El miR-488-3p podría servir como un nuevo marcador diagnóstico no invasivo para la AR. El miR-488-3p modula la función biológica de los sinoviocitos a través de ROCK1. Mostró una correlación negativa significativa con la gravedad de la enfermedad en pacientes con AR.
Artículo de investigación
La expresión sérica de miR-488-3p sirve como biomarcador diagnóstico no invasivo en pacientes con artritis reumatoide
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Resumen
Resumen
El diagnóstico de la artritis reumatoide (AR) sigue siendo un desafío debido a las limitaciones de los biomarcadores existentes. El objetivo del estudio fue investigar el potencial de miR-488-3p en suero como biomarcador para la AR y revelar su posible mecanismo de acción. El estudio incluyó a 135 pacientes con AR, 130 pacientes con osteoartritis (OA) y 125 controles sanos. Los niveles de expresión de miR-488-3p se analizaron mediante RT-qPCR. El mecanismo de acción se evaluó mediante pruebas funcionales (CCK-8, citometría de flujo, ELISA) y experimentos de validación de dianas (ensayo del gen reportero luciferasa, RIP). Los niveles séricos de expresión de miR-488-3p fueron significativamente más bajos en pacientes con AR que en pacientes con osteoartritis (OA) y controles sanos (p < 0,001). El análisis mediante curva ROC mostró que miR-488-3p presentaba una alta precisión diagnóstica para distinguir a los pacientes con AR de los controles sanos y de los pacientes con OA. miR-488-3p mostró una correlación negativa con la velocidad de sedimentación globular (VSG), la proteína C reactiva (PCR), el factor reumatoide (FR) y los puntajes DAS28. La validación funcional reveló que la sobreexpresión de miR-488-3p inhibió la proliferación y la respuesta inflamatoria de los sinoviocitos, mientras que indujo la apoptosis. Los estudios mecanicistas mostraron que miR-488-3p puede dirigirse directamente a la proteína quinasa 1 asociada a Rho con dominio en espiral (ROCK1), que media sus efectos protectores. El miR-488-3p en suero es una prometedora nueva marca diagnóstica no invasiva para la AR y protege a los sinoviocitos del daño.
Introducción
La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune común caracterizada por inflamación sinovial, erosión articular y destrucción1,2. La prevalencia mundial de la AR es de aproximadamente 0,5%–1%3, lo que afecta gravemente la calidad de vida y la capacidad laboral de los pacientes. La enfermedad tiene un inicio insidioso, y los síntomas iniciales suelen ser atípicos y fácilmente mal diagnosticados o pasados por alto4. A medida que la enfermedad progresa, puede provocar deformidad articular, pérdida de función e incluso aumentar el riesgo de complicaciones como enfermedades cardiovasculares5, lo que supone una carga considerable para los pacientes, sus familias y los sistemas de salud.
Actualmente, se requiere una combinación de síntomas clínicos, signos, pruebas de laboratorio y evaluación por imágenes para el diagnóstico de la AR6. Los indicadores de laboratorio comúnmente utilizados incluyen la velocidad de sedimentación globular (VSG) y la proteína C reactiva (PCR), que son marcadores inespecíficos de inflamación sistémica, así como el factor reumatoide (FR) y los anticuerpos anti-péptido citrulinado cíclico (anti-CCP), que son biomarcadores serológicos importantes para la AR7,8. Sin embargo, estos biomarcadores tradicionales tienen limitaciones: el FR puede ser positivo en algunas personas sanas y en pacientes con otras enfermedades autoinmunes (tasa de falsos positivos de aproximadamente el 5 %); el anti-CCP, aunque altamente específico (>95 %), tiene una sensibilidad limitada en las etapas iniciales de la enfermedad (alrededor del 60–70 %)4,9, y algunos pacientes con AR permanecen seronegativos10. Por lo tanto, es importante encontrar biomarcadores más sensibles y específicos para el diagnóstico temprano, el monitoreo de la enfermedad y la evaluación del pronóstico de la AR11.
Los microARN (miARN) son un grupo de moléculas de ARN reguladoras no codificantes endógenas con una longitud aproximada de 22–25 bases12,13. Se ha descubierto que los miARN actúan como reguladores clave en el desarrollo de diversas enfermedades, y su expresión aberrante está estrechamente relacionada con la patogénesis de enfermedades13,14,15, lo que convierte a los miARN en biomarcadores prometedores para el diagnóstico de enfermedades y la monitorización terapéutica. En los últimos años, el papel de los miARN en la artritis reumatoide (AR) ha recibido una atención creciente16. Estudios han demostrado que múltiples miARN están asociados con una expresión desregulada (por ejemplo, miR-146a, miR-155, etc.) en suero, tejidos sinoviales y células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes con AR17,18,19. Estos miARN contribuyen a la patogénesis de la AR mediante la regulación de la producción de citocinas inflamatorias, la promoción de la proliferación e invasión de células sinoviales y la influencia en la diferenciación de osteoclastos20. Entre ellos, el miR-488 se localiza en la región 1q25.2 del cromosoma humano21, y estudios previos han confirmado sus efectos neuroprotectores: desempeña un papel regulador en la progresión de gliomas22 y neuroblastomas23, y, notablemente, el miR-488-3p promueve la apoptosis de condrocitos osteoarticulares en la osteoartritis (OA)24. Aunque la OA y la AR son enfermedades articulares diferentes, comparten mecanismos comunes en los procesos patológicos de inflamación sinovial y destrucción del cartílago25. Planteamos la hipótesis de que el miR-488-3p podría desempeñar un papel en la AR mediante la regulación de vías diana similares. Sin embargo, el papel específico y los mecanismos potenciales del miR-488-3p en la AR no han sido elucidados.
