Este protocolo demuestra la evaluación de la Modificada Xiaoyao San en un modelo murino de depresión inducida por estrés crónico impredecible de leve intensidad, incluyendo evaluaciones conductuales, histológicas y moleculares de la necroptosis neuronal.
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Artículo de investigación
El Xiaoyao San modificado mejora las conductas similares a la depresión y la necroptosis neuronal en un modelo murino de estrés crónico impredecible leve
En este artículo
Resumen
Resumen
La pérdida y el daño neuronal son características patológicas importantes de la depresión, y se ha propuesto que la necroptosis podría ser un mecanismo potencial de muerte celular neuronal. El análisis de conjuntos de datos del Gene Expression Omnibus (GEO) (GSE54565, GSE54566 y GSE54568) identificó una asociación entre la depresión y la necroptosis, lo que sugiere que la inhibición de esta vía podría representar una estrategia terapéutica potencial. El Xiaoyao San modificado (MXYS), una formulación modificada del medicamento tradicional chino Xiaoyao San, fue desarrollado incorporando hierbas que eliminan el calor, enfrían la sangre, mejoran la cognición y promueven la resucitación, con el fin de aumentar su eficacia terapéutica. Sin embargo, sus efectos sobre la necroptosis neuronal y los constituyentes activos que alcanzan el tejido cerebral aún no están claros. Se utilizó cromatografía líquida de ultra alto rendimiento acoplada a espectrometría de masas de alta resolución (UHPLC-HRMS) para identificar tentativamente los constituyentes de MXYS detectados en el tejido cerebral. La eficacia terapéutica se evaluó en un modelo murino de estrés crónico impredecible y leve (CUMS) de depresión mediante evaluaciones conductuales, examen histológico, inmunofluorescencia, inmunotransferencia western y análisis bioinformáticos. La administración de MXYS se asoció con una mejora en los comportamientos similares a la depresión, atenuación de la lesión cerebral patológica y reducción de la fosforilación de la quinasa 3 de proteína interactiva con receptores (RIPK3) y de la proteína con dominio similar a quinasa de linaje mixto (MLKL). Estos hallazgos sugieren que el MXYS ejerce efectos similares a los antidepresivos que están asociados con una reducción de los marcadores de necroptosis neuronal, proporcionando apoyo experimental para investigar más a fondo al MXYS como una estrategia terapéutica potencial contra la depresión.
Introducción
La depresión, un trastorno mental grave dentro del espectro de los trastornos del estado de ánimo, se caracteriza principalmente por un estado de ánimo bajo persistente y está influenciado por múltiples factores1. Clínicamente, los pacientes con depresión comúnmente presentan síntomas como estado de ánimo deprimido, lentitud cognitiva, reducción de la comunicación verbal y de la actividad física, y, en casos graves, conductas autolesivas e ideación suicida2. Debido a su alta prevalencia, recurrencia, discapacidad y tasas de suicidio, la depresión es una de las principales causas de discapacidad en todo el mundo y supone una carga social y económica sustancial3. Según la Organización Mundial de la Salud, se prevé que la depresión se convierta en la principal causa de la carga global de enfermedad para 2030, superando al cáncer y a las enfermedades cardiovasculares y cerebrovasculares3. Además, la pandemia de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) se asoció con un aumento del 27,6 % en la prevalencia mundial del trastorno depresivo mayor4. En China, la prevalencia anual de la depresión es del 3,6 %, con una prevalencia a lo largo de la vida del 6,8 %5. La patogénesis de la depresión aún no se comprende completamente debido a su etiología compleja y a los múltiples factores que contribuyen. En consecuencia, las opciones de tratamiento siguen siendo limitadas, y aproximadamente entre el 30 % y el 40 % de los pacientes desarrollan depresión resistente al tratamiento debido a una respuesta inadecuada a los antidepresivos disponibles actualmente6. Además, el inicio tardío de la acción, los síntomas residuales, la neurotoxicidad y los efectos adversos asociados con los antidepresivos existentes continúan representando desafíos terapéuticos significativos7.
La muerte celular programada ha sido durante mucho tiempo un foco principal de la investigación biomédica. Cada vez hay más evidencia que sugiere que la depresión está asociada con la necroptosis8,9,10,11. La necroptosis, al igual que la apoptosis, es una forma de muerte celular programada; sin embargo, a diferencia de la apoptosis, provoca respuestas inmunitarias e inflamatorias pronunciadas12. En ausencia de actividad de la caspasa-8, el factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) se une al receptor 1 del factor de necrosis tumoral (TNFR1), lo que resulta en la activación de la quinasa 1 asociada al receptor de interacción con proteínas (RIPK1)13. La RIPK1 activada interactúa con la quinasa 3 asociada al receptor de interacción con proteínas (RIPK3) para formar el complejo necrosoma, que posteriormente activa la proteína con dominio similar a quinasa de linaje mixto (MLKL)14. Tras la oligomerización, la MLKL se transloca desde el citoplasma hacia la membrana plasmática, provocando hinchazón de los orgánulos15,16, alteración de la integridad de la membrana celular y liberación de contenidos intracelulares, incluidos patrones moleculares asociados al daño (DAMPs) y mediadores inflamatorios como el TNF-α, la interleucina (IL)-1 y la IL-6, lo que agrava aún más las respuestas inflamatorias17. Se ha implicado a la necroptosis en numerosas enfermedades inflamatorias y neurodegenerativas, incluyendo esclerosis múltiple, depresión, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Parkinson y enfermedad de Alzheimer18,19,20. Análisis proteómicos han demostrado que la depresión inducida por estrés leve impredecible crónico (CUMS) se asocia con un aumento en la expresión de RIPK3 y MLKL y con la activación de la vía de necroptosis2. En otro modelo murino de depresión CUMS, la fluoxetina ejerció efectos similares a los de un antidepresivo que se asociaron con la inhibición de la necroptosis mediada por RIPK110. Además, se ha demostrado que Nec-1s, un inhibidor de la necroptosis, mejora los comportamientos similares a la depresión inducidos por lipopolisacárido (LPS)21. Dado que la lesión neuronal es una característica patológica importante de la depresión, dirigirse contra la necroptosis podría representar una estrategia terapéutica prometedora para el tratamiento de la depresión.
