Identificación de biomarcadores candidatos asociados con disfunción mitocondrial y SUMOilación en insuficiencia cardíaca basándose en enfoques bioinformáticos

Resumen

Utilizando bioinformática, aprendizaje automático y validación de qPCR, este estudio identificó cinco biomarcadores candidatos asociados con la SUMOilación y la disfunción mitocondrial en la insuficiencia cardíaca. Estos hallazgos mejoran la comprensión de los mecanismos de insuficiencia cardíaca y sugieren posibles direcciones para futuras investigaciones diagnósticas.

Resumen

La insuficiencia cardíaca (IC) presenta un desafío clínico persistente. Aunque la SUMOilación y la función mitocondrial son vitales para la salud de los cardiomiocitos, su influencia conjunta sobre la IC sigue siendo esquiva. Se descargaron dos conjuntos de datos relacionados con HF desde GEO. Los genes superpuestos se obtuvieron de todos los genes del conjunto de entrenamiento, genes relacionados con SUMO y genes relacionados con mitocondriales. Se aplicaron tres algoritmos de aprendizaje automático para identificar genes clave diagnósticos. Posteriormente, se construyeron y evaluaron modelos diagnósticos basándose en estos genes. Además, el microambiente inmunitario en IC frente a controles sanos se evaluó utilizando CIBERSORT, MCP-counter y ssGSEA. Se analizaron las diferencias en la infiltración inmunitaria entre la IC y los controles sanos. Se realizaron predicciones de fármacos y acoplamientos moleculares para identificar posibles candidatos a fármacos que apuntaban a estos genes. Finalmente, se empleó qPCR para validar los niveles de expresión génica en muestras clínicas. Se identificaron un total de 113 genes comunes con un enriquecimiento notable en la regulación mitocondrial. Cinco genes clave, a saber, NFKB1, MYEF2, NSUN2, SQSTM1 y FKBP4, fueron identificados por tres algoritmos de aprendizaje automático. Los análisis de enriquecimiento funcional relacionaron estos genes con la respuesta inmune, el procesamiento del ARN y la regulación del ciclo celular. Además, el perfilado de infiltración inmunitaria reveló que la infiltración de neutrófilos contribuye a respuestas inmunitarias desreguladas en la HF. El acoplamiento molecular reveló que el fármaco de molécula pequeña IMX-942 tiene una afinidad favorable de unión con SQSTM1 (-5,8 kcal/mol). La validación qPCR apoyó los resultados de bioinformática. NFKB1, MYEF2, NSUN2, SQSTM1 y FKBP4 fueron identificados como genes clave que vinculan la SUMOilación y la función mitocondrial en la HF. Estos hallazgos aportan nuevas perspectivas sobre la fisiopatología de la IC y pueden contribuir al desarrollo de nuevas estrategias diagnósticas y terapéuticas.

Introducción

La insuficiencia cardíaca (IC), la fase terminal de diversas enfermedades cardiovasculares, se caracteriza por una función cardíaca deteriorada que no satisface las demandas metabólicas del^cuerpo. Esta condición debilitante supone amenazas significativas para la salud del paciente, lo que conduce a una disminución de la calidad de vida y a un aumento de las tasas de^{mortalidad 2}. Las modalidades diagnósticas actuales para la IC incluyen principalmente la detección de marcadores^{bioquímicos 3,4}, la ecocardiografía y la imagen^{radiológica 5}. Aunque los tratamientos disponibles incluyen agentes farmacológicos, intervenciones basadas en dispositivos y procedimientos quirúrgicos, los resultados clínicos siguen siendo^{insatisfactorios 6}. Limitaciones como reacciones adversas a los medicamentos, aplicabilidad limitada de los dispositivos, rechazo inmunitario y otras complicaciones frecuentemente dificultan la eficacia^terapéutica 7,8,9,10,11. Por ello, es urgente esclarecer los mecanismos subyacentes de la IC, identificar biomarcadores diagnósticos tempranos y precisos, y desarrollar estrategias terapéuticas más eficaces y seguras.