El estudio investigó los cambios en los niveles de expresión sérica de miR-488-3p en pacientes con AR y su relación con la actividad de la enfermedad y los indicadores clínicos, con el objetivo de evaluar su valor potencial como marcador diagnóstico no invasivo para la AR. Este estudio aporta una perspectiva novedosa sobre el cribado temprano y la predicción de la progresión de la enfermedad en la AR, mejorando así el pronóstico de los pacientes con esta enfermedad.
Protocolo
El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Hefei BOE (número de aprobación 2021–1), y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes antes de su inscripción.
Pacientes y especímenes
Este estudio reclutó a 135 pacientes con AR (diagnosticados según los criterios de clasificación ACR/EULAR 2010) del Departamento de Reumatología e Inmunología del Hospital Hefei BOE, 130 pacientes con OA del Departamento de Ortopedia (diagnosticados según los criterios diagnósticos de OA de la Asociación Médica China 2018) y 125 controles sanos apareados por edad y sexo del centro de exámenes médicos del mismo hospital. Los participantes tenían entre 30 y 80 años. Se confirmó que los controles sanos no presentaban enfermedades autoinmunitarias, trastornos articulares ni infecciones agudas mediante una revisión exhaustiva de la historia clínica, examen físico y pruebas de laboratorio. Se excluyeron a los participantes si tenían enfermedades autoinmunitarias concomitantes, antecedentes de infección o trauma en los últimos 3 meses, enfermedad maligna, o si estaban embarazadas o en período de lactancia.
Muestreo y preparación
Se recogió sangre venosa en ayunas de todos los sujetos del estudio. Tras la coagulación a temperatura ambiente durante 30 min, las muestras de suero se aislaron mediante centrifugación a 1500 × g durante 15 min. El suero se almacenó a -80°C hasta su posterior análisis.
Detección de marcadores clínicos y serológicos
Para evaluar de forma integral el estado de la enfermedad y la actividad inflamatoria, se midieron biomarcadores clínicos y serológicos mediante métodos estandarizados de laboratorio clínico. La VSG se midió utilizando el método de Westergren para evaluar la inflamación sistémica inespecífica. La PCR se cuantificó mediante un ensayo inmunoturbidimétrico (valor de referencia normal: <10 mg/L) para evaluar la respuesta inflamatoria de fase aguda. El FR se midió mediante un ensayo inmunoenzimático (ELISA) con un valor de referencia normal de ≤20 UI/mL. Los anticuerpos anti-CCP se midieron mediante un ELISA de segunda generación para proporcionar evidencia serológica para el diagnóstico de la AR.
Líneas celulares y cultivo
Las células de sinoviocitos tipo fibroblasto humanos afectados por AR (HFLS-RA) se cultivaron en medio de Dulbecco modificado (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina. Las células se mantuvieron en una incubadora a 37 °C con 5% de CO₂, y se utilizaron células entre el tercer y sexto pase para todos los experimentos.
Extracción de ARN y RT-PCR cuantitativa en tiempo real
Se extrajo ARN total de muestras de suero utilizando un reactivo de extracción de ARN. Se realizó la transcripción inversa utilizando un kit de síntesis de primera cadena para miARNs y un kit de transcripción inversa para genes diana de ARN mensajero (ARNm) según las instrucciones del fabricante. Se realizó la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) utilizando un sistema de PCR en tiempo real con una mezcla maestra de PCR basada en SYBR Green. El programa de termociclación se estableció en una pre-desnaturalización a 95 °C durante 30 s; seguido de 40 ciclos de amplificación (desnaturalización a 95 °C durante 5 s y hibridación/elongación a 60 °C durante 30 s). Cada muestra se analizó por triplicado. El ARN nuclear pequeño U6 (U6 snRNA) y la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se utilizaron como genes de referencia endógenos para la normalización de miARN y ARNm, respectivamente. Las secuencias de los cebadores se han resumido en la Tabla Suplementaria 1. Los niveles relativos de expresión de miR-488-3p y sus genes diana se calcularon utilizando el método 2−ΔΔCt. También se analizaron los cambios en los niveles de ARNm de los genes diana tras la sobreexpresión o inhibición de miR-488-3p para verificar sus relaciones reguladoras.
Transfección celular
Las células HFLS-RA se sembraron en placas de 6 pocillos con una densidad de 5 × 105 células/pocillo. Las células se transfirieron utilizando un reactivo de transfección basado en liposomas, siguiendo las instrucciones del fabricante. Los grupos de transfección incluyeron grupos de transfección simple y grupos de co-transfección. Los grupos de transfección simple fueron: 1) control—células no transfectadas; 2) control negativo del mimético (NC)—células transfectadas con el control negativo del mimético de miR-488-3p; 3) mimético de miR-488-3p—células transfectadas con el mimético de miR-488-3p; 4) control negativo del inhibidor—células transfectadas con el control negativo del inhibidor de miR-488-3p; 5) inhibidor de miR-488-3p—células transfectadas con el inhibidor de miR-488-3p. Los grupos de co-transfección fueron: 1) mimético de miR-488-3p + control de sobreexpresión (oe-NC)—células co-transfectadas con el mimético de miR-488-3p y el control negativo de los vectores de sobreexpresión de ROCK1; 2) mimético de miR-488-3p + oe-ROCK1—células co-transfectadas con el mimético de miR-488-3p y los vectores de sobreexpresión de ROCK1. Todas las secuencias de transfección se han resumido en la Tabla Suplementaria 1. El vector de sobreexpresión de ROCK1 se construyó clonando la región de la secuencia codificante (CDS) en el plásmido pcDNA 3.1. Las células transfectadas estuvieron disponibles para los experimentos siguientes tras 48 h de transfección celular.