La medicina tradicional china (MTC) tiene una larga historia en el tratamiento de la depresión. Según la teoría de la MTC, el hígado regula el flujo libre del qi; por lo tanto, la depresión se atribuye principalmente al malestar emocional que conduce a la estasis del qi hepático. En consecuencia, la estrategia terapéutica principal consiste en suavizar el hígado y aliviar la depresión. Xiaoyao San (XYS) es una fórmula herbácea clásica ampliamente utilizada con este fin, y existe amplia evidencia que respalda su aplicación en el tratamiento de la depresión22. Además, se ha informado que XYS posee propiedades anti-necroptóticas23,24. Con base en los conceptos de la MTC de «transformación de la depresión hepática en fuego» y «ascenso del yang claro al cerebro», XYS fue modificado mediante la adición de Moutan Cortex (Mudan Pi) y Gardeniae Fructus (Zhizi) para eliminar el calor y enfriar la sangre, junto con Acori Tatarinowii Rhizoma (Shi Changpu) y Polygalae Radix (Yuan Zhi) para promover la función cognitiva y la resucitación. La formulación resultante fue denominada Xiaoyao San Modificado (MXYS) y fue desarrollada para proporcionar efectos terapéuticos mejorados según los principios de la MTC. Sin embargo, en este estudio no se realizó una comparación directa con la formulación original de XYS25. Estudios clínicos han demostrado la eficacia antidepresiva de MXYS26,27,28, y sus efectos terapéuticos podrían estar asociados con la regulación del eje hipotálamo-hipófisis-adrenal (HPA) y la inhibición de la neuroinflamación29,30,31. No obstante, aún no está claro si MXYS se asocia con una reducción de la necroptosis neuronal.
En el presente estudio, se utilizó cromatografía líquida de ultra alto rendimiento acoplada a espectrometría de masas de alta resolución (UHPLC-HRMS) para identificar tentativamente compuestos derivados de MXYS detectados en tejido cerebral. Se emplearon conjuntos de datos públicos del Gene Expression Omnibus (GEO) y análisis bioinformáticos, incluyendo análisis de red de coexpresión génica ponderada (WGCNA), análisis de expresión diferencial y análisis de enriquecimiento, para investigar las asociaciones entre MXYS, la depresión y la necroptosis. Con base en estos hallazgos, planteamos la hipótesis de que MXYS podría ejercer efectos similares a los de un antidepresivo asociados con una reducción en los marcadores de necroptosis neuronal, siendo la vía del factor de transcripción activador 4 (ATF4)/proteína ligadora del elemento de respuesta al cAMP (CREB)/factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) un mecanismo correlativo candidato. Para evaluar esta hipótesis, se identificaron tentativamente los compuestos detectados en el tejido cerebral mediante UHPLC-HRMS, se realizaron análisis bioinformáticos para identificar posibles dianas terapéuticas y se llevaron a cabo experimentos in vivo para examinar si el tratamiento con MXYS se asocia con cambios en los marcadores de necroptosis y en la vía ATF4/CREB/BDNF. Estos hallazgos proporcionan evidencia preliminar que respalda la posible aplicación terapéutica de MXYS en la depresión, aunque se reconoce que aún son necesarios estudios comparativos con la formulación original de XYS y la validación de la respuesta a la dosis.
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Protocolo
Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Medicina China de Henan (número de aprobación: DWLLGZR202200023). Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales y nacionales sobre bienestar animal y cumplieron con las directrices ARRIVE. Se obtuvieron ratas macho Sprague–Dawley (SD) de un proveedor autorizado de animales de laboratorio. Los animales se mantuvieron en condiciones controladas de temperatura y humedad, con un ciclo de 12 h de luz/oscuridad, y se les proporcionó alimento estándar y agua ad libitum.
Identificación de los componentes presentes en el tejido cerebral de MXYS
Preparación del polvo liofilizado de MXYS:
Las 11 hierbas de MXYS se remojaron en 10 volúmenes de agua destilada durante 2 h y luego se hirvieron durante 40 min. La menta se añadió durante los últimos 5 min de la decocción. Se preparó una segunda decocción del mismo modo utilizando 8 volúmenes de agua destilada. Las dos decocciones se combinaron, filtraron a través de gasa, concentraron bajo presión reducida hasta una concentración de 1 g/mL (equivalente de droga cruda) y liofilizaron al vacío durante 48 h para obtener el polvo liofilizado de MXYS. El rendimiento de extracción fue del 21,7 % (p/p)25,29,31.
Animales y administración de MXYS:
Doce ratas macho SD fueron asignadas aleatoriamente a dos grupos y se les administró ya sea MXYS o agua purificada dos veces al día por gavaje oral. Las dos administraciones diarias se realizaron a las 8:00 AM y a las 8:00 PM (intervalo de 12 h). El polvo de MXYS se disolvió en agua purificada y se administró a una dosis de 24,4 g/kg (aproximadamente el doble de la dosis clínica para ratas)25. Al grupo control se le administró agua purificada en un volumen equivalente (10 mL/kg).
Preparación del tejido cerebral que contiene MXYS:
Después de 14 días, todas las ratas fueron anestesiadas con pentobarbital sódico (40 mg/kg, intraperitonealmente) 2 h después de la administración final de MXYS. Los tejidos cerebrales se recolectaron tras la perfusión transcardíaca con solución salina normal. Los cerebros completos se extirparon inmediatamente y se colocaron sobre hielo para obtener muestras de tejido cerebral en blanco y de tejido cerebral tratado con MXYS.
