La píldora Zuogui modula el acoplamiento osteoblasto-osteoclasto en ratas ovariectomizadas: un estudio factorial de tres por tres

Resumen

Este estudio evalúa los efectos de la píldora Zuogui en la osteoporosis posmenopáusica en ratas ovariectomizadas utilizando un diseño factorial tres por tres. Los resultados respaldan efectos sinérgicos de los componentes Yin y Yang sobre el metabolismo óseo y los marcadores asociados de la vía EphB4/ephrinB2, aunque la evidencia mecanicista sigue siendo asociativa y no causal.

Resumen

La osteoporosis posmenopáusica está impulsada por el desacoplamiento entre la formación y la reabsorción ósea asociado a la deficiencia de estrógenos. Este estudio cuantificó los efectos independientes e interactivos de las subformulaciones Yin-nourishing de la píldora Zuogui en un modelo de rata ovariectomizada y examinó las asociaciones con la vía EphB4/ephrinB2/RhoA/fosfatasa alcalina. De acuerdo con ARRIVE 2.0, 130 ratas hembra Sprague-Dawley libres de patógenos específicos fueron asignadas aleatoriamente a 13 grupos (n=10/grupo), incluyendo nueve grupos en un diseño factorial tres por tres. Los puntos finales incluyeron P1NP, CTX-1, densidad mineral ósea del fémur medida por absorciometría de rayos X de energía dual (DXA), histología trabecular y expresión de ácido ribonucleico mensajero y proteínas medida mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa por transcripción inversa y inmunotransferencia de Western. La fórmula completa (I2A2) se asoció con niveles más altos de P1NP, niveles más bajos de CTX-1 y mayor densidad mineral ósea en comparación con el grupo modelo. El análisis factorial identificó una interacción Yin-Yang entre P1NP y densidad mineral ósea, lo que respalda la sinergia farmacológica. Los cambios moleculares se asociaron con un aumento en la expresión de EphB4/ephrinB2/ALP y una reducción en la expresión de RhoA. Estos hallazgos respaldan una asociación entre el tratamiento con la píldora Zuogui, la mejora de los fenotipos óseos y la modulación de los marcadores de la vía; la dependencia causal de la vía requiere validación mediante inhibidores, silenciamiento génico y cultivos celulares en co-cultivo.

Introducción

La osteoporosis posmenopáusica (OPP) afecta a una gran población de mujeres y se caracteriza por la alteración del equilibrio entre la formación y la reabsorción ósea asociada al déficit de estrógenos^1,2. El sistema receptor-ligando EphB4/ephrinB2 media la comunicación entre osteoblastos y osteoclastos; la señalización de EphB4 favorece la diferenciación de los osteoblastos y la actividad de la fosfatasa alcalina (ALP), mientras que la señalización inversa de ephrinB2 puede inhibir la osteoclastogénesis mediante mecanismos relacionados con RhoA^3,4. La reducción del acoplamiento en el hueso con déficit de estrógenos proporciona una justificación mecanicista para evaluar intervenciones que afecten a ambos componentes celulares del remodelado óseo.

Las terapias actuales contra la osteoporosis, incluyendo agentes antirreabsortivos y anabólicos, reducen el riesgo de fracturas pero pueden estar limitadas por la adherencia, el costo, las contraindicaciones, los efectos de rebote o los eventos adversos durante el uso prolongado⁵. Por lo tanto, los tratamientos candidatos que mejoren la formación ósea limitando al mismo tiempo la reabsorción excesiva siguen siendo científicamente relevantes.

