos finales individuales y la experiencia previa con el modelo de laceración hepática en ratones. Los tamaños finales de muestra para los puntos finales experimentales individuales y los grupos experimentales se indican en las leyendas de las figuras correspondientes. Para las mediciones de peso hepático, se agruparon datos de múltiples experimentos independientes para evaluar la consistencia entre las cohortes experimentales. En los ensayos de coagulación realizados en corridas experimentales separadas, se incluyeron muestras previamente analizadas en diferentes corridas para monitorear la consistencia y la reproducibilidad entre ensayos.

1. Preparación previa al experimento

  1. Recolección de muestras basales (Día -1)
    1. Obtenga aproximadamente 200 µL de sangre mediante acceso retro-orbitario de cada ratón (8–10 semanas de edad) 24 h antes del experimento para establecer los parámetros basales.
    2. Administre aproximadamente 200 µL de solución salina estéril para inyección por vía subcutánea tras la recolección de sangre.
    3. Mantenga a los ratones en jaulas limpias bajo condiciones estándar de laboratorio, con una temperatura controlada de 20–24 °C, humedad relativa del 30%–70% y un ciclo de 12 h de luz y 12 h de oscuridad, con acceso ad libitum a alimento y agua hasta el día del experimento.
  2. Preparación de la jaula (Día 0)
    1. Transfiera al ratón a una jaula limpia forrada con toallas de papel nuevas el día del experimento.
    2. Retire el alimento y el agua 15 min antes del experimento y manténgalos retirados hasta que se retiren las esponjas de absorción tras la cirugía.

2. Preparación del instrumento y del campo quirúrgico

  1. Esterilización del instrumental
    1. Esterilice los instrumentos quirúrgicos, el algodón, los aplicadores y los papeles de filtro mediante autoclave.
    2. Desinfecte la superficie quirúrgica utilizando etanol al 70%.
  2. Preparación de la mesa quirúrgica
    1. Coloque los instrumentos estériles sobre un campo estéril.
    2. Prepare un recipiente de acero inoxidable con etanol al 70% y algodón estéril para la limpieza intermedia de los instrumentos.
    3. Active un esterilizador de microperlas y permita que alcance 150 °C para la esterilización entre animales.

3. Preparación del mantenimiento de la temperatura

  1. Preparación de la almohadilla isotérmica
    1. Active la almohadilla calefactora isotérmica inmediatamente antes de la cirugía según las instrucciones del fabricante.
    2. Ajuste la almohadilla calefactora isotérmica para mantener la temperatura corporal del ratón dentro de un rango objetivo de 36–37 °C durante toda la anestesia y la cirugía.
    3. Confirme una distribución uniforme del calor en toda la superficie de la almohadilla.
    4. Coloque la almohadilla sobre la plataforma quirúrgica y cúbrala con un campo estéril.
    5. Conecte la mesa quirúrgica al sistema de anestesia con isoflurano.

4. Anestesia y procedimientos preoperatorios

  1. Inducción de la anestesia
    1. Inducir la anestesia colocando al ratón en una cámara de inducción con isoflurano al 2% en oxígeno a 2 L/min.
    2. Confirmar una anestesia adecuada mediante el reflejo de compresión del dedo del pie.
    3. Registrar el peso corporal antes de la cirugía.
  2. Administración de analgesia y tratamiento
    1. Administrar buprenorfina (3,25 mg/kg, por vía subcutánea) para analgesia.
    2. Preparar agentes hemostáticos según sea necesario.
    3. Para los grupos de tratamiento, administrar factor VII activado recombinante humano (rhFVIIa; 3 mg/kg) o ácido tranexámico (10 mg/kg) mediante inyección intravenosa retroorbital 5 min antes de la lesión.
    4. Administrar un volumen equivalente (~100 µL) de solución salina estéril para inyección a los animales control.

5. Preparación quirúrgica

  1. Preparación del sitio quirúrgico
    1. Transfiera el ratón anestesiado a la tabla quirúrgica colocada sobre la almohadilla isotérmica.
    2. Mantenga la anestesia mediante un cono nasal con 1,5%–2% de isoflurano en oxígeno a 2 L/min durante todo el procedimiento quirúrgico.
    3. Coloque al ratón en posición supina y asegure las cuatro extremidades con cinta adhesiva.
    4. Afeite la región abdominal.
    5. Realice la preparación aséptica utilizando povidona-yodo y etanol al 70% de forma alternada (tres ciclos).