Pequeñas proteínas modificadoras similares a la ubiquitina (SUMO) se conjugan covalentemente a los residuos de lisina de las proteínas del sustrato mediante un proceso dinámico y reversible, que regula la estructura y función de las proteínas del^{sustrato 12}. La SUMOilación, una modificación posttraduccional crítica, actúa como regulador clave de varios procesos celulares^13,14. Las mitocondrias, como centro de energía y metabolismo de las células, están fundamentalmente implicadas en la patogénesis de la HF. En el proceso patológico de la HF, la disfunción mitocondrial, como la producción insuficiente de ATP, la ruptura de especies reactivas de oxígeno (ROS) y el desequilibrio de la homeostasis de Ca²⁺, contribuyen significativamente a la^{progresión 15,16,17,18}. Cabe destacar que la evidencia emergente sugiere una posible interacción entre la SUMOilación y la función mitocondrial. El estrés mitocondrial puede desencadenar vías relacionadas con la SUMOilación, mientras que las proteínas SUMO y sus proteasas específicas son esenciales para mantener la homeostasis mitocondrial 19,20,21. Estudios recientes han destacado aún más la importancia del control de calidad mitocondrial y la dinámica mitocondrial en las enfermedades cardiovasculares y la progresión de la IC^22,23. Sin embargo, el efecto sinérgico de la SUMOilación y la regulación mitocondrial sobre el desarrollo de la IC sigue siendo incierto, especialmente a nivel génico.

En este estudio, investigamos sistemáticamente genes en la intersección de la SUMOilación y la disfunción mitocondrial en la IC, dos procesos biológicos clave que han sido implicados individualmente en la IC pero aún no integrados de forma exhaustiva. Los genes superpuestos se identificaron mediante genes expresados diferencialmente relacionados con la HF, genes relacionados con SUMOylation y genes relacionados con mitocondrias. Los genes clave se examinaron después mediante algoritmos de aprendizaje automático y se emplearon para construir un modelo diagnóstico. Se realizaron análisis de enriquecimiento funcional e infiltración inmune para explorar sus posibles roles biológicos en la IC. Este enfoque integrado puede proporcionar un marco sistemático para explorar la intercomunicación entre la SUMOilación y la disfunción mitocondrial en la IC.

Protocolo

El estudio se realizó conforme a la Declaración de Helsinki, y el protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Tercer Hospital de la Universidad Médica de Hebei (W2025-065-1) en noviembre de 2024. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos implicados en el estudio.

Fuente de datos y preprocesamiento

Se obtuvieron datos de RNA-seq asociados con HF, incluyendo dos conjuntos de datos de microarrays del Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Se seleccionaron dos conjuntos de datos de microarrays de sangre periférica: GSE59867 (34 muestras de IC y 30 controles) como conjunto de datos de entrenamiento; GSE57338 (177 muestras de HF y 136 controles) se utilizó como conjunto de datos de validación. La información clínica disponible para GSE57338, incluyendo edad, género y estado de la enfermedad, fue obtida de GEO y se resume en la Tabla Suplementaria 1. Además, se obtuvieron un total de 3.893 genes relacionados con la SUMOilación (SRGs) de la base de datos dbPTM (https://awi.cuhk.edu.cn/dbPTM/index.php) (Tabla Suplementaria 2), mientras que se recogieron 2.030 genes relacionados con mitocondrias (MRGs) basados en un estudio^{previo 24} (Tabla Suplementaria 3). A continuación, se utilizó el paquete R GEOquery (v 2.72.0)²⁵ para descargar conjuntos de datos de la base de datos GEO, extraer la matriz de expresión y obtener la información fenotípica de la muestra. La anotación se realizaba mapeando el archivo de anotación y comparando los identificadores de gens. Se eliminaron identificadores génicos inválidos y se conservaron las sondas más expresadas.

Selección de genes clave mediante aprendizaje automático

Se utilizó un enfoque de varios pasos para seleccionar los genes relacionados con la HF, la SUMOilación y las mitocondrias. En primer lugar, se identificaron los genes comunes entre el conjunto de datos de entrenamiento, los SRGs y los MRGs mediante análisis de intersección. La función potencial de genes comunes fue identificada mediante el análisis de enriquecimiento de Gene Ontology (GO) y la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) utilizando el paquete R ClusterProfiler (v 4.12.6)²⁶. Después, se emplearon tres enfoques de aprendizaje automático, a saber, regresión LASSO, XGBoost y bosque aleatorio (RF), para filtrar aún más los genes. En la regresión LASSO, se seleccionó el parámetro óptimo de regularización λ mediante validación cruzada para identificar las características genéticas con mayor valor predictivo. Los genes con coeficientes distintos de cero fueron seleccionados para su análisis posterior. Luego, se utilizaron algoritmos XGBoost y RF para calcular las puntuaciones de importancia de las características y analizar los 20 genes principales.

