Este estudio se realizó de acuerdo con las normas éticas del Hospital Popular N.º 4 de Shanghái, Escuela de Medicina de la Universidad Tongji, y fue aprobado por el Comité de Revisión Institucional (Número de aprobación: 2026013-001). Los dientes humanos extraídos utilizados en este estudio se recolectaron de pacientes que se sometieron a extracciones dentales por razones ortodóncicas o periodontales. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes antes de la recolección de las muestras. No se realizó ninguna intervención clínica adicional con fines de este estudio. El estudio se llevó a cabo de acuerdo con los requisitos institucionales para el uso de dientes humanos extraídos.
Preparación y criterios de selección de las muestras
Se recibió un total de 141 dientes permanentes unirradiculares (incisivos mandibulares y premolares) recientemente extraídos del Departamento de Estomatología, afiliado al Hospital Cuarto del Pueblo de Shanghái de la Universidad Tongji. Todos los dientes fueron extraídos por razones ortodóncicas o periodontales. Se obtuvo el consentimiento informado de cada paciente. Se incluyeron en este estudio dientes con raíces de al menos diez milímetros, determinado mediante una sonda periodontal, dientes íntegros sin lesiones cariosas ni fisuras, formación radicular completa y curvatura radicular inferior a diez grados según el método de Schneider. Se excluyeron dientes con conductos múltiples, calcificación del conducto, reabsorción interna o tratamiento endodóntico previo. Tras la extracción, se eliminó todo el cálculo visible y los restos de tejido blando utilizando un instrumento de curetaje periodontal. Posteriormente, los dientes se almacenaron en solución salina al 0,9% a 4°C hasta su uso, para prevenir la deshidratación, y todos los experimentos se realizaron dentro de los tres meses siguientes a la extracción. Las muestras se asignaron a los grupos experimentales mediante una secuencia predefinida de asignación alternada. Concretamente, las muestras se asignaron secuencialmente a cada grupo de forma alternativa hasta alcanzar el tamaño muestral requerido para cada grupo. No se realizó ningún cálculo formal de potencia a priori. El tamaño muestral se seleccionó en función de estudios ex vivo comparables previos, el número de combinaciones de parámetros de irradiación evaluados y la disponibilidad de dientes extraídos elegibles.
Preparación y esterilización del conducto radicular
Se eliminó la corona de cada diente en la unión cemento-esmalte utilizando una sierra de diamante de baja velocidad con enfriamiento continuo por agua, para obtener un segmento radicular estandarizado de 10 mm. La longitud de trabajo se determinó a 1 mm del foramen apical utilizando una lima K tamaño 10. Los conductos radiculares se prepararon con el sistema rotatorio de níquel-titanio ProTaper Universal siguiendo las instrucciones del fabricante, en el orden S1, S2, F1, F2 y F3, hasta alcanzar un tamaño apical de preparación F3. Durante la instrumentación, los conductos se irrigaron con aproximadamente 2 mL de hipoclorito de sodio al 5,25% tras el uso de cada lima rotatoria, lo que resultó en un volumen total de irrigación de aproximadamente 10 mL por conducto. Se realizó una irrigación final con 5 mL de EDTA al 17% durante 1 minuto, seguido de 5 mL de solución salina estéril. El foramen apical se selló con un composite fluido para crear un sistema de conducto cerrado. Las raíces preparadas se esterilizaron mediante autoclave a 121°C durante 20 minutos, se almacenaron en solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) a 4°C y se inocularon con bacterias dentro de las 24 horas posteriores a la esterilización.
Cepa bacteriana y condiciones de cultivo
E. faecalis ATCC 29212 se utilizó para establecer el modelo de conducto radicular infectado. La cepa se cultivó en agar infusión cerebro corazón (BHI) a 37 °C durante 24 h en condiciones aeróbicas. Una colonia aislada se transfirió al caldo BHI e incubó a 37 °C durante 18–24 h. La suspensión bacteriana se ajustó a aproximadamente 1,5 × 108 UFC/mL, equivalente a un estándar de McFarland 0,5, utilizando un valor de densidad óptica a 600 nm (OD600) de 0,08–0,10.