La Píldora Zuogui (ZGP; Zuo Gui Wan) es una fórmula clásica de múltiples componentes utilizada en la medicina tradicional china para la deficiencia de la esencia renal, un patrón teórico relacionado con la debilidad ósea. Los componentes que nutren el Yin incluyen Rehmannia glutinosa (raíz preparada, Shu Di Huang, 24 g), Dioscorea opposita (rizoma, Huai Shan Yao, 12 g), Cornus officinalis (fruto, Shan Zhu Yu, 12 g), Lycium barbarum (fruto, Gou Qi Zi, 12 g), gelatina del plastrón de Chinemys reevesii (gelatina derivada del plastrón, Gui Ban Jiao, 12 g) y Cyathula officinalis (raíz, Chuan Niu Xi, 9 g). Los componentes que refuerzan el Yang incluyen Cuscuta australis (semilla, Tu Si Zi, 12 g) y gelatina del asta de Cervus elaphus (gelatina derivada del asta, Lu Jiao Jiao, 12 g). Según la teoría clásica, el principio de buscar el Yang dentro del Yin predice que las hierbas que refuerzan el Yang pueden potenciar una base que nutre el Yin, en lugar de actuar como simples aditivos independientes. Evidencia clínica y estudios preclínicos han reportado actividad antiosteoporótica de la ZGP o de intervenciones que contienen ZGP, incluyendo efectos sobre la DMO, la osteogénesis y el comportamiento farmacocinético^6,7,8,9,10.

La novedad de este estudio radica en la separación factorial formal 3×3 de los componentes que nutren el Yin y los que potencian el Yang en ratas ovariectomizadas (OVX), con la evaluación simultánea de fenotipos óseos y marcadores de la vía EphB4/ephrinB2/RhoA/ALP. Este diseño prueba la teoría de compatibilidad de fórmulas de manera más directa que estudios que utilizan únicamente la prescripción completa o un solo comparador, al tiempo que reconoce que los cambios en los marcadores de la vía permanecen asociativos a menos que se bloqueen o silencien mecanísticamente¹¹.

Protocolo

Todos los procedimientos de este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Mongolia Interior (Número de aprobación: YKD202404105) y se realizaron de acuerdo con ARRIVE 2.0¹².

Diseño del estudio

El estudio se realizó en la plataforma experimental de animales de la Universidad Médica de Mongolia Interior. Se aplicó un diseño factorial completo tres por tres con dos factores: la formulación base de Yin (I; tres niveles de dosis: 0, 27 y 54 g de equivalente de droga cruda) y la formulación de Yang (A; tres niveles de dosis: 0, 8 y 16 g de equivalente de droga cruda), lo que dio lugar a nueve celdas factoriales más cuatro grupos de referencia. El diseño factorial se muestra en Tabla 1. I2A2 representa la fórmula completa de ZGP a la dosis equivalente clínica. La conversión de la dosis se realizó mediante el método del área de superficie corporal (factor rata: humano = 6,25)¹³.

Animales, aleatorización y enmascaramiento

Ciento treinta ratas hembra Sprague-Dawley libres de patógenos específicos (6 meses de edad, 220–250 g) fueron asignadas mediante una tabla de números aleatorios generada por computadora. Los códigos de asignación fueron colocados en sobres sellados de forma secuencial por un investigador no involucrado en la evaluación de los resultados. Las ratas se mantuvieron en grupos de 3–4 por jaula ventilada bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h a 22 ± 2 ^oC y 50–60% de humedad, con agua ad libitum, alimento estándar para roedores con contenido documentado de calcio y fósforo, actividad en la jaula y enriquecimiento ambiental. Los ensayos moleculares, la puntuación histológica, la cuantificación de imágenes y la densitometría fueron realizados por investigadores cegados respecto a la asignación. El tamaño de la muestra fue determinado mediante un análisis de potencia a priori, obteniendo n = 10 por grupo.

Modelo OVX y tratamiento con fármacos

Se realizó una OVX bilateral bajo isoflurano inhalado administrado mediante un vaporizador de precisión. La anestesia se indujo al 3–4 % en oxígeno y se mantuvo entre 1,5 y 2,5 % a través de un cono nasal. Se confirmó una profundidad adecuada mediante la ausencia de reflejo de retirada plantar y del reflejo palpebral, con una respiración estable. El éxito de la OVX se evaluó por la ausencia de ciclos estrales vaginales al día 5 y por la reducción de la DMO a las 12 semanas posteriores a la cirugía. Tras la validación del modelo, se administró el tratamiento por gavaje durante 8 semanas (1 mL/100 g/día). Las decocciones se prepararon mediante extracción secuencial con agua en ebullición (100 °C, reflujo), con un volumen 10 veces mayor durante 2 h, seguido de un volumen 8 veces mayor durante 1,5 h, filtrándose luego a través de cuatro capas de gasa médica y concentrándose bajo presión reducida hasta 0,968 g de droga cruda/mL. El extracto concentrado se almacenó a 4 °C y se utilizó dentro de los 7 días posteriores a su preparación. Los controles positivos fueron gránulos de Gusukang (1,8 g/kg/día) y dietilstilbestrol (0,04 mg/kg/día). Al finalizar el experimento, las ratas fueron anestesiadas profundamente con 5 % de isoflurano hasta la pérdida de los reflejos plantar y corneal, luego exsanguinadas y sometidas a dislocación cervical. La muerte se confirmó por la ausencia de latidos cardíacos y de respiración. Las carroñas y los tejidos se desechó como residuos biológicos; los residuos químicos se eliminaron como residuos peligrosos; y las agujas o cuchillas se colocaron en contenedores para objetos punzocortantes aprobados.

