El miR-93-5p dirige directamente al receptor tipo Toll 4 (TLR4) en la neumonía pediátrica por Mycoplasma pneumoniae (MPP). Su regulación negativa podría contribuir a la progresión de la enfermedad y a la lesión asociada del sistema digestivo. Estos hallazgos sugieren que el miR-93-5p podría servir como un biomarcador diagnóstico potencial para la MPP y la MPP con lesión del sistema digestivo.
Artículo de investigación
Evaluación del papel de la miR-93-5p en niños infectados por Mycoplasma pneumoniae con lesión del sistema digestivo
En este artículo
Resumen
Resumen
Se ha implicado a miR-93-5p en la modulación de la lesión pulmonar aguda, pero su papel y valor diagnóstico en la neumonía por Mycoplasma pneumoniae (MPP) pediátrica con lesión del sistema digestivo permanecen poco claros. Este estudio evaluó el papel de miR-93-5p como biomarcador diagnóstico potencial para MPP y complicaciones digestivas asociadas en niños. Se recogieron muestras clínicas de pacientes pediátricos con MPP y controles sanos. La expresión de miR-93-5p se cuantificó mediante PCR cuantitativa con transcripción inversa. Se utilizaron células A549 infectadas con Mycoplasma pneumoniae (MP) para establecer un modelo celular de MPP con el fin de evaluar los cambios en la viabilidad celular y en las citocinas proinflamatorias. La interacción del miR-93-5p con el receptor tipo Toll 4 (TLR4) se evaluó mediante un ensayo de luciferasa. El rendimiento diagnóstico se evaluó mediante análisis de la curva característica de operación del receptor (ROC). Los niveles de miR-93-5p disminuyeron significativamente en pacientes con MPP en comparación con los controles sanos (P < 0,001) y disminuyeron aún más en pacientes con MPP con lesión del sistema digestivo en comparación con aquellos con MPP aislada. La infección por MP redujo la viabilidad celular y aumentó los niveles de IL-6 y TNF-α, mientras que la sobreexpresión de miR-93-5p atenuó estos efectos. La expresión de TLR4 aumentó tras la infección por MP y fue negativamente regulada por miR-93-5p. Clínicamente, la lesión del sistema digestivo en pacientes con MPP se asoció con niveles más bajos de miR-93-5p. Los análisis mediante curva ROC mostraron un buen rendimiento diagnóstico para distinguir a pacientes con MPP de controles sanos, y a pacientes con MPP con lesión del sistema digestivo de aquellos con MPP aislada. MiR-93-5p dirige directamente a TLR4 en la MPP pediátrica, y su regulación negativa podría contribuir a la progresión de la enfermedad y a la lesión asociada del sistema digestivo. Estos hallazgos sugieren que miR-93-5p podría servir como un biomarcador diagnóstico potencial para MPP y para MPP con lesión del sistema digestivo.
Introducción
Mycoplasma pneumoniae (MP) es un patógeno predominante responsable de la neumonía en niños1, lo que a menudo provoca una morbilidad respiratoria significativa a nivel mundial. Aunque MP provoca principalmente infección pulmonar, también puede causar complicaciones extrapulmonares que afectan a múltiples sistemas de órganos.2Durante la infección por M. pneumoniae, los síntomas gastrointestinales más frecuentemente reportados incluyen náuseas, vómitos, diarrea y dolor abdominal.3. También se ha identificado una variedad de afecciones y manifestaciones gastrointestinales como parte de M. pneumoniae-enfermedades extrapulmonares relacionadas (MPEPDs)2. Pacientes pediátricos con neumonía por M. pneumoniae (MPP) complicada por lesión del sistema digestivo que presenta desafíos clínicos que pueden agravar la gravedad de la enfermedad y dificultar el manejo4. Evidencia emergente indica una interacción entre la infección pulmonar y la disfunción intestinal, que podría subyacer a esta asociación5,6. La desregulación de las respuestas inmunitarias durante la infección por MP también puede estar asociada con lesión del sistema digestivo7.
A pesar de los avances en las modalidades diagnósticas8, la identificación temprana y precisa de la MPP sigue siendo un desafío debido a la superposición de manifestaciones clínicas con otras infecciones respiratorias y al compromiso extrapulmonar variable9. El pulmón y el intestino son componentes clave del sistema inmunitario mucosal común, y estos órganos pueden influir en la función uno del otro, como se observa en las alteraciones intestinales durante las enfermedades pulmonares y sus efectos recíprocos, un fenómeno conocido como la comunicación pulmón-intestino10. Además, la atención de enfermería pediátrica se centra principalmente en el manejo de los síntomas respiratorios11, mientras que las manifestaciones gastrointestinales pueden pasar desapercibidas o atribuirse a efectos secundarios del tratamiento. Esta brecha resalta la necesidad de una evaluación integral que combine la valoración pulmonar y gastrointestinal para optimizar las intervenciones de enfermería de apoyo12. Estudios moleculares recientes han destacado reguladores de las vías de señalización inflamatoria implicadas tanto en la patología pulmonar como en la inflamación intestinal en la MPP12,13.
