Este estudio evalúa los efectos de la píldora Zuogui en la osteoporosis posmenopáusica en ratas ovariectomizadas utilizando un diseño factorial tres por tres. Los resultados respaldan efectos sinérgicos de los componentes Yin y Yang sobre el metabolismo óseo y los marcadores asociados de la vía EphB4/ephrinB2, aunque la evidencia mecanicista sigue siendo asociativa y no causal.
Artículo de investigación
La píldora Zuogui modula el acoplamiento osteoblasto-osteoclasto en ratas ovariectomizadas: un estudio factorial de tres por tres
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11 de septiembre de 2026
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Resumen
Resumen
La osteoporosis posmenopáusica está impulsada por el desacoplamiento entre la formación y la reabsorción ósea asociado a la deficiencia de estrógenos. Este estudio cuantificó los efectos independientes e interactivos de las subformulaciones Yin-nourishing de la píldora Zuogui en un modelo de rata ovariectomizada y examinó las asociaciones con la vía EphB4/ephrinB2/RhoA/fosfatasa alcalina. De acuerdo con ARRIVE 2.0, 130 ratas hembra Sprague-Dawley libres de patógenos específicos fueron asignadas aleatoriamente a 13 grupos (n=10/grupo), incluyendo nueve grupos en un diseño factorial tres por tres. Los puntos finales incluyeron P1NP, CTX-1, densidad mineral ósea del fémur medida por absorciometría de rayos X de energía dual (DXA), histología trabecular y expresión de ácido ribonucleico mensajero y proteínas medida mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa por transcripción inversa y inmunotransferencia de Western. La fórmula completa (I2A2) se asoció con niveles más altos de P1NP, niveles más bajos de CTX-1 y mayor densidad mineral ósea en comparación con el grupo modelo. El análisis factorial identificó una interacción Yin-Yang entre P1NP y densidad mineral ósea, lo que respalda la sinergia farmacológica. Los cambios moleculares se asociaron con un aumento en la expresión de EphB4/ephrinB2/ALP y una reducción en la expresión de RhoA. Estos hallazgos respaldan una asociación entre el tratamiento con la píldora Zuogui, la mejora de los fenotipos óseos y la modulación de los marcadores de la vía; la dependencia causal de la vía requiere validación mediante inhibidores, silenciamiento génico y cultivos celulares en co-cultivo.
Introducción
La osteoporosis posmenopáusica (OPP) afecta a una gran población de mujeres y se caracteriza por la alteración del equilibrio entre la formación y la reabsorción ósea asociada al déficit de estrógenos1,2. El sistema receptor-ligando EphB4/ephrinB2 media la comunicación entre osteoblastos y osteoclastos; la señalización de EphB4 favorece la diferenciación de los osteoblastos y la actividad de la fosfatasa alcalina (ALP), mientras que la señalización inversa de ephrinB2 puede inhibir la osteoclastogénesis mediante mecanismos relacionados con RhoA3,4. La reducción del acoplamiento en el hueso con déficit de estrógenos proporciona una justificación mecanicista para evaluar intervenciones que afecten a ambos componentes celulares del remodelado óseo.
Las terapias actuales contra la osteoporosis, incluyendo agentes antirreabsortivos y anabólicos, reducen el riesgo de fracturas pero pueden estar limitadas por la adherencia, el costo, las contraindicaciones, los efectos de rebote o los eventos adversos durante el uso prolongado5. Por lo tanto, los tratamientos candidatos que mejoren la formación ósea limitando al mismo tiempo la reabsorción excesiva siguen siendo científicamente relevantes.
La Píldora Zuogui (ZGP; Zuo Gui Wan) es una fórmula clásica de múltiples componentes utilizada en la medicina tradicional china para la deficiencia de la esencia renal, un patrón teórico relacionado con la debilidad ósea. Los componentes que nutren el Yin incluyen Rehmannia glutinosa (raíz preparada, Shu Di Huang, 24 g), Dioscorea opposita (rizoma, Huai Shan Yao, 12 g), Cornus officinalis (fruto, Shan Zhu Yu, 12 g), Lycium barbarum (fruto, Gou Qi Zi, 12 g), gelatina del plastrón de Chinemys reevesii (gelatina derivada del plastrón, Gui Ban Jiao, 12 g) y Cyathula officinalis (raíz, Chuan Niu Xi, 9 g). Los componentes que refuerzan el Yang incluyen Cuscuta australis (semilla, Tu Si Zi, 12 g) y gelatina del asta de Cervus elaphus (gelatina derivada del asta, Lu Jiao Jiao, 12 g). Según la teoría clásica, el principio de buscar el Yang dentro del Yin predice que las hierbas que refuerzan el Yang pueden potenciar una base que nutre el Yin, en lugar de actuar como simples aditivos independientes. Evidencia clínica y estudios preclínicos han reportado actividad antiosteoporótica de la ZGP o de intervenciones que contienen ZGP, incluyendo efectos sobre la DMO, la osteogénesis y el comportamiento farmacocinético6,7,8,9,10.