Medidas de resultado

Las concentraciones séricas de P1NP y CTX-1 se midieron mediante ELISA de sándwich (Jiyinmei)¹⁴. La densidad mineral ósea (BMD) del fémur se cuantificó mediante DXA. La histología trabecular se evaluó mediante tinción con hematoxilina y eosina a 200x. La expresión génica se analizó mediante RT-qPCR utilizando el método 2^-ΔΔCt, normalizado respecto a la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). La expresión proteica se evaluó mediante inmunotransferencia (Western blot) y cuantificación con ImageJ (véase Tabla de Materiales). Los pesos moleculares observados y la información de catálogo de los anticuerpos se proporcionan en la Tabla Suplementaria 1. Las secuencias de los cebadores fueron: EphB4 sentido/antisentido, 5'-CTAGACTCTTTCCTGCGGCT/GGGAACTTGTGTAGGTGGGA-3'; ephrinB2, 5'-CGGACAAGGCCTGGTACTAT/ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT-3'; RhoA, 5'-GTTTATGTGCCCACGGTGTT/ACTATCAGGGCTGTCGATGG-3'; ALP, 5'-CGGACACAAGCATTCCCAGA/TGGTGGAGCTGAACAGGCTT-3'; GAPDH, 5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC/TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'.

Análisis estadístico

La normalidad se evaluó mediante la prueba de Shapiro-Wilk, y la homogeneidad de varianzas se evaluó mediante la prueba de Levene antes del análisis paramétrico. Los datos se expresan como media ± DE, y todas las barras de error en las figuras cuantitativas indican DE. Se aplicó un ANOVA factorial de dos vías a las nueve celdas factoriales para estimar los efectos principales y la interacción I por A, utilizando eta al cuadrado parcial (ηp²) como medida del tamaño del efecto. Las comparaciones por pares entre los 13 grupos se realizaron mediante un ANOVA de una vía con corrección de Bonferroni. Los análisis estadísticos se realizaron en GraphPad Prism. Los símbolos de significancia se definen consistentemente de la siguiente manera: *, **, ***, **** indican p <0,05, p <0,01, p <0,001, p <0,0001 frente al modelo; #, ##, ###, #### indican los mismos umbrales frente a la fórmula completa de ZGP.

Resultados

Validación del modelo mediante citología vaginal

Se confirmó el éxito de la OVX en todos los animales ovarectomizados, como lo evidenció la pérdida del ciclo estral dentro de los 5 días posteriores a la cirugía (Figura 1A), mientras que los animales sometidos a cirugía simulada mantuvieron un ciclo de 4 días (Figura 1B). A las 12 semanas, la DXA mostró una menor DMO femoral en el grupo modelo OVX en comparación con lo...

