Ligadura de precisión de la arteria coronaria descendente anterior izquierda utilizando puntos de referencia anatómicos en un modelo de infarto de miocardio murino

Resumen

Este protocolo induce infarto de miocardio en ratones mediante la ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior, utilizando el surco interventricular anterior como un punto de referencia superficial reproducible para la colocación precisa del punto de sutura. El infarto se valida mediante electrocardiografía, ecocardiografía, tinción histológica y análisis de biomarcadores séricos.

Resumen

La ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior (LAD) es el enfoque más ampliamente utilizado para establecer modelos murinos de infarto de miocardio (IM) en la investigación cardiovascular preclínica. Sin embargo, en los protocolos convencionales, el sitio de ligadura se coloca típicamente a 1–2 mm por debajo del apéndice auricular izquierdo, un punto de referencia que a menudo es difícil de identificar de manera confiable durante la cirugía. Combinado con una variabilidad interindividual considerable en la anatomía coronaria murina, esto con frecuencia resulta en una localización imprecisa de la LAD, sitios de ligadura inconsistentes y una menor reproducibilidad entre operadores. Para abordar estas limitaciones, este protocolo introduce el surco interventricular anterior (SIA) como punto de referencia guía para la ligadura de la LAD. El SIA es un surco superficial poco profundo que es directamente visible bajo el microscopio, con la LAD corriendo inmediatamente debajo. A diferencia de los enfoques convencionales, proporciona una referencia anatómica estable que facilita una selección más consistente del sitio de ligadura y es más fácil de identificar para operadores inexpertos. El protocolo combina anestesia por inhalación estandarizada con isoflurano, intubación traqueal no invasiva y valida el IM mediante electrocardiografía, ecocardiografía, ensayo inmunoenzimático (ELISA), tinción histopatológica e imagen tridimensional de las arterias coronarias. Este protocolo proporciona un método experimental confiable y reproducible para inducir IM en ratones con el fin de investigar los cambios fisiopatológicos e inmunitarios posteriores al infarto.

Introducción

El infarto de miocardio (IM), una de las principales causas de morbilidad y mortalidad cardiovascular en todo el mundo, representa una amenaza sustancial para la salud humana¹. Caracterizado por un inicio abrupto, un curso clínico crítico y una alta tasa de letalidad, el IM es causado principalmente por la oclusión trombótica de las arterias coronarias y puede provocar una isquemia miocárdica profunda, necrosis subsecuente de los cardiomiocitos y una cascada de complicaciones, incluyendo arritmias, insuficiencia cardíaca y muerte súbita cardíaca². A pesar de los notables avances en cardiología clínica, el acceso limitado al tejido miocárdico humano continúa obstaculizando la investigación de los mecanismos fisiopatológicos subyacentes del IM y el desarrollo de estrategias terapéuticas efectivas³. En consecuencia, modelos animales in vivo confiables, reproducibles y clínicamente relevantes que reproduzcan fielmente las características clínicas y la progresión del IM siguen siendo esenciales para estudios mecanicistas y la evaluación terapéutica preclínica.

Desde que Johns y Olson establecieron por primera vez un modelo de IM murino en 1954, las metodologías para inducir el IM en ratones han experimentado una mejora continua⁴. La ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior (AD) bajo visualización microscópica directa se ha convertido en la técnica más ampliamente adoptada porque reproduce características patológicas clave del IM humano, incluyendo isquemia miocárdica localizada, necrosis miocárdica y remodelación ventricular postinfarto⁵. Sin embargo, la ligadura convencional de la AD requiere una considerable experiencia en microcirugía que normalmente solo se adquiere tras una formación extensa, lo que limita la consistencia y reproducibilidad del procedimiento entre diferentes operadores y laboratorios⁶. Además, las complicaciones intraoperatorias y posoperatorias—como hemorragia, lesión o colapso pulmonar, colocación incorrecta de la ligadura y daño tisular mecánico derivado de una ventilación inadecuada—contribuyen a una mortalidad perioperatoria relativamente alta, lo que restringe aún más la aplicación generalizada de este modelo⁷. En respuesta a estas limitaciones, Gao et al. introdujeron una técnica modificada que consiste en la ligadura de la AD mediante eversión cardíaca, la cual simplifica el procedimiento quirúrgico y reduce el nivel técnico necesario para establecer el modelo⁸. También se han desarrollado otros enfoques experimentales, como la criolesión coronaria y la inducción farmacológica del daño miocárdico, para aplicaciones de investigación específicas^9,10. No obstante, la ligadura permanente de la AD bajo visualización directa sigue siendo el método preferido porque reproduce de manera más fiel las principales características fisiopatológicas del IM humano, a la vez que permite inducir de forma controlada el tamaño y la localización del infarto.

A pesar de su uso generalizado, la ligadura convencional de la DA anterior sigue siendo limitada por la identificación variable del sitio de ligadura, inconsistencia en el procedimiento, una mortalidad perioperatoria relativamente alta y variabilidad entre laboratorios en cuanto a la reproducibilidad, todo lo cual puede afectar la fiabilidad y comparabilidad de los resultados experimentales¹¹. El objetivo general del presente protocolo es establecer un método más estandarizado y reproducible para la ligadura permanente de la DA en ratones, utilizando el surco interventricular anterior (SIA) como punto de referencia anatómico externo para la localización del vaso. En lugar de estimar el sitio de ligadura a una distancia fija por debajo de la orejuela auricular izquierda, este protocolo identifica el SIA, una depresión superficial superficial directamente visible mediante visualización microscópica y que se encuentra sobre la DA, como un punto de referencia anatómico estable para guiar la ligadura. En comparación con la estimación convencional basada en puntos de referencia, este enfoque pretende facilitar una selección más consistente del sitio de ligadura, reducir la variabilidad dependiente del operador y mejorar el acceso para cirujanos menos experimentados, manteniendo al mismo tiempo la compatibilidad con los procedimientos estándar de IAM en ratones. Por lo tanto, este protocolo es adecuado para investigadores que buscan un método quirúrgico reproducible para generar modelos de IAM permanentes para estudios sobre lesión miocárdica, remodelación ventricular, inflamación y mecanismos relacionados con enfermedades cardiovasculares.

Protocolo

Todos los experimentos que involucraron animales se realizaron con la aprobación del Comité de Ética del Centro de Experimentación Animal de la Universidad Médica del Suroeste (número de aprobación: SWMU20240146). Se utilizaron ratones macho C57BL/6J (libres de patógenos específicos [SPF]), de 8 a 10 semanas de edad y con un peso de 20,0 ± 3,0 g. Acostumbre a los ratones durante 1 semana en condiciones estándar de laboratorio (22 °C ± 2 °C; ciclo de 12 h luz/12 h oscuridad) antes de comenzar los experimentos.

1. Preparación prequirúrgica

1. Prepare y esterilice todos los instrumentos quirúrgicos el día de la cirugía, incluyendo pinzas, tijeras oftálmicas, un portagujas, un hemostato micro-mosquito, un retractor de párpado en forma de V, suturas de nailon 7-0 de 3/8 de círculo con aguja, suturas de nailon 6-0 y suturas de nailon 5-0. Autoclave todos los instrumentos metálicos a 121°C durante 20 min antes del procedimiento, y reesterilícelos entre animales utilizando un esterilizador de perlas de vidrio (250°C durante 15 s), seguido de enfriamiento sobre una gasa estéril. Utilice suturas procedentes de envases estériles sellados.
2. Configure dos áreas de trabajo separadas para mantener la técnica aséptica. Prepare un área con pinzas, un kit de intubación traqueal para ratones y una máquina de anestesia, y prepare una segunda área quirúrgica estéril con instrumentos esterilizados, hisopos de algodón, povidona-yodo y gasa estéril.
3. Aplique crema depilatoria en la región torácica durante 1 min. Retire la crema y el vello suavemente utilizando gasa estéril humedecida con agua estéril o solución salina.
   1. La eliminación del vello por sí sola no constituye una preparación quirúrgica de la piel. Realice la desinfección cutánea aséptica definitiva y la colocación de campos estériles únicamente tras anestesiar, intubar y asegurar al ratón sobre la plataforma quirúrgica, inmediatamente antes de la incisión cutánea (Paso 2.6).
4. Administre cefazolina (300 mg/kg) mediante inyección intraperitoneal 1 h antes de la cirugía. Reconstituya el cefazolino sódico para inyección en solución salina estéril al 0,9 % hasta una concentración de trabajo de 30 mg/mL, y administre aproximadamente 0,2 mL por cada 20 g de peso corporal para alcanzar la dosis objetivo. Continúe la administración una vez al día durante 5 días consecutivos tras la cirugía.
   NOTA: No administre agentes hemostáticos farmacológicos sistémicos ni tópicos en este protocolo. Logre la hemostasia intraoperatoria aplicando presión suave y continua con un hisopo de algodón estéril durante 10–30 s, o hasta que cese el sangrado.

