Un protocolo optimizado para el modelo de estenosis valvular aórtica inducida por guía en ratones

Resumen

Este protocolo describe un modelo optimizado de estenosis valvular aórtica inducida por guía intravascular en ratones C57BL/6. Una plataforma de soporte vascular personalizada impresa en 3D permite un control preciso del sangrado, obteniendo un 95 % de supervivencia a las 24 horas (19/20) y un 90 % de éxito del modelo en general a las 4 semanas (18/20).

Resumen

La estenosis de la válvula aórtica (EVA) es una enfermedad cardiovascular importante cuya prevalencia aumenta en poblaciones de edad avanzada, aunque la escasez de tejido valvular enfermo limita severamente los estudios mecanicistas y el desarrollo de terapias. Este protocolo establece y optimiza un modelo murino reproducible de EVA mediante mejoras al método de lesión valvular inducida por guía de alambre de Honda, incorporando un manejo controlado de la hemorragia. Ratones C57BL/6 machos y hembras son sometidos a una lesión de la válvula aórtica inducida por guía de alambre; el procedimiento se perfecciona mediante una plataforma de soporte vascular personalizada impresa en 3D que permite un control preciso de la hemorragia durante la inserción y retirada del guía de alambre. Las medidas de resultado incluyen la supervivencia a las 24 horas, la evaluación ecocardiográfica a las 4 semanas y la validación histopatológica. El protocolo optimizado logra una tasa de supervivencia del 95 % a las 24 horas (19 de 20 animales); entre los supervivientes, el 94,7 % (18 de 19) cumple el criterio predefinido de éxito hemodinámico a las 4 semanas, obteniendo una tasa de éxito global del modelo del 90 % (18 de 20 animales), confirmada mediante ecocardiografía y análisis histológico. Este modelo estandarizado proporciona una plataforma fiable y reproducible para investigar los mecanismos de degeneración valvular y evaluar intervenciones terapéuticas candidatas.

Introducción

La enfermedad valvular cardíaca sigue siendo una carga sanitaria importante tanto en países desarrollados como en desarrollo, con una prevalencia que aumenta paralelamente al envejecimiento de la población¹. Aunque la implantación percutánea de válvula aórtica (TAVI) ha transformado el tratamiento de la estenosis aórtica grave^2,3, los mecanismos celulares y moleculares que impulsan la degeneración valvular aún no se comprenden completamente, y no existe ninguna terapia farmacológica aprobada para ralentizar o revertir la progresión de la enfermedad^4,5. Un obstáculo fundamental en la investigación de las enfermedades valvulares es la escasez de tejido enfermo disponible para su estudio^6,7. Es difícil obtener muestras de válvulas aórticas humanas en cantidad suficiente, y los modelos animales que reproduzcan de manera fiable los cambios valvulares patológicos también han sido igualmente escasos⁸. Esta carencia ha impulsado esfuerzos continuos por desarrollar modelos animales que reproduzcan las características hemodinámicas e histológicas de la estenosis valvular aórtica (AVS).

Los enfoques dietéticos convencionales, como la alimentación prolongada con alta grasa en ratones ApoE⁻/⁻, requieren de 20 a 24 semanas y presentan tasas de éxito bajas, con solo una minoría de animales desarrollando un fenotipo estenótico definitivo^9,10,11,12. El modelo de lesión valvular inducida por guía alámbrica descrito por Honda et al. abordó muchas de estas limitaciones al provocar mecánicamente una lesión en las valvas a través del acceso a la arteria carótida¹³. La técnica original implica disección de la arteria carótida, paso retrógrado del alambre guía hacia la válvula aórtica, rasguños repetidos en las valvas y rotación del alambre, lo que produce cambios hemodinámicos rápidos en cuestión de días y un fenotipo estenótico estable a las 4 semanas^13,14,15,16. Debido a su relativa rapidez y directividad, el método de Honda ha sido ampliamente adoptado en investigaciones valvulares recientes. Sin embargo, aún persisten varias lagunas importantes. Los detalles completos del procedimiento no han sido plenamente documentados en la literatura, falta estandarización entre laboratorios y el papel del control de hemorragia, un determinante importante de la morbilidad perioperatoria en este modelo, nunca ha sido abordado sistemáticamente. Estas inconsistencias reducen la reproducibilidad y limitan la traslacionalidad clínica.

Se planteó la hipótesis de que la optimización sistemática del control de hemorragia podría mejorar significativamente la supervivencia perioperatoria y la fiabilidad del modelo. Este protocolo presenta un enfoque perfeccionado y estandarizado que se basa en el método de Honda mediante la introducción de una plataforma de soporte vascular personalizada fabricada por impresión 3D. El dispositivo permite una tensión longitudinal ajustable sobre la arteria carótida, proporcionando una hemostasia temporal completa durante la inserción y retirada del alambre guía sin comprimir el vaso. Con este enfoque, el protocolo optimizado logra una tasa de supervivencia del 95 % a las 24 horas (19 de 20 animales); entre los supervivientes, el 94,7 % (18 de 19) cumple el criterio predefinido de éxito hemodinámico a las 4 semanas, lo que arroja una tasa global de éxito del modelo del 90 % (18 de 20 animales). Se proporciona documentación procedimental paso a paso para facilitar la reproducibilidad entre laboratorios.