6. Procedimiento de laceración hepática

  1. Pesado previo de materiales
    1. Pese previamente dos tubos de 1,5 mL, uno que contenga 0,5 mL de solución salina y otro tubo vacío.
    2. Pese previamente tres triángulos de absorción primarios y dos triángulos de absorción secundarios por animal y registre su masa combinada.
    3. Pese previamente un recipiente de pesaje por animal para la posterior determinación del peso del tejido hepático extirpado.
  2. Inducción de lesión hepática
    1. Realice una laparotomía media de aproximadamente 0,5 pulgadas (12,7 mm) de longitud para exponer el hígado.
    2. Coloque dos triángulos de absorción a lo largo de las paredes abdominales derecha e izquierda, evitando el contacto con el hígado.
    3. Exteriorice el lóbulo izquierdo del hígado e identifique los márgenes del lóbulo para estandarizar el grado de extirpación del tejido. Evite lesiones tisulares no intencionadas.
    4. Utilizando tijeras afiladas, lacere aproximadamente el 75 % del lóbulo en un único movimiento controlado para asegurar consistencia entre los animales.
    5. Transfiera el tejido lacerado extirpado al tubo vacío previamente pesado para la posterior cuantificación de la gravedad de la lesión.
    6. Introduzca un tercer triángulo de absorción en la cavidad abdominal para facilitar una recolección uniforme de sangre durante la fase de hemorragia.
  3. Cierre abdominal rápido para mantener la hemorragia interna (paso crítico)
    1. Cierre inmediatamente la pared abdominal en aproximadamente 10–15 s utilizando dos clips quirúrgicos autoclips.
    2. Asegure una alineación precisa de los bordes de la incisión para lograr un cierre completo sin espacios. Un cierre incompleto puede provocar fuga externa de sangre y subestimación de la pérdida sanguínea.
    3. Aplique una tensión constante pero suave durante el cierre, evitando la compresión del contenido abdominal, lo cual podría alterar la dinámica de sangrado.
    4. Refuerce el cierre con adhesivo tisular (2–3 gotas) para asegurar un compartimento abdominal completamente sellado.
  4. Monitoreo posterior a la lesión
    1. Pese el tejido hepático extirpado y normalice la medición respecto al peso corporal para cuantificar y confirmar el grado de lesión hepática.
    2. Devuelva el ratón a la jaula colocada sobre la placa isotérmica.
    3. Permita que la hemorragia progrese durante 60 min para el grupo de punto final y el grupo de supervivencia.

7. Recolección de sangre y cuantificación de la pérdida de sangre

  1. Recolección y procesamiento de la muestra de sangre
    1. Para la cohorte de punto final, reanestesiar al ratón con isoflurano a los 60 min tras la laceración hepática.
    2. Para la cohorte de supervivencia, reanestesiar al ratón con isoflurano a las 6 h y a los 7 días tras la laceración hepática para la recolección de sangre.
    3. Recolectar sangre mediante punción retroorbital en tubos que contienen solución de citrato de sodio (relación sangre-anticoagulante: 9:1) para la preparación de plasma.
    4. Centrifugar las muestras a 2,000 × g durante 10 min, seguido de una segunda centrifugación a 12,000 × g durante 5 min, para obtener plasma pobre en plaquetas destinado a ensayos posteriores de coagulación y fibrinólisis.
  2. Medición de la pérdida de sangre
    1. Reabrir el abdomen a los 60 min tras la laceración hepática tanto en la cohorte de punto final como en la de supervivencia, y retirar las esponjas absorbentes que contienen sangre.
    2. Transferir todas las esponjas impregnadas de sangre a un tubo previamente pesado que contenga solución salina estéril.
    3. Utilizar esponjas absorbentes adicionales previamente pesadas para recolectar la sangre residual dentro de la cavidad abdominal.
    4. Pesar el tubo de recolección tras la recolección de sangre para obtener el peso final del tubo.
    5. Calcular la pérdida de sangre utilizando la siguiente ecuación gravimétrica:
      Pérdida de sangre (µL/g) = [(peso final del tubo − peso inicial del tubo – peso de la esponja absorbente) / peso corporal del ratón] × 1000.
      NOTA: Todos los pesos se expresan en gramos. El factor 1,000 convierte gramos de sangre a microlitros, asumiendo una densidad sanguínea de aproximadamente 1 g/mL.
  3. Cohorte de supervivencia y resultados longitudinales
    1. Tras la medición de la pérdida de sangre a los 60 min, cerrar inmediatamente la incisión utilizando grapas quirúrgicas y adhesivo tisular para asegurar un compartimento abdominal completamente sellado.
    2. Administrar 400 µL de solución salina estéril por vía subcutánea antes de la recuperación.
    3. Devolver al ratón a su alojamiento estándar y monitorearlo continuamente durante la recuperación de la anestesia, evaluándolo a las 2 h, 6 h y 24 h tras la cirugía, seguido de monitoreo diario hasta el día 7.