2. Inducción de la anestesia e intubación traqueal

1. Coloque el ratón en la cámara de inducción (16 × 10 × 11 cm) conectada a la máquina de anestesia. Establezca el caudal del gas portador en 0,5 L/min e induzca la anestesia con 3,5%–4,0% de isoflurano.
   NOTA: Confirme una anestesia adecuada por la ausencia del reflejo de retirada del pie. Con estos ajustes, el ratón generalmente alcanza un plano quirúrgico de anestesia en 2–4 min.
2. Coloque al ratón anestesiado en posición supina sobre la plataforma de intubación traqueal para roedores. Suspenda al ratón enganchando sus incisivos superiores en la banda de goma de la plataforma, de modo que la cabeza y el cuello queden extendidos en un ángulo de aproximadamente 45°. Alinee los ejes oral, faríngeo y laríngeo para visualizar directamente la glotis.
3. Realice la intubación orotraqueal
   1. Realice la intubación orotraqueal bajo laringoscopia directa sin traqueotomía para establecer ventilación mecánica controlada. Utilice un catéter intravenoso de 20 G (diámetro externo, aproximadamente 0,9 mm; longitud, aproximadamente 15 mm) como tubo endotraqueal.
   2. Abra la boca y desplace suavemente la lengua hacia un lado usando pinzas. Inserte la hoja de un laringoscopio para pequeños animales a lo largo del dorso de la lengua y deprimar la base de la lengua.
   3. Avance el laringoscopio hasta que la epiglotis sea visible. Levante el laringoscopio hacia arriba y hacia adelante siguiendo el eje del mango para elevar la epiglotis y exponer la abertura glótica en forma de V y las cuerdas vocales pálidas.
   4. Avance el catéter a través de la glotis abierta durante la inspiración, manteniendo la visualización directa de las cuerdas vocales. Retire el laringoscopio después de que el catéter pase a través de la glotis.
   5. Avance el catéter hasta una profundidad de aproximadamente 5–7 mm. Retire el estilete y conecte el catéter al ventilador.
      NOTA: Confirme la colocación correcta del tubo endotraqueal observando un movimiento simétrico bilateral de la pared torácica sincronizado con el ventilador. Si el movimiento de la pared torácica es mínimo y en su lugar ocurre un movimiento abdominal rítmico, acompañado de una progresiva disminución de la anestesia, retire el catéter del esófago y repita la intubación.
   6. Si no se puede visualizar la glotis, retire el laringoscopio y reposicione al ratón sobre la plataforma de intubación con la cabeza y el cuello extendidos en aproximadamente 45°. Vuelva a alinear los ejes oral, faríngeo y laríngeo, elimine cualquier secreción orofaríngea con un hisopo estéril y repita la laringoscopia. Si el ratón muestra signos de despertar de la anestesia, devuélvalo a la cámara de inducción, profundice la anestesia y luego intente nuevamente la intubación.
   7. Interrumpa el procedimiento si el ratón desarrolla cianosis, sangrado laríngeo o apnea persistente. Deje de administrar isoflurano y coloque al ratón sobre una almohadilla térmica controlada por temperatura (37°C) hasta que se recupere completamente.
   8. No continúe con la toracotomía si la intubación traqueal no tiene éxito. Reagende el procedimiento para una sesión posterior o excluya al animal del estudio y regístrelo como un fracaso del procedimiento.
      NOTA: Intentos repetidos de intubación pueden causar edema laríngeo, aumentando el riesgo de dificultad respiratoria postoperatoria. En la mayoría de los casos, la intubación exitosa se logra dentro de los primeros dos intentos tras la visualización directa de la glotis. La destreza en la intubación orotraqueal requiere práctica y familiaridad con la técnica.
4. Administre aire como gas portador a un caudal de 0,5 L/min y mantenga la anestesia con 1,5%–2,0% de isoflurano. Configure el ventilador con una frecuencia respiratoria de 130 respiraciones/min, un volumen tidal de 2 mL y una relación inspiración:espiración de 5:4.
   NOTA: El volumen tidal ajustado en el ventilador excede el valor teórico estimado a partir del peso corporal porque compensa el volumen compresible del circuito del ventilador y el espacio muerto del tubo endotraqueal. Evalúe la ventilación durante todo el procedimiento monitoreando al animal en busca de cianosis y signos de barotrauma, incluyendo neumotórax y enfisema subcutáneo.
   1. Monitoree continuamente la profundidad de la anestesia durante todo el procedimiento. Evalúe el patrón respiratorio y el reflejo de retirada del pie cada 2 min. Monitoree la frecuencia cardíaca continuamente mediante el electrocardiograma (ECG) y ajuste la concentración de isoflurano para mantener una frecuencia cardíaca de 400–500 latidos/min; una concentración de isoflurano de 1,5%–2,0% generalmente es suficiente. Durante el procedimiento, observe esfuerzo respiratorio espontáneo contra el ventilador, movimiento de los bigotes y cambios en el color de las membranas mucosas.
   2. Aumente la concentración de isoflurano en incrementos de 0,5%, hasta un máximo de 3,0%, si reaparece el reflejo de retirada del pie, se observa movimiento de los bigotes o ocurre esfuerzo respiratorio espontáneo contra el ventilador. Disminuya la concentración de isoflurano en decrementos de 0,5%, hasta un mínimo de 1,0%, si la frecuencia cardíaca cae por debajo de 350 latidos/min. Pausar el procedimiento quirúrgico cada vez que se observen estos signos, continúe monitoreando la frecuencia cardíaca, el patrón respiratorio, el color de las membranas mucosas y el movimiento de los bigotes, y reanude el procedimiento solo después de que los parámetros fisiológicos se hayan estabilizado.
5. Incline al ratón hacia el lado derecho con el lado izquierdo en posición superior para exponer la pared torácica izquierda. Sujete las cuatro extremidades y la cola a la plataforma utilizando cinta adhesiva.
6. Desinfecte el sitio quirúrgico con tres aplicaciones sucesivas de povidona-yodo. Para cada aplicación, use un hisopo estéril nuevo, comenzando en el sitio previsto para la incisión y moviéndose hacia afuera en una espiral concéntrica hasta aproximadamente 1 cm más allá de la incisión proyectada en todas las direcciones. Descarte el hisopo después de cada aplicación y no vuelva a colocar un hisopo usado en el centro del campo quirúrgico. Deje que la última aplicación se seque completamente al aire, luego coloque un campo estéril, exponiendo únicamente el campo quirúrgico antes de realizar la incisión en la piel.

3. Toracotomía y exposición del corazón

NOTA: El flujo general del procedimiento quirúrgico, incluyendo la posición del animal, toracotomía, exposición del corazón, ligadura de la arteria coronaria descendente anterior (LAD), cierre torácico y recuperación posoperatoria, se ilustra en Figura 1 y Figura 2.

Figura 1: Localización anatómica del sitio de ligadura de la arteria coronaria descendente anterior izquierda utilizando el surco interventricular anterior. (A) Vista ventral del corazón murino expuesto antes de la ligadura, que muestra el surco interventricular anterior (SIA). (B) Vista de la misma región después de la ligadura de la arteria coronaria descendente anterior (DCA) izquierda; la región circunscrita indica el sitio de ligadura. (C) Esquema que muestra la relación espacial entre el SIA y las arterias coronarias. La DCA discurre a lo largo del SIA, y el punto de ligadura se encuentra en el tercio superior del surco. RCA, arteria coronaria derecha; LCA, arteria coronaria izquierda; LCX, arteria coronaria circunfleja izquierda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Procedimiento quirúrgico para la ligadura guiada por el surco interventricular anterior de la arteria coronaria descendente anterior izquierda en ratones. (A) Coloque y asegure al ratón anestesiado con la región torácica izquierda depilada. (B) Realice una incisión en la piel sobre la pared torácica izquierda. (C) Separe los músculos pectorales e identifique el espacio intercostal adecuado para la toracotomía. (D,E) Inserte y coloque el retractor torácico para ampliar el espacio intercostal y exponer el campo operatorio. (F) Visualice el corazón expuesto e identifique el surco interventricular anterior (SIA). (G) Pase una sutura de nailon 7-0 a través del SIA y por debajo de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (ADAI). (H) Asegure la sutura para producir una ligadura permanente de la ADAI. (I) Retire el retractor torácico y cierre la pared torácica. (J,K) Cierre secuencialmente las capas muscular y cutánea. (L) Permita que el ratón se recupere bajo condiciones de calor tras la cirugía. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Con tijeras oftálmicas, realice una incisión longitudinal de 1 cm en la piel de la pared torácica izquierda, paralela al eje largo del esternón y aproximadamente a 2 mm lateral al borde esternal izquierdo. Exponga los músculos pectorales subyacentes.
2. Con pinzas finas, separe por disección roma los músculos pectoral mayor y pectoral menor siguiendo la dirección de sus fibras. Retraiga los músculos lateralmente para exponer las costillas y los espacios intercostales, y evite cortar los músculos para minimizar el sangrado.
3. Identifique el espacio intercostal adecuado antes de abrir la cavidad torácica. Localice la arteria intercostal anterior, rama de la arteria torácica interna que discurre dentro de un espacio intercostal paralelo a las costillas, e identifique el tercer espacio intercostal inmediatamente craneal a la arteria más visiblemente constante en el cuarto espacio intercostal.
4. Si la arteria intercostal anterior no es claramente visible, palpe la primera costilla y cuente caudalmente para identificar el espacio entre la tercera y la cuarta costillas. Confirme que el espacio intercostal seleccionado ofrezca una vista directa y sin obstáculos del apéndice auricular izquierdo y de la pared libre anterior del ventrículo izquierdo antes de continuar.
   NOTA: La identificación precisa del tercer espacio intercostal es esencial, ya que un sitio incorrecto de toracotomía puede reducir la visualización del corazón y comprometer el procedimiento.
5. Realice una toracotomía a través del tercer espacio intercostal izquierdo. Separe suavemente el espacio intercostal utilizando un retractor en forma de V para párpados hasta que el apéndice auricular izquierdo y el tercio superior del ventrículo izquierdo queden claramente expuestos dentro del campo quirúrgico.
   NOTA: En esta etapa, el corazón sigue cubierto por el pericardio; por lo tanto, el AIS no puede identificarse de manera confiable. Identifique el AIS únicamente después de abrir el pericardio (Paso 3.6), como se describe en los Pasos 4.2–4.3.
6. Agarre suavemente el pericardio con un par de pinzas finas y levántelo lejos del miocardio. Utilice un segundo par de pinzas finas para rasgar lentamente el pericardio y exponer completamente el corazón.