Protocolo

NOTA: Todos los procedimientos con animales descritos en este protocolo se realizaron de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (IACUC) del Hospital de Occidente de China (Protocolo N.º 20240311055). Se utilizaron ratones macho C57BL/6 (8–10 semanas; aproximadamente 22–25 g) y ratones hembra C57BL/6 (8–10 semanas; aproximadamente 18–20 g). Todos los materiales, reactivos, instrumentos, software y dispositivos personalizados utilizados en este protocolo, incluida la plataforma de soporte vascular personalizada impresa en 3D, se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación preoperatoria e incisión quirúrgica

1. Anestesiar al ratón con isoflurano (3% para inducción, 1,5–2% para mantenimiento) vaporizado en oxígeno al 100%. Confirmar la profundidad adecuada de la anestesia verificando la ausencia de reflejos de retirada plantar (presión en los dedos del pie).
   ADVERTENCIA: El isoflurano es un anestésico volátil. Utilícelo con un sistema de captación activa o en un área bien ventilada, use equipo de protección personal adecuado y siga los procedimientos de seguridad institucionales.
2. Aplicar una pomada oftálmica en ambos ojos. Colocar al ratón en posición supina sobre una plataforma quirúrgica regulada por temperatura mantenida a 37 °C.
3. Preparar el campo quirúrgico depilando la región cervical anterior con una crema química para la eliminación del vello.
4. Desinfectar la piel con tres ciclos alternos de povidona-yodo (o clorhexidina) y alcohol al 70% (o solución salina estéril tibia), finalizando con el antiséptico.
5. Infiltrar lidocaína al 0,5% subcutáneamente a lo largo de la línea de incisión prevista para analgesia local preventiva.
6. A continuación, realizar una incisión longitudinal media en la piel (aproximadamente de 1,0–1,5 cm) en la región anterior del cuello, posicionada ligeramente a la derecha de la línea media traqueal, utilizando tijeras microquirúrgicas.
   ADVERTENCIA: Las tijeras microquirúrgicas, agujas, guías, y otros objetos punzantes pueden causar lesiones. Manipúlelos con cuidado y deseche los objetos punzantes usados en contenedores aprobados para residuos punzantes.

2. Aislamiento del vaso y colocación del hilo

1. Bajo un estereomicroscopio quirúrgico, exponga la arteria carótida común derecha (ACCD) mediante disección roma a través de las capas fasciales y musculares superpuestas. Separe cuidadosamente la ACCD del nervio vago adyacente y del tejido conectivo circundante, teniendo cuidado de evitar la irritación mecánica del nervio vago.
   NOTA: Mantenga las glándulas salivales y los tejidos expuestos húmedos con solución salina estéril tibia durante todo el procedimiento para prevenir la desecación.
2. Ligue permanentemente el extremo distal de la ACCD con una sutura de seda 6-0 anudada en un nudo seguro que no se deslice.
3. Coloque un lazo suelto de sutura de seda 6-0 alrededor del segmento proximal de la ACCD, dejándolo sin apretar para su uso posterior durante la inserción del alambre guía.

3. Aplicación de la plataforma y arteriotomía

NOTA: Antes de la cirugía, esterilice la plataforma impresa en 3D utilizando gas de óxido de etileno (EtO), seguido de una adecuada aireación, y esterilice todos los instrumentos quirúrgicos metálicos mediante autoclave.

ADVERTENCIA: El óxido de etileno es tóxico, inflamable y carcinogénico. Utilice la esterilización con EtO únicamente en instalaciones autorizadas, permita una aireación adecuada y siga los procedimientos institucionales de manejo de desechos.

1. Inserte cuidadosamente la plataforma de soporte vascular impresa en 3D debajo del segmento aislado de la RCCA, colocando el vértice en forma de V invertida directamente bajo el vaso.
2. Ajuste lentamente la plataforma para aumentar la tensión longitudinal sobre la RCCA, introduciendo las suturas previamente colocadas en muescas laterales progresivamente más altas.
   NOTA: El vértice en forma de V invertida está diseñado con un ángulo de 120° para adaptarse a la curvatura del vaso sin comprimir la pared. Detenga el aumento de tensión en el momento exacto en que ya no sea perceptible visualmente la pulsación arterial. Este punto final visual crítico asegura una hemostasia temporal sin lesión excesiva del vaso.
3. Realice una arteriotomía transversal pequeña (aproximadamente la mitad de la circunferencia del vaso) en el segmento de RCCA estabilizado, utilizando tijeras microquirúrgicas. Debe ocurrir un sangrado mínimo o nulo si la tensión se ha ajustado correctamente.

4. Inserción del guía y lesión valvular

1. Bajo visualización microscópica, inserte el alambre guía (diámetro de 0,014 pulgadas / 0,36 mm) en la luz arterial a través de la arteriotomía transversal en dirección retrógrada hacia la raíz aórtica.
   NOTA: Este calibre es estándar en los modelos publicados de lesión con alambre guía y se aproxima al diámetro luminal de la ACCd murina (~0,4–0,5 mm), lo que proporciona una relación alambre guía-vaso de aproximadamente 0,7–0,9.
   ADVERTENCIA: El alambre guía puede perforar vasos o tejidos circundantes. Avance lentamente bajo visualización y deseche los alambres usados como objetos punzantes o desechos quirúrgicos contaminados.
2. Ajuste el nudo corredizo proximal previamente colocado alrededor del vaso y del alambre guía para lograr hemostasia completa en el sitio de inserción. Una vez asegurado el nudo corredizo, retire cuidadosamente la plataforma impresa en 3D de debajo del vaso.
   NOTA: Si ocurre sangrado inesperado durante la inserción, o si el diámetro del alambre guía genera fricción excesiva, reposicione temporalmente la plataforma para ayudar con la hemostasia, o reduzca ligeramente la tensión de la plataforma para permitir que la luz del vaso se expanda antes de intentar nuevamente la inserción.
3. Avance cuidadosamente el alambre guía en dirección retrógrada a través de la ACCd, más allá del arco aórtico y hacia la válvula aórtica. Bajo guía ecocardiográfica en tiempo real, confirme que la punta del alambre guía ha cruzado la válvula aórtica y ha entrado en el ventrículo izquierdo.
4. Con el nudo corredizo proximal completamente ajustado para mantener la hemostasia, realice la lesión mecánica de la válvula ejecutando 100 movimientos de empuje-tracto (hacia adelante y hacia atrás) a través de la válvula aórtica, seguidos de 100 movimientos rotacionales del alambre guía contra los velos valvulares.
   NOTA: Los 100 movimientos de empuje-tracto y los 100 movimientos rotacionales se establecieron mediante una extensa optimización interna como los valores que mejor equilibran el tiempo del procedimiento con la inducción confiable de una estenosis hemodinámicamente significativa.