Se ha implicado a miR-93-5p en la patogénesis de la lesión pulmonar aguda, donde su regulación negativa se correlaciona con una función pulmonar deteriorada y respuestas inflamatorias exacerbadas14,15. Con base en estos hallazgos, se planteó la hipótesis de que miR-93-5p también estaría regulado negativamente en el suero de niños con MPP. Un análisis bioinformático mediante la base de datos TargetScan identificó al receptor tipo Toll 4 (TLR4) como un posible blanco directo de miR-93-5p. Se ha informado que TLR4 desempeña un papel importante en la modulación del eje pulmón-intestino16,17 y, por lo tanto, se consideró que podría estar asociado con complicaciones gastrointestinales en el MPP. En consecuencia, este estudio investigó la participación de miR-93-5p en pacientes pediátricos con MPP complicado por lesión del sistema digestivo.
Protocolo
Este estudio fue revisado y aprobado por el Comité de Ética del Hospital Afiliado de la Universidad de Yangzhou (Número de aprobación: 2023-YKL01-(16); 17 de enero de 2023). Se recogieron muestras de sangre venosa periférica de cada participante para los ensayos de laboratorio pertinentes. Antes de la participación, se obtuvo el consentimiento informado de los tutores legales de todos los participantes. Los reactivos, equipos y herramientas utilizados en este protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Recolección de muestras clínicas
Se incluyó a un total de 108 niños de 2 a 14 años en el Hospital Afiliado de la Universidad de Yangzhou entre febrero de 2023 y diciembre de 2024. Los 108 niños fueron diagnosticados con PPM, confirmado mediante imágenes torácicas y pruebas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para detectar ADN de MP en muestras nasofaríngeas. El ADN de MP en hisopos nasofaríngeos se detectó mediante PCR cuantitativa en tiempo real dirigida al gen de la adhesina P1 específico de MP.
Los pacientes fueron clasificados según el estado de la enfermedad en dos grupos: MPP sin IDS (n = 60) y MPP con IDS (n = 48). Se definió el IDS por la presencia de al menos un síntoma gastrointestinal, incluyendo diarrea (≥3 evacuaciones líquidas o acuosas por día durante un período de al menos 2 días), vómitos (episodios repetidos de vómito por día), náuseas, dolor abdominal, distensión abdominal o sangrado gastrointestinal. >24 h), náuseas, vómitos o dolor abdominal persistente con o sin sensibilidad a la palpación, acompañado de al menos un parámetro de laboratorio anormal y/o hallazgos de imagenología abdominal confirmatorios. Los parámetros de laboratorio anormales incluían transaminasas séricas, amilasa o lipasa elevadas y/o marcadores aumentados de permeabilidad intestinal, como el lactato D y la endotoxina. Los hallazgos de imagenología abdominal confirmatorios incluían engrosamiento de la pared intestinal, adenopatías mesentéricas aumentadas de tamaño o efusión peritoneal detectados mediante ultrasonografía o tomografía computarizada. Además, 60 niños sanos sometidos a exámenes de rutina sirvieron como controles.
- Criterios de inclusión
Los pacientes que presentaban síntomas gastrointestinales junto con anormalidades de laboratorio o de imágenes fueron clasificados en el grupo de DSI. - Criterios de exclusión
Los criterios de exclusión incluyeron neumonía viral o bacteriana, tuberculosis, antecedentes de alergia medicamentosa a los fármacos del estudio, trastornos inmunitarios, desnutrición, disfunción renal, malformaciones gastrointestinales y tratamiento previo con antibióticos antes del ingreso.
2. Cultivo celular y modelo MPP
Mycoplasma pneumoniae la cepa estándar ATCC 15531 se cultivó en caldo PPLO. Las células epiteliales alveolares A549 humanas se cultivaron en medio RPMI-1640 que contenía 10% de suero bovino fetal en condiciones húmedas a 37 °C con 5% de CO₂.
Para establecer un modelo in vitro de MPP, las células A549 fueron infectadas con suspensiones de M. pneumoniae a una multiplicidad de infección (MOI) de 1:10018. Tras la infección, las bacterias no unidas se eliminaron reemplazando el medio de cultivo. La eficiencia de la infección se confirmó mediante la detección por qPCR de ADN de MP en los sobrenadantes de cultivo tras la infección.
3. Construcción del plásmido y transfección
Los análogos de miR-93-5p, los plásmidos de sobreexpresión de TLR4 (oe-TLR4) y sus controles negativos correspondientes se sintetizaron comercialmente. Las células A549 infectadas con MP se transfirieron utilizando un reactivo de transfección basado en lípidos. La eficiencia de transfección se evaluó a las 48 h posteriores a la transfección mediante PCR cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR).