Condiciones cromatográficas/espectrométricas de masas y base de datos:
Se analizó polvo de MXYS liofilizado, tejido cerebral en blanco enriquecido con polvo de MXYS, tejido cerebral en blanco y extractos de tejido cerebral que contenían MXYS utilizando un sistema de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento equipado con una columna HSS-T3 (100 × 2,1 mm, 1,8 μm) mantenida a 35 °C. Las fases móviles consistieron en agua que contenía 0,1 % de ácido fórmico (fase móvil A) y acetonitrilo que contenía 0,1 % de ácido fórmico (fase móvil B). Las muestras se separaron a un flujo de 0,3 mL/min utilizando un gradiente de 5 % de B durante 1 min, aumentando hasta 98 % de B en 16 min, regresando a 5 % de B en 0,5 min y manteniéndose en 5 % de B durante 2,5 min.
Se adquirieron espectros de masas en modos de ionización por electrospray positivo y negativo utilizando adquisición dependiente de datos en un rango de m/z de 90–1,300. Los espectros MS/MS se generaron a partir de los 10 iones precursores más intensos utilizando energías de disociación por colisión con energía superior en escalones de 20, 40 y 60 eV. La temperatura del capilar se mantuvo a 320°C y la temperatura del calentador de la sonda se estableció en 350°C.
La anotación de compuestos se realizó mediante la comparación de la masa exacta, la distribución isotópica y los espectros MS/MS con una base de datos interna de medicina tradicional china y con las bases de datos públicas GNPS32, ReSpect33 y MassBank34. Se conservaron los compuestos con coincidencias confiables en MS/MS y formas de picos cromatográficos consistentes. La lista completa de compuestos identificados tentativamente se proporciona en la Tabla Suplementaria 1.
Bioinformática
Selección y preprocesamiento de conjuntos de datos de la base de datos GEO:
Se investigó la posible participación de la necroptosis en la patología de la depresión mediante la búsqueda en la base de datos GEO utilizando la palabra clave «depresión». Según los criterios de selección, se identificaron tres conjuntos de datos (GSE54566, GSE54565 y GSE54568) para su análisis posterior. Los conjuntos de datos procedían de diferentes regiones cerebrales: GSE54565 (corteza cingulada anterior), GSE54566 (amígdala) y GSE54568 (corteza prefrontal dorsolateral, BA9). Todos los conjuntos de datos se generaron utilizando la plataforma Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array (GPL570) y consistieron en muestras de tejido cerebral post mortem de pacientes con trastorno depresivo mayor (TDM) y controles sin trastornos psiquiátricos. Las características detalladas de las muestras para cada conjunto de datos se resumen en la Tabla Suplementaria 2. Estos conjuntos de datos comprendían datos transcriptómicos de tres regiones cerebrales implicadas en la depresión. Se realizó un análisis de expresión génica diferencial entre los grupos con TDM y los controles para cada conjunto de datos, y los genes consistentemente sobreexpresados y subexpresados se integraron utilizando el paquete R Robust Rank Aggregation (RRA).
Todos los conjuntos de datos se preprocesaron utilizando el algoritmo de promedio robusto de múltiples matrices (RMA) para la corrección del fondo y la normalización. Tras la normalización RMA, se aplicó el algoritmo ComBat implementado en el paquete R sva para ajustar los efectos de lote entre los conjuntos de datos, considerando el origen de cada conjunto como la covariable de lote. Este procedimiento redujo la variación técnica entre los conjuntos de datos y mejoró la comparabilidad para los análisis posteriores.
Los análisis bioinformáticos se realizaron utilizando el software R (versión 4.2.1). Los principales paquetes de R incluyeron ClusterProfiler (versión 4.8.2) para los análisis de enriquecimiento de Gene Ontology (GO) y Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), WGCNA (versión 1.72) para el análisis de red de coexpresión génica ponderada, RRA para la integración de genes diferenciales y sva (versión 3.48.0) para la corrección de lotes mediante ComBat. El flujo de trabajo analítico comprendió la adquisición de datos, normalización RMA, corrección de lotes con ComBat, análisis de expresión diferencial con integración de RRA, construcción de módulos mediante WGCNA, análisis de enriquecimiento de GO y KEGG con una tasa de descubrimiento falso (FDR) < 0.05, y predicción de objetivos mediante análisis de red de interacción proteína-proteína (PPI).
Uso de WGCNA para construir redes de coexpresión génica e identificación de módulos significativamente asociados con depresión y necroptosis:
WGCNA construye redes ponderadas de coexpresión génica aplicando una potencia de umbralización suave (valor β) para aproximar una topología libre de escala. El valor β se seleccionó cuando el coeficiente de correlación entre log(k) y log(p(k)) alcanzó al menos 0,9. Después de seleccionar el valor β, los módulos génicos se identificaron utilizando el método de corte dinámico del árbol. Los parámetros adicionales se establecieron de la siguiente manera: minModuleSize = 30, cutHeight = 0,25 y deepSplit = 2. El valor β se seleccionó cuando el coeficiente de correlación entre log(k) y log(p(k)) alcanzó al menos 0,9. Se utilizó una potencia de umbralización suave de β = 7 para la construcción de la red. El Eigengene del módulo (ME) se calculó para cada módulo con el fin de resumir los patrones de expresión génica y evaluar las asociaciones con rasgos biológicos. Posteriormente, se calcularon la significancia génica (GS) y la pertenencia al módulo (MM), y las relaciones entre módulos y rasgos se evaluaron mediante el coeficiente de correlación (cor) y el valor p correspondiente. Coeficientes de correlación más altos y valores p más bajos indicaron asociaciones más fuertes entre los módulos génicos y los rasgos biológicos.
Análisis de enriquecimiento funcional y construcción de la red PPI:
Se utilizó ClusterProfiler para realizar el análisis de enriquecimiento de vías KEGG. Se aplicó el método FDR de Benjamini–Hochberg para la corrección por múltiples pruebas, y se consideró estadísticamente significativo un valor p ajustado (FDR) < 0,05. Tras identificar el módulo diana, los genes clave dentro del módulo se intersectaron con los genes asociados con MXYS y necroptosis. Posteriormente, se construyó una red PPI utilizando la base de datos STRING.