5. Retiro del guía y cierre de la herida

1. Tras finalizar la lesión valvular, retire lentamente el alambre guía del vaso.
2. Convierta inmediatamente el nudo corredizo proximal en un nudo permanente no deslizable para ligar la arteria carótida común proximal (RCCA) y prevenir cualquier sangrado postprocedimiento.
3. Cierre la incisión cutánea con puntos de sutura de nylon 5-0 interrumpidos o con grapas quirúrgicas para heridas.
4. No administre fármacos antiinflamatorios no esteroideos (NSAIDs) posoperatorios. No administre antibióticos perioperatorios, ya que el procedimiento se realiza bajo condiciones asépticas.
5. Transfiera el animal a una jaula de recuperación limpia y calentada, y monitórelo continuamente hasta que se restablezca la deambulación completa.

6. Evaluación ecocardiográfica de la hemodinámica transvalvular

1. Realice evaluaciones ecocardiográficas en todos los ratones supervivientes a las 4 semanas posteriores a la cirugía para evaluar la gravedad de la estenosis valvular aórtica.
2. Induzca anestesia colocando al animal en una cámara de inducción con 3% de isoflurano en oxígeno al 100%. Confirme la profundidad anestésica verificando la pérdida de los reflejos de retirada plantar. Depile la pared torácica anterior utilizando una crema química para la eliminación del vello. Aplique una pomada oftálmica en ambos ojos para prevenir la desecación corneal.
3. Transfiera al ratón anestesiado a una plataforma de imagen regulada en temperatura en posición supina.
4. Sujete las patas a electrodos electrocardiográficos (ECG) de superficie para monitoreo continuo de la frecuencia cardíaca. Titule la concentración de isoflurano (típicamente 1,0–1,5%) para mantener una frecuencia cardíaca fisiológica estable de 450–550 latidos por minuto.
5. Limpie la pared torácica anterior y aplique una capa generosa de gel acoplante acústico precalentado.
6. Adquisición de imagen en modo B
   1. Utilizando un sistema de ultrasonidos Vevo 3100 con un transductor MX550D (40 MHz), presione el control Modo B para iniciar la imagen bidimensional en tiempo real.
   2. Coloque el transductor en posición parasternal izquierda para obtener una vista longitudinal parasternal del ventrículo izquierdo, la válvula aórtica y la aorta ascendente. Optimice la profundidad, el ancho y la ganancia en 2D.
7. Adquisición en modo M y medición del ventrículo izquierdo
   1. Desde la vista longitudinal parasternal, presione el control Modo M. Coloque la línea de muestreo a través del ventrículo izquierdo al nivel de los músculos papilares.
   2. Presione Iniciar para comenzar la adquisición. Una vez obtenido un trazado estable que abarque al menos tres ciclos cardíacos, presione Guardar.
   3. En Vevo LAB, utilice la herramienta Trazado VI para trazar el endocardio en telediástole y telesístole, y registre las dimensiones internas del ventrículo izquierdo, los espesores de las paredes anterior y posterior (LVAWd, LVPWd) y la masa del ventrículo izquierdo.
8. Reposicione y angule el transductor para obtener una vista específica del arco aórtico.
   ​NOTA: Obtener esta vista específica del arco aórtico es esencial para mediciones precisas de la velocidad transvalvular, ya que asegura una alineación óptima del haz de ultrasonido con la dirección del flujo sanguíneo a través de la válvula aórtica.
9. Evaluación con Doppler en color
   1. Desde la vista del arco aórtico, presione el control Color. Coloque el cuadro de color sobre la válvula aórtica y la porción proximal de la aorta ascendente.
   2. Ajuste la escala de color y la ganancia para que el chorro sistólico se visualice claramente sin aliasing. Presione Iniciar, luego Guardar.
10. Medición de velocidad con Doppler de onda pulsada
    1. Presione el control Doppler de onda pulsada (PW). Coloque la compuerta de volumen de muestra en el punto más estrecho del chorro (vena contracta) y aplique corrección de ángulo (<60°).
    2. Presione Iniciar para comenzar el trazado espectral; una vez registrados al menos tres ciclos cardíacos, presione Guardar. En Vevo LAB, mida la velocidad pico transvalvular con la herramienta Velocidad Pico, promediando al menos tres ciclos.