Discusión

El término de interacción factorial respalda una relación no aditiva entre los componentes nutritivos del Yin y potenciadores del Yang de ZGP. Este resultado es coherente con el principio tradicional de buscar el Yang dentro del Yin, en el cual se espera que los componentes potenciadores del Yang activen o potencien la base nutritiva del Yin¹⁵. El hallazgo debe interpretarse como una sinergia farmacológica a nivel de formulación. No identifica los constituyentes activos individuales responsables d...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agua amoniacal al 1%	N/A	N/A	Solución de azulado tras la diferenciación con hematoxilina.
Alcohol ácido clorhídrico al 1%	N/A	N/A	Solución de diferenciación para tinción con hematoxilina.
Mezcla qPCR 2x	N/A	N/A	Mezcla maestra para PCR cuantitativa. Volumen de reacción fuente: 12,5 µL por reacción.
Solución de paraformaldehído al 4%	N/A	N/A	Fijación de muestras de fémur y tibia izquierdos para análisis histológico.
Tampón de carga 5x	N/A	N/A	Desnaturalización de muestras antes de la electroforesis.
Anticuerpo primario ALP	Affinity Biosciences	N/A	Anticuerpo para inmunotransferencia. Dilución fuente: 1:2000. Se requiere RRID y número de lote para JoVE.
Pareja de cebadores ALP	N/A	N/A	El ARNm de ALP se midió mediante qRT-PCR, pero la tabla principal de cebadores no proporciona las secuencias de los cebadores ALP. Se requiere confirmación del autor.
Reactivo de anticuerpo biotinilado	Suministrado con el kit ELISA, Jiyinmei	Componente del kit	Se añade a los pocillos de muestra durante el ELISA.
Gelatina de asta de Cervus elaphus, Lu Jiao Jiao	Beijing Tongrentang	N/A	Componente que refuerza el Yang. Dosis total en la fórmula fuente: 12 g, proporción 4. La gelatina se derritió en la decocción.
Gelatina de plastrón de Chinemys reevesii, Gui Ban Jiao	Beijing Tongrentang	N/A	Componente que nutre el Yin. Dosis total en la fórmula fuente: 12 g, proporción 4. La gelatina se derritió en la decocción.
Cloroformo	N/A	N/A	Separação de fases durante la extracción de ARN.
Etapa de enfriamiento	Leica	1150	Soporte criogénico o de enfriamiento para el proceso de corte.
Cornus officinalis, Shan Zhu Yu	Beijing Tongrentang	N/A	Componente que nutre el Yin. Dosis total en la fórmula fuente: 12 g, proporción 4.
Cuscuta australis, Tu Si Zi	Beijing Tongrentang	N/A	Componente que refuerza el Yang. Dosis total en la fórmula fuente: 12 g, proporción 4.
Cyathula officinalis, Chuan Niu Xi	Beijing Tongrentang	N/A	Componente que nutre el Yin. Dosis total en la fórmula fuente: 9 g, proporción 3.
PBS tratado con DEPC	N/A	N/A	Lavado de vértebras lumbares L4 a L5 antes del congelado en nitrógeno líquido.
Diétilstilbestrol	N/A	N/A	Control positivo de medicina occidental. Dosis fuente: 0,04 mg/kg/día, 1 mL/100 g/día. El documento principal también contiene una inconsistencia en la nomenclatura china que debe armonizarse como diétilstilbestrol.
Dioscorea opposita, Huai Shan Yao	Beijing Tongrentang	N/A	Componente que nutre el Yin. Dosis total en la fórmula fuente: 12 g, proporción 4.
Mezcla de dNTP	N/A	N/A	Incluida en la reacción de transcripción inversa.
Reactivo quimioluminiscente ECL	N/A	N/A	Reactivo de detección para inmunotransferencia.
Reactivo cromogénico ELISA A	Suministrado con el kit ELISA, Jiyinmei	Componente del kit	Reactivo de desarrollo del color para ELISA.
Reactivo cromogénico ELISA B	Suministrado con el kit ELISA, Jiyinmei	Componente del kit	Reactivo de desarrollo del color para ELISA.
Solución de parada ELISA	Suministrado con el kit ELISA, Jiyinmei	Componente del kit	Se utiliza para detener la reacción de color en ELISA.