8. Cuidados posoperatorios

  1. Monitorización postoperatoria
    1. Monitoree continuamente a los animales durante la recuperación temprana de la anestesia en busca de signos de malestar o morbilidad.
    2. Registre el estado de supervivencia y las observaciones clínicas en cada evaluación programada.
  2. Cuidados de apoyo
    1. Administre 400 µL de solución salina estéril por vía subcutánea diariamente durante 3 días.
    2. Proporcione analgesia (buprenorfina, 3,25 mg/kg, por vía subcutánea) cada 72 h según el protocolo aprobado de cuidado animal.
    3. Mantenga a los ratones en condiciones estándar de alojamiento con acceso ad libitum a alimento y agua.
  3. Puntos finales humanitarios
    1. Monitoree a los animales en busca de puntos finales humanitarios predefinidos, incluyendo letargo severo o persistente, incapacidad para desplazarse o acceder a alimento o agua, dificultad respiratoria grave, falta de respuesta u otros signos de malestar severo según lo especificado en el protocolo institucional aprobado de cuidado animal.
    2. Se sacrificarán los animales que alcancen los puntos finales humanitarios predefinidos de acuerdo con las directrices institucionales.
    3. Continúe el monitoreo de supervivencia hasta el día 7 o hasta que se alcance un punto final humanitario.

9. Procedimientos finales y recolección de tejidos

  1. En puntos finales experimentales predeterminados, anestesiar ratones y obtener sangre mediante punción retroorbital.
  2. Eutanasiar mediante inhalación de CO₂ de acuerdo con las directrices institucionales.
  3. Extraer órganos y procesar los tejidos para análisis histológico según los procedimientos posteriores especificados.

10. Ensayos de coagulación, fibrinólisis y citoquinas

NOTA: Los reactivos, kits de ensayo y equipos utilizados para estos procedimientos se enumeran en la Tabla de Materiales.

  1. Medición del TTPa
    1. Registrar todos los tiempos de coagulación utilizando el coagulómetro indicado en la Tabla de Materiales.
    2. Mezclar 25 µL de plasma de ratón con 25 µL del reactivo de TTPa e incubar durante 3 min a 37 °C. Iniciar la coagulación mediante la adición de 25 µL de CaCl₂ (25 mM) preparado en HBS (20 mM HEPES, 147 mM NaCl, 3 mM KCl, pH 7.4) y registrar el tiempo de coagulación.
  2. Medición de la actividad de FV, FII y FX
    1. Mezclar 5 µL de plasma de ratón con 20 µL del plasma deficitario en el factor correspondiente y 25 µL de HBS que contenga 0,5 % de albúmina sérica bovina.
    2. Incubar durante 1 min a 37 °C e iniciar la coagulación mediante la adición del reactivo Innovin indicado en la Tabla de Materiales.
    3. Determinar la actividad del factor en relación con el sistema de calibración o referencia correspondiente.
  3. Medición del FVIII
    1. Determinar el FVIII mediante un ensayo cromogénico de FVIII siguiendo las instrucciones del fabricante.
  4. Medición del fibrinógeno
    1. Determinar la concentración de fibrinógeno mediante el método de Clauss. Añadir 10 µL de plasma de ratón a 40 µL de solución salina tamponada con HEPES que contenga 0,01 % de albúmina sérica bovina e incubar durante 3 min a 37 °C.
    2. Iniciar la formación del coágulo mediante la adición de 25 µL de trombina (25 U/mL) y determinar la concentración de fibrinógeno utilizando la calibración del ensayo.
  5. Medición de biomarcadores plasmáticos
    1. Medir los complejos TAT plasmáticos, los complejos PAP y el dímero D mediante los kits de ensayo comercialmente disponibles indicados en la Tabla de Materiales. Realizar cada ensayo según las instrucciones del fabricante.
    2. Utilizar estándares, calibradores y controles específicos del ensayo según lo especificado por los fabricantes y calcular las concentraciones del analito a partir de las curvas estándar correspondientes.
  6. Medición de IL-6 plasmática
    1. Medir las concentraciones plasmáticas de IL-6 en el momento basal y a los 60 min y 6 h tras la laceración hepática, utilizando el ensayo multiplex de citocinas indicado en la Tabla de Materiales.
    2. Realizar el ensayo según las instrucciones del fabricante y analizar los datos utilizando el software Q-View del fabricante.