La novedad de este estudio radica en la separación factorial formal 3×3 de los componentes que nutren el Yin y los que potencian el Yang en ratas ovariectomizadas (OVX), con la evaluación simultánea de fenotipos óseos y marcadores de la vía EphB4/ephrinB2/RhoA/ALP. Este diseño prueba la teoría de compatibilidad de fórmulas de manera más directa que estudios que utilizan únicamente la prescripción completa o un solo comparador, al tiempo que reconoce que los cambios en los marcadores de la vía permanecen asociativos a menos que se bloqueen o silencien mecanísticamente11.
Protocolo
Todos los procedimientos de este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Mongolia Interior (Número de aprobación: YKD202404105) y se realizaron de acuerdo con ARRIVE 2.012.
Diseño del estudio
El estudio se realizó en la plataforma experimental de animales de la Universidad Médica de Mongolia Interior. Se aplicó un diseño factorial completo tres por tres con dos factores: la formulación base de Yin (I; tres niveles de dosis: 0, 27 y 54 g de equivalente de droga cruda) y la formulación de Yang (A; tres niveles de dosis: 0, 8 y 16 g de equivalente de droga cruda), lo que dio lugar a nueve celdas factoriales más cuatro grupos de referencia. El diseño factorial se muestra en Tabla 1. I2A2 representa la fórmula completa de ZGP a la dosis equivalente clínica. La conversión de la dosis se realizó mediante el método del área de superficie corporal (factor rata: humano = 6,25)13.
Animales, aleatorización y enmascaramiento
Ciento treinta ratas hembra Sprague-Dawley libres de patógenos específicos (6 meses de edad, 220–250 g) fueron asignadas mediante una tabla de números aleatorios generada por computadora. Los códigos de asignación fueron colocados en sobres sellados de forma secuencial por un investigador no involucrado en la evaluación de los resultados. Las ratas se mantuvieron en grupos de 3–4 por jaula ventilada bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h a 22 ± 2 oC y 50–60% de humedad, con agua ad libitum, alimento estándar para roedores con contenido documentado de calcio y fósforo, actividad en la jaula y enriquecimiento ambiental. Los ensayos moleculares, la puntuación histológica, la cuantificación de imágenes y la densitometría fueron realizados por investigadores cegados respecto a la asignación. El tamaño de la muestra fue determinado mediante un análisis de potencia a priori, obteniendo n = 10 por grupo.
Modelo OVX y tratamiento con fármacos
Se realizó una OVX bilateral bajo isoflurano inhalado administrado mediante un vaporizador de precisión. La anestesia se indujo al 3–4 % en oxígeno y se mantuvo entre 1,5 y 2,5 % a través de un cono nasal. Se confirmó una profundidad adecuada mediante la ausencia de reflejo de retirada plantar y del reflejo palpebral, con una respiración estable. El éxito de la OVX se evaluó por la ausencia de ciclos estrales vaginales al día 5 y por la reducción de la DMO a las 12 semanas posteriores a la cirugía. Tras la validación del modelo, se administró el tratamiento por gavaje durante 8 semanas (1 mL/100 g/día). Las decocciones se prepararon mediante extracción secuencial con agua en ebullición (100 °C, reflujo), con un volumen 10 veces mayor durante 2 h, seguido de un volumen 8 veces mayor durante 1,5 h, filtrándose luego a través de cuatro capas de gasa médica y concentrándose bajo presión reducida hasta 0,968 g de droga cruda/mL. El extracto concentrado se almacenó a 4 °C y se utilizó dentro de los 7 días posteriores a su preparación. Los controles positivos fueron gránulos de Gusukang (1,8 g/kg/día) y dietilstilbestrol (0,04 mg/kg/día). Al finalizar el experimento, las ratas fueron anestesiadas profundamente con 5 % de isoflurano hasta la pérdida de los reflejos plantar y corneal, luego exsanguinadas y sometidas a dislocación cervical. La muerte se confirmó por la ausencia de latidos cardíacos y de respiración. Las carroñas y los tejidos se desechó como residuos biológicos; los residuos químicos se eliminaron como residuos peligrosos; y las agujas o cuchillas se colocaron en contenedores para objetos punzocortantes aprobados.
Medidas de resultado
Las concentraciones séricas de P1NP y CTX-1 se midieron mediante ELISA de sándwich (Jiyinmei)14. La densidad mineral ósea (BMD) del fémur se cuantificó mediante DXA. La histología trabecular se evaluó mediante tinción con hematoxilina y eosina a 200x. La expresión génica se analizó mediante RT-qPCR utilizando el método 2-ΔΔCt, normalizado respecto a la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). La expresión proteica se evaluó mediante inmunotransferencia (Western blot) y cuantificación con ImageJ (véase Tabla de Materiales). Los pesos moleculares observados y la información de catálogo de los anticuerpos se proporcionan en la Tabla Suplementaria 1. Las secuencias de los cebadores fueron: EphB4 sentido/antisentido, 5'-CTAGACTCTTTCCTGCGGCT/GGGAACTTGTGTAGGTGGGA-3'; ephrinB2, 5'-CGGACAAGGCCTGGTACTAT/ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT-3'; RhoA, 5'-GTTTATGTGCCCACGGTGTT/ACTATCAGGGCTGTCGATGG-3'; ALP, 5'-CGGACACAAGCATTCCCAGA/TGGTGGAGCTGAACAGGCTT-3'; GAPDH, 5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC/TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'.