4. Ligadura guiada por puntos de referencia de la arteria coronaria descendente anterior izquierda

1. Pase una sutura de nylon 6-0 a través de la pared torácica y aplique tracción suave para ampliar el campo operatorio. Exponga completamente la AIS antes de identificar el sitio de ligadura (Figura 1A).
2. Identifique la AIS como el surco superficial que discurre oblicuamente desde la base cardíaca hacia el ápice y marca el límite superficial entre los ventrículos izquierdo y derecho (Figura 1C). Bajo el microscopio, identifíquela como una depresión cuasi circular localizada aproximadamente a 1–2 mm por debajo del margen inferior de la orejuela auricular izquierda.
3. Si resulta difícil identificar la AIS, limpie suavemente la superficie epicárdica con una punta de algodón humedecida con solución salina tibia. Vuelva a examinar el campo operatorio bajo el microscopio para identificar el surco con mayor claridad.
   NOTA: Bajo el microscopio de disección, la AIS es un surco superficial fácilmente identificable que delimita anatómicamente el límite interventricular, con la arteria coronaria descendente anterior (LAD) corriendo inmediatamente debajo. Si la AIS sigue siendo indistinta tras el lavado, primero confirme que la toracotomía proporciona una exposición adecuada. Luego identifique directamente la LAD según métodos previamente descritos: en relación con su vena cardíaca acompañante, la arteria es de color más rosado, de menor calibre y marcadamente pulsátil¹².
   1. Si no se puede identificar la AIS o la arteria coronaria LAD, primero verifique que la toracotomía se realizó a través del tercer espacio intercostal izquierdo. Si es necesario, reposicione la toracotomía como se describe en los pasos 3.3–3.5, y luego repita la identificación de la AIS y de la LAD como se indica en los pasos 4.1–4.3.
   2. Termine el procedimiento si no se puede identificar la AIS o la LAD tras 10 minutos de inspección cuidadosa, si ocurre una hemorragia incontrolable, si el procedimiento total con tórax abierto excede los 20 minutos, o si la frecuencia cardíaca permanece por debajo de 300 latidos/min a pesar del ajuste de la profundidad anestésica. Anestesie profundamente al ratón con isoflurano al 5 %, eutanásielo mediante dislocación cervical y registre al animal como un fracaso del procedimiento para su inclusión en el análisis de resultados quirúrgicos.
4. Pase una sutura de nylon 7-0 a través del surco en el tercio superior de la AIS (Figura 1B). Introduzca la aguja perpendicularmente a la superficie epicárdica hasta una profundidad de aproximadamente 0,5–1 mm, con los puntos de entrada y salida situados en lados opuestos del surco y abarcando aproximadamente su anchura máxima.
5. Asegure la ligadura utilizando un nudo quirúrgico. Ajuste la ligadura hasta que ocurra un blanqueo inmediato del miocardio distal al sitio de ligadura tras el primer lazada, sin hundimiento tisular local apreciable.
   NOTA: Apriete la sutura solo lo suficiente para ocluir el flujo sanguíneo coronario. Una tensión excesiva podría lesionar el miocardio adyacente o hacer que la sutura corte el vaso y los tejidos circundantes.
6. Confirme la oclusión coronaria exitosa dentro del primer minuto tras la ligadura, observando un blanqueo isquémico irregular del miocardio distal al sitio de ligadura¹². Confirme además la oclusión identificando una elevación del segmento ST en el ECG.
7. Si el área isquémica es excesivamente pequeña o no hay blanqueo, suelte la ligadura y repita el procedimiento de ligadura.

5. Cierre y recuperación postoperatoria

1. Retire cuidadosamente el retractor en forma de V del párpado. Cierre la toracotomía con una sola sutura interrumpida de nylon 5-0 pasando la aguja alrededor de las costillas adyacentes tercera y cuarta para volver a aproximar el espacio intercostal tercero. Mantenga la aguja cerca de la superficie de la costilla para evitar lesionar el paquete neurovascular intercostal. Antes de anudar la sutura, comprima suavemente el tórax al final de la espiración para evacuar el aire intratorácico residual, luego mantenga la compresión mientras asegura la sutura con un nudo quirúrgico.
2. Cierre la incisión cutánea en capas utilizando suturas de nylon 5-0. Asegúrese de una completa aproximación de los bordes de la herida antes de continuar.
3. Coloque el ratón sobre una almohadilla térmica controlada por temperatura (37°C), suspenda la administración de isoflurano y continúe la ventilación mecánica hasta que se reanude la respiración espontánea. Observe al animal durante la recuperación de la anestesia, incluyendo el movimiento de la cola o los bigotes y la recuperación de un patrón respiratorio regular de aproximadamente 150 respiraciones/min.
4. Confirme la preparación para la extubación verificando una respiración espontánea regular, movimiento visible de la pared torácica sincronizado con el ciclo del ventilador y movimiento intencional de las extremidades o bigotes. Retire lentamente el tubo endotraqueal durante la fase espiratoria, luego continúe monitoreando al ratón sobre la almohadilla térmica durante 3–5 min para confirmar la ausencia de dificultad respiratoria.
   NOTA: La dificultad respiratoria tras la extubación se debe comúnmente a neumotórax provocado por el cierre incompleto del espacio intercostal. Si ocurre dificultad respiratoria, reanestesie temporalmente y ventile al ratón, reabra las suturas cutáneas, inspeccione el cierre intercostal y coloque suturas adicionales en cualquier sitio con fuga de aire antes de repetir el procedimiento de extubación.
5. Devuelva el ratón a su jaula de alojamiento tras la recuperación de la anestesia. Administre buprenorfina (0.1 mg/kg, por vía subcutánea) inmediatamente después de la cirugía y cada 4–6 h durante las primeras 48 h.
6. Monitoree a cada ratón al menos dos veces al día durante los primeros 3 días posoperatorios y una vez al día posteriormente. Evalúe el peso corporal, la postura, la actividad, el patrón respiratorio y la herida quirúrgica, y eutanase cualquier animal que cumpla con los criterios predefinidos de finalización humanitaria, incluyendo dificultad respiratoria persistente, incapacidad para acceder a alimento o agua, o una postura encorvada e inmóvil que no responda a la estimulación.

6. Evaluación electrocardiográfica (ECG)

1. Registre señales electrocardiográficas utilizando un sistema de registro fisiológico de múltiples canales equipado con un amplificador de ECG. Inserte tres electrodos subcutáneos de extremidades en el ratón, conectando la entrada positiva (VIN+) a la pata trasera izquierda, la entrada negativa (VIN−) a la pata delantera derecha y la tierra (GND) a la pata trasera derecha.
2. Conecte el módulo amplificador de ECG a la unidad de adquisición de datos. Establezca el filtro de muesca en 50 Hz (o 60 Hz, según la frecuencia de red local), luego abra el software de adquisición y agregue un nuevo módulo amplificador de ECG dentro de la configuración de canales analógicos.
   1. Configure el amplificador con los siguientes parámetros: ganancia = 2000, modo = normal, filtro paso bajo = 150 Hz y filtro paso alto = 0.05 Hz. Abra la configuración de adquisición, establezca la frecuencia de muestreo en 1 kHz y cierre la ventana de configuración.
   2. Después de colocar los electrodos, haga clic en Iniciar para comenzar la grabación. Establezca la base de tiempo de visualización en 0.5 s por división principal y la escala vertical en 0.25 mV por división principal, luego registre el ECG continuamente durante al menos 30 s. Seleccione un segmento estable y libre de artefactos para el análisis y la presentación representativa.
3. Registre el ECG inmediatamente después de la ligadura, manteniendo al ratón bajo anestesia con isoflurano al 1.5 % y normotermia sobre una almohadilla calefactora. Registre ECGs tanto del grupo de IM como del grupo control normal (NC) en el mismo punto temporal y bajo condiciones anestésicas comparables.