4. Análisis de RT-qPCR
Se extrajo ARN total de células A549 recolectadas al final de los experimentos. Las células fueron lisadas y homogenizadas utilizando solución salina tamponada con fosfatos (PBS). El ARN total fue purificado utilizando un reactivo de extracción de ARN basado en fenol. Un kit de transcripción inversa fue utilizado para la transcripción inversa de miR-93-5p, mientras que el ADN complementario para el análisis de ARNm fue sintetizado usando un reactivo de transcripción inversa disponible comercialmente. El análisis de RT-qPCR se realizó utilizando química SYBR Green.
5. Ensayo MTT
Se recolectaron y sembraron células A549 transfectadas de cada grupo experimental en placas de 96 pocillos a una densidad de 2 × 103 células por pocillo. Posteriormente, se añadieron 20 µL del reactivo de bromuro de metiltiazolildifenil-tetrazolio (MTT) a cada pocillo. Tras una incubación adicional de 2 h a 37 °C, se eliminaron cuidadosamente los sobrenadantes. Los cristales de formazán resultantes, formados por células metabólicamente activas, se solubilizaron según las instrucciones del ensayo. La viabilidad celular se cuantificó indirectamente midiendo la densidad óptica (OD) a 490 nm utilizando un lector de microplacas.
6. Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas
Se utilizaron kits comerciales de ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) para medir los niveles de interleucina-6 (IL-6) y factor de necrosis tumoral-α (TNF-α). Los ensayos se realizaron según las instrucciones del fabricante. Las mediciones se llevaron a cabo por triplicado en dos réplicas experimentales independientes para garantizar la precisión y la reproducibilidad.
7. Ensayo de luciferasa dual
Se predijeron sitios de unión de miR-93-5p dentro de la región no traducida 3′ (UTR) de TLR4 utilizando la base de datos TargetScan. Se clonaron fragmentos que contenían las secuencias tipo silvestre (WT) o mutadas (MUT) en un vector reportero de luciferasa. Las células A549 se transfectaron simultáneamente con 500 ng de cualquiera de los constructos WT o MUT junto con análogos de miR-93-5p o controles, utilizando un reactivo de transfección basado en lípidos. Después de 48 h, se midió la actividad de luciferasa mediante un ensayo dual de luciferasa reportera. La actividad de luciferasa de luciérnaga se normalizó respecto a la actividad de luciferasa Renilla para corregir la eficiencia de transfección.
8. Ensayo de inmunotransferencia (Western blotting)
Para la transferencia Western, los lisados celulares se mezclaron con tampón de carga y se centrifugaron a 10 000 × g durante 3 min. Los sobrenadantes se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio y las proteínas se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno. Las membranas se bloquearon con albúmina sérica bovina (BSA) al 5 % durante 1 h a temperatura ambiente y luego se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) y el inhibidor kappa B alfa (IκBα) en una dilución de 1:1000 en solución salina tamponada con Tris que contenía Tween 20 y BSA al 5 %. Tras tres lavados, las membranas se incubaron con inmunoglobulina G de cabra anti-conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) (1:500) durante 1 h a temperatura ambiente. Después de lavados adicionales, las bandas proteicas se visualizaron mediante un sustrato de quimioluminiscencia mejorada e imagenes se obtuvieron con un sistema de detección de quimioluminiscencia. Las intensidades de las bandas de las proteínas diana y de GAPDH se cuantificaron a partir de tres experimentos independientes utilizando software de análisis de imágenes.
9. Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando software de análisis estadístico. La normalidad de los datos de medición se evaluó mediante la prueba de Shapiro-Wilk. Los datos con distribución normal se presentan como media ± desviación estándar y se compararon mediante pruebas t para muestras independientes para dos grupos o análisis de varianza unifactorial (ANOVA) para múltiples grupos. Cuando el ANOVA indicó una diferencia general significativa, se utilizó la prueba post hoc de Tukey para comparaciones por pares. Los datos sin distribución normal se analizaron mediante la prueba de Mann-Whitney U. Las variables categóricas se expresaron como frecuencias y porcentajes y se compararon mediante pruebas de chi-cuadrado. Se utilizó análisis de curvas ROC (característica operativa del receptor) para evaluar el potencial diagnóstico de miR-93-5p para predecir MPP o MPP con DSI. Para identificar factores predictivos asociados con MPP con DSI, se realizó una regresión logística multivariable. Las variables incluidas en el modelo fueron: edad, sexo, duración de la fiebre, duración del uso de antibióticos y la expresión de miR-93-5p dividida por la mediana. Se consideró estadísticamente significativo un valor de P bilateral <0,05.
Resultados
El miR-93-5p está disminuido en la MPP pediátrica
Se evaluó el rendimiento diagnóstico del miR-93-5p para explorar su potencial como biomarcador en la MPP pediátrica. Como se muestra en Figura 1A, la expresión del miR-93-5p se redujo significativamente en pacientes pediátricos con MPP en comparación con los controles sanos. Las características demográficas y hematológicas de ambos grupos se resumen en la Tabla 1. No se observaron diferencias estadísticamente significativas en la distribución por edad o sexo entre los grupos (P > 0,05). Sin embargo, el recuento periférico de glóbulos blancos (GB), el porcentaje de neutrófilos (Neutrófilos%) y los niveles de proteína C reactiva (PCR) estuvieron significativamente elevados en el grupo con MPP en comparación con los controles sanos (P < 0,001).