Resultados

El modelo LL produce una gravedad de lesión reproducible y estandarizada en ratones. Figura 1A demuestra la consistencia del peso del hígado lacerado cuando se normaliza respecto al peso corporal (%PC), con una lesión mediana de 1,4 %PC en los grupos experimentales. Esta consistencia confirma una inducción quirúrgica confiable y permite la reproducibilidad entre animales y en distintas condiciones experimentales. La capacidad de estandarizar la gravedad de la lesión es fundamental para evaluar las respuestas fisiológicas posteriores independientemente de la variabilidad en el daño tisular.

La validación de la respuesta hemorrágica y la modulación terapéutica dentro del modelo se muestra en la Figura 1B. Los ratones fueron tratados previamente con solución salina, el agente prehemostático rhFVIIa o el agente antifibrinolítico TXA, y la pérdida de sangre se cuantificó y normalizó respecto al peso corporal (µL/g). Los ratones tratados con solución salina presentaron una hemorragia considerable tras la LL, mientras que los ratones tratados con rhFVIIa o TXA mostraron una reducción en la pérdida de sangre. Estos hallazgos demuestran la capacidad de este modelo para detectar la modulación farmacológica de la hemorragia y para evaluar intervenciones hemostáticas bajo condiciones de sangrado no controlado.

El modelo también reproduce características clave de la coagulopatía inducida por trauma. Como se muestra en la Figura 1C, la LL provocó un alargamiento del TTPa, lo que indica una coagulación deteriorada tras la lesión. El tratamiento con rhFVIIa o TXA atenuó este alargamiento, lo que sugiere una restauración de la función de coagulación. De manera similar, la generación de trombina, evaluada mediante complejos TAT, aumentó tras la LL y disminuyó con el tratamiento con TXA, mientras que rhFVIIa no reduce los niveles de TAT (Figura 1D), lo que sugiere una modulación de la activación de la coagulación.

La caracterización adicional de la coagulopatía se muestra en la Figura 2. La LL provocó un agotamiento selectivo de los factores de coagulación V y VIII, consistente con la CIT, y estos cambios se restablecieron con el tratamiento con rhFVIIa o TXA (Figura 2A,B). En contraste, los factores II y X no se alteraron significativamente (Figura 2C,D), lo que indica que estos cambios ocurren en un contexto de factores II y X preservados, lo cual apoya un fenotipo predominantemente asociado a la CIT y no uno similar a la coagulación intravascular diseminada (CIVD).

El desarrollo de la fibrinólisis tras la LL se muestra en la Figura 3. Los niveles de fibrinógeno disminuyeron tras la lesión, lo que indica consumo, y no se restablecieron completamente con rhFVIIa o TXA (Figura 3A). En contraste, los marcadores fibrinolíticos, incluidos los complejos de plasmina-antiplasmina (PAP) y el dímero D, aumentaron tras la LL. El rhFVIIa redujo los niveles de complejos PAP, pero no alteró significativamente los niveles de dímero D. La TXA redujo tanto los niveles de complejos PAP como los de dímero D tras la LL (Figura 3B,C).