Predicción de dianas para compuestos detectados en tejido cerebral:
Los 143 compuestos identificados tentativamente en tejido cerebral de rata tras la administración de MXYS se utilizaron para la predicción de dianas. Para cada compuesto, las dianas potenciales se recuperaron de la base de datos GeneCards mediante la función Related Targets con una puntuación de relevancia > 5. Las dianas duplicadas se fusionaron y solo se conservaron los genes humanos con símbolos génicos oficiales, lo que dio lugar a 3.164 dianas únicas. Estas dianas se sometieron a análisis de enriquecimiento GO y KEGG utilizando el paquete R ClusterProfiler, considerándose estadísticamente significativo un FDR < 0,05. El conjunto génico de fondo comprendió todos los genes humanos codificantes de proteínas anotados en la base de datos KEGG.
Verificación experimental
Cultivo celular:
Las células HT-22 fueron obtenidas de Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (CL-0697, RRID: CVCL_0321) y cultivadas en medio de crecimiento suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina. Las células se mantuvieron a 37°C en un incubador humedecido con 5% de CO₂.
Actividad anti-necroptótica de MXYS:
El polvo liofilizado de MXYS se reconstituyó en medio de crecimiento celular a una concentración de 1,0 g/mL, se esterilizó mediante un filtro de membrana de 0,22 μm y se almacenó a −20 °C hasta su uso. Las células HT-22 se sembraron a una densidad de 8.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos, con tres pocillos por grupo. MXYS se diluyó en medio de crecimiento hasta concentraciones finales de 2, 4 y 6 mg/mL. Después de una incubación de 12 h, las células se trataron con clorhidrato de SM-164 (10 nM) y el inhibidor de caspasa z-VAD-fmk (20 μM) durante 30 min, seguido de una estimulación con factor de necrosis tumoral alfa humano (h-TNF-α; 20 ng/mL) durante 12 h adicionales. La viabilidad celular se evaluó mediante un ensayo de viabilidad celular luminiscente según las instrucciones del fabricante. La luminiscencia se midió utilizando un lector de microplacas. La morfología celular se examinó bajo un microscopio invertido, y se obtuvieron imágenes representativas para su análisis.
Animales:
Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Medicina China de Henan (número de aprobación: DWLLGZR202200023). Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales y nacionales sobre bienestar animal y cumplieron con las directrices ARRIVE. Solo se utilizaron ratones BALB/c machos de 6 a 8 semanas de edad para el establecimiento del modelo CUMS. Los animales se mantuvieron en condiciones controladas de temperatura y humedad, con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se les proporcionó alimento estándar y agua ad libitum.
Modelo de depresión inducida por CUMS:
Los ratones se asignaron aleatoriamente a un grupo control o a un grupo CUMS. Tras una semana de aclimatación, los ratones del grupo CUMS fueron sometidos a estresores leves intermitentes e impredecibles, mientras que los ratones del grupo control permanecieron sin perturbaciones. El paradigma de estrés consistió en 13 estresores diferentes, incluyendo inclinación de la jaula, agitación de la jaula, intercambio de jaulas, cama húmeda, privación de agua, iluminación estroboscópica, exposición al ruido, luz continua, oscuridad continua, iluminación intermitente, natación en agua fría (4 °C), natación en agua tibia (40 °C), estrés por inmovilización y otros estresores leves. Cada estresor se aplicó durante 2–6 h por sesión en una secuencia aleatorizada para mantener la imprevisibilidad. Los ratones fueron expuestos a uno o dos estresores diferentes cada día según un horario aleatorizado.
Grupos y tratamiento farmacológico:
Después de seis semanas de exposición al CUMS, los ratones se asignaron aleatoriamente a los grupos de tratamiento CUMS, MXYS, paroxetina o Nec-1. Al grupo MXYS se le administró polvo liofilizado de MXYS por vía oral mediante gavaje a una dosis de 35,2 g/kg/día. Al grupo de paroxetina se le administró paroxetina (20 mg/kg) por vía oral mediante gavaje, mientras que al grupo Nec-1 se le administró Nec-1 (10 mg/kg) mediante inyección intraperitoneal durante cuatro semanas consecutivas. Durante el mismo periodo, los grupos control y CUMS recibieron un volumen equivalente de solución salina normal por vía oral mediante gavaje.
Experimentos conductuales:
Los ratones se asignaron aleatoriamente a grupos experimentales utilizando una secuencia de números aleatorios generada por computadora antes del inicio de la administración del fármaco. La secuencia de aleatorización fue generada por un investigador independiente que no participó en experimentos posteriores ni en el análisis de datos.
Las pruebas conductuales fueron realizadas por un investigador cegado respecto a los grupos de tratamiento. El mismo investigador llevó a cabo la puntuación conductual basada en video (tiempo de inmovilidad, distancia recorrida y tiempo pasado en el centro) utilizando un software automatizado de seguimiento para minimizar el sesgo subjetivo. El investigador cegado no tuvo acceso a los códigos de asignación de grupo hasta que todos los datos conductuales hubieron sido recopilados y registrados.
Los análisis de inmunofluorescencia fueron realizados por un investigador independiente que también estaba cegado respecto a los grupos experimentales. Las muestras fueron etiquetadas utilizando identificadores codificados, y la asignación de los grupos solo se reveló después de que se hubieran completado las mediciones densitométricas o de intensidad de fluorescencia. Los análisis estadísticos fueron realizados por un tercer investigador que estaba cegado tanto respecto a la asignación de los grupos como a los resultados experimentales correspondientes, hasta que todos los datos cuantitativos hubieran sido compilados.