Se realizó un análisis de la curva característica de operación del receptor (ROC) para evaluar más a fondo el rendimiento diagnóstico de miR-93-5p para distinguir a los pacientes con MPP de los niños sanos (Figura 1B). El área bajo la curva (AUC) fue de 0,9009 [intervalo de confianza (IC) del 95 %: 0,8537–0,9482], con una sensibilidad del 80,56 % y una especificidad del 88,33 %. Estos hallazgos indican que niveles disminuidos de miR-93-5p en suero se asociaron con MPP pediátrico.
Efecto de miR-93-5p en modelos celulares de MPP
Se realizó una serie de experimentos in vitro para evaluar el efecto de miR-93-5p en el modelo celular de MPP. En comparación con las células de control, la expresión de miR-93-5p se encontró regulada a la baja en el modelo celular de MPP (Figura 2A). La infección por MP también se asoció con una disminución en la viabilidad de las células A549 (Figura 2B). Además, los niveles de las citocinas proinflamatorias IL-6 y TNF-α se elevaron en el modelo de MPP en comparación con los controles (Figura 2C).
Para evaluar más a fondo el efecto funcional de miR-93-5p, se estableció un modelo de sobreexpresión de miR-93-5p en células A549 infectadas con MP (Figura 2D). La sobreexpresión de miR-93-5p aumentó significativamente la viabilidad celular en comparación con el modelo MPP sin sobreexpresión de miR-93-5p (Figura 2E). En consonancia con estos hallazgos, el aumento de la expresión de miR-93-5p se acompañó de una disminución en la producción de IL-6 y TNF-α (Figura 2F). Estos resultados indican que la reducción en la expresión de miR-93-5p se asoció con una viabilidad celular disminuida y respuestas inflamatorias aumentadas durante la infección por MP, mientras que la sobreexpresión de miR-93-5p atenuó estos cambios.
miR-93-5p dirige a TLR4
Para elucidar la relación reguladora entre miR-93-5p y TLR4, un análisis bioinformático identificó un sitio de unión predicho para miR-93-5p dentro de la región no traducida 3′ (UTR) del ARNm de TLR4 (Figura 3A). La expresión de TLR4 aumentó en el modelo celular MP en comparación con los controles (Figura 3B). La interacción predicha se evaluó posteriormente mediante un ensayo de luciferasa. La co-transfección con análogos de miR-93-5p redujo la actividad de luciferasa del constructo de tipo silvestre, lo que indica unión específica al sitio predicho (Figura 3C).
La sobreexpresión de miR-93-5p en células infectadas con MP redujo la expresión de TLR4 en comparación con los controles infectados sin tratamiento con el mimético (Figura 3D). Para investigar más a fondo los efectos descendentes asociados con la modulación de TLR4, se establecieron modelos de células A549 con sobreexpresión de TLR4 (Figura 3E). El análisis por inmunotransferencia mostró niveles aumentados de IκBα tras la sobreexpresión de TLR4 (Figura 3F).
La sobreexpresión de TLR4 disminuyó marcadamente la viabilidad celular tras la infección por MP en comparación con las células control, mientras que la sobreexpresión simultánea de miR-93-5p revirtió esta reducción (Figura 3G). La medición de citocinas inflamatorias mostró además que la sobreexpresión de TLR4 aumentó los niveles de mediadores proinflamatorios, mientras que la sobreexpresión de miR-93-5p atenuó estos cambios incluso en presencia de sobreexpresión de TLR4 (Figura 3H). Estos hallazgos indican que miR-93-5p regula negativamente la expresión de TLR4 y atenúa los cambios celulares asociados con la infección por MP.
Valor diagnóstico de miR-93-5p en MPP y MPP con DSI
Informes previos han descrito la participación de TLR4 en tejidos pulmonares y colónicos16. Por lo tanto, se evaluó clínicamente la asociación potencial entre miR-93-5p y la lesión del sistema digestivo en MPP. Como se muestra en Figura 4A, la expresión de miR-93-5p se redujo en el grupo MPP+DSI en comparación con el grupo MPP.
Las características demográficas y hematológicas se resumen en la Tabla 2. No se observaron diferencias significativas en edad o sexo entre los grupos. Sin embargo, la duración de la fiebre y el uso de antibióticos fueron significativamente mayores en los pacientes con infección sistémica concurrente (P < 0,05).
Se evaluó el valor diagnóstico de miR-93-5p para distinguir los casos de MPP con DSI de aquellos sin DSI mediante análisis de curva ROC. El AUC fue de 0.7866 (95 % CI: 0,6889–0,8843) (Figura 4B), con una sensibilidad del 85,71 % y una especificidad del 57,45 %.