Construcción y evaluación de modelos diagnósticos

Se construyó un modelo diagnóstico utilizando regresión logística basado en el conjunto de datos GSE59867. El modelo se aplicó entonces para predecir el estado de la enfermedad y calcular puntuaciones de probabilidad. Para validar el modelo, se extrajeron los mismos genes clave del conjunto de datos GSE57338, se normalizaron para coincidir con el conjunto de datos de entrenamiento y se utilizaron para predicciones externas. El rendimiento del modelo se evaluó utilizando curvas de Característica de Operación del Receptor (ROC), Matriz de Confusión, Curva de Calibración y Análisis de Curva de Decisión (DCA).

Análisis de enriquecimiento de conjuntos génicos (GSEA) y localización subcelular

El análisis de correlación de Spearman se utilizó para identificar genes correlacionados para cada gen clave. El análisis GSEA se realizó utilizando el paquete R ClusterProfiler (v 4.12.6) sobre los genes relacionados con los genes clave. Mientras tanto, para determinar la localización subcelular precisa de los genes clave dentro de la célula, se determinó su localización subcelular utilizando la base de datos GeneCards (https://www.genecards.org/).

Asociación gen-enfermedad y predicción de fármacos

Para evaluar la relevancia clínica de los genes clave identificados, se realizaron análisis sistemáticos de asociación de enfermedades e interacción medicamentosa. Las asociaciones enfermedad-gen fueron analizadas utilizando la Base de Datos Comparativa de Toxicogenómica (CTD; https://ctdbase.org/), con resultados clasificados tanto por puntuaciones de inferencia como por recuento de referencias (las 10 principales asociaciones reportadas). Los datos de interacción génico-fármaco para genes clave se obtuvieron de la base de datos Drug-Gene Interaction (DGIdb), y los fármacos se excluyeron basándose en una puntuación de interacción < 0,5. Posteriormente, descargamos las estructuras 3D de proteínas correspondientes a genes clave de la base de datos PDB (https://www.rcsb.org/) y las estructuras moleculares de fármacos potenciales de PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). A continuación, se realizó un análisis de acoplamiento molecular utilizando CB-Dock2²⁷ (https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php) para calcular las puntuaciones de unión entre los fármacos potenciales y las proteínas. Una energía libre de unión más baja indica una interacción más estable, lo que sugiere que el compuesto podría tener un mayor potencial de dirigimiento.

Análisis de infiltración inmune

La infiltración de células inmunitarias se evaluó utilizando tres métodos complementarios: contador de poblaciones celulares de microambiente (contador MCP⁾²⁸, identificación de tipos celulares mediante la estimación de subconjuntos relativos de transcritos de ARN (CIBERSORT⁾²⁹ y análisis de enriquecimiento de muestra única (ssGSEA⁾³⁰. El análisis con contador MCP y CIBERSORT se realizó utilizando el paquete R IOBR (v 0.99.0)³¹. El contador MCP se utilizó para estimar la abundancia de células inmunitarias y estromales, mientras que CIBERSORT se empleó para cuantificar las proporciones relativas de 22 tipos de células inmunitarias. ssGSEA se realizó utilizando el paquete GSVA (v1.52.3)³² para evaluar el enriquecimiento a nivel muestral de subtipos de células inmunitarias.

Construcción de la red reguladora de ARN endógeno (ceRNA) competidora

Para investigar los posibles roles regulatorios miARN–lncRNA asociados con genes clave previamente identificados, se construyó una red reguladora de ceRNA. El paquete R multiMiR (v 1.26.0)³³ se utilizó para predecir posibles interacciones microARN (miARN)–ARNm para genes clave, integrando datos de PITA (https://omictools.com/pita-tool/) y la base de datos miRDB (https://mirdb.org/). Se seleccionaron pares miARN–mRNA con alta confianza y consistencia. Posteriormente, las interacciones lncRNA–miARN fueron recuperadas de la base de datos StarBase (https://rnasysu.com/encori/) y filtradas para detectar interacciones soportadas por ≥ 10 experimentos CLIP-seq y categorizadas como lincRNAs. Se construyó una red de ceRNA integrando interacciones lncRNA-miARNm.