7. Procesamiento histológico y tinción de la raíz aórtica

1. Tras la evaluación ecocardiográfica, confirme una anestesia profunda verificando la ausencia completa del reflejo de retirada plantar. Realice la disección cervical como método secundario de eutanasia, de acuerdo con las Guías de la AVMA para la Eutanasia de Animales (edición 2020) y los protocolos aprobados institucionalmente.
   ADVERTENCIA: Los cadáveres animales, los tejidos extirpados y los materiales contaminados con sangre son desechos biológicos/animales. Desecharlos según las regulaciones institucionales de bioseguridad y de las instalaciones animales.
2. Realice una toracotomía utilizando microtijeras quirúrgicas para exponer el corazón.
3. Introduzca una aguja de perfusión en el ápice del ventrículo izquierdo y lave la circulación sistémica con solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril y fría. La perfusión exitosa se indica por el blanqueamiento del hígado y los pulmones.
4. Extraiga el corazón intacto y sumérjalo en paraformaldehído al 4% (PFA) a temperatura ambiente durante un mínimo de 24 h para asegurar una fijación completa.
   ADVERTENCIA: El paraformaldehído es tóxico e irritante. Manipule el PFA al 4% en una campana extractora de gases químicos con equipo de protección personal adecuado y deseche los residuos de PFA como desechos químicos peligrosos.
5. Transfiera el tejido fijado a un procesador automático de tejidos para deshidratación secuencial mediante una serie graduada de etanol, seguida de clarificación con xileno e infiltración con parafina a 65 °C.
   ADVERTENCIA: El xileno es inflamable y tóxico, y la parafina caliente puede causar quemaduras. Manipule el xileno en una campana extractora o en un procesador aprobado y deseche los residuos que contengan xileno como desechos químicos peligrosos.
6. Incorpore los corazones procesados en bloques de parafina.
   NOTA: La orientación correcta del corazón durante la inclusión es fundamental. Coloque el corazón de manera que permita seccionar transversalmente a través de la raíz aórtica a nivel de las tres valvas.
7. Utilizando un microtomo rotatorio, corte secciones transversales seriadas de 4–5 µm de grosor a través del plano de la válvula aórtica, asegurándose de capturar las tres valvas. Monte las secciones sobre portaobjetos de vidrio y almacénelas a temperatura ambiente.
8. Realice tinción con hematoxilina y eosina (H&E) en portaobjetos seleccionados para evaluar la morfología del tejido, el remodelado estructural y el grosor de las valvas valvulares.
9. Realice tinción de Von Kossa en secciones seriadas adyacentes para detectar y cuantificar la calcificación distrófica, identificable como depósitos minerales de color marrón oscuro a negro dentro de las valvas valvulares.

8. Procedimiento quirúrgico simulado

NOTA: Esta sección describe el procedimiento de control simulado. Los ratones de control simulado reciben la misma anestesia, preparación de la piel, exposición del vaso, arteriotomía e inserción retrógrada del guía que el grupo con lesión por alambre aórtico (AWI); el alambre guía se avanza hasta el nivel supravalvular, pero no se pasa a través de la válvula aórtica, y no se realiza ninguna lesión mecánica de la válvula.

1. Anestesiar al ratón y preparar el campo quirúrgico como se describe en los pasos 1.1 a 1.5.
2. Bajo visualización con microscopio estereoscópico, exponer la ACCD mediante disección roma como se describe en el paso 2.1.
3. Ligar permanentemente el extremo distal de la ACCD con una sutura de seda 6-0 y colocar un lazo deslizante proximal suelto (como en los pasos 2.2–2.3).
4. Realizar la arteriotomía transversal e insertar el alambre guía como se describe en los pasos 3.1–4.2.
5. Avanzar el alambre guía en dirección retrógrada hasta el nivel supravalvular de la aorta ascendente con guía ecocardiográfica, confirmando que la punta del alambre guía NO cruce la válvula aórtica.
   NOTA: NO realizar los movimientos de empuje-estiramiento o rotación que lesionan la válvula descritos en el paso 4.4. Retirar el alambre guía e inmediatamente ligar la ACCD proximal como se describe en los pasos 5.1–5.2.
6. Cerrar la incisión cutánea con suturas separadas de nilón 5-0 o clips para heridas.
   NOTA: Como en el grupo AWI, la analgesia intraoperatoria se proporciona mediante infiltración local de lidocaína (paso 1.5). Transferir al animal a una jaula de recuperación calentada y monitorearlo hasta que recupere completamente la deambulación.
7. Someter a los ratones Sham al mismo monitoreo posoperatorio, evaluación ecocardiográfica a las 4 semanas y procesamiento histológico que el grupo AWI.

9. Análisis estadístico y diseño del estudio

1. En todo el estudio, a 20 ratones (10 machos, 10 hembras) se les realizó el procedimiento AWI, y a 6 ratones C57BL/6 (3 machos, 3 hembras) se les realizó el procedimiento Sham.
2. Mida la velocidad pico transvalvular (el criterio que define el éxito del modelo) en todos los animales sobrevivientes (19 AWI, 6 Sham).
3. Analice índices ecocardiográficos e histológicos detallados en un subgrupo predeterminado y equilibrado por sexo de 6 ratones AWI (3 machos, 3 hembras).
4. Asegúrese de que todas las mediciones ecocardiográficas e histológicas sean realizadas por investigadores ciegos respecto a la asignación del grupo.
5. Evalue la normalidad de los datos con la prueba de Shapiro-Wilk antes de realizar pruebas paramétricas. Compare dos grupos independientes (AWI frente a Sham) utilizando una prueba t de Student no pareada de dos colas.
6. Analice y presente los datos de supervivencia utilizando el método de Kaplan-Meier.
7. Realice todos los análisis en GraphPad Prism. Presente los datos como media ± EE, considerando estadísticamente significativo un valor de p < 0,05.

