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Artículo de investigación

Análisis correlacional del Gránulo Qiming con la red centrada en CMKLR1 y la inflamación sistémica a través del eje intestino-retina en la retinopatía diabética

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DOI:

10.3791/72700

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15 de septiembre de 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Acupuncture-Moxibustion and Tuina, Beijing University of Chinese Medicine

En este artículo

Resumen

Este estudio demuestra que el gránulo Qiming (QMG) mejora la retinopatía diabética (DR) mediante la modulación del eje intestino–retina. QMG reconfiguró la microbiota intestinal, suprimió la inflamación sistémica y restauró la red reguladora centrada en CMKLR1, invirtiendo así el daño histopatológico retiniano. Estos hallazgos posicionan a QMG como una estrategia terapéutica prometedora dirigida al eje intestino–retina para la DR.

Resumen

La retinopatía diabética (DR) es una complicación neurovascular provocada por hiperglucemia crónica e inflamación sistémica, con evidencias emergentes que destacan el eje intestino-retina como un blanco terapéutico crítico pero poco explotado. Este estudio investiga si el Granulado Qiming (QMG) ejerce su eficacia protectora contra la DR mediante la modulación del eje intestino-retina. Se asignaron aleatoriamente ratones C57BL/6 a diferentes grupos experimentales y se sometieron a intervenciones específicas. Los cambios histopatológicos retinianos se evaluaron mediante tinción con hematoxilina-eosina (HE). Los niveles séricos de citocinas inflamatorias (IL-1β, IL-6, TNF-α) se midieron mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). La expresión de proteínas reguladoras clave (CMKLR1, Wnt5a, PPAR-γ, AP-1, TP53) en tejidos retinianos y colónicos se detectó mediante inmunotransferencia (WB). La composición y diversidad de la microbiota intestinal se caracterizaron mediante secuenciación completa del gen 16S de ARNr. Se realizaron análisis de correlación para evaluar las relaciones entre la microbiota intestinal y los factores inflamatorios o proteínas clave. El tratamiento con QMG mejoró las anomalías histopatológicas retinianas, evidenciado por la restauración de la arquitectura laminar retiniana, recuperación parcial del número de células ganglionares retinianas (P < 0,001) e inversión del adelgazamiento retiniano (P < 0,01). Asimismo, redujo marcadamente los niveles séricos de IL-1β, IL-6 y TNF-α (P < 0,0001). A lo largo del eje intestino-retina, QMG invirtió la expresión anormal de proteínas reguladoras clave, notablemente la red centrada en CMKLR1 (Wnt5a, PPAR-γ, AP-1, TP53). Además, QMG restauró la composición, diversidad y función de la microbiota intestinal, y los análisis de correlación revelaron que QMG acopla la inflamación sistémica con estas proteínas reguladoras para modular el eje intestino-retina. Este estudio proporciona evidencia farmacológica preliminar de que QMG mejora la DR acoplando la red reguladora centrada en CMKLR1 (incluyendo Wnt5a, PPAR-γ, AP-1 y TP53) y la inflamación sistémica a través del eje intestino-retina, posicionando a QMG como una estrategia terapéutica prometedora dirigida al eje intestino-retina para la DR.

Introducción

La retinopatía diabética (DR), una de las complicaciones microvasculares más comunes de la diabetes mellitus (DM), es una causa principal de ceguera entre los adultos en edad laboral en todo el mundo1. A nivel global, la DR afecta aproximadamente al 20–30 % de la población con DM2. La hiperglucemia crónica impulsa la patogénesis de la DR al desencadenar una cascada de eventos patológicos, incluyendo el acoplamiento neurovascular alterado, respuestas inflamatorias exacerbadas y estrés oxidativo3. Recientemente, se han observado alteraciones en la diversidad y composición de la microbiota intestinal en pacientes diabéticos con retinopatía en comparación con aquellos sin ella4,5. En consecuencia, el eje intestino-retina, una red de comunicación bidireccional que vincula la homeostasis intestinal con la salud retiniana, ha surgido como un nuevo factor contribuyente a la progresión de la DR. Sin embargo, los mediadores moleculares específicos que traducen las señales del eje intestino-retina en patología retiniana permanecen en gran parte no caracterizados, lo que limita la identificación de biomarcadores confiables y dianas terapéuticas.

