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Artículo de investigación
El miR-488-3p podría servir como un nuevo marcador diagnóstico no invasivo para la AR. El miR-488-3p modula la función biológica de los sinoviocitos a través de ROCK1. Mostró una correlación negativa significativa con la gravedad de la enfermedad en pacientes con AR.
El diagnóstico de la artritis reumatoide (AR) sigue siendo un desafío debido a las limitaciones de los biomarcadores existentes. El objetivo del estudio fue investigar el potencial de miR-488-3p en suero como biomarcador para la AR y revelar su posible mecanismo de acción. El estudio incluyó a 135 pacientes con AR, 130 pacientes con osteoartritis (OA) y 125 controles sanos. Los niveles de expresión de miR-488-3p se analizaron mediante RT-qPCR. El mecanismo de acción se evaluó mediante pruebas funcionales (CCK-8, citometría de flujo, ELISA) y experimentos de validación de dianas (ensayo del gen reportero luciferasa, RIP). Los niveles séricos de expresión de miR-488-3p fueron significativamente más bajos en pacientes con AR que en pacientes con osteoartritis (OA) y controles sanos (p < 0,001). El análisis mediante curva ROC mostró que miR-488-3p presentaba una alta precisión diagnóstica para distinguir a los pacientes con AR de los controles sanos y de los pacientes con OA. miR-488-3p mostró una correlación negativa con la velocidad de sedimentación globular (VSG), la proteína C reactiva (PCR), el factor reumatoide (FR) y los puntajes DAS28. La validación funcional reveló que la sobreexpresión de miR-488-3p inhibió la proliferación y la respuesta inflamatoria de los sinoviocitos, mientras que indujo la apoptosis. Los estudios mecanicistas mostraron que miR-488-3p puede dirigirse directamente a la proteína quinasa 1 asociada a Rho con dominio en espiral (ROCK1), que media sus efectos protectores. El miR-488-3p en suero es una prometedora nueva marca diagnóstica no invasiva para la AR y protege a los sinoviocitos del daño.
La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune común caracterizada por inflamación sinovial, erosión articular y destrucción1,2. La prevalencia mundial de la AR es de aproximadamente 0,5%–1%3, lo que afecta gravemente la calidad de vida y la capacidad laboral de los pacientes. La enfermedad tiene un inicio insidioso, y los síntomas iniciales suelen ser atípicos y fácilmente mal diagnosticados o pasados por alto4. A medida que la enfermedad progresa, puede provocar deformidad articular, pérdida de función e incluso aumentar el riesgo de complicaciones como enfermedades cardiovasculares5, lo que supone una carga considerable para los pacientes, sus familias y los sistemas de salud.
Actualmente, se requiere una combinación de síntomas clínicos, signos, pruebas de laboratorio y evaluación por imágenes para el diagnóstico de la AR6. Los indicadores de laboratorio comúnmente utilizados incluyen la velocidad de sedimentación globular (VSG) y la proteína C reactiva (PCR), que son marcadores inespecíficos de inflamación sistémica, así como el factor reumatoide (FR) y los anticuerpos anti-péptido citrulinado cíclico (anti-CCP), que son biomarcadores serológicos importantes para la AR7,8. Sin embargo, estos biomarcadores tradicionales tienen limitaciones: el FR puede ser positivo en algunas personas sanas y en pacientes con otras enfermedades autoinmunes (tasa de falsos positivos de aproximadamente el 5 %); el anti-CCP, aunque altamente específico (>95 %), tiene una sensibilidad limitada en las etapas iniciales de la enfermedad (alrededor del 60–70 %)4,9, y algunos pacientes con AR permanecen seronegativos10. Por lo tanto, es importante encontrar biomarcadores más sensibles y específicos para el diagnóstico temprano, el monitoreo de la enfermedad y la evaluación del pronóstico de la AR11.