Finalmente, se evalúa la respuesta inflamatoria sistémica y los resultados de supervivencia en Figura 4. Los niveles plasmáticos de interleucina-6 (IL-6) se miden a los 60 min y a las 6 h tras LL en todos los grupos de tratamiento. Los niveles de IL-6 están elevados en los tiempos tempranos en todos los grupos (Figura 4A). La supervivencia durante un período de 7 días se evalúa mediante análisis de Kaplan-Meier. La supervivencia a los 7 días es del 75 % en el grupo con suero salino, del 55 % en el grupo con rhFVIIa y del 80 % en el grupo tratado con TXA. No se observa diferencia significativa entre los grupos con suero salino y TXA, mientras que la supervivencia se reduce significativamente en el grupo con rhFVIIa en comparación con los grupos con suero salino y TXA (Figura 4B).

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Figura 1: Validación del modelo de laceración hepática (LL): reproducibilidad de la gravedad de la lesión, pérdida sanguínea cuantitativa e inducción de coagulopatía. Se induce hemorragia interna severa mediante laparotomía media seguida de LL estandarizada. Los ratones reciben previamente suero salino (~100 µL) o factor VII activado recombinante humano (rhFVIIa; 3 mg/kg), o ácido tranexámico (TXA; 10 mg/kg) antes de la lesión, para evaluar la modulación farmacológica del sangrado y la coagulopatía. (A) La gravedad de la lesión se cuantifica como el peso del hígado lacerado normalizado respecto al peso corporal (%BW), lo que demuestra una inducción reproducible de una lesión estandarizada en todos los animales. (B) La pérdida de sangre se cuantifica mediante un método gravimétrico y se normaliza respecto al peso corporal (µL/g), mostrando una hemorragia medible que se reduce con el tratamiento con TXA. (C) El tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) y (D) los complejos trombina–antitrombina (TAT) demuestran la inducción reproducible de coagulopatía tras la LL, con modulación observada tras el tratamiento con rhFVIIa o TXA. Los datos se presentan como valores individuales con mediana y rango intercuartílico; las comparaciones se realizaron utilizando una prueba no paramétrica de Mann-Whitney U (n = 5–21). ****P ≤ 0,0001. Adaptado con permiso de Joseph et al.16. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 2: Validación de la coagulopatía inducida por trauma (TIC) tras la laceración hepática (LL): depleción selectiva de factores de coagulación. Se induce hemorragia interna severa mediante laparotomía media seguida de LL estandarizada. Los ratones reciben previamente solución salina (~100 µL) o factor VII activado recombinante humano (rhFVIIa; 3 mg/kg), o ácido tranexámico (TXA; 10 mg/kg) antes de la lesión, para evaluar la modulación farmacológica de la coagulopatía. Los parámetros de coagulación se evalúan a los 60 minutos tras la LL. (A) Los niveles del factor V y (B) del factor VIII muestran una depleción reproducible tras la LL, lo cual es consistente con la TIC. (C) El factor II y (D) el factor X se mantienen relativamente preservados, lo que indica una depleción selectiva de factores de coagulación en lugar de un consumo global. Los datos se presentan como valores individuales con mediana y rango intercuartílico (n = 7–10). Las comparaciones estadísticas se realizaron utilizando la prueba no paramétrica de Mann-Whitney U. ***P ≤ 0.001; ****P ≤ 0.0001. Adaptado con permiso de Joseph et al.16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Validación de la activación fibrinolítica tras la laceración hepática (LL). Se induce una hemorragia interna severa mediante laparotomía media seguida de LL estandarizada. Los ratones reciben un tratamiento previo con suero salino (~100 µL), factor VII activado recombinante humano (rhFVIIa; 3 mg/kg) o ácido tranexámico (TXA; 10 mg/kg) antes de la lesión, para evaluar la modulación farmacológica de la fibrinólisis. Los parámetros fibrinolíticos se evalúan a los 60 minutos tras la LL. (A) Los niveles de fibrinógeno muestran consumo tras la lesión, lo que concuerda con la activación de la fibrinólisis y el agotamiento de factores de coagulación. (B) Los complejos plasmina–antiplasmina (PAP) y (C) los niveles de dímero D aumentan tras la LL, lo que indica degradación activa del fibrinógeno y activación sistémica de la fibrinólisis. Los datos se presentan como valores individuales con mediana y rango intercuartílico (n = 8–13). Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante la prueba no paramétrica de Mann-Whitney U. **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001; ****P ≤ 0.0001. Adaptado con permiso de Joseph et al.16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Validación de la respuesta inflamatoria sistémica y evaluación de la supervivencia tras la laceración hepática (LL). Se induce una hemorragia interna severa mediante laparotomía media seguida de una LL estandarizada. Los ratones reciben un tratamiento previo con solución salina (100 µL), factor VII activado recombinante humano (rhFVIIa; 3 mg/kg) o ácido tranexámico (TXA; 10 mg/kg) antes de la lesión. Tras la lesión, la incisión abdominal se cierra con grapas quirúrgicas y adhesivo tisular, y los animales se devuelven a sus jaulas de origen. El cuidado de apoyo consiste en la administración subcutánea diaria de solución salina (400 µL) durante los primeros tres días posteriores a la lesión. Se recolectan muestras de plasma a los 60 min y a las 6 h tras la LL para evaluar la activación inflamatoria sistémica. (A) Los niveles de interleucina-6 (IL-6) muestran una respuesta inflamatoria sistémica sostenida tras la lesión. Los datos se presentan como valores individuales con mediana y rango intercuartílico. Las comparaciones estadísticas se realizaron utilizando la prueba no paramétrica de Mann-Whitney U (n = 9–13). (B) La supervivencia a siete días se evaluó mediante análisis de Kaplan-Meier, lo que demuestra la capacidad del modelo para soportar puntos finales basados en resultados longitudinales (n = 20). ****P ≤ 0.0001. Adaptado con permiso de Joseph et al.16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria 1: Esquema general del modelo de laceración hepática y cronograma experimental. Esta figura resume el flujo de trabajo experimental para el modelo estandarizado de laceración hepática (LL) murina como modelo de hemorragia no controlada. Los ratones se someten a una laparotomía media seguida de una laceración hepática reproducible de aproximadamente el 75 % del lóbulo hepático izquierdo. Antes de la lesión, los ratones reciben suero salino (~100 µL, control vehicular) o factor VII activado recombinante humano (rhFVIIa; 3 mg/kg), o ácido tranexámico (TXA; 10 mg/kg), administrados por vía intravenosa mediante inyección retroorbital 5 min antes de la laceración hepática. La cuantificación de la pérdida sanguínea se realiza utilizando esponjas abdominales previamente pesadas, colocadas dentro del abdomen en el momento de la lesión, retiradas a los 60 min posteriores a la laceración hepática y pesadas nuevamente para determinar la hemorragia total. A continuación, el abdomen se cierra con grapas quirúrgicas y adhesivo tisular. Las muestras de sangre se obtienen mediante acceso retroorbital a los 60 min en el grupo de punto final y a las 6 h y 7 d en el grupo de supervivencia. El plasma se analiza para evaluar parámetros de coagulación, incluyendo el tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT), la actividad de los factores de coagulación, los complejos trombina-antitrombina (TAT), los complejos plasmina-α2-antiplasmina (PAP) y el dímero D a los 60 min. El perfil de citocinas se realiza a los 60 min y a las 6 h. La supervivencia se monitorea durante un período de 7 días. Adaptado con permiso de Joseph et al.16. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