Establecimiento de E. faecalis Modelo de conducto radicular infectado
Para establecer un modelo de biofilm en conducto radicular infectado, la superficie externa de cada raíz esterilizada se recubrió con dos capas de esmalte transparente para uñas con el fin de prevenir la penetración bacteriana a través del cemento. La región apical se recubrió después de haber sellado el foramen apical con un composite resinoso fluido, mientras que el orificio del conducto se dejó sin recubrir para permitir la inoculación bacteriana. Mediante una micropipeta estéril, 10 µL del E. faecalis la suspensión se transfirió a cada conducto radicular individual para llenar toda la longitud del conducto sin derramar. Las muestras inoculadas se colocaron individualmente en placas de cultivo estériles de 24 pocillos, agregando 1,5 mL de caldo BHI a cada pocillo. Las muestras se cultivaron a 37°C en condiciones aeróbicas durante 21 días. El medio de cultivo fue eliminado y reemplazado cada 2 días con caldo BHI estéril fresco para proporcionar nutrientes para el crecimiento bacteriano continuo y para eliminar los restos celulares acumulados. No se realizó ninguna inoculación adicional con E. faecalis durante el reemplazo del medio. Tras completar el período de incubación, todas las muestras viables fueron lavadas una vez con PBS para eliminar las bacterias planctónicas débilmente adheridas antes de las pruebas experimentales. Dos muestras seleccionadas al azar se utilizaron para visualizar la formación de biofilm maduro y la penetración bacteriana en los túbulos dentinarios mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). Los especímenes fueron fijados en glutaraldehído al 2,5 % en 4°C durante 24 h, enjuagado tres veces con PBS, deshidratado mediante una serie gradual de etanol (30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 % y 100 %), con cada paso de 10 min, luego dividido longitudinalmente, secado al aire, montado sobre platillos de aluminio, recubierto con oro por pulverización catódica y examinado mediante MEB.
Grupos experimentales y protocolos de irradiación con láser
Las 135 muestras de raíces infectadas se dividieron en tres grupos experimentales principales según el sistema de láser utilizado: el grupo del láser de diodo de 808 nm, el grupo del láser de tulio de 1940 nm y el grupo del láser de erbio de 2940 nm. Había 45 muestras en cada grupo de láser, que se subdividieron aún más según los parámetros de irradiación. El láser de diodo se operó con potencias medias de 1,0, 1,5 o 2,0 W, y cada ajuste de potencia se aplicó durante 10, 20 o 30 s, lo que dio lugar a nueve subgrupos con tres muestras por subgrupo. El láser de tulio se operó con potencias medias de 1,5, 2,5 o 3,5 W, y cada ajuste de potencia se aplicó durante 10, 20 o 30 s, resultando también en nueve subgrupos con tres muestras por subgrupo. El láser de erbio funcionó en modo de pulso supercorto con una frecuencia fija de 15 Hz. Se aplicaron energías de pulso de 10, 20 o 30 mJ durante 10, 20 o 30 s, generando nueve subgrupos con tres muestras por subgrupo. Tanto el láser de diodo de 808 nm como el láser de tulio de 1940 nm se operaron en modo de onda continua.
En total, se incluyeron seis muestras adicionales, asignándose tres muestras a cada grupo de control negativo y positivo. Al grupo de control negativo se le aplicó solución salina estéril, mientras que al grupo de control positivo se le aplicó hipoclorito de sodio al 5,25% (NaOCl) durante 30 s.
Para los grupos con láser, se siguió un protocolo de irradiación estandarizado. La fibra óptica se introdujo en el conducto radicular hasta la longitud de trabajo y se movió en un movimiento espiral lento y continuo desde la dirección apical hasta la coronal durante todo el período de irradiación. Se utilizaron fibras o puntas de entrega específicas para cada láser, en lugar de una única fibra intercambiable. El láser de diodo de 808 nm se aplicó mediante una fibra terminal de 200 µm, el láser de tulio de 1940 nm mediante una fibra terminal de 200 µm, y el láser de erbio de 2940 nm mediante una punta radial de 400 µm. La fibra o punta de entrega se retiró a una velocidad aproximada de 1 mm/s. Tras alcanzar el orificio del conducto, se volvió a la longitud de trabajo y se repitió el movimiento espiral de apical a coronal hasta completar la duración asignada de irradiación.
Para los láseres de tulio y erbio, los conductos se mantuvieron llenos de solución salina estéril durante la irradiación para simular la activación láser asistida por agua. Aproximadamente 10 µL de solución salina estéril se introdujeron en cada conducto para llenarlo hasta el nivel del orificio del conducto antes de la irradiación. La solución salina se repuso antes de cada ciclo de irradiación, cuando fue necesario, para mantener el conducto lleno de líquido durante todo el tratamiento. Para el grupo con láser de diodo, los conductos se secaron con puntas de papel estériles antes de la irradiación, ya que el láser de diodo a 808 nm tiene una absorción relativamente baja en el agua y se utilizó para producir un efecto antibacteriano fototérmico directo dentro del conducto. En contraste, los láseres de tulio a 1940 nm y de erbio a 2940 nm tienen una absorción en agua considerablemente mayor, por lo que se aplicaron en conductos llenos de solución salina para facilitar efectos fototérmicos y fotomecánicos mediados por el agua. El tratamiento con láser se repitió una vez al día durante tres días consecutivos.