Los microARN (miARN) son un grupo de moléculas de ARN reguladoras no codificantes endógenas con una longitud aproximada de 22–25 bases12,13. Se ha descubierto que los miARN actúan como reguladores clave en el desarrollo de diversas enfermedades, y su expresión aberrante está estrechamente relacionada con la patogénesis de enfermedades13,14,15, lo que convierte a los miARN en biomarcadores prometedores para el diagnóstico de enfermedades y la monitorización terapéutica. En los últimos años, el papel de los miARN en la artritis reumatoide (AR) ha recibido una atención creciente16. Estudios han demostrado que múltiples miARN están asociados con una expresión desregulada (por ejemplo, miR-146a, miR-155, etc.) en suero, tejidos sinoviales y células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes con AR17,18,19. Estos miARN contribuyen a la patogénesis de la AR mediante la regulación de la producción de citocinas inflamatorias, la promoción de la proliferación e invasión de células sinoviales y la influencia en la diferenciación de osteoclastos20. Entre ellos, el miR-488 se localiza en la región 1q25.2 del cromosoma humano21, y estudios previos han confirmado sus efectos neuroprotectores: desempeña un papel regulador en la progresión de gliomas22 y neuroblastomas23, y, notablemente, el miR-488-3p promueve la apoptosis de condrocitos osteoarticulares en la osteoartritis (OA)24. Aunque la OA y la AR son enfermedades articulares diferentes, comparten mecanismos comunes en los procesos patológicos de inflamación sinovial y destrucción del cartílago25. Planteamos la hipótesis de que el miR-488-3p podría desempeñar un papel en la AR mediante la regulación de vías diana similares. Sin embargo, el papel específico y los mecanismos potenciales del miR-488-3p en la AR no han sido elucidados.
El estudio investigó los cambios en los niveles de expresión sérica de miR-488-3p en pacientes con AR y su relación con la actividad de la enfermedad y los indicadores clínicos, con el objetivo de evaluar su valor potencial como marcador diagnóstico no invasivo para la AR. Este estudio aporta una perspectiva novedosa sobre el cribado temprano y la predicción de la progresión de la enfermedad en la AR, mejorando así el pronóstico de los pacientes con esta enfermedad.
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El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Hefei BOE (número de aprobación 2021–1), y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes antes de su inscripción.
Pacientes y especímenes
Este estudio reclutó a 135 pacientes con AR (diagnosticados según los criterios de clasificación ACR/EULAR 2010) del Departamento de Reumatología e Inmunología del Hospital Hefei BOE, 130 pacientes con OA del Departamento de Ortopedia (diagnosticados según los criterios diagnósticos de OA de la Asociación Médica China 2018) y 125 controles sanos apareados por edad y sexo del centro de exámenes médicos del mismo hospital. Los participantes tenían entre 30 y 80 años. Se confirmó que los controles sanos no presentaban enfermedades autoinmunitarias, trastornos articulares ni infecciones agudas mediante una revisión exhaustiva de la historia clínica, examen físico y pruebas de laboratorio. Se excluyeron a los participantes si tenían enfermedades autoinmunitarias concomitantes, antecedentes de infección o trauma en los últimos 3 meses, enfermedad maligna, o si estaban embarazadas o en período de lactancia.
Muestreo y preparación
Se recogió sangre venosa en ayunas de todos los sujetos del estudio. Tras la coagulación a temperatura ambiente durante 30 min, las muestras de suero se aislaron mediante centrifugación a 1500 × g durante 15 min. El suero se almacenó a -80°C hasta su posterior análisis.
Detección de marcadores clínicos y serológicos
Para evaluar de forma integral el estado de la enfermedad y la actividad inflamatoria, se midieron biomarcadores clínicos y serológicos mediante métodos estandarizados de laboratorio clínico. La VSG se midió utilizando el método de Westergren para evaluar la inflamación sistémica inespecífica. La PCR se cuantificó mediante un ensayo inmunoturbidimétrico (valor de referencia normal: <10 mg/L) para evaluar la respuesta inflamatoria de fase aguda. El FR se midió mediante un ensayo inmunoenzimático (ELISA) con un valor de referencia normal de ≤20 UI/mL. Los anticuerpos anti-CCP se midieron mediante un ELISA de segunda generación para proporcionar evidencia serológica para el diagnóstico de la AR.