Reactivo enzimático marcado para ELISA	Suministrado con el kit ELISA, Jiyinmei	Componente del kit	Se añade a los pocillos no en blanco en ELISA.
Anticuerpo primario EphB4	Proteintech	N/A	Anticuerpo para inmunotransferencia. Dilución fuente: 1:2000. Se requiere RRID y número de lote para JoVE.
Pareja de cebadores EphB4	N/A	Producto de PCR de 232 pb	Adelantado CTAGACTCTTTCCTGCGGCT; Reverso GGGAACTTGTGTAGGTGGGA. Error tipográfico en la tabla principal: Rat RphB4 debe leerse Rat EphB4.
Anticuerpo primario ephrinB2	Affinity Biosciences	N/A	Anticuerpo para inmunotransferencia. Dilución fuente: 1:2000. Se requiere RRID y número de lote para JoVE.
Pareja de cebadores ephrinB2	N/A	Producto de PCR de 172 pb	Adelantado CGGACAAGGCCTGGTACTAT; Reverso ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT.
Etileno, absoluto y graduado al 95%, 85%, 75%	N/A	N/A	Deshidratación y rehidratación gradual durante la tinción con hematoxilina y eosina.
Ratas hembra Sprague-Dawley	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	No se proporcionó en el artículo fuente el certificado de animal ni el número de licencia	Hembras sanas no preñadas, libres de patógenos específicos, de 6 meses de edad. El documento fuente chino indica 230 a 270 g; un borrador anterior en inglés indica 220 a 250 g. Verificar un rango final antes del envío.
Anticuerpo primario GAPDH	Servicebio	N/A	Anticuerpo de control de carga. Dilución fuente: 1:2000. Se requiere RRID y número de lote para JoVE.
Pareja de cebadores GAPDH	N/A	Producto de PCR de 253 pb	Adelantado ACAGCAACAGGGTGGTGGAC; Reverso TTTGAGGGTGCAGCGAACTT.
Software GraphPad Prism	GraphPad Software	Versión 9.4.1; RRID:SCR_002798	Análisis estadístico y generación de gráficos. Deben conservarse en los archivos de salida la normalidad, homogeneidad de varianza, ANOVA, corrección de Bonferroni y tamaños del efecto.
Gránulos Gusukang	Liaoning Wohua Kangchen Pharmaceutical Co., Ltd.	N/A	Control positivo de medicina tradicional china. Dosis fuente: 1,8 g/kg/día o 0,5 mL/100 g/día.
Solución de tinción con hematoxilina	Zhuhai Beisuo Biotechnology Co., Ltd.	N/A	Tinción histológica. El procedimiento fuente utilizó una tinción de 5 minutos con hematoxilina.
Microcentrífuga de alta velocidad	N/A	TG16W	Centrifugación para procedimientos de suero y ácidos nucleicos.
Absorciometría dual de rayos X Hologic	Hologic	N/A	Análisis de densidad mineral ósea. El documento fuente informa escaneo femoral in vivo y ex vivo.
Software ImageJ	National Institutes of Health	RRID:SCR_003070	Cuantificación densitométrica de bandas en inmunotransferencia. La versión no se proporcionó en el artículo fuente.
Cocina de inducción	Midea	N/A	Listada en la tabla de instrumentos del documento fuente chino.
Isóflurano	N/A	N/A	Anestesia para ovariohisterectomía bilateral y posicionamiento en DXA. El protocolo revisado debe especificar inducción, mantenimiento, vía y criterios de profundidad anestésica.
Isopropanol	N/A	N/A	Precipitación de ARN durante la extracción.
Nitrógeno líquido	N/A	N/A	Congelado rápido de muestras de vértebras lumbares.
Lycium barbarum, Gou Qi Zi	Beijing Tongrentang	N/A	Componente que nutre el Yin. Dosis total en la fórmula fuente: 12 g, proporción 4.
Lector de microplacas	N/A	AMR-100	Detección de absorbancia en ELISA a 450 nm.
Lavador de microplacas	N/A	APW-200	Paso de lavado para placas de ELISA.
Transcriptasa inversa MMLV	N/A	N/A	Enzima de transcripción inversa.
Bálsamo de montaje neutro	Sinopharm Group	N/A	Medio de montaje para portaobjetos teñidos con hematoxilina y eosina.
Solución salina normal	N/A	N/A	Vehículo administrado por gavaje para los grupos control en blanco, sham-operado y modelo.
Cebador Oligo(dT)18	N/A	N/A	Utilizado para la transcripción inversa.