Medición de la Temperatura de la Superficie Radicular Externa
Se midieron los cambios de temperatura en tiempo real sobre la superficie radicular externa durante el primer día de irradiación láser. Cada espécimen radicular se fijó verticalmente en un soporte para matraz en temperatura ambiente (22 °C ± 1 °C). Un termopar tipo K conectado a un termómetro digital se colocó en contacto firme con el tercio medio de la superficie radicular externa, perpendicular al eje longitudinal de la raíz. La sonda del termopar se posicionó mediante una abrazadera ajustable y se aseguró a la superficie radicular con cinta adhesiva resistente al calor para mantener un contacto firme y constante durante toda la medición. La sonda del termopar se calibró antes de cada sesión de medición utilizando agua hirviendo (100 °C) y una mezcla de hielo y agua (0 °C). Las lecturas de temperatura se registraron a intervalos de 50 ms durante todo el período de irradiación (10, 20 o 30 s). Para cada espécimen, se midieron tanto la temperatura basal como la temperatura máxima registrada durante o inmediatamente después de la irradiación láser. El aumento de temperatura desde la temperatura basal hasta la temperatura máxima se calculó como ΔT. Se consideró un ΔT superior a 10 °C como el umbral de posible daño a los tejidos periodontales.
Evaluación microbiológica: recuento de colonias y tasa de inhibición
Para determinar el efecto antibacteriano de los tratamientos con láser, se recolectaron muestras tras cada tratamiento con láser. El conducto se secó con puntas de papel estériles. Se utilizó una lima estéril nueva del tamaño 40 de Hedström para cada espécimen con el fin de obtener virutas de dentina de las paredes del conducto, evitando así la contaminación cruzada entre muestras. Cada viruta de dentina se transfirió a un tubo microcentrífugo separado que contenía 1 mL de PBS estéril. Los tubos se agitaron vigorosamente durante 30 s para liberar las bacterias de las virutas de dentina. Se prepararon diluciones seriadas de 10 veces, desde 10−1 hasta 10−6, transfiriendo 100 µL de la suspensión bacteriana a 900 µL de PBS estéril en cada paso de dilución. Se sembraron alícuotas (30 µL) de cada dilución en placas separadas de agar de infusión cerebral y cardíaca, las cuales se incubaron a 37°C durante 24 h. Se contaron las colonias y se registraron como unidades formadoras de colonias (CFU). Cada dilución se sembró por triplicado, y para el análisis se utilizó el recuento medio de colonias de las tres placas. Las placas se codificaron antes del recuento, y el investigador que realizó el recuento de colonias permaneció ciego respecto a las asignaciones de tratamiento.

Aquí, C es el recuento medio de UFC del grupo control negativo (solución salina) y T es el recuento medio de UFC del grupo experimental.
Análisis de la curva de crecimiento bacteriano
Se investigó el efecto de diversos tratamientos con láser sobre la cinética de crecimiento bacteriano mediante la elaboración de curvas de crecimiento. El día 3 después del tratamiento final con láser, los conductos se lavaron con 5 mL de solución salina estéril. El contenido de los conductos se recolectó utilizando puntas de papel estériles, que luego se transfirieron a un tubo de centrífuga que contenía 5 mL de caldo BHI. El tubo se agitó en vórtex para suspender las bacterias en el caldo. La suspensión bacteriana se ajustó a 1 × 106 UFC/mL. La concentración bacteriana se ajustó según mediciones de OD600 utilizando una curva de calibración previamente establecida para E. faecalis ATCC 29212 y posteriormente se verificó mediante recuento de colonias viables. Se añadió una alícuota de 200 µL de la suspensión a cada pocillo de una microplaca estéril de 96 pocillos. Además, se añadieron 20 µL de aceite mineral estéril a cada pocillo para minimizar la evaporación. La microplaca se colocó en un espectrofotómetro/incubadora mantenido a 37°C, y el valor de OD600 se midió cada hora durante 24 h. Antes de cada medición de OD600, la microplaca se sometió a agitación orbital a aproximadamente 300 rpm durante 10 s para asegurar una suspensión bacteriana homogénea. Cada muestra se analizó en cinco pocillos replicados.
Análisis estadístico
Todos los datos numéricos se presentan como media ± desviación estándar (DE). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando SPSS versión 26.0. La distribución de los datos se evaluó mediante la prueba de Shapiro–Wilk. Se utilizó el análisis de varianza (ANOVA) para comparar más de dos grupos, seguido de la prueba de diferencia significativa honrada de Tukey (HSD) para comparaciones por pares. Las comparaciones entre dos grupos se realizaron mediante una prueba t para muestras independientes. La homogeneidad de la varianza se evaluó mediante la prueba de Levene antes de aplicar pruebas paramétricas. Cuando se violó el supuesto de homogeneidad de la varianza, se aplicó la corrección de Welch, según correspondiera. Se consideró estadísticamente significativo un valor de P < 0,05. Los gráficos se generaron utilizando GraphPad Prism versión 9.0.