Líneas celulares y cultivo
Las células de sinoviocitos tipo fibroblasto humanos afectados por AR (HFLS-RA) se cultivaron en medio de Dulbecco modificado (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina. Las células se mantuvieron en una incubadora a 37 °C con 5% de CO₂, y se utilizaron células entre el tercer y sexto pase para todos los experimentos.
Extracción de ARN y RT-PCR cuantitativa en tiempo real
Se extrajo ARN total de muestras de suero utilizando un reactivo de extracción de ARN. Se realizó la transcripción inversa utilizando un kit de síntesis de primera cadena para miARNs y un kit de transcripción inversa para genes diana de ARN mensajero (ARNm) según las instrucciones del fabricante. Se realizó la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) utilizando un sistema de PCR en tiempo real con una mezcla maestra de PCR basada en SYBR Green. El programa de termociclación se estableció en una pre-desnaturalización a 95 °C durante 30 s; seguido de 40 ciclos de amplificación (desnaturalización a 95 °C durante 5 s y hibridación/elongación a 60 °C durante 30 s). Cada muestra se analizó por triplicado. El ARN nuclear pequeño U6 (U6 snRNA) y la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se utilizaron como genes de referencia endógenos para la normalización de miARN y ARNm, respectivamente. Las secuencias de los cebadores se han resumido en la Tabla Suplementaria 1. Los niveles relativos de expresión de miR-488-3p y sus genes diana se calcularon utilizando el método 2−ΔΔCt. También se analizaron los cambios en los niveles de ARNm de los genes diana tras la sobreexpresión o inhibición de miR-488-3p para verificar sus relaciones reguladoras.
Transfección celular
Las células HFLS-RA se sembraron en placas de 6 pocillos con una densidad de 5 × 105 células/pocillo. Las células se transfirieron utilizando un reactivo de transfección basado en liposomas, siguiendo las instrucciones del fabricante. Los grupos de transfección incluyeron grupos de transfección simple y grupos de co-transfección. Los grupos de transfección simple fueron: 1) control—células no transfectadas; 2) control negativo del mimético (NC)—células transfectadas con el control negativo del mimético de miR-488-3p; 3) mimético de miR-488-3p—células transfectadas con el mimético de miR-488-3p; 4) control negativo del inhibidor—células transfectadas con el control negativo del inhibidor de miR-488-3p; 5) inhibidor de miR-488-3p—células transfectadas con el inhibidor de miR-488-3p. Los grupos de co-transfección fueron: 1) mimético de miR-488-3p + control de sobreexpresión (oe-NC)—células co-transfectadas con el mimético de miR-488-3p y el control negativo de los vectores de sobreexpresión de ROCK1; 2) mimético de miR-488-3p + oe-ROCK1—células co-transfectadas con el mimético de miR-488-3p y los vectores de sobreexpresión de ROCK1. Todas las secuencias de transfección se han resumido en la Tabla Suplementaria 1. El vector de sobreexpresión de ROCK1 se construyó clonando la región de la secuencia codificante (CDS) en el plásmido pcDNA 3.1. Las células transfectadas estuvieron disponibles para los experimentos siguientes tras 48 h de transfección celular.
Ensayo de función celular
Ensayo de proliferación celular (Kit de recuento de células-8 [CCK-8]): Las células HFLS-RA transfectadas se inocularon en placas de 96 pocillos a una concentración de 5 × 103 células/pocillo, con tres pocillos replicados por grupo. A las 0, 24, 48 y 72 h posteriores a la transfección, se añadieron 10 µL de solución CCK-8 a cada pocillo, seguido de una incubación a 37 °C durante 2 h. La absorbancia se midió a 450 nm (longitud de onda de detección) y 630 nm (longitud de onda de referencia) utilizando un lector de microplacas. La tasa relativa de proliferación se calculó utilizando el tiempo de 0 h como línea base.