Ensayo de función celular
Ensayo de proliferación celular (Kit de recuento de células-8 [CCK-8]): Las células HFLS-RA transfectadas se inocularon en placas de 96 pocillos a una concentración de 5 × 103 células/pocillo, con tres pocillos replicados por grupo. A las 0, 24, 48 y 72 h posteriores a la transfección, se añadieron 10 µL de solución CCK-8 a cada pocillo, seguido de una incubación a 37 °C durante 2 h. La absorbancia se midió a 450 nm (longitud de onda de detección) y 630 nm (longitud de onda de referencia) utilizando un lector de microplacas. La tasa relativa de proliferación se calculó utilizando el tiempo de 0 h como línea base.
Detección de apoptosis (citometría de flujo): La apoptosis se evaluó mediante análisis con el ensayo de apoptosis con anexina V-fluoresceína isotiocianato (FITC)/yoduro de propidio (PI). Las células se transfectaron con los plásmidos adecuados y luego se recolectaron tras la tripsinización. La tasa de apoptosis se determinó por citometría de flujo.
Ensayo de factores inflamatorios (ensayo inmunoenzimático tipo ELISA [ELISA]): Las células HFLS-RA se sembraron en placas de 24 pocillos y se transfectaron con el mimético de miR-488-3p, el inhibidor de miR-488-3p o sus controles negativos correspondientes durante 48 h. Las concentraciones de interleucina-6 (IL-6), factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) e interleucina-1β (IL-1β) en los sobrenadantes del cultivo celular se cuantificaron mediante kits de ELISA.
Validación del blanco
Predicción del blanco: Se predijo que ROCK1 era un blanco downstream de miR-488-3p utilizando la base de datos TargetScan26. También se identificaron los sitios de unión predichos entre miR-488-3p y la región no traducida 3′ (3′UTR) de ROCK1.
Ensayo de gen reportero Dual-Luciferasa: La región 3′UTR de tipo silvestre o mutante de ROCK1 se clonó en el plásmido pGL3. Los sitios de unión predichos y los sitios mutantes se muestran en la Figura 4. Las células HEK-293T se co-transfectaron con el mimético o el inhibidor de miR-488-3p junto con los vectores construidos27. La actividad de luciferasa se midió 48 h después de la transfección con el mimético o el inhibidor de miR-488-3p.
Inmunoprecipitación de ARN (RIP): Las células HFLS-RA se incubaron con un anticuerpo anti-Argonauta 2 (Ago2) (RRID: AB_2882071, dilución 1:200) o con un anticuerpo de control inmunoglobulina G (IgG) (RRID: AB_2819160, dilución 1:5000), seguido de la extracción de ARN y PCR cuantitativa (qPCR) para enriquecer el ARNm de ROCK1 según se describió anteriormente.
Análisis estadístico
El estudio se analizó estadísticamente utilizando SPSS 23.0 (RRID: SCR_002865) y GraphPad Prism 9.0 (RRID: SCR_002798). Los datos de medición se expresaron como media ± desviación estándar (DE). Todos los experimentos se realizaron con tres réplicas biológicas, y cada réplica biológica se analizó por triplicado. Los datos brutos se han adjuntado en el material suplementario. Los datos se evaluaron mediante una gráfica de probabilidad normal (P-P) antes de las pruebas estadísticas paramétricas. Se utilizó la prueba t para muestras independientes para comparar las variables continuas basales (por ejemplo, edad, índice de masa corporal [IMC], etc.) y la prueba de chi-cuadrado para las variables categóricas (por ejemplo, sexo, etc.). Los niveles de expresión génica se compararon mediante la prueba t para muestras independientes. Los cambios en la proliferación celular en diferentes puntos temporales se analizaron mediante un análisis de varianza (ANOVA) de medidas repetidas, mientras que se utilizó un ANOVA de un solo factor para comparar las tasas de apoptosis determinadas por citometría de flujo. El análisis de correlación se realizó utilizando el coeficiente de Spearman (para variables que no cumplían con la distribución normal) y el coeficiente de Pearson (para variables que cumplían con la distribución normal). El rendimiento diagnóstico se evaluó mediante el análisis de la curva característica de operación del receptor (ROC). El valor óptimo de corte, la sensibilidad y la especificidad se determinaron utilizando el índice de Youden máximo. Todas las pruebas estadísticas fueron bilaterales, y se consideró estadísticamente significativo un valor de p < 0,05.
Resultados
Características básicas de los participantes del estudio
Este estudio incluyó 125 controles sanos, 130 pacientes con OA y 135 pacientes con RA para análisis sistemático (Tabla 1). No hubo diferencias significativas en las características basales de los tres grupos en cuanto a edad (p = 0.191), proporción de sexos (p = 0.203) y IMC (p = 0.562), lo que aseguró la comparabilidad de la población estudiada. En cuanto a las características de la enfermedad, la VSG (82,63 ± 40,32 frente a 18,39 ± 6,38 mm/h, p < 0,001) y los niveles de PCR (56,33 ± 38,07 frente a 10,54 ± 4,98 mg/L, p < 0,001) en el grupo con RA fueron significativamente más altos que en el grupo con OA, lo que refleja el nivel de inflamación sistémica. Mientras tanto, el FR, un marcador serológico asociado con la RA, fue positivo en el 70,37 % (95/135), con una concentración sérica significativamente mayor (144,13 ± 81,05 frente a 5,10 ± 1,37 UI/mL, p < 0,001); y la tasa de positividad de anti-CCP en pacientes con RA fue del 56,30 % (76/135), con una puntuación DAS28 de 4,12 ± 1,36.