El análisis de regresión logística multivariable identificó la baja expresión de miR-93-5p, la duración prolongada de la fiebre y el uso prolongado de antibióticos como factores asociados con lesión del sistema digestivo durante la infección por MP (Tabla 3; P < 0,05).
Figura 1: Expresión y valor diagnóstico de miR-93-5p en controles sanos (n = 60) y pacientes con MPP (n = 108). (A) La expresión de miR-93-5p se redujo en pacientes con MPP. (B) Análisis mediante curva ROC de miR-93-5p. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Efectos funcionales de miR-93-5p en el modelo celular infectado con MP. (A) La expresión de miR-93-5p disminuyó en el modelo infectado con MP. (B) La viabilidad celular disminuyó en el modelo infectado con MP. (C) Los niveles de TNF-α e IL-6 aumentaron en el modelo infectado con MP. (D) Eficiencia de transfección del mimético de miR-93-5p. (E) La viabilidad celular aumentó tras la sobreexpresión de miR-93-5p. (F) Los niveles de TNF-α e IL-6 disminuyeron tras la sobreexpresión de miR-93-5p. n = 3. P < 0,05, P < 0,01, P < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: El miR-93-5p dirige directamente a TLR4. (A) Sitio de unión predicho entre miR-93-5p y TLR4. (B) Expresión de TLR4 en el modelo infectado con MP. (C) Ensayo de luciferasa dual. (D) Regulación negativa de TLR4 por miR-93-5p. (E) Eficiencia de sobreexpresión de TLR4. (F) Análisis por inmunotransferencia de IκBα. (G) Viabilidad celular. (H) Niveles de TNF-α e IL-6. n = 3. P < 0,05, P < 0,01, P < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Expresión y valor diagnóstico de miR-93-5p en pacientes con MPP (n = 60) y pacientes con MPP con DSI (n = 48). (A) Expresión de miR-93-5p en el grupo MPP+DSI. (B) Análisis mediante curva ROC de miR-93-5p. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Variable | Sano (n = 60) | MPP (n = 108) | P |
| edad (años) | 6,81 ± 3,14 | 7,12 ± 3,55 | 0,559 |
| sexo (masculino/femenino) | 28/32 | 49/59 | 0,872 |
| GB (× 109/L) | 7,27 ± 0,89 | 9,86 ± 1,36 | <0,001 |
| PCR (mg/L) | 2,35 ± 0,17 | 11,53 ± 2,01 | <0,001 |
| Porcentaje de neutrófilos (%) | 42,55 ± 5,62 | 56,51 ± 15,40 | <0,001 |
Tabla 1: Comparación de las características demográficas y los parámetros sanguíneos de rutina entre controles sanos y pacientes con MPP. Esta tabla resume las características demográficas y los parámetros hematológicos de rutina de los controles sanos y los pacientes con MPP, incluyendo edad, sexo, recuento de glóbulos blancos (WBC), porcentaje de neutrófilos, porcentaje de eosinófilos, porcentaje de basófilos y proteína C reactiva (CRP). Se presentan comparaciones entre grupos y los valores de P correspondientes.
| Variable | MPP (n = 60) | MPP+DSI (n = 48) | P |
| edad (años) | 6.88 ± 3.87 | 7.42 ± 3.11 | 0.441 |
| sexo (masculino/femenino) | 31/29 | 28/20 | 0.494 |
| GB ( × 109/L) | 8.9 ± 0.89 | 11.05 ± 0.76 | <0.001 |
| PCR (mg/L) | 10.94 ± 1.62 | 12.27 ± 2.22 | <0.001 |
| Porcentaje de neutrófilos (%) | 55.87 ± 14.75 | 57.32 ± 16.29 | 0.629 |
| Duración de la fiebre (día) | 4.60 ± 1.83 | 7.26 ± 1.04 | <0.001 |
| Tiempo de uso de antibióticos (día) | 4.65 ± 1.147 | 6.29 ± 0.771 | <0.001 |
Tabla 2: Comparación de las características demográficas y los parámetros sanguíneos de rutina entre pacientes con MPP y pacientes con MPP+DSI. Esta tabla compara las características demográficas, los parámetros hematológicos de rutina y las características clínicas relevantes entre pacientes con MPP aislado y aquellos con MPP complicado por DSI. Se presentan las comparaciones entre grupos y los valores de P correspondientes.
| Variable | OR | IC 95% | Valor p | |
| inferior | superior | |||
| miR-93-5p (Bajo vs Alto) | 6.702 | 1.487 | 30.211 | 0.013 |
| edad | 1.126 | 0.286 | 4.437 | 0.866 |
| sexo | 1.071 | 0.27 | 4.248 | 0.923 |
| Duración de la fiebre | 73.416 | 15.018 | 358.895 | <0.001 |
| Tiempo de uso de antibióticos | 7.921 | 1.877 | 33.421 | 0.005 |
Tabla 3: Análisis de regresión logística de niños con infección por MP complicada por lesión del sistema digestivo. Esta tabla presenta los resultados del análisis de regresión logística que evalúa los factores asociados con lesión del sistema digestivo en niños con infección por MP. El análisis incluye la OR, el IC del 95 % y el valor de P para cada variable.