Detección de apoptosis (citometría de flujo): La apoptosis se evaluó mediante análisis con el ensayo de apoptosis con anexina V-fluoresceína isotiocianato (FITC)/yoduro de propidio (PI). Las células se transfectaron con los plásmidos adecuados y luego se recolectaron tras la tripsinización. La tasa de apoptosis se determinó por citometría de flujo.
Ensayo de factores inflamatorios (ensayo inmunoenzimático tipo ELISA [ELISA]): Las células HFLS-RA se sembraron en placas de 24 pocillos y se transfectaron con el mimético de miR-488-3p, el inhibidor de miR-488-3p o sus controles negativos correspondientes durante 48 h. Las concentraciones de interleucina-6 (IL-6), factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) e interleucina-1β (IL-1β) en los sobrenadantes del cultivo celular se cuantificaron mediante kits de ELISA.
Validación del blanco
Predicción del blanco: Se predijo que ROCK1 era un blanco downstream de miR-488-3p utilizando la base de datos TargetScan26. También se identificaron los sitios de unión predichos entre miR-488-3p y la región no traducida 3′ (3′UTR) de ROCK1.
Ensayo de gen reportero Dual-Luciferasa: La región 3′UTR de tipo silvestre o mutante de ROCK1 se clonó en el plásmido pGL3. Los sitios de unión predichos y los sitios mutantes se muestran en la Figura 4. Las células HEK-293T se co-transfectaron con el mimético o el inhibidor de miR-488-3p junto con los vectores construidos27. La actividad de luciferasa se midió 48 h después de la transfección con el mimético o el inhibidor de miR-488-3p.
Inmunoprecipitación de ARN (RIP): Las células HFLS-RA se incubaron con un anticuerpo anti-Argonauta 2 (Ago2) (RRID: AB_2882071, dilución 1:200) o con un anticuerpo de control inmunoglobulina G (IgG) (RRID: AB_2819160, dilución 1:5000), seguido de la extracción de ARN y PCR cuantitativa (qPCR) para enriquecer el ARNm de ROCK1 según se describió anteriormente.
Análisis estadístico
El estudio se analizó estadísticamente utilizando SPSS 23.0 (RRID: SCR_002865) y GraphPad Prism 9.0 (RRID: SCR_002798). Los datos de medición se expresaron como media ± desviación estándar (DE). Todos los experimentos se realizaron con tres réplicas biológicas, y cada réplica biológica se analizó por triplicado. Los datos brutos se han adjuntado en el material suplementario. Los datos se evaluaron mediante una gráfica de probabilidad normal (P-P) antes de las pruebas estadísticas paramétricas. Se utilizó la prueba t para muestras independientes para comparar las variables continuas basales (por ejemplo, edad, índice de masa corporal [IMC], etc.) y la prueba de chi-cuadrado para las variables categóricas (por ejemplo, sexo, etc.). Los niveles de expresión génica se compararon mediante la prueba t para muestras independientes. Los cambios en la proliferación celular en diferentes puntos temporales se analizaron mediante un análisis de varianza (ANOVA) de medidas repetidas, mientras que se utilizó un ANOVA de un solo factor para comparar las tasas de apoptosis determinadas por citometría de flujo. El análisis de correlación se realizó utilizando el coeficiente de Spearman (para variables que no cumplían con la distribución normal) y el coeficiente de Pearson (para variables que cumplían con la distribución normal). El rendimiento diagnóstico se evaluó mediante el análisis de la curva característica de operación del receptor (ROC). El valor óptimo de corte, la sensibilidad y la especificidad se determinaron utilizando el índice de Youden máximo. Todas las pruebas estadísticas fueron bilaterales, y se consideró estadísticamente significativo un valor de p < 0,05.