El eje intestino-retina delinea una red compleja de comunicación bidireccional entre la microbiota intestinal y sus metabolitos con los tejidos retinianos a través de vías inmunológicas, metabólicas, neuroendocrinas y vasculares, modulando así su equilibrio homeostático6. Molecularmente, el eje intestino-retina se caracteriza por la desregulación de proteínas clave que responden al estrés y determinan el destino celular, específicamente AP-1 y TP537,8,9. Además, CMKLR1, un receptor de quimioquinas clave, surge como un mediador importante de la disfunción endotelial y la desregulación metabólica, estableciendo un vínculo crítico entre las alteraciones de la microbiota intestinal y la patogénesis de la retinopatía diabética10. Importante, la señalización Wnt coordina funciones reguladoras duales en el mantenimiento de la homeostasis vascular retiniana y la función de la barrera epitelial intestinal11, mientras que la señalización PPAR actúa como regulador maestro de las respuestas inflamatorias y los procesos metabólicos en ambos tejidos ocular e intestinal12,13. Estos actores moleculares constituyen colectivamente una red de señalización interconectada dentro del eje intestino-retina, ofreciendo nuevas perspectivas mecanicistas y oportunidades terapéuticas para las complicaciones relacionadas con la diabetes. Por lo tanto, dirigirse a las alteraciones estructurales y funcionales a lo largo de este eje representa una estrategia prometedora para el manejo de la RD.

La medicina tradicional china (MTC) ha desempeñado históricamente un papel importante en el tratamiento de la diabetes y la retinopatía asociada, con decisiones terapéuticas basadas en la diferenciación de síndromes14. El gránulo Qiming (QMG), compuesto por Astragalus membranaceus, Pueraria lobata, Rehmannia glutinosa, Lycium barbarum, Senna obtusifolia, Leonurus japonicus, Typha angustifolia y Whitmania pigra, se aplica ampliamente en el tratamiento de la retinopatía diabética (DR). Autorizado por la Administración Nacional de Productos Médicos de China (número de aprobación: Z20090036), QMG ha completado con éxito ensayos clínicos y ha recibido autorización para su comercialización. QMG exhibe efectos protectores al prevenir el engrosamiento de la membrana basal en los capilares retinianos, reducir el daño a las células perivasculares y a la microvasculatura retiniana, y mantener la morfología patológica local del ojo15, lo que lo convierte en una terapia prometedora para abordar la DR. Al actuar sobre proteínas clave y factores inflamatorios, los componentes activos de QMG ejercen efectos antiinflamatorios, antioxidantes y antiapoptóticos, proporcionando una base mecanicista para su modulación del eje intestino–retina16. Estas propiedades ofrecen una base mecanicista para el potencial de QMG de modular el eje intestino–retina, aunque pocos estudios han explorado esta relación. Por lo tanto, este estudio tiene como objetivo validar la eficacia de QMG en la modulación del eje intestino–retina, aportando evidencia experimental sobre su potencial terapéutico en la DR.

Este estudio combina predicciones teóricas con datos experimentales in vivo para validar la eficacia de QMG en la modulación del eje intestino-retina. Estos hallazgos demuestran que QMG mejora la retinopatía diabética al acoplar la red reguladora centrada en CMKLR1 (incluyendo Wnt5a, PPAR-γ, AP-1 y TP53) con la inflamación sistémica a través del eje intestino-retina, posicionando a QMG como una estrategia terapéutica prometedora dirigida al eje intestino-retina para la retinopatía diabética. El resumen gráfico se muestra en Figure 1.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron cumpliendo con las directrices ARRIVE. El estudio fue aprobado por el Comité de Revisión Ética de Sichuan Scientist Biotechnology Co., Ltd. (IACUC ISSUE SYST-2024-011).  Se proporciona una cronología experimental detallada que resume el diseño del estudio en la Figura Suplementaria 1.