Características de expresión y valor diagnóstico de miR-488-3p en pacientes con AR
Los niveles de expresión sérica de miR-488-3p estuvieron significativamente regulados a la baja en pacientes con AR en comparación con pacientes con OA y controles sanos (p < 0,0001, Figura 1A). El análisis de la curva ROC mostró que miR-488-3p tenía una alta precisión diagnóstica para distinguir la AR de la OA y de los controles sanos: al distinguir la AR de los controles sanos, presentó un valor de AUC de 0,931 (IC 95 %: 0,896–0,967), una sensibilidad del 96,15 % (IC 95 %: 91,31 %–98,35 %) y una especificidad del 80,95 % (IC 95 %: 73,22 %–86,85 %, p < 0,001, Figura 1B); y al distinguir la AR de los pacientes con OA, el valor de AUC fue de 0,800 (IC 95 %: 0,747–0,854), con una sensibilidad del 85,93 % (IC 95 %: 79,06 %–90,80 %) y una especificidad del 66,15 % (IC 95 %: 57,66 %–73,72 %, p < 0,001, Figura 1C). El análisis de regresión logística multivariable identificó a miR-488-3p como un factor independiente asociado al riesgo de AR (OR = 0,166, IC 95 %: 0,097–0,284; Tabla 2).
Análisis de correlación de miR-488-3p con indicadores clínicos de AR
Los niveles de expresión de miR-488-3p en suero mostraron una correlación negativa significativa con indicadores clínicos clave de la AR, incluyendo VSG, PCR, FR y DAS28 (todo con p < 0,001; Tabla 3). Específicamente, miR-488-3p presentó correlación negativa con la VSG (r = −0,718), la PCR (r = −0,726), el FR (r = −0,805) y la puntuación del DAS28 (r = −0,836) (Tabla 3).
La sobreexpresión de miR-488-3p inhibe la proliferación celular y las respuestas inflamatorias, e induce la apoptosis en células HFLS-RA
Para investigar el efecto de miR-488-3p sobre la función de HFLS-RA, modulamos su expresión mediante transfección con análogos e inhibidores. El análisis mediante RT-qPCR confirmó que el nivel de expresión de miR-488-3p fue significativamente mayor en el grupo con análogo de miR-488-3p en comparación con el grupo control (p = 0,0001), mientras que el nivel de expresión en el grupo con inhibidor de miR-488-3p fue significativamente menor (p = 0,0003, Figura 2A). El ensayo CCK-8 mostró que la sobreexpresión de miR-488-3p inhibió la proliferación celular, que fue significativamente menor que la del grupo control a las 24 h, 48 h y 72 h (p = 0,0208, p < 0,0001, p = 0,0036), y que la inhibición de la expresión de miR-488-3p aumentó significativamente la proliferación celular (Figura 2B). La citometría de flujo mostró que la sobreexpresión de miR-488-3p promovió significativamente la apoptosis (p = 0,0033, Figura 2C).
Luego realizamos un ELISA para investigar el efecto del aumento de la expresión de miR-488-3p sobre los niveles de citocinas inflamatorias. Los resultados mostraron que cuando se sobreexpresaba miR-488-3p, los niveles de citocinas inflamatorias (IL-6, TNF-α e IL-1β) disminuían significativamente (p < 0,0001, Figura 3A-C), mientras que la inhibición de la expresión de miR-488-3p producía el efecto opuesto. Estos efectos reguladores significativos se verificaron en los tres experimentos biológicos independientes y los controles negativos no mostraron cambios significativos (p > 0,05).
MiR-488-3p regula la expresión de las moléculas ROCK1
Para elucidar los mecanismos moleculares subyacentes al papel de miR-488-3p en la progresión de la enfermedad de AR, exploramos los blancos downstream de miR-488-3p. Los análisis bioinformáticos mostraron que se predijo que miR-488-3p se une a la región de la UTR 3' de ROCK1 (Figura 4A). El ensayo de luciferasa dual confirmó que la actividad luciferasa se redujo significativamente cuando la UTR 3' de tipo silvestre de ROCK1 se co-transfectó con análogos de miR-488-3p (p < 0,0001), y la actividad luciferasa se reguló significativamente hacia arriba cuando se inhibió la expresión de miR-488-3p (p < 0,0001); mientras que no hubo un cambio significativo en este efecto regulador tras la mutación del sitio de unión (Figura 4B). Experimentos de RIP verificaron además esta relación reguladora, mostrando que el nivel de expresión del ARNm de ROCK1 se elevó significativamente en los complejos enriquecidos con anticuerpo Ago2 en comparación con los controles de IgG (p < 0,0001, Figura 4C).
Además, en muestras clínicas, ROCK1 mostró un patrón de expresión opuesto al de miR-488-3p, donde se observó una regulación positiva significativa de ROCK1 en comparación con pacientes con OA y controles sanos (Figura 4D). En células HFLS-RA, la RT-qPCR reveló que la sobreexpresión de miR-488-3p provocó una disminución significativa en la expresión de ROCK1 (p = 0.0093), mientras que la inhibición de miR-488-3p aumentó significativamente la expresión de ROCK1 (p = 0.0003, Figura 4E).