Penicilina	N/A	N/A	Profilaxis de infección postoperatoria. Dosis fuente: 20.000 U/kg por vía intramuscular durante 3 días.
Olla a presión	Xinfei	N/A	Listada en la tabla de instrumentos del documento fuente chino.
Inhibidor de proteasas	N/A	N/A	Se añade durante la extracción de proteínas.
Tampón de lisis proteica	N/A	N/A	Extracción de proteínas de tejido óseo para inmunotransferencia.
Membrana PVDF	N/A	N/A	Membrana de transferencia para inmunotransferencia activada con metanol.
Instrumento de qRT-PCR	N/A	N/A	PCR cuantitativa de transcripción inversa para EphB4, ephrinB2, RhoA, ALP y GAPDH.
Kit ELISA de CTX-1 de rata	Jiyinmei	JYM0026Ra	ELISA sandwich para el telopéptido C-terminal del colágeno tipo 1 en suero. Detección a 450 nm.
Kit ELISA de P1NP de rata	Jiyinmei	JYM0030Ra	ELISA sandwich para el propepétido N-terminal del procollágeno tipo 1 en suero. Detección a 450 nm.
Rehmannia glutinosa, Shu Di Huang	Beijing Tongrentang	N/A	Componente que nutre el Yin. Dosis total en la fórmula fuente: 24 g, proporción 8.
Anticuerpo primario RhoA	Proteintech	N/A	Anticuerpo para inmunotransferencia. Dilución fuente: 1:2000. Se requiere RRID y número de lote para JoVE.
Pareja de cebadores RhoA	N/A	Producto de PCR de 177 pb	Adelantado GTTTATGTGCCCACGGTGTT; Reverso ACTATCAGGGCTGTCGATGG. Terminología armonizada de RHoA a RhoA.
Inhibidor de RNasa	N/A	N/A	Incluido en la reacción de transcripción inversa.
Agua libre de RNasa	N/A	N/A	Disolución de ARN tras el secado.
Microtomo rotatorio	Leica	2245	Corte histológico.
Anticuerpo secundario para inmunotransferencia	N/A	N/A	Dilución fuente: 1:15000. Se requiere especificar la reactividad del huésped y el RRID para JoVE.
Leche desnatada al 5%	N/A	N/A	Reactivo de bloqueo para inmunotransferencia, 2 h a temperatura ambiente.
Máquina para extensión y horneado de portaobjetos	Jinhua Yidi	N/A	Preparación de portaobjetos para histología.
Pentobarbital sódico al 3%	N/A	N/A	Anestesia terminal antes de la recogida de sangre por aorta abdominal en el documento fuente chino. Debe verificarse el procedimiento final de eutanasia y el método de confirmación.
Diluyente estándar de muestra	Suministrado con el kit ELISA, Jiyinmei	Componente del kit	Se utiliza para dilución seriada estándar en el procedimiento ELISA.
Tampón TBST	N/A	N/A	Tampón de lavado para inmunotransferencia.
Incubadora termostática con agitación	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.	N/A	Incubación y agitación en laboratorio.
Reactivo TRIzol	N/A	N/A	Extracción de ARN de 100 mg de tejido óseo.
Microscopio vertical	Leica	DM1000	Imagenología histológica con hematoxilina y eosina a 200x.
Incubadora termostática con camisa de agua	N/A	GNP-9080	Incubación para procedimientos de ensayo.
Solución de tinción con eosina hidrosoluble	Zhuhai Beisuo Biotechnology Co., Ltd.	N/A	Contratinción histológica. El procedimiento fuente utilizó una tinción de 3 minutos con eosina.
Sistema de electroforesis para inmunotransferencia	N/A	N/A	Separación de proteínas. Electroforesis fuente: inicialmente 80 V, luego 120 V.
Sistema de imagen para inmunotransferencia	N/A	N/A	Imagen de membranas quimioluminiscentes. Se requieren membranas sin recortar para el envío.
Sistema de transferencia para inmunotransferencia	N/A	N/A	Transferencia de proteínas a membrana PVDF. Condición de transferencia fuente: 400 mA, 90 min, baño de hielo.
Xileno	N/A	N/A	Desparafinado y aclarado del tejido durante la histología.
Hierbas componentes de la píldora Zuogui	Beijing Tongrentang	N/A	Fórmula de ocho hierbas: Rehmannia glutinosa, Dioscorea opposita, Cornus officinalis, Lycium barbarum, gelatina de plastrón de Chinemys reevesii, Cyathula officinalis, Cuscuta australis y gelatina de asta de Cervus elaphus.