7. Ecocardiografía

1. Retire el vello de la región torácica anterior utilizando una crema depilatoria 1 día antes de la adquisición de imágenes. Anestesie al ratón con isoflurano al 1,5 % durante todo el examen.
2. Coloque al ratón en posición supina sobre una plataforma calentada, asegure las cuatro extremidades a los electrodos del ECG y aplique gel ultrasónico en el precordio. Ajuste la concentración de isoflurano según sea necesario para mantener una frecuencia cardíaca superior a 400 latidos/min.
3. Coloque la sonda de ultrasonido en el espacio intercostal tercero a cuarto a lo largo del borde esternal izquierdo. Dirija la marca de la sonda hacia la extremidad anterior derecha con un ángulo de aproximadamente 30° y alinee la sonda con el eje largo del corazón.
4. Realice toda la adquisición de imágenes utilizando un transductor de matriz lineal con una frecuencia de transmisión central de 30 MHz, un ancho de banda de 20–46 MHz y una resolución axial de 50 μm. Ajuste la potencia de transmisión al 100 %, la profundidad de la imagen a 13 mm, el ancho de la imagen a 11 mm, el rango dinámico a 60 dB y la ganancia en dos dimensiones a 40 dB. Adquiera bucles de cine en modo B a una velocidad de cuadros de 210 cuadros/s.
5. Guarde estos parámetros de adquisición como un ajuste preestablecido del sistema. Utilice el mismo transductor, ajuste preestablecido, potencia de transmisión, rango dinámico, profundidad de imagen y anchura de imagen para todos los animales y todas las sesiones de adquisición, y no modifique la profundidad de imagen entre los grupos NC y MI.
6. Dentro de la misma vista de eje largo, coloque la línea de muestreo del modo-M a nivel medio ventricular, perpendicular al tabique interventricular y a la pared posterior del ventrículo izquierdo, con la compuerta de muestreo abarcando todo el diámetro anteroposterior del ventrículo izquierdo. Registre el trazado del modo-M para su análisis posterior.
7. Adquiera imágenes en modo B en las que se visualicen claramente el ventrículo izquierdo, la aurícula izquierda y la raíz aórtica, y registre bucles cinematográficos para su análisis posterior. Adquiera imágenes correspondientes en modo M en el mismo plano de imagen.
8. Mida el diámetro interno al final de la diástole del ventrículo izquierdo (D_d), diámetro interno final sistólico del ventrículo izquierdo (Ds) y grosor del tabique interventricular a partir de las imágenes obtenidas. Adquiera cinco ciclos cardíacos consecutivos y reporte los valores promedio.
   NOTA: Calcule automáticamente el volumen telediastólico del ventrículo izquierdo (LVEDV) y el volumen telesistólico del ventrículo izquierdo (LVESV) utilizando el software de imagen. Calcule la fracción de acortamiento (FS) como FS = (D_d − D_s) / D_d × 100% y fracción de eyección (FE) como FE = (VTDVI − VTSVI) / VTDVI × 100%.

8. Recolección de tejidos, tinción histológica y ELISA

1. Extracción de tejido
   1. El día 7 después de la inducción del infarto de miocardio (IM), realice ecocardiografía en cada ratón. Anestesie al ratón con 4 % de isoflurano, recoja aproximadamente 1,5 mL de sangre mediante sangrado retroorbital, eutanase al ratón por dislocación cervical y extirpe el corazón.
   2. Deje que las muestras de sangre coagulen durante la noche a 4 °C. Centrifugue las muestras a 2000 × g durante 10 min a 4 °C, recoja el suero y almacénelo a −80 °C hasta su análisis.
2. Ensayo inmunoenzimático (ELISA)
   1. Cuantifique el péptido natriurético tipo B (BNP), la interleucina-1β (IL-1β), el factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) y el factor nuclear-κB p65 (NF-κB p65) en suero mediante kits de ensayo inmunoenzimático (ELISA).
      1. Lleve todos los reactivos y muestras de suero a temperatura ambiente y prepare las soluciones de trabajo según las instrucciones del kit. Diluya las muestras de suero 1:5 en solución salina tamponada con fosfato (PBS), es decir, un volumen de suero más cuatro volúmenes de PBS.
      2. Añada 50 μL de estándares, PBS y muestras de suero diluidas a los pozos estándar, cero y de muestra, respectivamente, dejando el pozo en blanco vacío. Añada 100 μL de anticuerpo de detección conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) a todos los pozos excepto al en blanco, selle la placa e incube a 37 °C durante 60 min en la oscuridad.
      3. Deseche el contenido de cada pozo y lave la placa cinco veces con tampón de lavado, dejando que el tampón permanezca en cada pozo durante 20 s en cada ciclo de lavado. Seque la placa presionándola suavemente sobre papel sin pelusa.
      4. Añada 100 μL de sustrato recién preparado (las Soluciones A y B mezcladas en una proporción de volumen 1:1) a cada pozo. Incube la placa sellada a 37 °C durante 15 min en la oscuridad, añada 50 μL de solución de parada y mida la densidad óptica a 450 nm.
   2. Reste la densidad óptica del blanco a cada medición y genere una curva estándar utilizando un modelo de regresión logística de cuatro parámetros (4PL). Calcule la concentración de cada muestra a partir de la curva ajustada, multiplique el valor por el factor de dilución de 5 y reporte el valor medio obtenido de los pozos duplicados.
3. Procesamiento, inclusión y corte de tejido
   1. Lave brevemente cada corazón extirpado en solución salina tamponada con fosfato fría para eliminar la sangre residual. Fije el tejido en paraformaldehído al 4 % durante al menos 24 h a temperatura ambiente.
   2. Recorte cada corazón para exponer una superficie plana en eje corto y colóquelo en una casete de tejido etiquetada. Deshidrate el tejido mediante una serie graduada de etanol (75 % de etanol durante 4 h, 85 % de etanol durante 2 h, 90 % de etanol durante 2 h, 95 % de etanol durante 1 h y dos cambios de etanol absoluto durante 30 min cada uno). Transfiera el tejido a través de una mezcla de etanol–xileno durante 5–10 min, límpielo en dos cambios de xileno durante 10 min cada uno e infíltrelo con tres cambios de parafina fundida durante 1 h cada uno.
   3. Incorpore cada corazón con el eje corto orientado hacia la superficie del bloque. Corte secciones seriadas de 3 μm en el nivel medio papilar, flote las secciones en un baño de agua a 40 °C, monte sobre portaobjetos de vidrio y séquelas a 60 °C.
   4. Desparafine las secciones en dos cambios de xileno (15 min cada uno), seguidos de tres cambios de etanol absoluto (5 min cada uno), etanol al 75 % (5 min) y agua de ósmosis inversa (RO) (5 min).
      ADVERTENCIA: El paraformaldehído es un probable carcinógeno y un irritante respiratorio y dérmico, y el xileno es inflamable y neurotóxico. Manipule estos reactivos en una campana extractora de gases, utilizando guantes médicos asépticos, bata de laboratorio y protección ocular, y deseche los residuos según los procedimientos institucionales para residuos peligrosos. El etanol y el n-butanol son inflamables; manténgalos alejados de fuentes de ignición.
4. Tinción histológica
   1. Tinción con hematoxilina y eosina
      1. Sumerja las secciones desparafinadas y rehidratadas en hematoxilina durante 3–5 min. Enjuague las secciones con agua.
      2. Diferencie las secciones en alcohol ácido al 1 % y enjuáguelas con agua. Añada azul a las secciones en amoníaco acuoso al 0,5 % y enjuáguelas nuevamente.
      3. Transfiera las secciones secuencialmente a través de etanol al 85 %, etanol al 95 % y etanol absoluto durante 5 min cada uno. Contratiña las secciones con eosina durante 3–5 min.
      4. Deshidrate las secciones mediante tres cambios de etanol absoluto durante 5 min cada uno y luego en n-butanol durante 5 min. Limpie las secciones mediante tres cambios de xileno durante 5 min cada uno y monte con resina neutra.
         NOTA: Los núcleos aparecen azules, mientras que el citoplasma y la matriz extracelular aparecen rojos.
   2. Tinción tricrómica de Masson
      1. Mordante las secciones desparafinadas y rehidratadas en solución de dicromato de potasio al 2,5 % durante la noche durante aproximadamente 15 h a temperatura ambiente. Enjuague las secciones con agua corriente durante aproximadamente 30 s hasta que desaparezca el tinte amarillento.
      2. Tiña las secciones en solución de ponceau–fucsina ácida durante 6 min hasta que el tejido aparezca rojo brillante. Alargue el tiempo de tinción si el color permanece tenue y enjuague las secciones con agua corriente hasta que el agua de desecho sea incolora.
      3. Drene el exceso de agua sin permitir que las secciones se sequen. Diferencie las secciones en ácido fosfomolibdico acuoso durante 1–2 min hasta que el colágeno aparezca pálido y las fibras musculares permanezcan rojas.
      4. Transfiera las secciones directamente a la solución de azul de anilina sin enjuagar. Incube las secciones durante 6–30 s.
      5. Diferencie las secciones mediante tres a cinco cambios de ácido acético al 1 % durante aproximadamente 8 s por cambio. Deshidrátelas rápidamente mediante tres cambios de etanol absoluto durante aproximadamente 3, 5 y 5 s, respectivamente.
      6. Limpie las secciones en n-butanol durante 5 min y luego en xileno durante 5 min. Monte las secciones con resina neutra.
         NOTA: Las fibras de colágeno aparecen azules, mientras que las fibras musculares, el fibrinógeno y los eritrocitos aparecen rojos.
   3. Tinción con rojo de Sirius
      1. Incube las secciones desparafinadas y rehidratadas en la solución A de rojo de Sirius en un horno a 65 °C durante 30 min. Lave las secciones con agua corriente hasta que desaparezca el tinte amarillento.
      2. Elimine el exceso de líquido con papel absorbente y sumerja las secciones en la solución B de rojo de Sirius durante 2 min. Lave brevemente las secciones y elimine el exceso de líquido.
      3. Sumerja las secciones en la solución C de rojo de Sirius durante 30 min. Enjuáguelas brevemente durante 1–2 s.
      4. Deshidrate las secciones mediante tres cambios de etanol absoluto durante aproximadamente 3 s cada uno. Límpielas mediante tres cambios de xileno durante 5 min cada uno y monte con resina neutra.
         NOTA: Bajo iluminación de campo claro, las fibras de colágeno aparecen rojas sobre un fondo amarillo.
5. Adquisición y cuantificación de imágenes
   1. Adquiera todas las imágenes histológicas utilizando un escáner digital de portaobjetos. Utilice configuraciones idénticas de iluminación, balance de blancos, exposición y aumento para todas las secciones de todos los grupos, e incluya una barra de escala de calibración en cada imagen.
   2. Calibre la escala espacial antes del análisis de imágenes. Cargue una imagen de referencia que contenga la barra de escala adquirida con la misma resolución y dimensiones de píxeles que las imágenes del estudio. En Medida > Calibración > Establecer sistema, cree una nueva calibración espacial, establezca la unidad en μm, defina la conversión píxeles-micrómetros alineando los puntos de calibración con la barra de escala, guarde la calibración y aplíquela a todas las imágenes.
   3. Cargue una sección teñida con tricrómica de Masson y delimite el ventrículo izquierdo utilizando la herramienta de área de interés (AOI) irregular. Excluya la cavidad ventricular, el ventrículo derecho y los artefactos del procesamiento del tejido, y registre el área total del ventrículo izquierdo.
   4. Abra Medida > Contar/Tamaño y seleccione Seleccionar colores para abrir el cuadro de diálogo de segmentación. Elija la segmentación basada en cubo de color y establezca los parámetros de la siguiente manera: sensibilidad = 4, expandir selección en 1 índice de color, tamaño mínimo de color = 1 píxel y tamaño del kernel = 3 × 3. Aplique la misma configuración de segmentación a todas las secciones.
   5. Seleccione los píxeles positivos para colágeno azul utilizando la herramienta cuentagotas como puntos semilla. Muestree únicamente regiones claramente positivas para colágeno, genere una imagen de vista previa y confirme que la máscara incluya las áreas positivas para colágeno excluyendo el miocardio teñido de rojo, la cavidad ventricular y el fondo. Ajuste los puntos semilla si es necesario antes de aplicar la máscara.
      NOTA: Vuelva a seleccionar los píxeles semilla para cada sección para tener en cuenta pequeñas diferencias de intensidad de tinción entre secciones. Mantenga parámetros de segmentación idénticos (sensibilidad, grado de expansión, tamaño mínimo de color y tamaño del kernel) para todas las imágenes y acepte la segmentación solo cuando la vista previa demuestre cobertura completa de las áreas positivas para colágeno con exclusión de estructuras no colágenas.
   6. Aplique la máscara de segmentación y cierre el cuadro de diálogo. En Medida > Seleccionar mediciones, seleccione Área, haga clic en Contar, abra Ver > Estadísticas y registre el área positiva para colágeno sumada.
   7. Calcule la fracción de volumen de colágeno (CVF) dividiendo el área positiva para colágeno por el área total del ventrículo izquierdo y exprese el resultado como un porcentaje.