Resultados

Desarrollo de una plataforma impresa en 3D para el control de hemorragias

Para abordar la hemorragia peroperatoria—la principal causa de morbilidad y mortalidad en el modelo convencional de AVS inducido por guía metálica—se diseñó una plataforma de soporte vascular impresa en 3D (Figura 1). La plataforma fue fabricada mediante impresión por estereolitografía (SLA) utilizando una resina fotopolimérica biocompatible (conforme con USP Clase VI / ISO 10993), con un espesor estructural de 1,07 mm. Después de la impresión, las piezas se lavaron con alcohol isopropílico para eliminar la resina no curada y se sometieron a un curado posterior bajo luz ultravioleta. Se proporciona el archivo de diseño completo (.stp) para que la plataforma pueda reproducirse en sistemas SLA estándar. La plataforma presenta una superficie apical en forma de V invertida con un ángulo de vértice de 120° (Figura 1A–B), que se adapta a la curvatura de la arteria carótida común derecha aislada sin inducir una compresión excesiva de la pared. Múltiples muescas laterales escalonadas (Figura 1C–D) permite al operador enganchar las suturas previamente colocadas y aplicar una tensión longitudinal ajustable al vaso. La tensión se incrementa progresivamente hasta que ya no sea visible la pulsación arterial, un punto final visual que indica una hemostasia temporal adecuada. Este enfoque proporciona un campo quirúrgico estable para la arteriotomía y la inserción del guía, al tiempo que evita lesiones por aplastamiento excesivo en la pared vascular.

Confirmación intraoperatoria de la colocación del alambre guía

La colocación correcta del alambre guía se verificó en dos etapas durante el procedimiento. Primero, mediante visualización estereomicroscópica directa, se observó que el alambre guía entraba en la luz de la ACCD a través de la arteriotomía transversal en dirección retrógrada (Figura 2A). En segundo lugar, la ecocardiografía en tiempo real confirmó que la punta del alambre guía había cruzado la válvula aórtica y entrado en el ventrículo izquierdo. La imagen en modo B identificó el alambre guía como un artefacto lineal hiperecogénico que atravesaba el plano de la válvula aórtica. (Figura 2B). La imagen Doppler de color mostró un flujo turbulento localizado a nivel de la válvula aórtica, lo que proporcionó una confirmación adicional del posicionamiento del alambre guía a través de las valvas valvulares (Figura 2C; Vídeo suplementario 1).

Supervivencia perioperatoria y tasa de éxito del modelo

La integración de la plataforma ajustable de tensión en el flujo quirúrgico resultó en una alta supervivencia temprana. El análisis de Kaplan-Meier demostró una tasa de supervivencia del 95 % a las 24 h posteriores a la cirugía (19 de 20 ratones; Figura 3A). El examen post mortem del único no sobreviviente no reveló evidencia de hemorragia importante, daño estructural o isquemia cardíaca, lo que sugiere que la muerte se debió a complicaciones relacionadas con la anestesia y no al trauma quirúrgico. El éxito del modelo a las 4 semanas se evaluó mediante un criterio predefinido: una velocidad pico del flujo transvalvular superior a 2.000 mm/s, junto con hallazgos histológicos de apoyo. De los 19 animales sobrevivientes, 18 (94,7 %) cumplieron con este umbral, lo que arrojó una tasa de éxito del modelo del 90 % en todo el grupo (18 de 20 ratones; Figura 3B). Los resultados fueron comparables entre sexos: la supervivencia a las 24 h fue de 9 de 10 en machos y de 10 de 10 en hembras, y la tasa de éxito del modelo a las 4 semanas fue de 9 de 10 (90 %) en ambos sexos; la única muerte peroperatoria fue en un macho (relacionada con anestesia) y el único fracaso del modelo correspondió a una hembra sobreviviente.

Confirmación ecocardiográfica de la estenosis aórtica

La ecocardiografía transtorácica a las 4 semanas posteriores a la cirugía confirmó cambios hemodinámicos compatibles con estenosis aórtica severa en el grupo AWI. Los valores ecocardiográficos cuantitativos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM); los parámetros funcionales y de remodelado del ventrículo izquierdo se analizaron en 6 ratones Sham y 6 ratones AWI, mientras que la velocidad pico del chorro transvalvular se midió en todos los ratones AWI sobrevivientes y en los controles Sham (n = 19 AWI, n = 6 Sham). La fracción de eyección del ventrículo izquierdo fue ligeramente menor en el grupo AWI que en los controles Sham a las 4 semanas (56,21 ± 1,15 % frente a 61,57 ± 2,12 %; p = 0,0503; Figura 3C), una diferencia que no alcanzó significación estadística. Los registros de Doppler de onda pulsada mostraron un aumento marcado en la velocidad del chorro transvalvular en el grupo AWI, alcanzando 2740,89 ± 104,10 mm/s, en comparación con 988,00 ± 126,24 mm/s en el grupo control Sham (Figura 3D). El análisis cuantitativo confirmó un aumento altamente significativo en la velocidad pico del chorro transvalvular en el grupo AWI en relación con los controles Sham (p < 0,0001; Figura 3E). En consonancia con una fase temprana de adaptación a la sobrecarga de presión, el grupo AWI presentó remodelado concéntrico del ventrículo izquierdo: el grosor diastólico de la pared anterior aumentó significativamente (LVAWd 1,14 ± 0,02 frente a 0,96 ± 0,03 mm; p = 0,0016; Figura 3F), mientras que el grosor diastólico de la pared posterior y la masa del ventrículo izquierdo fueron mayores, aunque sin alcanzar significación estadística (LVPWd 1,01 ± 0,12 frente a 0,76 ± 0,02 mm, p = 0,0650, Figura 3G; masa del VI 124,51 ± 10,63 frente a 104,47 ± 2,45 mg, p = 0,0961, Figura 3H).