Prueba de preferencia por sacarosa (SPT): La evaluación conductual se realizó después de la administración final del fármaco. Antes de la prueba, los ratones se aclimataron a una solución de sacarosa al 1% proporcionando dos botellas que contenían esta solución durante 12 h, seguido de una botella con solución de sacarosa al 1% y otra con agua potable durante 12 h adicionales. Luego, se privó a los ratones de alimento y agua durante 12 h antes de la prueba formal. Durante la prueba, a cada ratón se le proporcionó una botella con solución de sacarosa al 1% y otra con agua potable. Después de 12 h, se midió el volumen consumido de cada botella. La preferencia por sacarosa se calculó como:
Prueba de Suspensión por la Cola (TST): La cola de cada ratón se sujetó en la parte superior del aparato de prueba utilizando cinta adhesiva. El comportamiento del ratón se registró durante 6 min mediante software de grabación y análisis de video del comportamiento. Se cuantificó la duración de la inmovilidad durante los últimos 4 min de la prueba.
Prueba del campo abierto (OFT): Cada ratón se colocó individualmente en el centro del aparato de campo abierto. La actividad conductual se registró y analizó durante 5 min mediante software de rastreo conductual, incluyendo la distancia locomotora y la actividad de movimiento. Después de cada prueba, el aparato se limpió con etanol al 75 %.
Recolección de muestras:
Se excluyeron del estudio los ratones que murieron durante el procedimiento CUMS o que presentaron signos de enfermedad grave (por ejemplo, pérdida de peso corporal >20%, infección visible o incapacidad para moverse). La eutanasia fue realizada por personal certificado mediante una sobredosis de pentobarbital sódico (150 mg/kg, por vía intraperitoneal). Tras la pérdida de conciencia, se realizó una dislocación cervical como método secundario para asegurar la muerte. Para las análisis de tinción de Nissl e inmunofluorescencia, se seleccionaron aleatoriamente tres ratones de cada grupo. Los tejidos del hipocampo para el análisis por inmunotransferencia (western blot) se diseccionaron inmediatamente sobre hielo y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido.
Tinción de Nissl:
Para los análisis de tinción de Nissl e inmunofluorescencia, los ratones fueron anestesiados profundamente con pentobarbital sódico (150 mg/kg, por vía intraperitoneal) y decapitados sin perfusión transcardíaca. Los cerebros se extrajeron rápidamente y se fijaron en paraformaldehído al 4 % durante 24–48 h antes del incluido en parafina. Los cortes en parafina se realizaron con un grosor de 3 μm. Los cortes en parafina se desparafinizaron mediante incubación secuencial en solución desparafinante, etanol absoluto y etanol al 75 %, antes de enjuagar con agua corriente. Los cortes congelados, cuando correspondía, se llevaron a temperatura ambiente, se fijaron con fijador tisular durante 15 min y se enjuagaron con agua corriente. Las secciones tisulares se tiñeron con la solución de tinción de Nissl durante 2–5 min, se enjuagaron con agua, se diferenciaron con ácido acético glaciar al 0,1 %, se lavaron para detener la reacción, se controlaron microscópicamente para regular la diferenciación, se secaron, se aclararon en xileno durante 10 min y se montaron con medio de montaje neutro.
Inmunofluorescencia:
Los procedimientos de inmunofluorescencia se realizaron utilizando métodos estándar. El tejido cerebral se fijó en paraformaldehído al 4 % y se incluyó en parafina para la tinción por inmunofluorescencia. Las secciones de tejido se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra NeuN (1:200), MLKL (1:300), ATF4 (1:5000) y CREB (1:1000). Después de la incubación con los anticuerpos primarios, las secciones se lavaron cuatro veces con PBS e incubaron durante 1 h a oscuras con los anticuerpos secundarios fluorescentes correspondientes: IgG de cabra anti-murino conjugado con CY3 (1:300, Servicebio, GB21301) para anti-ATF4 de ratón; IgG de cabra anti-murino conjugado con Alexa Fluor 488 (1:400, Servicebio, GB25301) para anti-MLKL de ratón; IgG de cabra anti-conejillo conjugado con CY3 (1:300, Servicebio, GB21303) para anti-NeuN de conejo; e IgG de cabra anti-conejillo conjugado con Alexa Fluor 488 (1:400, Servicebio, GB25303) para anti-CREB de conejo. Luego, las secciones se tiñeron con DAPI durante 10 min a temperatura ambiente, se lavaron con PBS, se montaron con un medio de montaje antifade y se adquirieron imágenes de fluorescencia mediante microscopía confocal.
Western blot:
Los tejidos cerebrales se homogenizaron en tampón de lisis RIPA (ensayo de inmunoprecipitación con radioinmunoensayo). Se determinaron las concentraciones de proteína, y se separaron 20 μg de proteína total por pocillo mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 10 % con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) antes de transferirlos a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF). Después del bloqueo, las membranas se incubaron durante toda la noche a 4 °C con anticuerpos primarios (1:1000), seguido de incubación con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) durante 1 h. Las bandas proteicas se visualizaron mediante un sistema de imagen de quimioluminiscencia, y las intensidades de las bandas se cuantificaron utilizando el software ImageJ. Para el análisis por western blot de tejidos del hipocampo, se analizaron dos ratones por grupo, y se muestran inmunotransferencias representativas. Para los experimentos con células HT-22, el análisis por western blot se realizó una vez como experimento representativo. Estos datos se presentan como observaciones cualitativas de tendencias, más que como hallazgos cuantificados estadísticamente.
Análisis estadístico:
Las diferencias entre los grupos se analizaron mediante un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar (SD). Se consideró estadísticamente significativo un valor de p < 0,05.
Disponibilidad de datos:
Los conjuntos de datos generados y analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y en sus materiales suplementarios. Los resultados de identificación de compuestos mediante UHPLC-HRMS se proporcionan en la Tabla Suplementaria 1, y las características de los conjuntos de datos GEO utilizados para los análisis bioinformáticos se resumen en la Tabla Suplementaria 2. Datos adicionales de apoyo, incluyendo inmunofluorescencia de GFAP (Figura Suplementaria 1), tinción de inmunofluorescencia de p-RIPK3 y p-MLKL (Figura Suplementaria 2), el diseño experimental y la línea de tiempo de asignación de animales (Figura Suplementaria 3), y las imágenes originales de las transferencias Western sin recortar (Figura Suplementaria 4), están disponibles en los materiales suplementarios.