ROCK1 media los efectos reguladores de miR-488-3p en células HFLS-RA
En células HFLS-RA, la supresión de la expresión de ROCK1 mediante la sobreexpresión de miR-488-3p se revirtió mediante la transfección con vectores de sobreexpresión de ROCK1 (Figura 5A). De manera similar, el efecto inhibitorio de la sobreexpresión de miR-488-3p sobre la proliferación celular se atenuó por la sobreexpresión de ROCK1 (Figura 5B). Además, la sobreexpresión de ROCK1 también revirtió el aumento de la apoptosis inducida por miR-488-3p (Figura 5C) y restableció los niveles de citocinas inflamatorias que habían sido suprimidos por la sobreexpresión de miR-488-3p (Figura 5D).
Figura 1. Niveles de expresión y rendimiento diagnóstico de miR-488-3p en pacientes con artritis reumatoide (AR), osteoartritis (OA) y controles sanos. (A) Comparación de los niveles de expresión relativos de miR-488-3p en pacientes con AR, pacientes con OA y controles sanos. (B) Análisis de la curva característica de operación del receptor (ROC) de miR-488-3p para diferenciar AR de controles sanos. (C) Análisis de la curva ROC de miR-488-3p para diferenciar AR de pacientes con OA. AUC, área bajo la curva; CI, intervalo de confianza. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Efectos funcionales de miR-488-3p en células HFLS-RA. (A) Expresión relativa de miR-488-3p en células HFLS-RA transfectadas determinada mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (RT-qPCR). (B) Efectos de la sobreexpresión y la inhibición de miR-488-3p sobre la proliferación celular. (C) Efectos de la sobreexpresión y la inhibición de miR-488-3p sobre la apoptosis. Los datos se presentan como media ± DE. Todas las mediciones se realizaron con tres réplicas biológicas, cada una con tres réplicas técnicas. p < 0,05 indica una diferencia estadísticamente significativa entre los grupos indicados. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 3. Efecto de miR-488-3p sobre la secreción de citocinas inflamatorias. (A) Interleucina-6 (IL-6). (B) Factor de necrosis tumoral-α (TNF-α). (C) Interleucina-1β (IL-1β). Las concentraciones de citocinas se midieron mediante ensayo inmunoenzimático (ELISA). Los datos se presentan como media ± DE. Todas las mediciones se realizaron con tres réplicas biológicas, cada una con tres réplicas técnicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Validación del mecanismo molecular subyacente a la regulación dirigida de ROCK1 por miR-488-3p. (A) Sitio de unión predicho de miR-488-3p dentro de la región no traducida 3′ (3′UTR) de ROCK1. (B) Ensayo de luciferasa dual que demuestra la interacción entre miR-488-3p y la 3′UTR de ROCK1 de tipo silvestre o mutante. (C) Ensayo de inmunoprecipitación de ARN (RIP) que muestra el enriquecimiento de ARN mensajero (ARNm) de ROCK1 en complejos enriquecidos con anticuerpo contra Argonauta 2 (Ago2). (D) Niveles relativos de expresión de ROCK1 en pacientes con AR, pacientes con OA y controles sanos. (E) Expresión relativa de ROCK1 en células HFLS-RA transfectadas determinada mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa por transcripción reversa (RT-qPCR). Los datos se presentan como media ± DE. Todas las mediciones se realizaron con tres réplicas biológicas, cada una con tres réplicas técnicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Participación de ROCK1 en la regulación de células HFLS-RA por miR-488-3p. (A) Regulación de la expresión de ROCK1 en células HFLS-RA tras la transfección celular. (B) Efectos de la sobreexpresión de ROCK1 sobre la proliferación celular en condiciones de sobreexpresión de miR-488-3p. (C) Efectos de la sobreexpresión de ROCK1 sobre la apoptosis en condiciones de sobreexpresión de miR-488-3p. (D) Efectos de la sobreexpresión de ROCK1 sobre la producción de citoquinas inflamatorias en condiciones de sobreexpresión de miR-488-3p. Los datos se presentan como media ± DE. Todas las mediciones se realizaron con tres réplicas biológicas, cada una con tres réplicas técnicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Variable | Control (n = 125) | OA (n = 130) | RA (n = 135) | p-valor |
| Edad (años) | 55,10 ± 9,30 | 57,21 ± 10,27 | 55,22 ± 11,61 | 0,191 |
| Sexo (hombre/mujer) | 74/51 | 63/67 | 69/66 | 0,203 |
| IMC (kg/m2) | 22,79 ± 1,73 | 22,98 ± 1,98 | 23,04 ± 2,05 | 0,562 |
| Duración de la enfermedad (años) | - | 7,96 ± 4,00 | 8,03 ± 3,83 | 0,882 |
| Anti-CCP positivo (n/%) | - | - | 76 (56,30) | - |
| VS (mm/h) | 18,39 ± 6,38 | 82,63 ± 40,32 | <0,001 | |
| PCR (mg/L) | 10,54 ± 4,98 | 56,33 ± 38,07 | <0,001 | |
| FR positivo | - | - | 95 (70,37) | |
| FR (IU/mL) | - | 5,10 ± 1,37 | 144,13 ± 81,05 | <0,001 |
| DAS28 | - | - | 4,12 ± 1,36 | - |
Tabla 1: Características basales de los participantes del estudio. Los tres grupos de estudio fueron comparables con respecto a las características demográficas. Los pacientes con AR presentaron marcadores inflamatorios y niveles de FR elevados.