Análisis estadístico
La normalidad se evaluó mediante la prueba de Shapiro-Wilk, y la homogeneidad de varianzas se evaluó mediante la prueba de Levene antes del análisis paramétrico. Los datos se expresan como media ± DE, y todas las barras de error en las figuras cuantitativas indican DE. Se aplicó un ANOVA factorial de dos vías a las nueve celdas factoriales para estimar los efectos principales y la interacción I por A, utilizando eta al cuadrado parcial (ηp2) como medida del tamaño del efecto. Las comparaciones por pares entre los 13 grupos se realizaron mediante un ANOVA de una vía con corrección de Bonferroni. Los análisis estadísticos se realizaron en GraphPad Prism. Los símbolos de significancia se definen consistentemente de la siguiente manera: *, **, ***, **** indican p <0,05, p <0,01, p <0,001, p <0,0001 frente al modelo; #, ##, ###, #### indican los mismos umbrales frente a la fórmula completa de ZGP.
Resultados
Validación del modelo mediante citología vaginal
Se confirmó el éxito de la OVX en todos los animales ovarectomizados, como lo evidenció la pérdida del ciclo estral dentro de los 5 días posteriores a la cirugía (Figura 1A), mientras que los animales sometidos a cirugía simulada mantuvieron un ciclo de 4 días (Figura 1B). A las 12 semanas, la DXA mostró una menor DMO femoral en el grupo modelo OVX en comparación con los controles simulados (0,214 ± 0,020 frente a 0,281 ± 0,019 mg/cm3; Bonferroni-ajustado p < 0,001), lo que respalda el establecimiento del modelo de pérdida ósea inducida por OVX antes del tratamiento.
Densidad mineral ósea
La fórmula completa de ZGP (I2A2) mostró la mayor recuperación de DMO entre las subfórmulas factoriales y fue estadísticamente comparable con ambos controles positivos (Tabla 2, Figura 2). Todas las subfórmulas factoriales aumentaron la DMO en comparación con el grupo modelo. El alto enriquecimiento de Yin por sí solo (I3A1: 0,253 mg/cm3) y el alto fortalecimiento de Yang por sí solo (I1A3: 0,243 mg/cm3) siguieron siendo menores que el ZGP completo (I2A2: 0,307 mg/cm3), lo que respalda una interacción en lugar de un efecto de dosis simple.
Marcadores séricos de remodelación ósea
En comparación con el grupo modelo, la fórmula completa de ZGP se asoció con un aumento de P1NP (+51 %; IC 95 %: 210,3-327,5 pg/mL; p <0,0001) y una disminución de CTX-1 (-16 %; p <0,01), lo que indica un equilibrio mejorado entre formación y reabsorción (Figura 3A,B). Algunas comparaciones mostraron valores absolutos más altos de P1NP en los grupos con monoterapia de dosis elevada, pero el patrón factorial apoyó una actividad combinada optimizada en lugar de una respuesta máxima a la dosis en un solo brazo. Los datos completos a nivel de grupo se encuentran en Tabla 3.
ANOVA factorial e interacción sinérgica
Un ANOVA factorial de dos vías de las nueve celdas factoriales identificó efectos principales significativos de los factores nutritivos del Yin y potenciadores del Yang, así como términos de interacción I por A significativos en todos los puntos finales primarios (Tabla 4). El efecto de interacción para P1NP (ηp2 = 0.74) sugiere que los componentes potenciadores del Yang amplificaron la actividad de los componentes nutritivos del Yin bajo estas condiciones experimentales.
Densidad ósea (validación del modelo)
La densidad ósea femoral fue menor en el grupo Modelo (OVX) que en los grupos Control y Falso operado, lo que confirma la inducción exitosa del fenotipo de pérdida ósea por OVX antes del tratamiento, como se muestra en la Figura 4.
Expresión de EphB4/ephrinB2/RhoA/ALP
Los análisis de RT-qPCR utilizaron muestras biológicas de cada grupo con reacciones técnicas por triplicado, y la densitometría de inmunotransferencia se realizó en lisados biológicos independientes (Figura 5 y Figura 6). En comparación con el grupo modelo, la fórmula completa de ZGP se asoció con niveles más altos de EphB4 (0.498 ± 0.009 frente a 0.048 ± 0.002; p < 0.0001), ephrinB2 (0.411 ± 0.036 frente a 0.048 ± 0.003; p < 0.0001) y ALP (0.842 ± 0.019 frente a 0.090 ± 0.003; p < 0.0001), y con niveles más bajos de RhoA (1.658 ± 0.028 frente a 7.332 ± 0.430; p < 0.0001). Estos hallazgos moleculares se interpretan como asociaciones con marcadores de la vía, más que como prueba de mediación causal.