En este estudio, presentamos un modelo murino reproducible de hemorragia profunda mediante la utilización de LL estandarizados que integra la evaluación cuantitativa de la pérdida sanguínea, la caracterización de la CCI y la inflamación, así como el análisis de supervivencia dentro de un único experimento. El modelo produce una gravedad de lesión constante, como se demuestra mediante el peso del hígado lacerado normalizado respecto al peso corporal, al tiempo que permite la evaluación reproducible de la hemorragia y de las respuestas hemostáticas sistémicas entre los grupos experimentales. El uso de un modelo de roedor pequeño con lesión estandarizada y medidas cuantitativas de resultados permite una evaluación eficiente de múltiples puntos finales experimentales dentro de un único marco experimental, facilitando investigaciones reproducibles y escalables de la CCI, sin requerir procedimientos técnicamente complejos.

Es importante destacar que este modelo reproduce características clave de la CCI, incluyendo la prolongación de los parámetros generales de coagulación (TCA), el aumento de la generación de trombina reflejado por complejos TAT, el agotamiento selectivo de los factores de coagulación V y VIII, y la activación de la fibrinólisis evidenciada por complejos PAP elevados y formación de dímero D. Estos cambios ocurren en un contexto de factores II y X preservados, lo que apoya un fenotipo predominante de CCI en lugar de coagulación intravascular diseminada. La capacidad de cuantificar simultáneamente estos parámetros proporciona un marco con relevancia traslacional para evaluar la disregulación hemostática tras una lesión traumática.

Una fortaleza clave de este modelo es la incorporación de la supervivencia como un punto final de resultado en el contexto de hemorragia traumática. Para evaluar estrategias de rescate clínicamente relevantes, evaluamos tanto el rhFVIIa como el TXA, dos agentes utilizados o investigados para la reanimación por trauma en humanos. El TXA demostró efectos consistentes en la reducción de la pérdida sanguínea, la normalización de la coagulopatía y la activación fibrinolítica, lo que se tradujo en un rescate de la supervivencia. Por el contrario, el rhFVIIa provocó una mortalidad notable asociada con la sobre-corrección de los parámetros hemostáticos y el control incompleto de la fibrinólisis16.

Estos hallazgos destacan un aspecto importante del modelo: la supervivencia está determinada por una compleja interacción entre la gravedad de la hemorragia, la coagulopatía y la respuesta sistémica, y no por la corrección aislada de vías hemostáticas individuales. Parece que este modelo de hemorragia es sensible a la integración de parámetros hemostáticos bioquímicos con la supervivencia, siendo esta última un determinante crítico del resultado en la práctica clínica. Aunque la hemorragia traumática grave es la lesión principal modelada en este sistema, las lesiones orgánicas secundarias también podrían contribuir al resultado. En nuestro estudio previo utilizando este modelo, se observaron microtrombos pulmonares y depósitos de fibrina en ratones tratados con rhFVIIa, los cuales se asociaron con una mayor mortalidad, lo que sugiere una posible contribución de la lesión orgánica tromboinflamatoria al resultado16.

Aunque en el presente estudio no se incluyó un grupo contemporáneo operado simulado, previamente demostramos que la laparotomía sin LL no resultó en TIC, lo que muestra la necesidad de una pérdida adicional rápida de sangre (choque) para producir las alteraciones características de la coagulación observadas con TIC14.

Varias consideraciones técnicas son importantes para la reproducibilidad de este modelo. Es necesario estandarizar la extensión y ubicación de la lesión hepática (LL), ya que la variación en la cantidad de hígado extirpado puede afectar considerablemente la gravedad del sangrado y la respuesta coagulopática resultante. En nuestro protocolo, se extirpa aproximadamente el 75 % del lóbulo hepático izquierdo, normalizando el peso del hígado lacerado respecto al peso corporal, lo que proporciona una medida objetiva de la consistencia del daño. El cierre abdominal rápido y seguro también es fundamental para prevenir la pérdida externa de sangre y mantener un entorno de hemorragia intraabdominal contenida durante el período de observación. Para una medición precisa de la pérdida sanguínea, las esponjas previamente pesadas deben recuperarse de manera consistente, utilizando el mismo procedimiento y momento de recolección en todos los grupos experimentales. Estos pasos minimizan la variación dependiente del operador y son particularmente importantes porque las diferencias en la pérdida inicial de sangre pueden influir en la coagulopatía y la supervivencia posteriores. Si ocurre un sangrado excesivo antes del cierre o se pierde sangre externamente, el animal debe ser excluido.

Una limitación de este modelo es que se centra en lesiones de órganos, lo cual no refleja la heterogeneidad del politraumatismo, que puede incluir fracturas de huesos largos, traumatismos por aplastamiento de tejidos blandos y otros estados complejos de shock. Sin embargo, esta lesión específica también es una característica intencionada del modelo, ya que permite estudiar los efectos de la hemorragia profunda y la CIP sin la complejidad y variabilidad procedimentales adicionales introducidas por múltiples modalidades de lesión. En conclusión, este modelo murino de LL proporciona un enfoque rentable (en comparación con estudios en animales grandes), robusto y escalable para investigar la hemorragia traumática, la CIP y la mortalidad. Al combinar una plataforma experimental sencilla con roedores pequeños, una lesión estandarizada, medición cuantitativa de la pérdida de sangre, perfilado hemostático completo y evaluación de la supervivencia, el modelo ofrece una alternativa práctica frente a modelos de trauma más complejos y con mayor instrumentación. Permite la evaluación integrada de la pérdida de volumen sanguíneo, coagulación (TCA, FII, FV, FVIII, FX, TAT), fibrinólisis (fibrinógeno, PAP, dímero D) y puntos finales de supervivencia en un contexto clínicamente relevante, adecuado para evaluar intervenciones antifibrinolíticas y tratamientos hemostáticos dirigidos.