Validación histopatológica del remodelado valvular y la calcificación

El examen histológico de las raíces aórticas corroboró los hallazgos ecocardiográficos. Los valores histológicos cuantitativos se presentan como media ± EE y se analizaron en 6 ratones Sham y 6 ratones AWI. La tinción H&E en el grupo AWI reveló un engrosamiento pronunciado de las valvas y una desorganización estructural, características que estaban ausentes en los controles Sham (Figura 3I). La morfometría cuantitativa confirmó un aumento significativo en el grosor medio de las valvas valvulares en el grupo AWI en comparación con el grupo Sham (p < 0,0001; Figura 3J). La tinción de Von Kossa demostró una calcificación distrófica extensa dentro de las valvas valvulares engrosadas del grupo AWI, identificada como depósitos minerales de color marrón oscuro a negro. Los controles Sham mostraron una deposición mineral despreciable (Figura 3K). El análisis cuantitativo de imágenes reveló un aumento significativo en el área total de calcificación (µm²) en el grupo AWI en relación con los controles Sham (p < 0,0001; Figura 3L).

Figura 1: Diseño de la plataforma de soporte vascular impresa en 3D mostrada en cuatro vistas. (A) Vista oblicua frontal-izquierda. (B) Vista oblicua posterior-derecha. (C) Vista lateral del perfil longitudinal general de la plataforma. (D) Vista en ángulo que resalta la región apical en forma de V invertida. Etiquetas de los componentes: 110, cuerpo de la plataforma; 120, brazos laterales; 121, muescas laterales escalonadas; 130, extremo de operación; 140, ápice de inserción en forma de V invertida; 150, superficie de soporte de contacto con el vaso; 160, pendiente de transición entre muescas adyacentes; 190, arteria carótida común derecha (RCCA). La plataforma está fabricada a partir de una resina fotopolimérica biocompatible (espesor estructural: 1,07 mm). El dibujo estructural 3D fue generado por los autores a partir del archivo CAD original (.stp) de la plataforma de soporte vascular utilizando FreeCAD, un software gratuito y de código abierto para visualización y modelado CAD. No se adaptó ninguna publicación de terceros ni dibujo con derechos de autor. El archivo CAD original está disponible como archivo complementario. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Confirmación intraoperatoria y ecocardiográfica del posicionamiento del alambre guía. (A) Fotografía intraoperatoria que muestra la inserción retrógrada del alambre guía (flecha) a través de la arteriotomía transversa hacia la luz de la arteria carótida común derecha (RCCA), visualizada directamente mediante microscopía estereoscópica. (B) Imagen ecocardiográfica en modo B que muestra el alambre guía (identificado como un artefacto lineal hiperecogénico; flecha) atravesando la válvula aórtica e ingresando al ventrículo izquierdo. (C) Imagen ecocardiográfica con Doppler color que demuestra un flujo turbulento localizado a nivel de la válvula aórtica, confirmando el posicionamiento del alambre guía a través de las valvas. La visualización en tiempo real del flujo transvalvular mediante Doppler color durante el posicionamiento del alambre guía se muestra en Video Suplementario 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Resultados de supervivencia, hemodinámicos, remodelación ventricular y histopatológicos del modelo optimizado de lesión aórtica con alambre (AWI, por sus siglas en inglés). (A) Curva de supervivencia a las 24 h según Kaplan-Meier en ratones AWI (n = 20). (B) Éxito (rojo) frente a fracaso (negro) en el grupo AWI a las 4 semanas (n = 20); el éxito se definió como una velocidad transvalvular pico > 2.000 mm/s. (C) Fracción de eyección (FE; p = 0,0503). (D) Ecocardiogramas representativos con Doppler de onda pulsada (PW) de un ratón falso operado (Sham, izquierda) y un ratón AWI (derecha). (E) Velocidad transvalvular pico (n = 19 AWI, n = 6 Sham; p < 0,0001). (F) Grosor diastólico de la pared anterior del ventrículo izquierdo (LVAWd; p = 0,0016). (G) Grosor diastólico de la pared posterior del ventrículo izquierdo (LVPWd; p = 0,0650). (H) Masa del ventrículo izquierdo (p = 0,0961). (I) Secciones representativas de la raíz aórtica teñidas con hematoxilina-eosina (HE) (Sham, izquierda; AWI, derecha). (J) Grosor de las cúspides de la válvula aórtica (p < 0,0001). (K) Secciones representativas de la raíz aórtica teñidas con Von Kossa (Sham, izquierda; AWI, derecha). (L) Área total de depósito de calcio (µm²; p < 0,0001). Barras de escala = 500 µm. En todos los gráficos de barras cuantitativos, las barras representan valores medios y las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). Las comparaciones cuantitativas entre los grupos Sham y AWI en los paneles C, E–H, J y L se realizaron mediante una prueba t de Student no pareada de dos colas. Los datos cuantitativos proceden de los grupos Sham y AWI (n = 6 por grupo), excepto la velocidad transvalvular pico en el panel E, que se midió en todos los ratones AWI supervivientes y controles Sham (n = 19 AWI, n = 6 Sham). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Vídeo suplementario 1: Visualización ecocardiográfica con Doppler color del flujo sanguíneo transvalvular durante la colocación del alambre guía. El vídeo muestra imágenes en tiempo real con Doppler color a nivel de la válvula aórtica durante el procedimiento AWI, evidenciando un flujo turbulento localizado inducido por la colocación del alambre guía a través de las valvas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Este protocolo proporciona una descripción detallada de un modelo animal estable y seguro de estenosis aórtica. Una característica de este enfoque es una plataforma auxiliar que facilita la inserción del alambre guía en la arteria carótida común. La plataforma se fabrica mediante impresión por estereolitografía (SLA) a partir de una resina fotopolimérica biocompatible (espesor estructural de 1,07 mm) e incorpora una superficie apical en forma de V invertida con un ángulo apical de 120°; el archivo completo de diseño está disponible gratuitamente como archivo suplementario .stp. Este dispositivo asegura una entrada suave del alambre guía, controla objetivamente la pérdida sanguínea perioperatoria y, por lo tanto, protege tanto la supervivencia a corto como a largo plazo de los ratones del modelo. Desde la descripción original, el modelo inducido por alambre guía se ha perfeccionado y caracterizado aún más, incluyendo variantes de gravedad graduada que titulan la intensidad de la lesión para producir estenosis de leve a severa¹⁷ y reportes recientes que documentan sus complicaciones perioperatorias¹⁸; el presente protocolo se basa en este conjunto de trabajos abordando sistemáticamente la hemorragia perioperatoria.