Disponibilidad de datos
Los archivos de datos originales utilizados para generar los resultados del presente estudio se proporcionan como un Archivo de Código Suplementario que acompaña a este artículo
Figura 1. Citología vaginal representativa utilizada para verificar la ciclicidad estral tras la ovariohisterectomía (tinción con hematoxilina y eosina, 200x). (A) Frotis vaginal representativo de una rata sometida a ovariohisterectomía que muestra una citología persistente no cíclica. (B) Frotis vaginal representativo de una rata sometida a cirugía simulada que demuestra una ciclicidad estral normal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. DMO femoral en todos los grupos. Las barras de error indican la desviación estándar (DE). Los símbolos estadísticos indican comparaciones ajustadas por Bonferroni frente al modelo o la fórmula completa de ZGP, según se define en la sección de análisis estadístico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Marcadores séricos de remodelación ósea. (A) P1NP, un marcador de formación ósea. (B) CTX-1, un marcador de reabsorción ósea. Las barras de error indican la desviación estándar (SD). Los símbolos estadísticos indican comparaciones ajustadas por Bonferroni respecto al modelo o a la fórmula completa de ZGP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Densidad ósea femoral que confirma la pérdida ósea inducida por OVX antes del tratamiento. Gráfico de barras que compara la densidad ósea femoral (mg/cm3) entre los grupos Control (no ovariectomizadas, sin tratar), Falso-operado y Modelo (OVX) en el punto de tiempo previo al tratamiento para la validación del modelo. Las barras representan la media ± DE (n = 10 por grupo). *** = p < 0,001 frente al grupo Control y frente al grupo Falso-operado (ANOVA unidireccional con corrección de Bonferroni). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Expresión génica relativa de ARNm. Niveles de expresión de (A) EphB4 (B) ephrinB2 (C) RhoA (D) ALP mediante el método 2^-ΔΔCt normalizado a GAPDH. La qPCR utilizó reacciones por triplicado técnico para cada muestra biológica. Las barras de error indican la desviación estándar (SD). Los símbolos estadísticos indican comparaciones ajustadas por Bonferroni. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 6. Expresión proteica por inmunotransferencia (Western blot). Los paneles muestran inmunotransferencias representativas para EphB4, ephrinB2, RhoA, ALP y el control de carga GAPDH, seleccionadas de muestras biológicas independientes. La densitometría se normalizó respecto a GAPDH utilizando ImageJ. Pesos moleculares observados: EphB4, 110 kDa; ephrinB2, 36 kDa; RhoA, 22 kDa; ALP, 39 kDa; GAPDH, 37 kDa (véase Tabla Suplementaria 1). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Factor nutritivo de Yin (I) | ||||
| I₁ (0 g) | I₂ (27 g) | I₃ (54 g) | ||
| Factor que potencia el Yang (A) | A₁ (0 g) | I₁A₁ (Modelo) | I₂A₁ (Yin) | I₃A₁ (Hi-Yin) |
| A₂ (8 g) | I₁A₂ (Yang) | I₂A₂ (ZGP†) | I₃A₂ (Hi-Yin+Yang) | |
| A₃ (16 g) | I₁A₃ (Hi-Yang) | I₂A₃ (Yin+Hi-Yang) | I₃A₃ (Full-Hi) | |
Tabla 1: Diseño factorial tres por tres y grupos experimentales. La tabla presenta los 13 grupos experimentales organizados según un diseño factorial 3 por 3 de niveles de dosis de Yin (I) y Yang (A), más 4 grupos de referencia. †I₂A₂ = fórmula completa de la píldora Zuogui a dosis equivalente clínica. Conversión de dosis mediante el método del área de superficie corporal (rata : humano = 6,25).
| Grupo | Celda factorial | DBM (mg/cm³, x̄ ± DE) | vs. Modelo |
| Control en blanco | — | 0.279 ± 0.030 | **** |
| Falso operado | — | 0.281 ± 0.019 | **** |
| Modelo (OVX) | I₁A₁ | 0.214 ± 0.020 | — |
| Refuerzo de Yang | I₁A₂ | 0.258 ± 0.011 | ** |
| Alto refuerzo de Yang | I₁A₃ | 0.243 ± 0.021 | * |
| Refuerzo de Yin | I₂A₁ | 0.262 ± 0.015 | *** |
| Alto refuerzo de Yin | I₃A₁ | 0.253 ± 0.017 | ** |
| Yin + Alto Yang | I₂A₃ | 0.240 ± 0.014 | * |
| Alto Yin + Yang | I₃A₂ | 0.248 ± 0.014 | * |
| Total-Alto | I₃A₃ | 0.257 ± 0.017 | ** |
| Fórmula completa ZGP | I₂A₂ | 0.307 ± 0.010 | **** |
| Control positivo MTC | — | 0.307 ± 0.029 | **** |
| Control de medicina occidental | — | 0.307 ± 0.009 | **** |
Tabla 2: DMO femoral en todos los grupos (n=10/grupo, media ± DE). * = p <0,05, ** = p <0,01, *** = p<0,001, **** = p<0,0001 frente al modelo (corrección de Bonferroni).