Validación qPCR

Para validar la expresión de genes clave, se recogieron muestras de sangre de pacientes con IC y controles sanos de la cohorte clínica (n = 6 por grupo) en el Tercer Hospital de la Universidad Médica de Hebei (W2025-065-1) bajo protocolos aprobados y consentimiento informado. El ARN total fue aislado utilizando el reactivo TRIzol junto con cloroformo e isopropanol. Tras la extracción, el ARN se disolvió en agua tratada con DEPC, y su concentración y pureza se evaluaron utilizando un espectrofotómetro NanoDrop. Para el análisis transcripcional, el ARN se transcribió inversamente en cDNA usando la mezcla rápida de síntesis de cDNA de primera cadena para RT (con dsDNasa). Posteriormente se realizó una PCR cuantitativa utilizando la Fast Taq qPCR SYBR Green Mix. Las secuencias específicas de cebadores se detallan en la Tabla de Materiales. Los niveles relativos de expresión génica se calcularon utilizando el método ^2-ΔΔCT , con la normalización adecuada.

Análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software R y GraphPad Prism. Se realizaron comparaciones estadísticas entre dos grupos independientes utilizando la prueba t de Student o la prueba U de Mann-Whitney, dependiendo de la distribución de datos. Se consideró que un valor p inferior a 0,05 indicaba significancia estadística.

Resultados

Identificación y enriquecimiento funcional de genes que se intersectan

Para identificar genes implicados en la SUMOilación y la función mitocondrial en la IC, se realizó primero el control de calidad en el conjunto de entrenamiento GSE59867 (Figura suplementaria 1A). Se realizó un análisis de intersección triple entre todos los genes del conjunto de entrenamiento, SRGs y MRGs, identificando 113 genes superpuestos (

Discusión

La IC, una etapa progresiva y terminal de diversas enfermedades cardiovasculares, se caracteriza por mecanismos fisiopatológicos altamente complejos^{y multifactoriales 17,34}. Aunque tanto la SUMOilación como la disfunción mitocondrial han sido implicadas individualmente en la IC, sus posibles roles sinérgicos siguen siendo insuficientemente explorados, especialmente a nivel génico. En el presente estudio, identificamos cinco genes...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sucedáneo de cloroformo	Servicebio	G3014-02	reactivo qPCR
Agua tratada con DEPC	Biosharp	BL510A	reactivo qPCR
Mezcla rápida de síntesis de primera cadena de ADN para RT (con dsDNase)	Albatross Biology	500-101	reactivo qPCR
Mezcla Fast Taq qPCR SYBR Green	Albatross Biology	500-102	reactivo qPCR
Primers FKBP4	Tsingke	N/A	Forward: 5’-GAAGGCGTGCTGAAGGTCAT-3’ Reverse: 5’-TGCCATCTAATAGCCAGCCAG-3’
Isopropanol	Hushi	80109218	reactivo qPCR
Primers MYEF2	Tsingke	N/A	Forward: 5’-CAGCTCCAATGGCGTTAAAATG-3’ Reverse: 5’-TGGCCTTCTTACTTCCTGTAGAT-3’
Espectrofotómetro NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	NanoDrop 2000C	reactivo qPCR
Primers NFKB1	Tsingke	N/A	Forward: 5’-AACAGAGAGGATTTCGTTTCCG-3’ Reverse: 5’-TTTGACCTGAGGGTAAGACTTCT-3’
Primers NSUN2	Tsingke	N/A	Forward: 5’-GAACTTGCCTGGCACACAAAT-3’ Reverse: 5’-TGCTAACAGCTTCTTGACGACTA-3’
Primers SQSTM1	Tsingke	N/A	Forward: 5’-GCACCCCAATGTGATCTGC-3’ Reverse: 5’-CGCTACACAAGTCGTAGTCTGG-3’
Reactivo TRIzol	Vazyme	R401-01	reactivo qPCR
Primers de β-actina	Tsingke	N/A	Forward: 5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’ Reverse: 5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’