Varios pasos en este protocolo son fundamentales para una inducción exitosa del modelo y merecen especial atención. En primer lugar, el grado de tensión longitudinal aplicada mediante la plataforma impresa en 3D debe calibrarse con precisión: la tensión debe aumentarse únicamente hasta que la pulsación arterial deje de ser perceptible visualmente. Una tensión insuficiente provoca sangrado continuo durante la arteriotomía, mientras que una tensión excesiva conlleva el riesgo de daño endotelial y ruptura del vaso. En segundo lugar, el nudo corredizo proximal debe ajustarse firmemente alrededor del vaso y del guía antes de retirar la plataforma; la eliminación prematura de la plataforma con un nudo corredizo insuficientemente asegurado es la causa más común de hemorragia durante el procedimiento. En tercer lugar, es esencial confirmar, mediante guía ecocardiográfico, la entrada del guía en el ventrículo izquierdo. Sin esta verificación, el operador no puede asegurar que el guía esté correctamente posicionado en la válvula aórtica, y una lesión incompleta dará como resultado el fracaso del modelo.

Se pueden anticipar y manejar varias complicaciones comunes. Si ocurre sangrado durante la inserción del alambre guía, la plataforma debe reposicionarse debajo del vaso para restablecer la hemostasia temporal antes de continuar. En animales con arterias carótidas de menor calibre, reducir ligeramente la tensión de la plataforma puede expandir la luz del vaso para acomodar el alambre guía. Este modelo tiene varias limitaciones que deben considerarse al interpretar los resultados. La lesión mecánica con alambre produce una lesión aguda mecánica e inflamatoria de la válvula, que difiere del proceso degenerativo crónico impulsado por lípidos que caracteriza la estenosis aórtica calcificada humana^17,19,20,21. En consecuencia, las características histológicas —aunque reproducen el engrosamiento valvular y la calcificación distrófica— podrían no recapitular completamente todos los eventos moleculares de la enfermedad humana. El protocolo fue desarrollado y validado en ratones C57BL/6 de ambos sexos con edades entre 8 y 10 semanas; sin embargo, la aplicabilidad a otras cepas o animales de edad avanzada requiere validación independiente. Las diferencias relacionadas con el sexo en el diámetro de la arteria carótida y en la anatomía cardíaca pueden modular la dificultad quirúrgica y los resultados hemodinámicos; se recomienda a los investigadores informar el sexo como una variable biológica en los análisis posteriores²². Además, la ligadura permanente de la arteria carótida común derecha es inherente al procedimiento, aunque el círculo de Willis proporciona perfusión colateral cerebral en ratones, y no se observaron déficits neurológicos evidentes, no pueden descartarse efectos cognitivos sutiles o alteraciones cerebrovasculares. No se realizó ecocardiografía basal (previa al procedimiento); el grupo simulado concurrente sirvió como control para la función valvular normal, y se recomienda realizar una exploración basal cuando sea factible, para permitir comparaciones intra-animales y para detectar las raras anomalías espontáneas de la válvula aórtica descritas en ratones C57BL/6 (~0,3 % en cepas no modificadas). La insuficiencia aórtica no fue evaluada sistemáticamente en este estudio; la frecuencia de insuficiencia aórtica inducida por la lesión y su relación con la gravedad de la estenosis requiere una evaluación específica y será abordada en trabajos futuros.

También se deben considerar las desventajas potenciales de la plataforma. El dispositivo podría irritar mecánicamente estructuras adyacentes, incluido el nervio vago que discurre junto a la arteria carótida; este riesgo se minimiza gracias a los bordes redondeados y romos de la plataforma, a su ápice de 120° que se adapta al vaso y a su breve tiempo de aplicación, y en este estudio no se observaron anomalías respiratorias ni otras complicaciones evidentes atribuibles al dispositivo. En comparación con los enfoques alternativos establecidos, este protocolo optimizado ofrece varias ventajas prácticas. Los modelos dietéticos en ratones ApoE⁻/⁻ requieren de 20 a 24 semanas de alimentación con dieta rica en grasas y producen fenotipos estenóticos variables, con muchos animales que no desarrollan enfermedad hemodinámicamente significativa. El presente protocolo genera un fenotipo estenótico consistente en 4 semanas, con una tasa de éxito general del 90 % (18 de 20 animales). En comparación con el método original de alambre guía de Honda, el avance principal de este protocolo es el control sistemático de la hemorragia perioperatoria mediante la plataforma impresa en 3D.