9. Clarificación de tejidos e imagen tridimensional de la arteria coronaria

1. Etiquetado por fluorescencia del sistema vascular coronario
   1. Injecte 200 µL de una solución al 2% de azul de Evans en la vena lateral de la cola para marcar el sistema vascular coronario. Devuelva el ratón a su jaula durante 60 min para permitir la circulación sistémica del colorante.
   2. Coloque el ratón en la cámara de inducción (16 × 10 × 11 cm) conectada al equipo de anestesia e induzca anestesia con 4% de isoflurano. Eutanasia al ratón mediante dislocación cervical, abra la cavidad torácica, extirpe el corazón intacto, enjuáguelo en PBS y fíjelo en paraformaldehído al 4% (PFA) durante 24 h a 4°C.
      ADVERTENCIA: El PFA es un probable carcinógeno y un irritante respiratorio y dérmico. Manipule el PFA en una campana extractora de gases usando guantes médicos asépticos, bata de laboratorio y protección ocular, y deseche los residuos según los procedimientos institucionales para residuos peligrosos.
   3. Prepare una solución al 3% de agarosa en agua RO e incluya el corazón fijado con el sitio de ligadura orientado adecuadamente para la obtención de imágenes. Inyecte 1 µL de solución de DAPI en cada uno de ocho sitios alrededor del área de ligadura utilizando una jeringa microlitro y incube la muestra a temperatura ambiente durante 2 días.
2. Clarificación del tejido
   1. Realice la clarificación del tejido utilizando un kit de clarificación de tejidos FDISCO (imagen tridimensional de órganos clarificados con solventes con capacidad superior de preservación de la fluorescencia) según las instrucciones del fabricante. El kit consta de seis reactivos (A–F): los reactivos A, B, C, D y E contienen tetrahidrofuran (THF) al 50%, 70%, 80%, 100% y 100% en agua, respectivamente, y el reactivo F es éter dibencílico.
      ADVERTENCIA: El THF es altamente inflamable, forma peróxidos explosivos durante el almacenamiento y es un irritante respiratorio y dérmico. El éter dibencílico es un irritante cutáneo y ocular. Manipule todos los reactivos en una campana extractora de gases usando equipo de protección personal adecuado, incluyendo guantes médicos asépticos, bata de laboratorio y protección ocular. Deseche los residuos según los procedimientos institucionales para residuos peligrosos.
   2. Incube cada corazón secuencialmente en los reactivos A, B, C, D y E durante 6 h por reactivo. Utilice 10 mL de cada reactivo por corazón, lo que corresponde a una relación mínima volumétrica muestra-reactivo de 1:5.
   3. Transfiera la muestra al reactivo F y continúe la incubación hasta que el tejido se vuelva ópticamente transparente, generalmente durante aproximadamente 1 h.
   4. Realice todos los pasos de clarificación a 6°C–8°C con agitación suave. Coloque la muestra en un recipiente de vidrio envuelto en papel de aluminio y protéjala de la luz durante todo el procedimiento para preservar la fluorescencia.
3. Imagen por microscopía de hoja de luz con fluorescencia
   1. Monte la muestra clarificada en el soporte de muestra. Utilice un microscopio de hoja de luz equipado con un objetivo de 4× (apertura numérica = 0,28; distancia de trabajo = 20,0 mm).
   2. Sumerja la muestra montada en éter dibencílico dentro de la cámara de imagen. Ilumine el espécimen desde ambos lados y excite secuencialmente el DAPI a 405 nm y el azul de Evans a 647 nm.
   3. Configure los parámetros de adquisición de la siguiente manera: para el canal de 405 nm, utilice una intensidad láser de 3.000 unidades arbitrarias y un tiempo de exposición de 30 ms; para el canal de 647 nm, utilice una intensidad láser de 4.000 unidades arbitrarias y un tiempo de exposición de 30 ms. Adquiera todas las imágenes utilizando un tamaño de paso z de 6 μm y una resolución de imagen de 1.024 × 1.024 píxeles.
   4. Configure el modo de adquisición de la cámara en XYCZT, en el cual primero se adquieren las imágenes laterales (XY), seguidas por la adquisición secuencial de canales (C), el avance axial (Z) y la adquisición de puntos temporales (T), según lo configurado por el software de imagen.
4. Procesamiento de datos de imagen y reconstrucción tridimensional
   1. Una los archivos de imágenes TIFF crudos utilizando el software de procesamiento de imágenes suministrado con el microscopio. Convierta los archivos de imágenes unidos al formato IMS seleccionando Archivo > Convertir a Imaris.
   2. Importe los archivos IMS convertidos al software de análisis tridimensional. Genere reconstrucciones renderizadas en volumen utilizando la configuración predeterminada de renderizado y exporte imágenes representativas utilizando el módulo Snapshot.
      NOTA: Las reconstrucciones tridimensionales se generan utilizando la tubería de renderizado predeterminada del software sin modificaciones. No se aplica segmentación de imagen, umbralización, reducción de ruido, sustracción de fondo ni otro preprocesamiento. Las imágenes reconstruidas se utilizan para la visualización cualitativa del sistema vascular coronario y no están destinadas al análisis cuantitativo.