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Resultados
WGCNA identifica un módulo génico asociado a la depresión enriquecido en la vía de la necroptosis
Se utilizó el paquete RRA para integrar genes expresados de manera diferencial consistentemente regulados al alza y regulados a la baja en los conjuntos de datos GSE54566, GSE54565 y GSE54568, lo que permitió identificar 2.513 genes. Un mapa de calor de estos genes se muestra en Figura 1A. Los tres conjuntos de datos se derivaron de regiones cerebrales distintas: la cortez...
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Discusión
La muerte neuronal anormal desempeña un papel crucial en la patogénesis de la depresión8. La necroptosis, una forma de muerte celular programada, ha sido ampliamente investigada, lo que ha permitido avances significativos en el desarrollo de inhibidores dirigidos a esta vía39. Desde la identificación del inhibidor de la necroptosis Nec-1 en 200540, se ha logrado un progreso considerable en el desarrollo de compuestos que actúan sobre componentes clav...
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Divulgaciones
Conflictos de intereses:
Los autores no tienen nada que declarar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Proyecto Clave de Investigación Científica de las Instituciones de Educación Superior de Henan, China (No. 26A360008), el Proyecto de Investigación Científica de Medicina Tradicional China de la Provincia de Henan (No. 2025ZY3152), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 82274496), el Proyecto de Investigación Científica y Tecnológica de la Provincia de Henan (No. 232301420018) y el Proyecto de Herencia e Innovación Zhang Zhongjing del Departamento de Ciencia y Tecnología de la Administración Nacional de Medicina Tradicional China (No. GZY-KJS-2022-044-1).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Rhizoma de Acori Tatarinowii (Acorus tatarinowii Schott; Shi Changpu) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | 231001 | Ingrediente herbal (12 g) |
| Cinta adhesiva | No aplicable | No aplicable | Prueba de suspensión de la cola |
| Radix de Angelicae Sinensis (Angelica sinensis (Oliv.) Diels; Dang Gui) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | G01230507-16 | Ingrediente herbal (10 g) |
| Anticuerpo anti-ATF4 (inmunofluorescencia) | Servicebio | GB111137 | Anticuerpo primario |
| Anticuerpo anti-ATF4 (inmunotransferencia) | MedChemExpress | HY-P80486 | Anticuerpo primario |
| Anticuerpo anti-BDNF | MedChemExpress | HY-P80567 | Anticuerpo primario para inmunotransferencia |
| Anticuerpo anti-CREB | Beyotime | AF1018 | Anticuerpo primario para inmunotransferencia e inmunofluorescencia |
| Anticuerpo anti-GAPDH | Abcam | ab181602 | Control de carga |
| Anticuerpo anti-MLKL | Proteintech | 66675-1-Ig | Anticuerpo primario para inmunotransferencia e inmunofluorescencia |
| Anticuerpo anti-NeuN | Servicebio | GB11138 | Anticuerpo primario para inmunofluorescencia |
| Anticuerpo anti-CREB fosforilado | Beyotime | AF5785 | Anticuerpo primario |
| Anticuerpo anti-MLKL fosforilado | Bioss | bsm-54104R | Anticuerpo primario |
| Anticuerpo anti-RIPK1 fosforilado | Biolynx | BX60008 | Anticuerpo primario |
| Anticuerpo anti-RIPK3 fosforilado | Abcam | ab195117 | Anticuerpo primario |
| Anticuerpo anti-RIPK1 | Cell Signaling Technology | 3493S | Anticuerpo primario |
| Anticuerpo anti-RIPK3 | Proteintech | 17563-1-AP | Anticuerpo primario |
| Atractylodes macrocephala (Atractylodes macrocephala Koidz.; Bai Zhu) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | 230801 | Ingrediente herbal (10 g) |
| Software automatizado de seguimiento del comportamiento | Panlab (Harvard Apparatus) | N/A | Software de seguimiento de video SMART 3.0 para pruebas de campo abierto y suspensión de la cola |
| Kit de ensayo de proteína BCA | CWBIO | CW0014S | Cuantificación de proteínas |
| Sistema de grabación del comportamiento | Panlab (Harvard Apparatus) | SMART V3.0 | Pruebas de campo abierto y suspensión de la cola |
| Sistema de imagen por quimioluminiscencia Bio-Rad | Bio-Rad | 12003154 | Sistema de imagen ChemiDoc MP para detección por inmunotransferencia con quimioluminiscencia |
| Kit de ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Lumi II | Beyotime | C0056XL | Ensayo de viabilidad celular |
| Microscopio confocal | Nikon Eclipse C1 | N/A | Imagen de inmunofluorescencia |
| DAPI | Servicebio | G1012 | Tinción nuclear |
| Solución ambiental de desparafinado | Servicebio | G1128 | Desparafinado de parafina |
| Suero bovino fetal (FBS) | BI | C04001-500 | Suplemento para cultivo celular |
| Fructus de Gardeniae (Gardenia jasminoides J. Ellis; Zhi Zi) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | 22102109 | Ingrediente herbal (12 g) |
| Radix de Glycyrrhizae (Glycyrrhiza uralensis Fisch.; Gan Cao) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | 230301 | Ingrediente herbal (3 g) |
| Anticuerpo secundario fluorescente de cabra anti-IgG de ratón conjugado con CY3 | Servicebio | GB21301 | Anticuerpo secundario fluorescente para anti-ATF4 de ratón (IF, CY3, 1:300) |
| Anticuerpo secundario fluorescente de cabra anti-IgG de ratón conjugado con Alexa Fluor 488 | Servicebio | GB25301 | Anticuerpo secundario fluorescente para anti-MLKL de ratón (IF, Alexa Fluor 488, 1:400) |
| Anticuerpo secundario fluorescente de cabra anti-IgG de conejo conjugado con CY3 | Servicebio | GB21303 | Anticuerpo secundario fluorescente para anti-NeuN de conejo (IF, CY3, 1:300) |