Se ha reconocido que la hemorragia durante la inserción del alambre guía es una complicación de la técnica original, pero se ha abordado de forma insuficiente. En la experiencia retrospectiva del mismo laboratorio con el procedimiento convencional (previo a la plataforma) (más de 400 casos), se produjo hemorragia intraoperatoria importante en aproximadamente el 40 % de los casos, con una mortalidad posthemorragia del ~60 % y una supervivencia a las 24 horas del ~75 %, siendo la hemorragia —principalmente en el sitio de acceso carotídeo— responsable prácticamente de todas las muertes peroperatorias. Esto concuerda con Qian et al., quienes identificaron el sangrado en el sitio de punción carotídeo como la causa principal de muerte peroperatoria en este modelo. Al controlar la pérdida sanguínea, la plataforma impresa en 3D aumentó la supervivencia a 24 horas hasta el 95 %, sin que se observara ninguna muerte atribuible a hemorragia en la cohorte actual. Dado que la hemorragia ya no es la preocupación limitante, la intensidad de la lesión mecánica puede variarse para producir una gravedad de estenosis graduada. Esta capacidad de ajuste tiene una relevancia traslacional directa: para terapéuticos candidatos con tamaños de efecto modestos, puede ser necesario un daño basal más severo para revelar diferencias relacionadas con el tratamiento que de otro modo quedarían enmascaradas en un modelo más leve.

Este modelo es muy adecuado para varias categorías de investigaciones posteriores. Dado que el fenotipo estenótico se desarrolla dentro de un período de tiempo definido y reproducible, puede servir como una plataforma para la evaluación preclínica de terapias farmacológicas candidatas destinadas a ralentizar la calcificación o fibrosis valvular²³. El modelo también es compatible con enfoques genéticos: el protocolo puede aplicarse a ratones transgénicos o knockout en el fondo C57BL/6 para desentrañar la contribución de vías de señalización específicas en la progresión de la enfermedad valvular. Además, el punto final a las 4 semanas ofrece una ventana práctica para el monitoreo ecocardiográfico seriado de la evolución de la enfermedad o de la respuesta al tratamiento. Los archivos de diseño de la plataforma impresa en 3D pueden compartirse libremente como un archivo suplementario .stp, y se espera que la estandarización de este dispositivo entre laboratorios mejore aún más la reproducibilidad entre sitios.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Plataforma de soporte vascular impresa en 3D	Personalizado	N/A	Plataforma de soporte vascular personalizada impresa en 3D; archivo CAD complementario proporcionado en formato .stp.
Paraformaldehído al 4%	Servicebio	G1101-3ML	Fijación de tejidos
Sutura de nailon 5-0	Jinhuan Medical	F503	Cierre de la piel mediante suturas interrumpidas
Sutura de seda 6-0	Jinhuan Medical	RC411	Ligadura permanente de la RCCA distal y nudo corredizo proximal
Gel acústico de acoplamiento (precalentado)	Keppler	KL-250	Ecocardiografía
Resina fotopolimerizable biocompatible	Formlabs	RS-F2-BMCL-01	Material de impresión SLA utilizado para fabricar la plataforma de soporte vascular personalizada impresa en 3D.
Ratones C57BL/6 (8–10 semanas; machos de 22–25 g, hembras de 18–20 g)	GemPharmatech	C57BL/6	Se utilizaron ambos sexos; mantenidos en condiciones estándar
Gas de óxido de etileno	Instalación institucional de esterilización	N/A	Esterilización de la plataforma de soporte vascular personalizada impresa en 3D.
FreeCAD	FreeCAD Project Association	1.1.1	Visualización CAD y generación del dibujo estructural 3D a partir del archivo .stp.
GraphPad Prism	GraphPad Software	9.0	Análisis estadístico y elaboración de gráficos
Guía guía, diámetro de 0,014 pulgadas	Boston Scientific	H749393071900	Lesión mecánica de la válvula aórtica
Kit de tinción de hematoxilina y eosina (H&E)	Beyotime	C0105S	Morfología y grosor de las valvas
Isoflurano	RWD Life Science	R510-22-2	Inducción al 3%; mantenimiento al 1,5–2% en O2 al 100%
Lidocaína	Shijiazhuang Pharmaceutical Group	H14024045	Infiltración local preventiva en el sitio de la incisión (0,5 %, paso 1.5)
Tijeras microquirúrgicas	RWD Life Science	F11022-11	Incisión de piel, arteriotomía, toracotomía
Transductor MX550D (40 MHz)	FUJIFILM VisualSonics	MX550D	Ecocardiografía
Cremas depilatorias Nair	Nair	255 g	Para la depilación de la región cervical anterior y la pared torácica
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Servicebio	G4202-100ML	Perfusión
Microtomo rotatorio	Leica Biosystems	RM2125 RTS	Seccionado seriado a 4–5 µm
Micróscopio estereoscópico (quirúrgico)	Olympus	SZX7	Aislamiento vascular y microcirugía
Sistema de ultrasonido de alta resolución Vevo 3100	FUJIFILM VisualSonics	Vevo 3100	Ecocardiografía
Kit de tinción de Von Kossa	Servicebio	G1043-20ML	Detección de calcificación distrófica
Xileno	Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd.	C0430530209	Clarificación de tejidos durante el procesamiento con parafina.