| Grupo | Célula | P1NP (pg/mL, x̄ ± SD) | CTX-1 (ng/mL, x̄ ± SD) |
| Control en blanco | — | 1388.8 ± 29.7****#### | 33.4 ± 6.8****#### |
| Falso-operado | — | 1268.7 ± 124.1****#### | 45.0 ± 6.7****#### |
| Modelo (OVX) | I₁A₁ | 526.4 ± 78.7 | 105.5 ± 9.9 |
| Refuerzo de Yang | I₁A₂ | 845.1 ± 76.7**** | 84.2 ± 6.6**** |
| Alto refuerzo de Yang | I₁A₃ | 1013.0 ± 73.7 ****## | 65.5 ± 6.6****#### |
| Nutrición de Yin | I₂A₁ | 870.7 ± 63.6**** | 88.2 ± 7.6** |
| Alta nutrición de Yin | I₃A₁ | 1068.0 ± 48.7****#### | 64.5 ± 4.0****#### |
| Yin + Alto Yang | I₂A₃ | 951.5 ± 146.5****# | 63.1 ± 6.0****#### |
| Alto Yin + Yang | I₃A₂ | 990.2 ± 116.8****## | 62.6 ± 4.4****#### |
| Total-Alto | I₃A₃ | 739.5 ± 93.5** | 97.1 ± 8.9 |
| Fórmula completa ZGP | I₂A₂ | 794.8 ± 66.0**** | 88.2 ± 6.0**** |
| Control positivo MCT | — | 967.7 ± 49.9****# | 66.3 ± 6.1****#### |
| Control de medicina occidental | — | 1026.6 ± 65.1****### | 68.8 ± 7.3****### |
Tabla 3: P1NP y CTX-1 séricos en todos los grupos (n=10/grupo, media ± DE). ** = p <0,01, **** = p <0,0001 frente al modelo; # = p <0,05, ## = p <0,01, ### = p <0,001, #### = p <0,0001 frente a ZGP (Bonferroni). IC del 95 % para ZGP P1NP frente al modelo: 210,3–327,5 pg/mL.
| Resultado | Factor | gl | F | valor p | η² parcial |
| P1NP (pg/mL) | Yin (I) | 2, 81 | 17.84 | <0.001 | 0.31 |
| Yang (A) | 2, 81 | 6.22 | 0.003 | 0.13 | |
| I × A | 4, 81 | 57.21 | <0.001 | 0.74 | |
| BMD (mg/cm³) | Yin (I) | 2, 81 | 31.90 | <0.0001 | 0.44 |
| Yang (A) | 2, 81 | 28.70 | <0.0001 | 0.41 | |
| I × A | 4, 81 | 24.60 | <0.0001 | 0.55 | |
| CTX-1 (ng/mL) | Yin (I) | 2, 81 | 14.22 | <0.001 | 0.26 |
| Yang (A) | 2, 81 | 5.88 | 0.004 | 0.13 | |
| I × A | 4, 81 | 19.43 | <0.001 | 0.49 |
Tabla 4: ANOVA factorial 3x3 con efectos principales e interacciones, y comparaciones post hoc corregidas con Bonferroni. Se informa la eta cuadrada parcial como tamaño del efecto. df indica los grados de libertad.
Tabla suplementaria 1. Información sobre los anticuerpos para inmunotransferencia. La tabla enumera las proteínas diana, los pesos moleculares observados, los proveedores, números de catálogo, especies huésped y diluciones de trabajo de los anticuerpos primarios y secundarios utilizados en este estudio.Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo de código suplementario 1. Datos experimentales brutos que respaldan el estudio. Este archivo contiene los archivos de datos originales utilizados para generar los resultados presentados en el manuscrito, incluyendo mediciones individuales de DMO, datos brutos de ELISA, valores de Ct de RT-qPCR con amplificación y curvas de disociación, imágenes originales de inmunotransferencia y archivos de análisis de densitometría, imágenes representativas de microscopía histológica e informes generados por los instrumentos asociados con estos experimentos.Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discusión
El término de interacción factorial respalda una relación no aditiva entre los componentes nutritivos del Yin y potenciadores del Yang de ZGP. Este resultado es coherente con el principio tradicional de buscar el Yang dentro del Yin, en el cual se espera que los componentes potenciadores del Yang activen o potencien la base nutritiva del Yin15. El hallazgo debe interpretarse como una sinergia farmacológica a nivel de formulación. No identifica los constituyentes activos individuales responsables del efecto.
EphB4 y ephrinB2 son mediadores biológicamente plausibles del acoplamiento osteoblasto-osteoclasto3,4, pero la evidencia actual es correlativa. El aumento observado de EphB4, ephrinB2 y ALP junto con la disminución de RhoA es compatible con un mejor acoplamiento, aunque no establece que esta vía sea necesaria ni suficiente para la acción de ZGP. Se requieren inhibidores de la vía, enfoques con anticuerpos anti-EphB4 o que bloqueen ephrinB2, modulación de RhoA/ROCK16, silenciamiento génico y experimentos de cultivo conjunto de osteoblastos y osteoclastos para comprobar la dependencia causal.
La traducción clínica requiere precaución. La conversión de la dosis equivalente a humanos en ratas apoya la escala inicial, pero la administración de dosis en humanos también requiere estudios de farmacocinética, farmacodinamia y seguridad a largo plazo. Un producto estandarizado de ZGP necesitaría un perfilado químico mediante HPLC o LC-MS, límites para compuestos marcadores, comparabilidad entre lotes, pruebas de contaminantes y documentación del origen de las hierbas, extracción, concentración y prácticas de fabricación17. La traducción regulatoria también debe considerar las interacciones entre los constituyentes, la compatibilidad con los medicamentos antiosteoporóticos existentes y los resultados clínicos comparativos, como la reducción de fracturas, y no solo la densidad mineral ósea (BMD).