| Anticuerpo secundario fluorescente de cabra anti-IgG de conejo conjugado con Alexa Fluor 488 | Servicebio | GB25303 | Anticuerpo secundario fluorescente para anti-CREB de conejo (IF, Alexa Fluor 488, 1:400) |
| Anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de conejo conjugado con HRP | Absin | abs20040 | Anticuerpo secundario para inmunotransferencia |
| Anticuerpo secundario de ratón anti-cadena ligera de IgG de conejo conjugado con HRP | ABclonal | AS061 | Anticuerpo secundario para inmunotransferencia |
| Factor de necrosis tumoral humano α | Novoprotein | C008 | Inductor de necroptosis |
| Células HT-22 | Procell | CL-0697 | RRID: CVCL_0321 |
| Medio de crecimiento HyClone | Cytiva (HyClone) | SH30022.01 | Medio de cultivo celular |
| ImageJ | NIH | Software gratuito | Cuantificación de bandas |
| Microscopio invertido | Nikon | Eclipse Ti-SR | Morfología celular |
| Nitrógeno líquido | Henan Jilai New Energy Technology Co., Ltd. | N/A | Preservación de tejidos |
| Lector de microplacas Molecular Devices | Molecular Devices | SpectraMax M5 | Medición de luminiscencia |
| Corteza de Moutan (Paeonia suffruticosa Andr.; Mu Danpi) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | 22121714 | Ingrediente herbal (12 g) |
| Necrostatina-1 (Nec-1) | Selleck | S8037 | Inhibidor de RIPK1 |
| Paraformaldehído | Servicebio | G1101-500ML | Fijación de tejidos |
| Clorhidrato de paroxetina hemihidratado | Aladdin | P129711 | Control positivo |
| PBS | Servicebio | G4202-500ML | Tampón de lavado |
| Menta (Mentha haplocalyx Briq.; Bo He) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | 230101 | Ingrediente herbal (6 g) |
| Penicilina–estreptomicina | Gibco | 15140-122 | Antibiótico para cultivo celular |
| Radix de Polygalae (Polygala tenuifolia Willd.; Yuan Zhi) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | 20221101 | Ingrediente herbal (12 g) |
| Membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) | Merck Millipore | ISEQ00010 | Inmunotransferencia |
| Poria (Wolfiporia cocos; Fu Ling) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | D23070601 | Ingrediente herbal (15 g) |
| Tampón de lisis para ensayo de inmunoprecipitación de radioinmunoensayo (RIPA) | CWBIO (Jiangsu Cowin Biotech Co., Ltd.) | CW2333S | Extracción de proteínas |
| Radix de Bupleuri (Bupleurum chinense DC.; Chai Hu) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | 230801 | Ingrediente herbal (12 g) |
| Reactivos de SDS-PAGE | Solarbio; Servicebio; Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd. | No aplicable | Acrylamida, bis-acrylamida, Tris, SDS, APS y TEMED preparados in situ |
| Pentobarbital sódico | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 69020181 | Anestésico |
| Sistema de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento | Thermo Fisher Scientific | Vanquish UHPLC System | Análisis por LC-MS |
| Columna UHPLC HSS-T3 (100 × 2.1 mm, 1.8 μm) | Waters | 186003539 | Separación cromatográfica |
| z-VAD-fmk | TargetMol | T6013 | Inhibidor pan-caspasa |
Referencias
- Zhang Y, et al. Natural volatile oils derived from herbal medicines: A promising therapy way for treating depressive disorder. Pharmacol Res. 2021;164:105376.
- O’Connor EA, et al. Depression and suicide risk screening: Updated evidence report and systematic review for the US Preventive Services Task Force. JAMA. 2023;329(23):2068-85.
- World Health Organization. The global burden of disease: 2004 update. World Health Organization; Geneva; 2008.
- Pedrosa-Naudín MA, et al. Non-adherence to antidepressant treatment and related factors in a region of Spain: A population-based registry study. Pharmaceutics. 2022;14(12):2696.
- Huang Y, et al. Prevalence of mental disorders in China: A cross-sectional epidemiological study. Lancet Psychiatry. 2019;6(3):211-24.
- Thase ME. New medications for treatment-resistant depression: A brief review of recent developments. CNS Spectr. 2017;22(S1):39-48.
- Monteggia LM, Malenka RC, Deisseroth K. Depression: The best way forward. Nature. 2014;515(7526):200-1.
- Cao H, et al. Hippocampal proteomic analysis reveals activation of necroptosis and ferroptosis in a mouse model of chronic unpredictable mild stress-induced depression. Behav Brain Res. 2021;403:113261.
- Sun Y, et al. Dysmyelination by oligodendrocyte-specific ablation of Ninj2 contributes to depressive-like behaviors. Adv Sci (Weinh). 2022;9(3):e2103065.
- Zeb S, et al. Necroptotic kinases are involved in the reduction of depression-induced astrocytes and fluoxetine’s inhibitory effects on necroptotic kinases. Front Pharmacol. 2022;13:1060954.
- Duan YW, Chen SX, Li QY, Zang Y. Neuroimmune mechanisms underlying neuropathic pain: The potential role of the TNF-α-necroptosis pathway. Int J Mol Sci. 2022;23(13):7191.
- Frank D, Vince JE. Pyroptosis versus necroptosis: Similarities, differences, and crosstalk. Cell Death Differ. 2019;26(1):99-114.
- Vandenabeele P, Galluzzi L, Vanden Berghe T, Kroemer G. Molecular mechanisms of necroptosis: An ordered cellular explosion. Nat Rev Mol Cell Biol. 2010;11(10):700-14.
- Linkermann A, Green DR. Necroptosis. N Engl J Med. 2014;370(5):455-65.
- Sun L, et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 2012;148(1-2):213-27.
- Cai Z, et al. Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis. Nat Cell Biol. 2014;16(1):55-65.
- Kaczmarek A, Vandenabeele P, Krysko DV. Necroptosis: The release of damage-associated molecular patterns and its physiological relevance. Immunity. 2013;38(2):209-23.