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Características básicas de los participantes del estudio
Este estudio incluyó 125 controles sanos, 130 pacientes con OA y 135 pacientes con RA para análisis sistemático (Tabla 1). No hubo diferencias significativas en las características basales de los tres grupos en cuanto a edad (p = 0.191), proporción de sexos (p = 0.203) y IMC (p = 0.562), lo que aseguró la comparabilidad de la población estudiada. En cuanto a las características...
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Como enfatizaron Smolen et al1 en las últimas directrices para el diagnóstico y tratamiento de la AR, el desarrollo de nuevos biomarcadores tiene un valor clínico significativo. En este estudio, confirmamos que el miR-488-3p sérico estaba significativamente regulado a la baja en pacientes con AR y mostró un rendimiento diagnóstico prometedor, con sensibilidad y especificidad relativamente satisfactorias. El diagnóstico temprano de la AR siempre ha sido una dificultad clínica, y los biomarcadores e...
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Los autores declaran que no tienen conflictos de interés.
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Kit de detección de apoptosis por anexina V-FITC | BD Bioscience | 556547 | apoptosis celular |
| anticuerpo anti-Ago2 | Proteintech | 66720-1-Ig | Inmunoprecipitación de ARN |
| Solución CCK-8 | Dojindo | CK04 | proliferación celular |
| Medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) | Thermo Fisher | 121000146 | cultivo celular |
| Suero bovino fetal | Thermo Fisher | 10437028 | cultivo celular |
| Citómetro de flujo | BD Bioscience | FACSCalibur | apoptosis celular |
| Kit ELISA de anticuerpo anti-CCP humano | Cusabio | CSB-E09077h | detección de anti-CCP |
| Kit ELISA de RF-IgA humano | Feien Biotechnology | EH4270 | detección de RF |
| Fibroblastos sinoviales tipo fibroblasto de artritis reumatoide humano (HFLS-RA) | Cell Applications | HFLS-RA-200 | validación in vitro de la función de miR-488-3p |
| anticuerpo control IgG | Abcam | ab205718 | Inmunoprecipitación de ARN |
| Kit ELISA de interleucina-1β (IL-1β) | R&D Systems | DY201-05 | concentración celular de IL-1β |
| Kit ELISA de interleucina-6 (IL-6) | R&D Systems | D6050B | concentración celular de IL-6 |
| Reactivo de transfección con liposomas 3000 | Ingenuity Life Technologies | L3000015 | transfección celular |
| Lector de microplacas | BioTek | ELx808 | ensayo ELISA |
| Kit Mir-XTM de síntesis de la primera cadena de microARN | Nihonbao Bioengineering Co., Ltd. | 638313 | transcripción inversa |
| Medio Opti-MEM | Ingenuity Life Technologies, Inc | 31985070 | transfección celular |
| pcDNA 3.1 | Invitrogen | V790-20 | sobreexpresión de ROCK1 |
| Penicilina-estreptomicina | Thermo Fisher | 15140122 | cultivo celular |
| Sistema de laboratorio Phadia 250 | Thermo Fisher | Phadia 250 | análisis de sangre |
| Kit de transcripción inversa PrimeScriptTM | Nihonbao Bioengineering Co., Ltd. | RR037A | transcripción inversa |
| Yoduro de propidio (PI)/ribonucleasa (RNasa) | BD Bioscience | 550825 | apoptosis celular |
| Sistema QuantStudio 5 | Applied Biosystems, Inc. | A28138 | ensayo de PCR |
| Reactivo RNAiso Plus | Nihonbao Bioengineering Co., Ltd. | 9108 | aislamiento de ARN |
| Mezcla previa SYBR Green Ex Taq | Nippon Poh Bio-Engineering Co., Ltd. | RR420A | amplificación por PCR |
| Base de datos TargetScan | TargetScan | N/A | predicción de sitios de unión, (https://www.targetscan.org/) |
| Tina-quant proteína C reactiva IV | Roche Diagnostics | 7876033190 | detección de PCR |
| Kit ELISA de factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) | R&D Systems | DY210-05 | concentración celular de TNF-α |
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