Este estudio tiene varias limitaciones. El modelo de rata OVX induce una retirada abrupta de estrógeno y no puede reproducir completamente la menopausia humana, el envejecimiento, la regulación inmunitaria, la longevidad, las comorbilidades ni la dinámica del remodelado óseo a largo plazo18,19. Los efectos endocrinos sistémicos pueden contribuir a los resultados observados, por lo que no debe asumirse una señalización directa en las células óseas. La ausencia de inhibición de vías o silenciamiento génico impide realizar afirmaciones mecanicistas causales. La falta de perfilado mediante HPLC o LC-MS limita la reproducibilidad y dificulta atribuir los efectos a constituyentes específicos. No se realizó una evaluación cuantitativa de la microarquitectura ósea trabecular. Los estudios futuros deberían incorporar análisis mediante micro-TC o histomorfometría cuantitativa, incluyendo BV/TV, Tb.N, Tb.Th y Tb.Sp, para proporcionar una evaluación más completa de los cambios estructurales óseos20. La variabilidad entre lotes de hierbas, los procedimientos de extracción y los requisitos de control de calidad siguen siendo barreras importantes para la traslación.
En ratas con PMOP inducida por OVX, la fórmula completa de la Píldora Zuogui se asoció con una mejoría en la DMO, marcadores séricos favorables de remodelación ósea y cambios coordinados en los marcadores de la vía EphB4/ephrinB2/RhoA/ALP. El análisis factorial tres por tres respalda una interacción sinérgica entre los componentes nutritivos del Yin y potenciadores del Yang, lo cual es coherente con la teoría tradicional de compatibilidad de fórmulas. Estos datos apoyan la investigación adicional de ZGP como candidato multiancla para la PMOP, pero se requieren estudios con inhibidores, experimentos de silenciamiento génico, cultivos cocultivos de osteoblastos y osteoclastos, perfilado químico, análisis cuantitativo de la microarquitectura ósea, farmacocinética, pruebas de seguridad a largo plazo y ensayos clínicos antes de que puedan confirmarse afirmaciones mecanicistas o traslacionales.
Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por la Fundación de Ciencias Naturales de Mongolia Interior (número de beca 2025LHMS08047), el Proyecto General de la Universidad Médica de Mongolia Interior (número de beca YKD2025MS015) y el Fondo de Inicio para Doctores de la Universidad Médica de Mongolia Interior (número de beca YKD2023BSQD007). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación de datos, el análisis, la decisión de publicar ni en la preparación del manuscrito.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agua amoniacal al 1% | N/A | N/A | Solución de azulado tras la diferenciación con hematoxilina. |
| Alcohol ácido clorhídrico al 1% | N/A | N/A | Solución de diferenciación para tinción con hematoxilina. |
| Mezcla qPCR 2x | N/A | N/A | Mezcla maestra para PCR cuantitativa. Volumen de reacción fuente: 12,5 µL por reacción. |
| Solución de paraformaldehído al 4% | N/A | N/A | Fijación de muestras de fémur y tibia izquierdos para análisis histológico. |
| Tampón de carga 5x | N/A | N/A | Desnaturalización de muestras antes de la electroforesis. |
| Anticuerpo primario ALP | Affinity Biosciences | N/A | Anticuerpo para inmunotransferencia. Dilución fuente: 1:2000. Se requiere RRID y número de lote para JoVE. |
| Pareja de cebadores ALP | N/A | N/A | El ARNm de ALP se midió mediante qRT-PCR, pero la tabla principal de cebadores no proporciona las secuencias de los cebadores ALP. Se requiere confirmación del autor. |
| Reactivo de anticuerpo biotinilado | Suministrado con el kit ELISA, Jiyinmei | Componente del kit | Se añade a los pocillos de muestra durante el ELISA. |
| Gelatina de asta de Cervus elaphus, Lu Jiao Jiao | Beijing Tongrentang | N/A | Componente que refuerza el Yang. Dosis total en la fórmula fuente: 12 g, proporción 4. La gelatina se derritió en la decocción. |
| Gelatina de plastrón de Chinemys reevesii, Gui Ban Jiao | Beijing Tongrentang | N/A | Componente que nutre el Yin. Dosis total en la fórmula fuente: 12 g, proporción 4. La gelatina se derritió en la decocción. |
| Cloroformo | N/A | N/A | Separação de fases durante la extracción de ARN. |
| Etapa de enfriamiento | Leica | 1150 | Soporte criogénico o de enfriamiento para el proceso de corte. |
| Cornus officinalis, Shan Zhu Yu | Beijing Tongrentang | N/A | Componente que nutre el Yin. Dosis total en la fórmula fuente: 12 g, proporción 4. |
| Cuscuta australis, Tu Si Zi | Beijing Tongrentang | N/A | Componente que refuerza el Yang. Dosis total en la fórmula fuente: 12 g, proporción 4. |