Preparación y tratamiento del animal

Los ratones fueron anestesiados profundamente mediante inhalación de isoflurano al 2 %. Bajo anestesia profunda, se recolectó sangre mediante enucleación retroorbital. Inmediatamente después de la recolección de sangre, se enuclearon los ojos para obtener el tejido retiniano. Posteriormente, se realizó la dislocación cervical bajo anestesia profunda para asegurar la eutanasia. A continuación, se diseccionaron los tejidos del colon inmediatamente. Los animales que presentaron eventos adversos fueron retirados inmediatamente del estudio y recibieron la atención veterinaria adecuada.

Randomización y enmascaramiento

Se alojaron ratones macho C57BL/6, de 5 semanas de edad y con un peso entre 20 y 30 gramos, bajo condiciones estrictamente reguladas, incluyendo temperatura y humedad. Después de una semana de aclimatación, los ratones C57BL/6 se asignaron aleatoriamente a tres grupos (grupos control, modelo e intervención) mediante una secuencia de números aleatorios generada por computadora. La secuencia de aleatorización fue generada por un investigador que no participó en el manejo de los animales ni en la evaluación de los resultados.

Para garantizar el enmascaramiento, todos los cuidados animales, la administración de fármacos y la recopilación de datos fueron realizados por investigadores que desconocían la asignación de los grupos. Las asignaciones codificadas de los grupos se revelaron únicamente tras la finalización de todos los experimentos y los análisis estadísticos. El enmascaramiento incluyó: al técnico que realizó la gavaje oral; al patólogo que evaluó la histología retiniana; y al analista que cuantificó las bandas de inmunotransferencia (WB).

Cálculo del tamaño de la muestra

El tamaño de la muestra se determinó en función de un experimento preliminar que evaluaba los conteos de células ganglionares de la retina (RGC) bajo las mismas condiciones experimentales. Suponiendo un nivel de significancia bilateral (α) de 0,05 y una potencia estadística (1-β) de 0,80, se requirió un mínimo de 5 ratones por grupo para detectar una diferencia clínicamente relevante en los conteos de RGC entre los grupos modelo e intervención. Considerando una tasa de abandono potencial de aproximadamente el 20 %, cada grupo se estableció con 6 ratones.

Establecimiento de animales diabéticos

Al grupo control se le administró una dieta estándar, mientras que a los grupos de intervención y modelo se les suministró una dieta alta en grasas y azúcares (HFHSD) durante un período de cuatro semanas. Tras este período alimenticio, los grupos de intervención y modelo recibieron una inyección intraperitoneal con una solución al 1 % de estreptozotocina (STZ) en una dosis de 35 mg/kg17,18,19,20. Setenta y dos horas después de la inyección, los ratones que presentaron niveles de glucosa en sangre en ayunas superiores a 16,7 mmol/L se consideraron como animales con un modelo de DM exitosamente inducido y fueron seleccionados para experimentos posteriores. Los animales con DM continuaron con la dieta alta en grasas y azúcares durante cuatro meses adicionales, mientras que el grupo control mantuvo su dieta estándar.

Validación taxonómica y evaluación de la calidad

Los ocho ingredientes en QMG se validaron taxonómicamente utilizando la herramienta Modernized Plant Names Search (MPNS, http://mpns.kew.org/mpns-portal/). La calidad del informe de composición para el QMG se evaluó utilizando la herramienta ConPhYMP.