| Variable | OR | 95%CI | p-valor |
| Edad (años) | 1.411 | 0.822–2.422 | 0.211 |
| Sexo (masculino/femenino) | 1.209 | 0.707–2.067 | 0.489 |
| IMC (kg/m2) | 1.336 | 0.778–2.295 | 0.293 |
| Duración de la enfermedad (años) | 1.13 | 0.663–1.929 | 0.653 |
| MiR-483-3p | 0.166 | 0.097–0.284 | <0.001 |
Tabla 2: Factores independientes derivados de la regresión logística multivariable asociados con la progresión de la osteoartritis a artritis reumatoide. Se identificó que el miR-488-3p se asocia con el riesgo de desarrollo de AR en pacientes con OA.
| Elementos | MiR-488-3p (artritis reumatoide) | p-valor |
| Correlación (r) | ||
| VES (mm/h) | -0.718 | <0.001 |
| PCR (mg/L) | -0.726 | <0.001 |
| FR (IU/mL) | -0.805 | <0.001 |
| DAS28 | -0.836 | <0.001 |
Tabla 3: Correlaciones entre miR-488-3p y características clínico-patológicas de pacientes con AR. miR-488-3p presentó una correlación negativa significativa con la VSG, PCR, FR y puntuación DAS28 en pacientes con AR.
Tabla suplementaria 1. Información de las secuencias para la transfección celular y el ensayo de PCR. Se resume la información sobre las secuencias de los cebadores y los reactivos de transfección utilizados en el estudio.Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discusión
Como enfatizaron Smolen et al1 en las últimas directrices para el diagnóstico y tratamiento de la AR, el desarrollo de nuevos biomarcadores tiene un valor clínico significativo. En este estudio, confirmamos que el miR-488-3p sérico estaba significativamente regulado a la baja en pacientes con AR y mostró un rendimiento diagnóstico prometedor, con sensibilidad y especificidad relativamente satisfactorias. El diagnóstico temprano de la AR siempre ha sido una dificultad clínica, y los biomarcadores existentes no son suficientemente sensibles para el diagnóstico de la AR, mientras que el potencial diagnóstico significativo del miR-488-3p podría llenar este vacío, especialmente para la identificación de pacientes con AR seronegativa. En comparación con individuos sanos, los pacientes con AR presentaron una inflamación sistémica más pronunciada. Mientras que los pacientes con OA tienen predominantemente un trastorno articular degenerativo local, con frecuencia se observa una inflamación sistémica de bajo grado. Por lo tanto, la eficiencia discriminativa del miR-488-3p es mucho mayor cuando se compara con individuos sanos que cuando se compara con pacientes con OA. El rendimiento diagnóstico del miR-488-3p no se comparó directamente con el de los biomarcadores clínicos establecidos. Los pacientes incluidos en este estudio fueron diagnosticados según el estándar clínico oro actual para la AR, que incorpora biomarcadores establecidos como los anticuerpos anti-CCP, FR, VSG y PCR. Se observaron diferencias significativas en estos marcadores entre pacientes con OA y AR (Tabla 1). Por lo tanto, esta cohorte no fue adecuada para comparar directamente el rendimiento diagnóstico del miR-488-3p con estos biomarcadores establecidos. Tales comparaciones requieren una cohorte de validación independiente.
Además, se encontró que los niveles de expresión de miR-488-3p correlacionan significativamente de forma negativa con diversos indicadores clínicos de la AR, incluyendo marcadores inflamatorios sistémicos (ESR, PCR)28 y autoanticuerpos (RF)6. De particular relevancia clínica, miR-488-3p mostró una fuerte correlación negativa con el Índice de Actividad de la Enfermedad (DAS28). El DAS28 es un índice compuesto que refleja la actividad de la enfermedad basado en la inflamación articular, sensibilidad, hinchazón y el estado clínico del paciente. Por lo tanto, estos hallazgos sugieren que miR-488-3p podría servir como un biomarcador potencial de la actividad de la enfermedad en la AR. Asimismo, respaldan su papel regulador en la patogénesis de la AR y podrían influir en la progresión de la enfermedad al inhibir vías de señalización inflamatorias o respuestas autoinmunes29.
En experimentos funcionales, descubrimos que el miR-488-3p suprimió la proliferación y promovió la apoptosis de células HFLS-RA de pacientes con AR, y redujo significativamente la producción de citocinas inflamatorias (IL-6, TNF-α e IL-1β). Las células HFLS-RA desempeñan un papel clave en el proceso patológico de la AR30, y su proliferación anómala y crecimiento invasivo pueden provocar hiperplasia sinovial y destrucción articular, mientras que la sobreproducción de factores inflamatorios agrava aún más las respuestas inflamatorias locales y sistémicas31. Por lo tanto, la regulación de la función de las células HFLS-RA por el miR-488-3p podría inhibir directamente la invasión sinovial y la erosión ósea en la AR, proporcionando una base teórica para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas dirigidas. Estudios previos han demostrado que otras miARNs, como el miR-155, pueden afectar la progresión de la AR mediante la regulación de la función de los sinoviocitos19, lo cual respalda aún más nuestros hallazgos.
Estudios mecanicistas demostraron que miR-488-3p puede dirigirse directamente a ROCK1 e inhibir su expresión mediante la unión a su región 3'UTR. ROCK1 es una molécula efectora clave de la vía de señalización Rho/ROCK, que participa en la reorganización del citoesqueleto, la respuesta inflamatoria y la fibrosis32. Estudios previos mostraron que ROCK1 se expresa altamente en sinoviocitos de AR y promueve su migración e invasión33. Como se esperaba, la sobreexpresión de ROCK1 revirtió significativamente los efectos de miR-488-3p en células HFLS-RA, lo que indica su participación en el papel regulador de miR-488-3p en la progresión de la AR.