10. Análisis estadístico

1. Expresar todos los datos como media ± error estándar de la media (SEM). Realizar los análisis estadísticos utilizando el software GraphPad Prism (versión 5.0).
2. Defina la unidad experimental como el animal individual. Analice n = 8 ratones por grupo para todos los puntos finales funcionales, de biomarcadores y histomorfométricos.
3. Realice la recopilación y el análisis de los datos utilizando identificadores de muestra codificados, manteniendo el enmascaramiento del investigador respecto a la asignación de grupos. Revele las asignaciones de grupo únicamente tras completar todos los análisis cuantitativos.
4. Evalúe la normalidad de los datos mediante la prueba de Shapiro-Wilk y la homogeneidad de la varianza mediante la prueba de Levene en GraphPad Prism (versión 5.0) antes de seleccionar la prueba estadística adecuada.
5. Comparar dos grupos utilizando una prueba t de Student no pareada de dos colas t-prueba cuando se satisfacen los supuestos de normalidad y varianza igual. De lo contrario, realice una prueba de Mann-Whitney U prueba.
6. Considere P < 0.05 significativo estadísticamente. Indique la significancia estadística como P < 0,05, P < 0.01, y P < 0.001.

Resultados

El SAI sirvió como referencia anatómica para la localización de la arteria coronaria descendente anterior (LAD) y la identificación del sitio de ligadura (Figura 1A–C). Tras identificar el SAI, se realizó la secuencia quirúrgica para la inducción del infarto de miocardio (IM), que incluye toracotomía, exposición del corazón, ligadura de la LAD, cierre torácico y recuperación postoperatoria, tal como se ilustra en la Figura 2A–L. El protocolo simplificado permitió una inducción rápida y reproducible del IM en ratones. Este protocolo requiere un período prolongado de entrenamiento práctico antes de poder realizarse de forma confiable; la intubación traqueal y la ligadura guiada por el SAI son los dos pasos con la curva de aprendizaje más pronunciada. Durante las primeras etapas del entrenamiento, la mortalidad perioperatoria dentro de los primeros 7 días postoperatorios puede alcanzar el 50 % o más, y la tasa de éxito en la inducción del modelo puede descender al 30 % o menos. Una vez dominadas estas técnicas, la tasa de éxito quirúrgico supera consistentemente el 90 %. En el presente estudio, no se registraron muertes perioperatorias durante los primeros 7 días postoperatorios. Todos los procedimientos de entrenamiento se realizaron bajo el mismo protocolo institucional aprobado para el uso de animales.

Tras la ligadura de la DA, se observaron anormalidades electrocardiográficas características, incluyendo un acentuado aplanamiento del segmento Q, elevación del segmento ST con morfología convexa hacia arriba, punta hiperaguda de la onda T (que típicamente evoluciona hacia inversión de la onda T durante la fase subaguda), aumento del voltaje del complejo QRS con amplitud ensanchada y marcada taquicardia (Figura 3A). El examen macroscópico mostró palidez miocárdica localizada y dilatación ventricular distal al sitio de ligadura en el grupo IM en comparación con el grupo CN (Figura 3B). El examen histopatológico reveló fibras miocárdicas desorganizadas, espacios intercelulares ensanchados, infiltración de células inflamatorias, depósito de colágeno y alteración estructural del miocardio en el grupo IM, evidenciado mediante tinciones con hematoxilina y eosina (H&E), tricrómica de Masson y rojo de Sirius (Figura 3C). El análisis cuantitativo de secciones teñidas con tricrómica de Masson mostró una FVC significativamente mayor en el grupo IM que en el grupo CN (18,24% ± 1,67% frente a 0,05% ± 0,01%; P < 0,001; Figura 3D).

Figura 3: Cambios electrocardiográficos, anatómicos macroscópicos e histopatológicos tras la ligadura de la arteria coronaria descendente anterior izquierda en ratones. (A) Electrocardiogramas (ECG) representativos registrados inmediatamente después de la cirugía en los grupos control normal (NC) e infarto de miocardio (MI). (B) Imágenes macroscópicas representativas de corazones de los grupos NC y MI. Barras de escala = 1 mm. (C) Secciones transversales cardíacas representativas de los grupos NC y MI teñidas con hematoxilina y eosina (H&E; izquierda), tricrómico de Masson (centro) y rojo de Sirius (derecha). En las secciones teñidas con tricrómico de Masson, el colágeno aparece azul y el miocardio rojo; en las secciones teñidas con rojo de Sirius, el colágeno aparece rojo sobre un fondo amarillo. Barras de escala = 1.000 µm. (D) Fracción de volumen de colágeno (CVF), calculada como el área positiva para colágeno dividida por el área total del ventrículo izquierdo y expresada como porcentaje, en los grupos NC y MI. Los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM); n = 8 ratones por grupo. La significancia estadística respecto al grupo NC se indica como **P < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Se confirmó el deterioro funcional cardíaco mediante ecocardiografía. Imágenes representativas en modo M mostraron una contractilidad ventricular izquierda reducida en el grupo con IM (Figura 4A). El análisis cuantitativo mostró una fracción de eyección y una fracción acortada del ventrículo izquierdo significativamente reducidas en el grupo con IM en comparación con el grupo NC (Figura 4B,C). ELISA mostró concentraciones séricas significativamente aumentadas de BNP, TNF-α, NF-κB p65 e IL-1β en el grupo con IM (Figura 4D–G), lo cual es consistente con una función cardíaca deteriorada y una respuesta inflamatoria.

Figura 4: Cambios funcionales cardíacos y niveles de biomarcadores séricos tras la ligadura de la arteria coronaria descendente anterior izquierda. (A) Imágenes ecocardiográficas representativas en modo M de los grupos control normal (NC) e infarto de miocardio (MI). (B) Fracción de eyección del ventrículo izquierdo (EF). (C) Fracción de acortamiento del ventrículo izquierdo (FS). (D–G) Concentraciones séricas de (D) péptido natriurético tipo B (BNP), (E) factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), (F) factor nuclear-κB p65 (NF-κB p65) e (G) interleucina-1β (IL-1β), medidas mediante ensayo inmunoenzimático (ELISA). La EF y la FS se expresan como porcentajes; el BNP, el TNF-α y la IL-1β se expresan en pg/mL; y el NF-κB p65 se expresa en ng/mL. Los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM); n = 8 ratones por grupo. La significancia estadística respecto al grupo NC se indica como *P < 0,01 y **P < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La imagen tridimensional mediante fluorescencia de corazones transparentados demostró el trayecto de la ADA por debajo de la AIS y mostró que la ligadura en el sitio definido anatómicamente produjo oclusión coronaria (Figura 5A–F). En conjunto, estos hallazgos demuestran la inducción exitosa de un fenotipo de IM en esta serie inicial de ocho animales por grupo, caracterizado por disfunción del ventrículo izquierdo, fibrosis miocárdica e inflamación sistémica. El presente estudio fue diseñado para establecer y demostrar la viabilidad del modelo de IM guiado por AIS, más que para proporcionar una validación exhaustiva del tamaño de la muestra, la estabilidad a largo plazo del modelo o la concordancia anatómica entre la AIS y la ADA. Por consiguiente, estos aspectos se reconocen como limitaciones del presente estudio y se discuten en la sección de Discusión. Específicamente, las evaluaciones funcionales y bioquímicas se limitaron a la fase aguda tras el IM, y la relación entre la AIS y la ADA se demostró cualitativamente, pero aún no se ha cuantificado en una cohorte suficientemente grande.

Figura 5: Imagen de fluorescencia tridimensional de la vasculatura coronaria murina transparentada. Corazones enteros transparentados fueron marcados con Azul de Evans para visualizar la vasculatura coronaria y con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para visualizar los núcleos, seguido de imágenes de hoja luminiscente por fluorescencia y reconstrucción tridimensional. (A–C) Reconstrucciones de corazones completos que muestran el canal (A) DAPI, el canal (B) Azul de Evans y los canales fusionados (C). Barras de escala = 1.000 µm. (D–F) Vistas ampliadas de la región vascular coronaria que muestran el canal (D) DAPI, el canal (E) Azul de Evans y los canales fusionados (F). Barras de escala = 400 µm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

No todos los procedimientos producen un modelo óptimo, y reconocer los resultados subóptimos es importante para la resolución de problemas. Una ligadura colocada demasiado proximalmente o el paso de la aguja demasiado profundo pueden provocar un infarto excesivamente grande acompañado de insuficiencia cardíaca grave, arritmia o ruptura ventricular, lo que conduce a una mortalidad temprana. Por el contrario, una ligadura colocada demasiado distalmente o demasiado superficialmente puede producir solo un infarto pequeño o no inducir infarto alguno. Por lo tanto, la inducción exitosa del modelo debe evaluarse utilizando múltiples criterios. Durante la cirugía, el blanqueamiento del miocardio distal al sitio de ligadura proporciona un indicador inmediato de la oclusión coronaria, aunque este hallazgo no siempre sea fácilmente visible. La ecocardiografía posoperatoria y el examen histopatológico proporcionan una confirmación adicional del establecimiento exitoso del modelo. Supplementary Figure 1 muestra un modelo representativo no exitoso en el que el examen histopatológico demuestra ausencia de infiltración evidente de células inflamatorias o fibrosis.