- Wallach D, Kang TB, Kovalenko A. Concepts of tissue injury and cell death in inflammation: A historical perspective. Nat Rev Immunol. 2014;14(1):51-9.
- Yuan J, Amin P, Ofengeim D. Necroptosis and RIPK1-mediated neuroinflammation in CNS diseases. Nat Rev Neurosci. 2019;20(1):19-33.
- Mitroshina EV, Saviuk M, Vedunova MV. Necroptosis in CNS diseases: Focus on astrocytes. Front Aging Neurosci. 2022;14:1016053.
- Gong Q, et al. RIPK1 inhibition mitigates neuroinflammation and rescues depressive-like behaviors in a mouse model of LPS-induced depression. Cell Commun Signal. 2024;22(1):427.
- Kwon TG, et al. A review of antidepressant and anxiolytic effects of Soyo-san (Xiaoyao-san) and modified Soyo-san in animal models. Phytomedicine. 2024;135:155387.
- Jiao H, et al. Xiaoyaosan ameliorates CUMS-induced depressive-like and anorexia behaviors in mice via necroptosis-related cellular senescence in the hypothalamus. J Ethnopharmacol. 2024;318(Pt A):116938.
- Yan ZY, et al. Antidepressant mechanism of traditional Chinese medicine formula Xiaoyaosan in a CUMS-induced depressed mouse model via RIPK1-RIPK3-MLKL-mediated necroptosis based on network pharmacology analysis. Front Pharmacol. 2021;12:773562.
- Wu M, et al. Integration of network pharmacology and experimental verification to reveal the active components and molecular mechanism of modified Danzhi Xiaoyao San in the treatment of depression. J Ethnopharmacol. 2025;337:118739.
- Chen X, et al. Therapeutic effect of Jiawei Danzhi Xiaoyao Powder combined with intravenous human umbilical cord mesenchymal stem cells on post-stroke depression. Chin J Pathophysiol. 2019;35(12):2274-79.
- Zhang J. Clinical observation of Shugan Jiannao Tiaoyu Tablets in the treatment of 30 cases of depression. New J Tradit Chin Med. 2008;40(11):48-49.
- Zhang J, Zhang B. Thirty-five patients with post-stroke depression were treated with Shugan Jiannao Tiaoyu Tablets. New J Tradit Chin Med. 2006;38(3):75-76.
- Su P, et al. Modified Xiaoyao San reverses lipopolysaccharide-induced depression-like behavior through suppressing microglial M1 polarization by enhancing autophagy via the PI3K/AKT/mTOR pathway in mice. J Ethnopharmacol. 2023;308:116659.
- Guo X, et al. Effect of Jiawei Danzhi Xiaoyao Powder on mineralocorticoid receptor and glucocorticoid receptor in the hippocampus of depression model rats. Chin J Exp Tradit Med Formulae. 2014;20(11):119-22.
- Wang B, et al. Modified Danzhi Xiaoyaosan inhibits neuroinflammation by regulating the TRIM31/NLRP3 inflammasome in chronic unpredictable mild stress-induced depression. Exp Gerontol. 2024;187:112451.
- Wang M, et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nat Biotechnol. 2016;34(8):828-37.
- Sawada Y, et al. RIKEN tandem mass spectral database (ReSpect) for phytochemicals: A plant-specific MS/MS-based data resource and database. Phytochemistry. 2012;82:38-45.
- Horai H, et al. MassBank: A public repository for sharing mass spectral data for life sciences. J Mass Spectrom. 2010;45(7):703-14.
- Wang M, et al. Targeting programmed cell death in inflammatory bowel disease through natural products: New insights from molecular mechanisms to targeted therapies. Phytother Res. 2024;38:4587-611.
- Huang X, et al. Shikonin overcomes drug resistance and induces necroptosis by regulating the miR-92a-1-5p/MLKL axis in chronic myeloid leukemia. Aging (Albany NY). 2020;12(17):17662-80.
- Yuan J, Najafov A, Py BF. Roles of caspases in necrotic cell death. Cell. 2016;167(7):1693-704.
- Mu R, et al. Activation of TGR5 ameliorates streptozotocin-induced cognitive impairment by modulating apoptosis, neurogenesis, and neuronal firing. Oxid Med Cell Longev. 2022;2022:3716609.
- Gardner CR, et al. From (tool)bench to bedside: The potential of necroptosis inhibitors. J Med Chem. 2023;66(4):2361-85.
- Degterev A ,et al. Chemical inhibitor of nonapoptotic cell death with therapeutic potential for ischemic brain injury. Nat Chem Biol. 2005;1(2):112-19.
- Cao L, Mu W. Necrostatin-1 and necroptosis inhibition: Pathophysiology and therapeutic implications. Pharmacol Res. 2021;163:105297.
- Vissers M, et al. Safety, pharmacokinetics and target engagement of the novel RIPK1 inhibitor SAR443060 (DNL747) for neurodegenerative disorders: Randomized, placebo-controlled, double-blind phase I/Ib studies in healthy subjects and patients. Clin Transl Sci. 2022;15(8):2010-23.
- Mo K, et al. Targeting HNRNPC suppresses thyroid follicular epithelial cell apoptosis and necroptosis through m6A-modified ATF4 in autoimmune thyroid disease. Pharmacol Res. 2023;195:106933.
- Liu J, et al. Brain-derived neurotrophic factor elevates activating transcription factor 4 (ATF4) in neurons and promotes ATF4-dependent induction of SESN2. Front Mol Neurosci. 2018;11:62.
- Tang H, Kang R, Liu J, Tang D. ATF4 in cellular stress, ferroptosis, and cancer. Arch Toxicol. 2024;98(4):1025-41.
- Pang BPS, et al. Deficiency of muscle-generated brain-derived neurotrophic factor causes inflammatory myopathy through reactive oxygen species-mediated necroptosis and pyroptosis. Redox Biol. 2024;74:103418.
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