Sin embargo, aún queda mucho trabajo por hacer en investigaciones futuras. La expresión de miR-488-3p en las muestras clínicas se evaluó mediante RT-qPCR utilizando U6 como referencia interna. Estudios previos han reportado hallazgos contradictorios sobre la estabilidad de U6, especialmente en muestras circulantes, como el suero. Aunque en el presente estudio se realizaron experimentos preliminares para garantizar la estabilidad de U6, la posible volatilidad de esta sigue siendo una limitación, lo que aumenta el riesgo de diagnóstico erróneo. Se requiere una validación adicional utilizando genes de referencia interna más estables. Por otro lado, la evaluación clínica de miR-488-3p se basó en una cohorte de un solo centro, sin validación externa. El tamaño de la muestra fue relativamente pequeño, limitado a la escala hospitalaria. Además, hubo falta de seguimiento longitudinal para evaluar el valor pronóstico de miR-488-3p. Estas limitaciones deben abordarse en estudios futuros. Asimismo, algunos estudios indican que in vivo la administración de miARN sigue siendo un desafío importante para la traducción clínica34. Estudios futuros podrían validar el potencial terapéutico de miR-488-3p in vivo mediante la generación de ratones knockout condicionales o el uso de sistemas de administración dirigida, como nanocarriers35.
En conclusión, este estudio reveló el valor potencial de miR-488-3p en el diagnóstico y como diana terapéutica en la artritis reumatoide (RA). MiR-488-3p mostró un alto rendimiento diagnóstico e inhibió la proliferación y las respuestas inflamatorias de las células HFLS-RA, al tiempo que promovió la apoptosis. Esto sugiere que podría representar una diana prometedora para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas contra la RA. Las investigaciones futuras deberían centrarse en 1) validar la estabilidad diagnóstica de miR-488-3p en grandes cohortes multicéntricas, 2) explorar sus efectos sinérgicos con agentes terapéuticos existentes, como inhibidores de JAK o biológicos28, y 3) optimizar los sistemas de administración de miARN para mejorar su viabilidad de traslación clínica36.
DISPONIBILIDAD DE LOS DATOS:
Los datos brutos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en los materiales suplementarios presentados junto con este manuscrito.
Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen conflictos de interés.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Kit de detección de apoptosis por anexina V-FITC | BD Bioscience | 556547 | apoptosis celular |
| anticuerpo anti-Ago2 | Proteintech | 66720-1-Ig | Inmunoprecipitación de ARN |
| Solución CCK-8 | Dojindo | CK04 | proliferación celular |
| Medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) | Thermo Fisher | 121000146 | cultivo celular |
| Suero bovino fetal | Thermo Fisher | 10437028 | cultivo celular |
| Citómetro de flujo | BD Bioscience | FACSCalibur | apoptosis celular |
| Kit ELISA de anticuerpo anti-CCP humano | Cusabio | CSB-E09077h | detección de anti-CCP |
| Kit ELISA de RF-IgA humano | Feien Biotechnology | EH4270 | detección de RF |
| Fibroblastos sinoviales tipo fibroblasto de artritis reumatoide humano (HFLS-RA) | Cell Applications | HFLS-RA-200 | validación in vitro de la función de miR-488-3p |
| anticuerpo control IgG | Abcam | ab205718 | Inmunoprecipitación de ARN |
| Kit ELISA de interleucina-1β (IL-1β) | R&D Systems | DY201-05 | concentración celular de IL-1β |
| Kit ELISA de interleucina-6 (IL-6) | R&D Systems | D6050B | concentración celular de IL-6 |
| Reactivo de transfección con liposomas 3000 | Ingenuity Life Technologies | L3000015 | transfección celular |
| Lector de microplacas | BioTek | ELx808 | ensayo ELISA |
| Kit Mir-XTM de síntesis de la primera cadena de microARN | Nihonbao Bioengineering Co., Ltd. | 638313 | transcripción inversa |
| Medio Opti-MEM | Ingenuity Life Technologies, Inc | 31985070 | transfección celular |
| pcDNA 3.1 | Invitrogen | V790-20 | sobreexpresión de ROCK1 |
| Penicilina-estreptomicina | Thermo Fisher | 15140122 | cultivo celular |
| Sistema de laboratorio Phadia 250 | Thermo Fisher | Phadia 250 | análisis de sangre |
| Kit de transcripción inversa PrimeScriptTM | Nihonbao Bioengineering Co., Ltd. | RR037A | transcripción inversa |
| Yoduro de propidio (PI)/ribonucleasa (RNasa) | BD Bioscience | 550825 | apoptosis celular |
| Sistema QuantStudio 5 | Applied Biosystems, Inc. | A28138 | ensayo de PCR |
| Reactivo RNAiso Plus | Nihonbao Bioengineering Co., Ltd. | 9108 | aislamiento de ARN |
| Mezcla previa SYBR Green Ex Taq | Nippon Poh Bio-Engineering Co., Ltd. | RR420A | amplificación por PCR |
| Base de datos TargetScan | TargetScan | N/A | predicción de sitios de unión, (https://www.targetscan.org/) |
| Tina-quant proteína C reactiva IV | Roche Diagnostics | 7876033190 | detección de PCR |
| Kit ELISA de factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) | R&D Systems | DY210-05 | concentración celular de TNF-α |
Referencias
- Smolen JS, et al. Rheumatoid arthritis. Nat Rev Dis Primers. 2018;4:18001.
- Kook HY, et al. Serum miR-214 as a novel biomarker for ankylosing spondylitis. Int J Rheum Dis. 2019;22(7):1196-201.
- Alamanos Y, Voulgari PV, Drosos AA. Incidence and prevalence of rheumatoid arthritis, based on the 1987 American College of Rheumatology criteria: a systematic review. Semin Arthritis Rheum. 2006;36(3):182-8.