Figura suplementaria 1. Hallazgos histológicos representativos de un modelo de infarto de miocardio fallido. Secciones transversales representativas del corazón de un ratón en el que la inducción del infarto de miocardio fue fallida, teñidas con (A) hematoxilina y eosina (H&E), (B) tricrómica de Masson y (C) rojo de Sirius. En comparación con una inducción exitosa de infarto de miocardio, estas secciones no muestran infiltración evidente de células inflamatorias ni remodelación fibrotica en el miocardio del ventrículo izquierdo, lo que concuerda con una oclusión fallida de la arteria coronaria. Barras de escala = 1.000 µm.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

En los últimos años, los modelos clínicos y experimentales del IAM han adquirido una importancia creciente en la investigación cardiovascular, aunque muchas preguntas sobre la patogénesis del IAM y las estrategias para su tratamiento siguen sin resolverse. En este artículo se describe un método perfeccionado para establecer un modelo de IAM murino, en el que varios pasos procedimentales críticos requieren atención especial. El primer paso crítico es la intubación traqueal. Algunos protocolos previos establecen la vía aérea mediante traqueotomía, lo que requiere una incisión de la piel cervical y la disección de los tejidos para exponer la tráquea antes de la intubación¹³; otros mantienen la intubación orotraqueal pero recomiendan una incisión cervical media para mejorar la visualización durante el procedimiento¹⁴. En contraste con ambos enfoques, el presente protocolo utiliza un laringoscopio para iluminar la orofaringe y realiza la intubación orotraqueal bajo visualización directa de la glotis sin necesidad de una incisión cervical. Aunque este enfoque exige mayor destreza técnica por parte del operador, evita el trauma del tejido cervical, reduce el riesgo de infección y de dolor postoperatorio, y acorta el tiempo quirúrgico. El error más común durante la intubación es la colocación inadvertida en el esófago. Si el tórax no se eleva durante la ventilación y el tubo endotraqueal no muestra condensación durante la espiración, retire inmediatamente el tubo y repita la intubación. Conecte el ventilador solo tras confirmar un movimiento simétrico bilateral de la pared torácica.

El segundo paso, y más crítico, es la identificación de la arteria coronaria descendente anterior (LAD) y la colocación precisa del ligadura. Los métodos convencionales enfrentan varios desafíos en esta etapa. La frecuencia cardíaca en reposo del ratón es aproximadamente de 500–600 latidos/min, y la LAD se encuentra adyacente a varias venas coronarias acompañantes, lo que dificulta inherentemente la identificación intraoperatoria en tiempo real de la arteria. Además, incluso bajo condiciones óptimas, una proporción considerable de LAD no puede visualizarse claramente bajo un microscopio estereoscópico¹⁵. En este contexto, protocolos anteriores que estiman el sitio de ligadura como un punto situado 1–2 mm por debajo del apéndice auricular izquierdo están limitados por la identificación intraoperatoria inconsistente de este referente anatómico^12,14, mientras que el complejo patrón de ramificación de la arteria coronaria izquierda puede comprometer aún más la reproducibilidad¹⁶. Para abordar estos desafíos, el presente protocolo utiliza el surco interventricular anterior (AIS) como punto de referencia anatómico para posicionar la ligadura. Bajo el microscopio estereoscópico, el AIS aparece como un surco poco profundo en la superficie ventral del corazón, con la LAD corriendo inmediatamente debajo. Por lo tanto, proporciona un referente anatómico relativamente estable que depende menos de la experiencia del operador. Colocar la ligadura en el tercio superior del AIS ofrece un blanco anatómico consistente para la oclusión coronaria. Los resultados representativos demuestran que este enfoque produjo con éxito el fenotipo esperado de infarto agudo de miocardio (MI) en los animales examinados.

El punto de referencia del SAI no es confiable en todas las circunstancias. Cuando la exposición torácica sea limitada o el sangrado epicárdico oscurezca la superficie cardíaca y dificulte la identificación del SAI, limpie suavemente el campo quirúrgico con una torunda de algodón humedecida en solución salina y vuelva a evaluar el surco antes de realizar la ligadura. Si aún no se puede identificar el SAI con certeza, identifique directamente la ADA según se describe en el protocolo y realice la ligadura bajo visualización directa en lugar de depender del SAI. De ser necesario, confirme el espacio intercostal correcto contando caudalmente desde la primera costilla para asegurar una exposición adecuada de la orejuela auricular izquierda y de la pared anterior del ventrículo izquierdo.

Entre las complicaciones posoperatorias, el neumotórax es la más común y generalmente se presenta como dificultad respiratoria tras la extubación. La clave para prevenir el neumotórax es la evacuación completa del aire residual de la cavidad torácica antes del cierre del espacio intercostal. Si se sospecha neumotórax, reanestesie brevemente y ventile al ratón, reabra las suturas de la piel e inspeccione el cierre intercostal. Si se identifica uno o más sitios de cierre incompleto, coloque suturas adicionales en el sitio de fuga de aire antes de repetir el procedimiento de extubación. Otra complicación potencial es la hemorragia intraoperatoria, que ocurre más comúnmente cuando la aguja perfora un pequeño vaso epicárdico o una vena coronaria adyacente durante la ligadura. La hemorragia generalmente es limitada y suele controlarse aplicando presión suave con un hisopo de algodón humedecido con solución salina durante varios segundos. Antes de cerrar la cavidad torácica, confirme que no persista sangrado activo en el campo quirúrgico para minimizar las complicaciones posoperatorias. Además, los ratones pueden desarrollar arritmias, incluyendo contracciones ventriculares prematuras o fibrilación ventricular transitoria, durante o inmediatamente después del procedimiento. Estas arritmias a menudo mejoran manteniendo la temperatura corporal, estabilizando la profundidad de la anestesia y pausando temporalmente el procedimiento para permitir la recuperación espontánea del ritmo cardíaco. Por último, las complicaciones anestésicas ocurren más comúnmente por no reducir rápidamente la concentración de isoflurano tras una intubación traqueal exitosa. Reduzca inmediatamente la concentración de isoflurano al nivel de mantenimiento tras conectar el tubo endotraqueal al ventilador, y supervise continuamente la respiración y la frecuencia cardíaca durante todo el procedimiento.

En general, este método requiere una habilidad microquirúrgica considerable y, al igual que otros modelos de ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior (LAD), sigue estando sujeto a variabilidad derivada de las diferencias anatómicas coronarias y de la experiencia del operador. Sin embargo, con una formación adecuada y una técnica quirúrgica consistente, los investigadores pueden establecer el modelo de IM con una consistencia razonable, mejorando al mismo tiempo la reproducibilidad del procedimiento y la supervivencia posoperatoria.