Acrónimos: Baso%, porcentaje de basófilos; IC, intervalo de confianza; PCR, proteína C reactiva; LSI, lesión del sistema digestivo; Eos%, porcentaje de eosinófilos; IκBα, inhibidor kappa B alfa; IL-6, interleucina-6; MP, Mycoplasma pneumoniae; MPP, neumonía por Mycoplasma pneumoniae; NC, control negativo; Net%, porcentaje de neutrófilos; oe-TLR4, sobreexpresión de TLR4; OR, razón de momios; ROC, característica operativa del receptor; TLR4, receptor tipo Toll 4; TNF-α, factor de necrosis tumoral-α; GB, recuento de glóbulos blancos.
DISPONIBILIDAD DE LOS DATOS:
Los datos numéricos brutos que sustentan las figuras y las tablas se proporcionan como Tabla Suplementaria 1.
Tabla suplementaria 1: Datos numéricos brutos para las figuras y tablas. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discusión
Aunque principalmente se considera un patógeno pulmonar, la infección por MP puede causar diversas complicaciones extrapulmonares que afectan múltiples sistemas de órganos más allá de los pulmones19,20. Evidencia emergente sugiere una interacción a lo largo del eje pulmón-intestino, en el cual mediadores inflamatorios liberados durante la patología pulmonar alteran el equilibrio de la flora intestinal21 y la función intestinal22. Esta interacción bidireccional resalta la importancia de una evaluación integral del paciente que aborde tanto los síntomas respiratorios como la salud gastrointestinal. Por lo tanto, los biomarcadores séricos circulantes han atraído una atención creciente como herramientas mínimamente invasivas con posible valor diagnóstico o pronóstico23,24. Los miARN han surgido como candidatos prometedores debido a su estabilidad y sus funciones en la regulación de vías de señalización relacionadas con la inflamación implicadas en la patogénesis de MP25,26,27. Este estudio exploró sistemáticamente el papel y la importancia clínica de miR-93-5p en la MPP pediátrica, particularmente cuando se complica con lesión del sistema digestivo. Los niveles de miR-93-5p estuvieron disminuidos en niños con MPP en comparación con controles sanos y se redujeron aún más en aquellos con lesión del sistema digestivo. Estos hallazgos indican un posible papel de la desregulación de miR-93-5p en la patología pulmonar y como biomarcador potencial para manifestaciones extrapulmonares.
Las miARN han demostrado valor diagnóstico en neumonía grave, con sensibilidad, especificidad y precisión diagnóstica general prometedora28,29. Clínicamente, los niños con MPP complicada por DSI presentaron mayor duración de la fiebre y tratamiento antibiótico prolongado en comparación con aquellos sin complicaciones digestivas. Niveles más bajos de miR-93-5p se asociaron independientemente con la afectación del sistema digestivo, junto con estos parámetros clínicos, en el análisis de regresión logística multivariable. Además, el análisis de la curva ROC mostró un desempeño diagnóstico favorable de la miR-93-5p sérica para distinguir a pacientes con MPP con DSI de aquellos sin DSI. Por lo tanto, la medición de miR-93-5p podría aportar un valor adicional para la identificación temprana y la estratificación de riesgos en la infección por MP pediátrica.
En cuanto al rendimiento diagnóstico de miR-93-5p circulante en comparación con los marcadores inflamatorios clínicos habituales, los hallazgos sugieren que miR-93-5p podría aportar un valor complementario en lugar de reemplazar a los indicadores convencionales. La proteína C reactiva (PCR) y la procalcitonina (PCT) siguen siendo biomarcadores ampliamente utilizados en la práctica clínica para evaluar la gravedad de la infección y guiar el tratamiento antibiótico, y metaanálisis han demostrado que la PCT presenta una precisión diagnóstica ligeramente superior frente a la PCR en la neumonía bacteriana30. Sin embargo, estos reactantes de fase aguda son en gran medida inespecíficos, ya que responden a diversos estímulos inflamatorios y no pueden distinguir de forma confiable la infección por MP de otros patógenos respiratorios ni reflejar específicamente el riesgo de complicaciones extrapulmonares. En contraste, miR-93-5p, como molécula reguladora asociada a la señalización TLR4/factor nuclear kappa B (NF-κB), podría proporcionar información fisiopatológica distinta que complementa a los marcadores convencionales. Se ha informado que la correlación entre miR-93-5p y PCR es relativamente débil (r de Pearson = 0,2698), lo que sugiere que miR-93-5p podría reflejar un aspecto diferente de la respuesta inflamatoria al de la respuesta sistémica de fase aguda.