| Cyathula officinalis, Chuan Niu Xi | Beijing Tongrentang | N/A | Componente que nutre el Yin. Dosis total en la fórmula fuente: 9 g, proporción 3. |
| PBS tratado con DEPC | N/A | N/A | Lavado de vértebras lumbares L4 a L5 antes del congelado en nitrógeno líquido. |
| Diétilstilbestrol | N/A | N/A | Control positivo de medicina occidental. Dosis fuente: 0,04 mg/kg/día, 1 mL/100 g/día. El documento principal también contiene una inconsistencia en la nomenclatura china que debe armonizarse como diétilstilbestrol. |
| Dioscorea opposita, Huai Shan Yao | Beijing Tongrentang | N/A | Componente que nutre el Yin. Dosis total en la fórmula fuente: 12 g, proporción 4. |
| Mezcla de dNTP | N/A | N/A | Incluida en la reacción de transcripción inversa. |
| Reactivo quimioluminiscente ECL | N/A | N/A | Reactivo de detección para inmunotransferencia. |
| Reactivo cromogénico ELISA A | Suministrado con el kit ELISA, Jiyinmei | Componente del kit | Reactivo de desarrollo del color para ELISA. |
| Reactivo cromogénico ELISA B | Suministrado con el kit ELISA, Jiyinmei | Componente del kit | Reactivo de desarrollo del color para ELISA. |
| Solución de parada ELISA | Suministrado con el kit ELISA, Jiyinmei | Componente del kit | Se utiliza para detener la reacción de color en ELISA. |
| Reactivo enzimático marcado para ELISA | Suministrado con el kit ELISA, Jiyinmei | Componente del kit | Se añade a los pocillos no en blanco en ELISA. |
| Anticuerpo primario EphB4 | Proteintech | N/A | Anticuerpo para inmunotransferencia. Dilución fuente: 1:2000. Se requiere RRID y número de lote para JoVE. |
| Pareja de cebadores EphB4 | N/A | Producto de PCR de 232 pb | Adelantado CTAGACTCTTTCCTGCGGCT; Reverso GGGAACTTGTGTAGGTGGGA. Error tipográfico en la tabla principal: Rat RphB4 debe leerse Rat EphB4. |
| Anticuerpo primario ephrinB2 | Affinity Biosciences | N/A | Anticuerpo para inmunotransferencia. Dilución fuente: 1:2000. Se requiere RRID y número de lote para JoVE. |
| Pareja de cebadores ephrinB2 | N/A | Producto de PCR de 172 pb | Adelantado CGGACAAGGCCTGGTACTAT; Reverso ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT. |
| Etileno, absoluto y graduado al 95%, 85%, 75% | N/A | N/A | Deshidratación y rehidratación gradual durante la tinción con hematoxilina y eosina. |
| Ratas hembra Sprague-Dawley | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | No se proporcionó en el artículo fuente el certificado de animal ni el número de licencia | Hembras sanas no preñadas, libres de patógenos específicos, de 6 meses de edad. El documento fuente chino indica 230 a 270 g; un borrador anterior en inglés indica 220 a 250 g. Verificar un rango final antes del envío. |
| Anticuerpo primario GAPDH | Servicebio | N/A | Anticuerpo de control de carga. Dilución fuente: 1:2000. Se requiere RRID y número de lote para JoVE. |
| Pareja de cebadores GAPDH | N/A | Producto de PCR de 253 pb | Adelantado ACAGCAACAGGGTGGTGGAC; Reverso TTTGAGGGTGCAGCGAACTT. |
| Software GraphPad Prism | GraphPad Software | Versión 9.4.1; RRID:SCR_002798 | Análisis estadístico y generación de gráficos. Deben conservarse en los archivos de salida la normalidad, homogeneidad de varianza, ANOVA, corrección de Bonferroni y tamaños del efecto. |
| Gránulos Gusukang | Liaoning Wohua Kangchen Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | Control positivo de medicina tradicional china. Dosis fuente: 1,8 g/kg/día o 0,5 mL/100 g/día. |
| Solución de tinción con hematoxilina | Zhuhai Beisuo Biotechnology Co., Ltd. | N/A | Tinción histológica. El procedimiento fuente utilizó una tinción de 5 minutos con hematoxilina. |
| Microcentrífuga de alta velocidad | N/A | TG16W | Centrifugación para procedimientos de suero y ácidos nucleicos. |
| Absorciometría dual de rayos X Hologic | Hologic | N/A | Análisis de densidad mineral ósea. El documento fuente informa escaneo femoral in vivo y ex vivo. |
| Software ImageJ | National Institutes of Health | RRID:SCR_003070 | Cuantificación densitométrica de bandas en inmunotransferencia. La versión no se proporcionó en el artículo fuente. |
| Cocina de inducción | Midea | N/A | Listada en la tabla de instrumentos del documento fuente chino. |
| Isóflurano | N/A | N/A | Anestesia para ovariohisterectomía bilateral y posicionamiento en DXA. El protocolo revisado debe especificar inducción, mantenimiento, vía y criterios de profundidad anestésica. |
| Isopropanol | N/A | N/A | Precipitación de ARN durante la extracción. |
| Nitrógeno líquido | N/A | N/A | Congelado rápido de muestras de vértebras lumbares. |
| Lycium barbarum, Gou Qi Zi | Beijing Tongrentang | N/A | Componente que nutre el Yin. Dosis total en la fórmula fuente: 12 g, proporción 4. |