Divulgaciones

A.v.D. ha recibido honorarios por participar en juntas asesoras científicas, consultorías y presentaciones académicas de BioMarin, Regeneron, Pfizer, Bioverativ/Sanofi, CSL Behring, Novo Nordisk, Spark Therapeutics, Genentech y uniQure. A.v.D. es cofundador de Hematherix LLC, una empresa biotecnológica que está desarrollando la terapia con superFVa para complicaciones hemorrágicas. B.C.J., M.L.C. y R.M. no tienen nada que declarar.

Agradecimientos

Agradecemos a Laurent Mosnier, PhD, por su asesoramiento técnico.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Aguja 25 GBD Diagnostics305124
Aguja 30 GBD Diagnostics305106
Sistema de anestesiaPatterson Scientific78915712
Reactivo de TTPa – STA-C.K. Prest. 5Stago597
AutoclipFine Science Tools12022-19
Aplicador de AutoclipFine Science Tools12020-09
Removedor de AutoclipFine Science Tools12023-00
Albúmina sérica bovinaSigma Aldrich10735078001
Cloruro de calcioFisher scientificC79-500
Tubo capilar – lisoFisher Scientific22-260943
Aplicador de algodónMedique19-090-701
Bolas de algodónFisher Scientific22-456-103
Kit ELISA de D-dímeroInvitrogenEEL094
Almohadilla isotérmica Delta PhaseBraintree Scientific50-195-4663
EtilenoFisher scientificBP28184
EthiqaFidelisSKU 072117
Plasma deficiente en factor IIAffinity BiologicalsFII-DP
Plasma deficiente en factor VAffinity BiologicalsFV-DP
Plasma deficiente en factor VIIIAffinity BiologicalsFVIII-DP
Plasma deficiente en factor XAffinity BiologicalsFX-DP
Papel filtro, extra grueso, 7 cm × 8,4 cmFisher ScientificPI88605
Pinzas de GraefeFine Science Tools11049-10
Cámara de inducciónPatterson Scientific78933385
Solución salina de grado inyectableHospira0409-4888-02
InnovinSiemens Healthineers23-044-778
IsofluranoMed Vet International50-304-2993
K824086 Chromogenix Coatest SP Factor VIIIDiapharma K822585
Adhesivo tisular rápido Liqui VetWorld Precision Instrument50-253-9340
Esterilizador de microperlasFisher scientific14-955-342
Tubos microcéntrifugos – 1,5 mLFisher ScientificAM12400
Kit multiplex de citocinas para ratónQuansys Biosciences 111049MS-13P
Kit de ensayo del complejo PAPBiotechneNBP3-06903
Povidona-yodoMed Vet International50-283-2277
Factor VII activado recombinante humanoNovo Nordisk0169-7001
Citrato de sodioFisher ScientificS279-500
Bata quirúrgicaStoelting10-000-695
Plataforma quirúrgica, manifold de anestesia para ratón Equaflow 5Patterson Scientific78919268
Tijeras quirúrgicasFine Science Tools91405-11
Cinta adhesivaFisher scientific15-901-5R
Kit de ensayo del complejo TATSiemens Healthineers23-044-704
TrombinaInvitrogenPIRP43100
Ácido tranexámicoAuromedics55150-0188-10
RecortadorStoelting10-000-792
Sistema de filtración con carbón activado WAGPatterson Scientific78909457
Barquilla para pesarFisher Scientific01-549-752

Referencias

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Coagulopatía inducida por traumacuantificación de la hemorragiamarcadores de inflamaciónanálisis de supervivenciamedición de la pérdida de sangrefactores de coagulaciónactivación de la fibrinólisisactivación inflamatoriamodulación farmacológica

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