- van der Linden MPM, et al. Long-term impact of delay in assessment of patients with early arthritis. Arthritis Rheum. 2010;62(12):3537-46.
- Anderson J, et al. Rheumatoid arthritis disease activity measures: American College of Rheumatology recommendations for use in clinical practice. Arthritis Care Res (Hoboken). 2012;64(5):640-7.
- Aletaha D, et al. 2010 rheumatoid arthritis classification criteria: an American College of Rheumatology/European League Against Rheumatism collaborative initiative. Arthritis Rheum. 2010;62(9):2569-81.
- Yang J, et al. MicroRNA-488: a miRNA with diverse roles and clinical applications in cancer and other human diseases. Biomed Pharmacother. 2023;165:115115.
- Molendijk M, Hazes JMW, Lubberts E. From patients with arthralgia, pre-RA and recently diagnosed RA: what is the current status of understanding RA pathogenesis? RMD Open. 2018;4(1):e000256.
- van Venrooij WJ, van Beers JJBC, Pruijn GJM. Anti-CCP antibodies: the past, the present and the future. Nat Rev Rheumatol. 2011;7(7):391-8.
- Szodoray P, et al. Anti-citrullinated protein/peptide autoantibodies in association with genetic and environmental factors as indicators of disease outcome in rheumatoid arthritis. Autoimmun Rev. 2010;9(3):140-3.
- Filer A, et al. Utility of ultrasound joint counts in the prediction of rheumatoid arthritis in patients with very early synovitis. Ann Rheum Dis. 2011;70(3):500-7.
- Zuo C, Fan P, Yang Y, Hu C. MiR-488-3p facilitates wound healing through CYP1B1-mediated Wnt/β-catenin signaling pathway by targeting MeCP2. J Diabetes Investig. 2024;15(2):145-58.
- Mendell JT, Olson EN. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 2012;148(6):1172-87.
- Cai Z, Poulos RC, Liu J, Zhong Q. Machine learning for multi-omics data integration in cancer. iScience. 2022;25(2):103798.
- Fabian MR, Sonenberg N. The mechanics of miRNA-mediated gene silencing: a look under the hood of miRISC. Nat Struct Mol Biol. 2012;19(6):586-93.
- Duroux-Richard I, et al. Circulating miRNA-125b is a potential biomarker predicting response to rituximab in rheumatoid arthritis. Mediators Inflamm. 2014;2014:342524.
- Zakeri Z, et al. MicroRNA and exosome: key players in rheumatoid arthritis. J Cell Biochem. 2019;120(7):10930-44.
- Pauley KM, et al. Upregulated miR-146a expression in peripheral blood mononuclear cells from rheumatoid arthritis patients. Arthritis Res Ther. 2008;10(4):R101.
- Kurowska-Stolarska M, et al. MicroRNA-155 as a proinflammatory regulator in clinical and experimental arthritis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011;108(27):11193-8.
- Pers YM, et al. miR-155 contributes to the immunoregulatory function of human mesenchymal stem cells. Front Immunol. 2021;12:624024.
- Fu Q, et al. miR-488-3p alleviates neuropathic pain by regulating target gene ROCK1. Acta Neurobiol Exp (Wars). 2023;83(3):271-9.
- Xue W, et al. PVT1 regulates the malignant behaviors of human glioma cells by targeting miR-190a-5p and miR-488-3p. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 2018;1864(5 Pt A):1783-94.
- Muiños-Gimeno M, et al. Human microRNAs miR-22, miR-138-2, miR-148a, and miR-488 are associated with panic disorder and regulate several anxiety candidate genes and related pathways. Biol Psychiatry. 2011;69(6):526-33.
- Le TD, Zhang J, Liu L, Li J. Computational methods for identifying miRNA sponge interactions. Brief Bioinform. 2017;18(4):577-90.
- Scanzello CR, Goldring SR. The role of synovitis in osteoarthritis pathogenesis. Bone. 2012;51(2):249-57.
- McGeary SE, et al. The biochemical basis of microRNA targeting efficacy. Science. 2019;366(6472):eaav1741.
- Liu X, et al. Impaired AGO2/miR-185-3p/NRP1 axis promotes colorectal cancer metastasis. Cell Death Dis. 2021;12(4):390.
- Smolen JS, Aletaha D, McInnes IB. Rheumatoid arthritis. Lancet. 2016;388(10055):2023-38.
- O'Connell RM, Rao DS, Baltimore D. microRNA regulation of inflammatory responses. Annu Rev Immunol. 2012;30:295-312.
- Bottini N, Firestein GS. Duality of fibroblast-like synoviocytes in RA: passive responders and imprinted aggressors. Nat Rev Rheumatol. 2013;9(1):24-33.
- Firestein GS, McInnes IB. Immunopathogenesis of rheumatoid arthritis. Immunity. 2017;46(2):183-96.
- Amano M, Nakayama M, Kaibuchi K. Rho-kinase/ROCK: a key regulator of the cytoskeleton and cell polarity. Cytoskeleton (Hoboken). 2010;67(9):545-54.
- Peng H, et al. ROCK1 induces endothelial-to-mesenchymal transition in glomeruli to aggravate albuminuria in diabetic nephropathy. Sci Rep. 2016;6:20304.
- van der Meel R, et al. Smart cancer nanomedicine. Nat Nanotechnol. 2019;14(11):1007-17.
- Yin H, et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nat Rev Genet. 2014;15(8):541-55.
- Setten RL, Rossi JJ, Han SP. The current state and future directions of RNAi-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2019;18(6):421-46.