Evidencia emergente de modelos animales ha demostrado que la infección por Mycoplasma pneumoniae puede inducir no solo patología respiratoria, sino también lesión del sistema digestivo a través del eje pulmón-intestino mediado por la flora intestinal31. En ratones infectados con MP, se ha observado lesión patológica tanto en los pulmones como en el colon, junto con alteraciones en la composición de la microbiota intestinal, incluyendo una disminución en la abundancia de bacterias beneficiosas como Corynebacterium glutamicum y un aumento en la abundancia de patógenos potenciales como Lachnospiraceae NK4A136 group y Escherichia-Shigella, acompañado de niveles elevados de lipopolisacárido (LPS) en el contenido colónico y en sangre32. También se ha informado que la baicalina mejora la inflamación pulmonar y regula la flora intestinal en ratones con MPP a través de la vía TLR4/NF-κB, lo que respalda la participación de esta cascada de señalización en la comunicación cruzada entre pulmón e intestino33. Estos hallazgos son consistentes con una posible participación de la señalización NF-κB en el eje miR-93-5p/TLR4 examinado en el presente estudio.
A nivel mecanicista, TLR4, un mediador clave de la inmunidad innata asociado con respuestas proinflamatorias34,35,36,37, se reguló positivamente durante la infección por MP. La expresión elevada de TLR4 se acompañó de niveles aumentados de las citoquinas inflamatorias IL-6 y TNF-α y de una viabilidad reducida de las células epiteliales. La sobreexpresión de miR-93-5p suprimió la expresión de TLR4, atenuó la liberación de citoquinas inflamatorias y mejoró la supervivencia celular en condiciones infecciosas. Por lo tanto, la regulación negativa de miR-93-5p en pacientes con MPP, particularmente en aquellos con lesión del sistema digestivo, podría estar asociada con una señalización inflamatoria mediada por TLR4 aumentada y respuestas inflamatorias sistémicas más amplias. Los hallazgos actuales no establecen la activación de la vía downstream NF-κB, ya que no se evaluaron IκBα y p65 fosforilados.
Se deben reconocer varias limitaciones de este estudio. Primero, se trató de un estudio unicéntrico con un tamaño de muestra relativamente pequeño, particularmente para el subgrupo de ISD, lo cual podría limitar el poder estadístico y la generalizabilidad. Se requiere una validación externa en cohortes más grandes y multicéntricas para confirmar estos hallazgos y establecer valores de corte clínicos confiables. Segundo, aunque IκBα se detectó mediante inmunotransferencia (Western blotting), no se realizó una validación exhaustiva de otros componentes descendentes de la vía TLR4/NF-κB, incluyendo MyD88, p-IκBα y p65. La validación a nivel de proteína de estos componentes de señalización reforzaría la interpretación mecanicista. Tercero, el diseño observacional impide realizar inferencias causales; se necesitan experimentos de pérdida y ganancia de función, incluyendo miméticos o inhibidores de ARNm en cultivo o in vivo, para determinar si miR-93-5p contribuye directamente a la lesión digestiva asociada con la MPP. Cuarto, los experimentos in vitro se realizaron en células epiteliales pulmonares A549. Aunque este modelo es adecuado para evaluar los efectos antiinflamatorios de miR-93-5p en un contexto pulmonar, no puede modelar directamente la patología gastrointestinal. La asociación propuesta entre la señalización de miR-93-5p/TLR4 en pulmón y las manifestaciones digestivas, posiblemente mediada a través del eje pulmón-intestino, requiere validación directa en modelos de células epiteliales intestinales, como las células Caco-2, y en modelos animales in vivo de infección por MP. Finalmente, los desafíos técnicos asociados con la detección de ARNm, incluyendo la estabilidad del ARN y las estrategias de normalización, siguen siendo barreras para la implementación clínica rutinaria. A pesar de estas limitaciones, los hallazgos proporcionan una base para futuros estudios mecanicistas y esfuerzos de validación a gran escala.
En conclusión, la sobreexpresión de miR-93-5p atenuó la inflamación inducida por MP en células epiteliales pulmonares mediante la supresión de TLR4. Clínicamente, niveles circulantes disminuidos de miR-93-5p se asociaron con lesión del sistema digestivo en niños con MPP, lo que sugiere un posible uso como biomarcador complementario para identificar pacientes con riesgo de complicaciones gastrointestinales.