| Lector de microplacas | N/A | AMR-100 | Detección de absorbancia en ELISA a 450 nm. |
| Lavador de microplacas | N/A | APW-200 | Paso de lavado para placas de ELISA. |
| Transcriptasa inversa MMLV | N/A | N/A | Enzima de transcripción inversa. |
| Bálsamo de montaje neutro | Sinopharm Group | N/A | Medio de montaje para portaobjetos teñidos con hematoxilina y eosina. |
| Solución salina normal | N/A | N/A | Vehículo administrado por gavaje para los grupos control en blanco, sham-operado y modelo. |
| Cebador Oligo(dT)18 | N/A | N/A | Utilizado para la transcripción inversa. |
| Penicilina | N/A | N/A | Profilaxis de infección postoperatoria. Dosis fuente: 20.000 U/kg por vía intramuscular durante 3 días. |
| Olla a presión | Xinfei | N/A | Listada en la tabla de instrumentos del documento fuente chino. |
| Inhibidor de proteasas | N/A | N/A | Se añade durante la extracción de proteínas. |
| Tampón de lisis proteica | N/A | N/A | Extracción de proteínas de tejido óseo para inmunotransferencia. |
| Membrana PVDF | N/A | N/A | Membrana de transferencia para inmunotransferencia activada con metanol. |
| Instrumento de qRT-PCR | N/A | N/A | PCR cuantitativa de transcripción inversa para EphB4, ephrinB2, RhoA, ALP y GAPDH. |
| Kit ELISA de CTX-1 de rata | Jiyinmei | JYM0026Ra | ELISA sandwich para el telopéptido C-terminal del colágeno tipo 1 en suero. Detección a 450 nm. |
| Kit ELISA de P1NP de rata | Jiyinmei | JYM0030Ra | ELISA sandwich para el propepétido N-terminal del procollágeno tipo 1 en suero. Detección a 450 nm. |
| Rehmannia glutinosa, Shu Di Huang | Beijing Tongrentang | N/A | Componente que nutre el Yin. Dosis total en la fórmula fuente: 24 g, proporción 8. |
| Anticuerpo primario RhoA | Proteintech | N/A | Anticuerpo para inmunotransferencia. Dilución fuente: 1:2000. Se requiere RRID y número de lote para JoVE. |
| Pareja de cebadores RhoA | N/A | Producto de PCR de 177 pb | Adelantado GTTTATGTGCCCACGGTGTT; Reverso ACTATCAGGGCTGTCGATGG. Terminología armonizada de RHoA a RhoA. |
| Inhibidor de RNasa | N/A | N/A | Incluido en la reacción de transcripción inversa. |
| Agua libre de RNasa | N/A | N/A | Disolución de ARN tras el secado. |
| Microtomo rotatorio | Leica | 2245 | Corte histológico. |
| Anticuerpo secundario para inmunotransferencia | N/A | N/A | Dilución fuente: 1:15000. Se requiere especificar la reactividad del huésped y el RRID para JoVE. |
| Leche desnatada al 5% | N/A | N/A | Reactivo de bloqueo para inmunotransferencia, 2 h a temperatura ambiente. |
| Máquina para extensión y horneado de portaobjetos | Jinhua Yidi | N/A | Preparación de portaobjetos para histología. |
| Pentobarbital sódico al 3% | N/A | N/A | Anestesia terminal antes de la recogida de sangre por aorta abdominal en el documento fuente chino. Debe verificarse el procedimiento final de eutanasia y el método de confirmación. |
| Diluyente estándar de muestra | Suministrado con el kit ELISA, Jiyinmei | Componente del kit | Se utiliza para dilución seriada estándar en el procedimiento ELISA. |
| Tampón TBST | N/A | N/A | Tampón de lavado para inmunotransferencia. |
| Incubadora termostática con agitación | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | N/A | Incubación y agitación en laboratorio. |
| Reactivo TRIzol | N/A | N/A | Extracción de ARN de 100 mg de tejido óseo. |
| Microscopio vertical | Leica | DM1000 | Imagenología histológica con hematoxilina y eosina a 200x. |
| Incubadora termostática con camisa de agua | N/A | GNP-9080 | Incubación para procedimientos de ensayo. |
| Solución de tinción con eosina hidrosoluble | Zhuhai Beisuo Biotechnology Co., Ltd. | N/A | Contratinción histológica. El procedimiento fuente utilizó una tinción de 3 minutos con eosina. |
| Sistema de electroforesis para inmunotransferencia | N/A | N/A | Separación de proteínas. Electroforesis fuente: inicialmente 80 V, luego 120 V. |
| Sistema de imagen para inmunotransferencia | N/A | N/A | Imagen de membranas quimioluminiscentes. Se requieren membranas sin recortar para el envío. |
| Sistema de transferencia para inmunotransferencia | N/A | N/A | Transferencia de proteínas a membrana PVDF. Condición de transferencia fuente: 400 mA, 90 min, baño de hielo. |
| Xileno | N/A | N/A | Desparafinado y aclarado del tejido durante la histología. |
| Hierbas componentes de la píldora Zuogui | Beijing Tongrentang | N/A | Fórmula de ocho hierbas: Rehmannia glutinosa, Dioscorea opposita, Cornus officinalis, Lycium barbarum, gelatina de plastrón de Chinemys reevesii, Cyathula officinalis, Cuscuta australis y gelatina de asta de Cervus elaphus. |
Referencias
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