Se deben reconocer varias limitaciones de este método. En primer lugar, las evaluaciones funcionales y bioquímicas se completaron dentro de una semana después de la inducción del IM, por lo que reflejan únicamente la fase aguda del IM, sin una evaluación sistemática de los resultados a largo plazo, como el remodelado ventricular a las 4–8 semanas posteriores a la cirugía. En segundo lugar, al igual que otros modelos de ligadura permanente del IM que utilizan suturas no absorbibles, este protocolo podría provocar adherencias pericárdicas crónicas. Esto representa una característica inherente al modelo de ligadura, más que una limitación específica del enfoque guiado por el AIS. Sin embargo, la gravedad de estas adherencias y sus efectos sobre la función cardíaca a largo plazo no se cuantificaron en el presente estudio. Estudios futuros podrían investigar el uso de suturas absorbibles y evaluar sus efectos sobre la formación de adherencias y el desempeño del modelo. En tercer lugar, aunque la imagenología coronaria tridimensional demostró cualitativamente que la ADA discurre por debajo del AIS, la concordancia anatómica entre estas estructuras aún no se ha cuantificado en una cohorte suficientemente grande. En cuarto lugar, este estudio incluyó únicamente ratones macho C57BL/6J. Aunque se espera que el AIS represente un punto de referencia anatómico consistente, su aplicabilidad en ratones hembra, otras cepas de ratones y otras especies requiere una validación adicional. Finalmente, las ventajas potenciales de este protocolo respecto a la consistencia del sitio de ligadura y la reproducibilidad del procedimiento se basan en la experiencia de un solo laboratorio y no se han evaluado mediante comparación directa con métodos convencionales de ligadura de la ADA ni entre múltiples operadores e instituciones. Por lo tanto, se requerirán estudios adicionales de validación para establecer la generalización más amplia del método.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución salina estéril al 0,9%	Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.	-	Reconstitución de cefazolina
Agarosa al 3%	Sigma-Aldrich	A0169	Inclusión de muestras
Paraformaldehído al 4%	Sigma-Aldrich	158127	Fijación de tejidos
Etileno absoluto	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	05.001.0170A	Deshidratación del tejido; inflamable
Fucsina ácida	Aladdin	A104916-100g	Preparación de la solución de ponceau–fucsina ácida para tinción tricrómica de Masson
Software AcqKnowledge	BIOPAC Systems	AcqKnowledge 4.0	Adquisición y análisis de electrocardiograma
Solución amoniacal, acuosa al 0,5%	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	05.001.2528A	Revelado durante la tinción con hematoxilina y eosina
Azul de anilina, soluble en ácido	Aladdin	A111200-100g	Preparación de la solución de azul de anilina para tinción tricrómica de Masson
Guantes médicos asépticos	Nanchang Feixiang Latex Products Co., Ltd.	-	Protección química y biológica
Buprenorfina	Qinghai Pharmaceutical Factory Co., Ltd.	H10940181	Analgesia postoperatoria
Cefazolina sódica para inyección	CSPC Zhongnuo Pharmaceutical (Shijiazhuang) Co., Ltd.	-	Profilaxis antibiótica perioperatoria
Hisopos de algodón	Shijiazhuang Kangertai Medical Equipment Co., Ltd.	-	Limpiado epicárdico y preparación aséptica
Solución de tinción con DAPI	Thermo Fisher	D1306	Etiquetado nuclear
Cremas depilatorias	Veet	-	Depilación torácica
Escáner digital de portaobjetos	3DHISTECH	Pannoramic MIDI II	Imagen completa de portaobjetos
Amplificador de ECG	BIOPAC Systems	ECG100C	Amplificación de electrocardiograma
Sistema de registro de electrocardiograma	BIOPAC Systems	MP160	Registro de electrocardiograma
Kit ELISA, péptido natriurético tipo B murino	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	RXW202726M	Cuantificación sérica de BNP
Kit ELISA, interleucina-1β murina	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	RX203063M	Cuantificación sérica de IL-1β
Kit ELISA, factor nuclear-κB p65 murino	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	RX201879M	Cuantificación sérica de NF-κB p65
Kit ELISA, factor de necrosis tumoral-α murino	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	RX202412M	Cuantificación sérica de TNF-α
Casetes de inclusión	Jiangsu Shitai	22022	Inclusión de tejidos
Catéter endotraqueal, 20 G	Shenzhen Bailide Biotechnology Co., Ltd.	B11103	Intubación oral; diámetro exterior aproximado de 0,9–1,0 mm; recortado a aproximadamente 15 mm antes del uso
Eosina Y, soluble en alcohol	Hefei BASF Biotechnology Co., Ltd.	Y0310-100G	Contratinción citoplasmática durante la tinción con hematoxilina y eosina
Azul de Evans	Jarvisbio	A312001	Etiquetado de la vasculatura coronaria
Pinzas finas	RWD Life Science	F12011-10	Manejo de tejidos y apertura pericárdica
Pinzas finas, microquirúrgicas	RWD Life Science	FC12002T-08	Manejo microquirúrgico de tejidos
Tijeras finas	RWD Life Science	S12000-09	Tijeras oftálmicas para incisión y disección de piel
Ácido acético glacial	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	-	Preparación de ácido acético al 1% para diferenciación en tinción tricrómica de Masson
Portaobjetos de vidrio	Jiangsu Shitai	80312/80302	Montaje de secciones
Esterilizador de perlas de vidrio	RWD Life Science	RS3002	Esterilización de instrumentos entre animales
Software GraphPad Prism	GraphPad Software	Versión 5.0	Análisis estadístico
Almohadilla térmica	RWD Life Science	69020	Termorregulación postoperatoria
Solución de tinción con hematoxilina	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1004	Tinción nuclear durante la tinción con hematoxilina y eosina
Anticuerpo de detección conjugado con peroxidasa de rábano picante	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	Incluido con los kits ELISA	Detección en ELISA
Ácido clorhídrico	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	05.001.1337A	Preparación de alcohol ácido para diferenciación de hematoxilina
Software Image-Pro Plus	Media Cybernetics	Versión 6.0	Cuantificación de la fracción de volumen de colágeno
Software Imaris	Bitplane	Versión 7.2.3	Reconstrucción y análisis tridimensional
Isoflurano	RWD Life Science	R510-22-10	Anestésico inhalatorio
Sistema de anestesia con isoflurano	RWD Life Science	TAIJI-IE	Administración de isoflurano
Laringoscopio para pequeños animales	Shanghai Yuyan Scientific Instrument Co., Ltd.	SR310-MR	Visualización directa durante la intubación
Microscopio de hoja de luz con fluorescencia	Light Innovation Technology	LiToneXL	Imagen tridimensional con fluorescencia
Software LitScan	Light Innovation Technology	Versión 3.31	Empalme y conversión de imágenes
Respirador mecánico	Chengdu Taimeng Software Co., Ltd.	HX-101E	Ventilación mecánica; 130 respiraciones/min; volumen tidal de 2 mL
Hemostato micro mosquito	RWD Life Science	FC21001R-12	Sujeción de agujas durante ligadura y cierre
Jeringa microlitro	Shanghai Gaoge Industry and Trade Co., Ltd.	-	Inyección localizada de DAPI
Lector de microplacas	Molecular Devices (Shanghai) Co., Ltd.	SpectraMax iD5	Medición de densidad óptica a 450 nm
Microscopio estereoscópico	Maishidi (Dongguan) Technology Co., Ltd.	MSD204	Visualización intraoperatoria
Microscopio óptico vertical	Leica	DM500	Imagen histológica
Cuchillas para microtomo	Epredia	MX35 ULTRA	Seccionado de parafina
Kit de tinción con rojo Sirius modificado	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1078	Tinción de colágeno; incluye las soluciones A, B y C
n-Butanol	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	05.001.0886A	Deshidratación e aclaramiento histológico; inflamable
Resina de montaje neutra	Shanghai Yiyang	YSQN41-91	Montaje de portaobjetos
Sutura de nailon, 3/8 de círculo 7-0 con aguja	Ningbo Medical Needle Co., Ltd.	-	Ligadura de la arteria coronaria descendente anterior izquierda
Sutura de nailon, 5-0	Ningbo Medical Needle Co., Ltd.	-	Cierre torácico y de piel
Sutura de nailon, 6-0	Ningbo Medical Needle Co., Ltd.	-	Exposición y tracción de la pared torácica
Estación de inclusión en parafina	Wuhan Junjie Electronics	JB-L5	Inclusión de tejidos
Cera de parafina	NA	NA	Infiltración e inclusión de tejidos
Solución salina tamponada con fosfato	Sigma-Aldrich	P3813	Lavado de tejidos y dilución de reactivos
Ácido fosfomolíbdico	Tianjin Aopusheng Chemical Co., Ltd.	-	Diferenciación en tinción tricrómica de Masson
Ponceau 2R	Aladdin	P104989-25g	Preparación de la solución de ponceau–fucsina ácida para tinción tricrómica de Masson
Dicromato de potasio	Zhengzhou Paini Chemical Reagent Factory	7778-50-9	Mordiente en tinción tricrómica de Masson
Povidona–yodo	SingleLady	GB26368-2010	Desinfección de la piel
Agua de ósmosis inversa	Purificada en laboratorio	No aplicable	Preparación de soluciones
Microtomo rotatorio	Leica Instruments (Shanghai)	RM2016	Seccionado de parafina
Adaptador de soporte de muestra	Light Innovation Technology	Suministrado con LiToneXL	Montaje de muestras clarificadas para imagen de hoja de luz
Cinta adhesiva para piel	Qingdao Schultz Biotechnology Co., Ltd.	-	Sujeción de extremidades y cola
Cubreobjetos	Jiangsu Shitai	80340-1630	Aplicación de cubreobjetos
Secador de portaobjetos	Shaoxing Luyue	101-3B	Secado de portaobjetos
Solución de parada	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	Incluida con los kits ELISA	Terminación de la reacción ELISA
Soluciones sustrato A y B	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	Incluidas con los kits ELISA	Desarrollo del color en ELISA
Baño flotador de tejidos	Wuhan Junjie Electronics	JK-5/6	Flotación de secciones
Procesador de tejidos	Wuhan Junjie Electronics	JT-12S	Procesamiento automático de tejidos
Kit de clarificación de tejidos, reactivos A–F	Jarvisbio	JA11012	Clarificación de tejidos basada en solventes
Plataforma para intubación traqueal	RWD Life Science	Re20-M	Posicionamiento para intubación oral
Software de análisis por ultrasonido	Fujifilm VisualSonics	VevoLAB 3.2.6	Análisis de datos de ecocardiografía
Gel de ultrasonido	Tianjin Jinya Electronics Co., Ltd.	TM-100	Acoplamiento ecocardiográfico
Sistema de imagen por ultrasonido	Fujifilm VisualSonics	Vevo 3100	Ecocardiografía
Retractor de párpados en forma de V	Suqian Shengshi Medical Equipment Co., Ltd.	SS5009G	Retracción intercostal y de costillas
Tampón de lavado	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	Incluido con los kits ELISA	Lavado de placas ELISA
Sistema de purificación de agua	Sichuan ULUPURE Ultrapure Technology Co., Ltd.	UPT-II-20T	Producción de agua de ósmosis inversa
Xileno	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	05.001.0586A	Aclaramiento de tejidos y desparafinización; inflamable y neurotóxico