Divulgaciones
Los autores declaran que no existen conflictos de interés.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Células epiteliales alveolares humanas A549 | ATCC, EE. UU. | Cat# CCL-185; RRID: CVCL_0023 | Línea celular epitelial alveolar humana utilizada para el modelo in vitro de MPP |
| Anticuerpo anti-GAPDH | Hangzhou XianZhi Biological Technology, China | Cat# AB-P-R001; RRID: AB_3096355 | Anticuerpo primario utilizado para la detección de GAPDH como control de carga en el inmunotransferencia |
| Anticuerpo anti-IκBα | Beyotime, China | Cat# AG2741; RRID: AB_3731391 | Anticuerpo primario utilizado para la detección de IκBα mediante inmunotransferencia |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Solarbio, China | Cat# A8012 | Reactivo bloqueante utilizado durante la inmunotransferencia |
| Centrífuga | Thermo Fisher Scientific, EE. UU. | Multifuge X4 Pro; Cat# 75016066; RRID: SCR_020726 | Centrífuga utilizada durante el cultivo celular y la preparación de muestras |
| Sistema de imagen quimioluminiscente | Tanon, China | 5200Multi; RRID: SCR_027114 | Sistema de imagen utilizado para visualizar las señales quimioluminiscentes de inmunotransferencia |
| Sistema de ensayo de luciferasa dual | Promega, EE. UU. | Cat# E1910 | Utilizado para medir las actividades de luciferasa de luciérnaga y Renilla |
| Suero bovino fetal (FBS) | Gibco, EE. UU. | Cat# A5256701 | Suplemento sérico para el medio de cultivo celular |
| Anticuerpo secundario de cabra anti-rabbit IgG conjugado con HRP | Cell Signaling Technology, EE. UU. | Cat# 7074; RRID: AB_2099233 | Anticuerpo secundario conjugado con HRP utilizado para inmunotransferencia |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 10.1.2; URL: https://www.graphpad.com | Software utilizado para análisis estadístico y presentación gráfica |
| Kit ELISA de interleucina-6 (IL-6) | Elabscience, China | Cat# E-EL-H6156; RRID: AB_3665145 | Kit ELISA utilizado para cuantificar IL-6 |
| Reactivo de transfección Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | Cat# L3000015 | Reactivo basado en lípidos utilizado para la transfección de células A549 |
| Lector de microplacas | Tecan, Suiza | Infinite M Plex; RRID: SCR_026522 | Lector de microplacas utilizado para medir la densidad óptica a 490 nm |
| análogos de miR-93-5p | Ribobio, China | Cat# miR10000093-1-5 | Análogo sintético de miR-93-5p utilizado para la sobreexpresión de miR-93-5p |
| Control negativo de miR-93-5p | Ribobio, China | Cat# miR1N0000001-1-5 | Control negativo para la transfección con análogo de miR-93-5p |
| Kit de ensayo de proliferación celular y citotoxicidad MTT | Beyotime, China | Cat# C0009S | Utilizado para evaluar la viabilidad celular |
| Cepa estándar de Mycoplasma pneumoniae ATCC 15531 | ATCC, EE. UU. | Cat# 15531 | Cepa estándar de M. pneumoniae utilizada para establecer el modelo de infección |
| Vector reportero de luciferasa pGL3-Basic | Promega, EE. UU. | Cat# E1751 | Vector reportero utilizado para el ensayo de luciferasa dual |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Solarbio, China | Cat# IP9212 | Tampón utilizado para lavado celular y preparación de muestras |
| Sustrato Western Pierce ECL | Thermo Scientific, EE. UU. | Cat# 32209 | Sustrato quimioluminiscente utilizado para la detección en inmunotransferencia |
| Medio de organismo tipo pleuropneumonía (PPLO) | BD, EE. UU. | Cat# 255420 | Medio de cultivo utilizado para M. pneumoniae |
| Membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) | Bio-Rad | Cat# 1620177 | Membrana utilizada para la transferencia de proteínas durante la inmunotransferencia |
| Mezcla maestra de transcripción inversa PrimeScript RT (Perfect Real Time) | Takara Bio Inc., Japón | Cat# RR036A | Mezcla maestra de transcripción inversa utilizada para la síntesis de ADNc |
| Kit de reactivos PrimeScript RT | Takara Bio Inc., Japón | Cat# RR037A | Kit de reactivos utilizado para transcripción inversa |
| Sistema de PCR en tiempo real | Applied Biosystems, EE. UU. | QuantStudio 3 Real-Time PCR System; RRID: SCR_020238 | Instrumento de PCR en tiempo real utilizado para análisis de qPCR |
| Medio RPMI-1640 | Gibco, EE. UU. | Cat# 11875135 | Medio de cultivo celular utilizado para células A549 |
| SPSS | IBM | Version 27.0; RRID: SCR_016479 | Software utilizado para análisis estadístico |
| Control negativo de sobreexpresión de TLR4 | Ribobio, China | NA | Control negativo para experimentos de sobreexpresión de TLR4 |
| Plásmido de sobreexpresión de TLR4 (oe-TLR4) | Ribobio, China | NA | Plásmido utilizado para la sobreexpresión de TLR4 |
| Reactivo TRIzol | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Cat# 15596026 | Reactivo utilizado para la extracción de ARN total |
| Kit ELISA de factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) | Elabscience, China | Cat# E-EL-H0109; RRID: AB_3665144 | Kit ELISA utilizado para cuantificar TNF-α |
| Mezcla maestra universal SYBR qPCR | Takara Bio Inc., Japón | Cat# BL697A | Mezcla maestra utilizada para PCR cuantitativa |
| Sistema de electroforesis en gel para inmunotransferencia | Bio-Rad, EE. UU. | Mini-PROTEAN Tetra Cell; Cat# 1658004 | Sistema de electroforesis utilizado para la separación de proteínas |
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