Métodos de administración

En el grupo de intervención, los animales recibieron QMG por vía oral. QMG fue adquirido de Zhejiang Sansheng Mandi Pharmaceutical Co., Ltd. (número de aprobación nacional de medicamentos chino Z20090036). La suspensión de QMG se preparó mezclando uniformemente QMG con agua destilada. A los ratones del grupo de intervención se les administró la suspensión mediante sonda oral en un volumen equivalente al de los grupos modelo y control. La dosis se calculó en función de la dosis terapéutica única clínica de 4,5 g por cada 60 kg de peso corporal (la dosis unitaria estándar de la formulación comercializada), utilizando el método de normalización del área de superficie corporal (BSA) recomendado por la FDA y Reagan-Shaw21. El factor de conversión entre adultos humanos (Km = 37) y ratones (Km = 3) fue de 12,33, lo que resultó en una dosis para ratones de 0,9 g/kg de peso corporal. Al grupo modelo y al grupo control se les administró un volumen equivalente de solución salina mediante sonda oral. La administración se realizó diariamente entre las 9:00 y las 11:00 durante un período consecutivo de 3 meses.

Indicadores de observación y pruebas

Monitoreo general de signos vitales

Se observaron y registraron sistemáticamente los signos vitales generales e indicadores fisiológicos, incluyendo el peso corporal, los niveles de glucosa en sangre, el consumo de agua y alimento, la producción de orina, los niveles de actividad y comportamiento, la temperatura corporal, así como el estado del pelaje y la piel, con el fin de evaluar de manera integral las intervenciones terapéuticas y detectar posibles complicaciones.

Observación de los cambios morfológicos en la retina mediante análisis con tinción HE

Todos los especímenes se procesaron mediante un deshidratador automático utilizando una serie de soluciones de etanol y xileno tras la fijación, seguido de inclusión en parafina. Posteriormente, se cortaron secciones de 4 µm en parafina y se tiñeron con HE, y luego se montaron con goma neutra. Las imágenes de la retina se escanearon utilizando un escáner 3DHISTECH Pannoramic SCAN. El análisis de imágenes y la medición de datos se realizaron con Image-Pro Plus.

Detección de IL-6, TNF-α e IL-1β séricas mediante análisis por ELISA

Las muestras de sangre se recolectaron mediante enucleación retroorbital. El suero se separó por centrifugación a 1.000 × g durante 15 min a 4 °C y se almacenó a -80 °C hasta el análisis. Los niveles séricos de IL‑1β, IL‑6 y TNF‑α se midieron según procedimientos estándar, incluyendo equilibrio de reactivos, adición de muestras, incubación, lavado, adición de conjugado y sustrato, terminación de la reacción, medición de la densidad óptica y cálculo de la concentración basado en una curva estándar. La densidad óptica se leyó a 450 nm utilizando un lector de microplacas, y las concentraciones de citocinas se calcularon frente a curvas estándar.

Detección de las proteínas reguladoras clave en la retina y el colon mediante análisis por WB

Se realizaron tres réplicas biológicas independientes en una sola membrana y se analizaron secuencialmente para las proteínas diana. Todas las réplicas se obtuvieron a partir de una única cohorte de animales sacrificados simultáneamente. Cuando el peso molecular de una proteína diana era demasiado cercano al de GAPDH (<5 kDa de diferencia), se analizaron en membranas independientes para evitar el solapamiento de señales. Cada membrana se incubó exclusivamente con la proteína diana o con GAPDH para garantizar una cuantificación precisa. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: anticuerpo policlonal contra GAPDH policlonal anticuerpo (1:5000), anticuerpo policlonal contra CMKLR1 (1:1000), anticuerpo policlonal contra Wnt5a (1:1000), anticuerpo policlonal contra TP53 (1:1000), anticuerpo monoclonal contra AP-1 (1:5000) y anticuerpo policlonal contra PPAR gamma (PPAR-γ) (1:1000). Las proteínas totales se obtuvieron mediante lisis celular seguida de centrifugación. Las concentraciones de proteína se determinaron mediante el ensayo BCA. Las proteínas extraídas se separaron mediante electroforesis en gel de SDS-PAGE con un gel separador al 12% y posteriormente se transfirieron a membranas. Las membranas se bloquearon en TBST que contenía leche descremada al 5% e incubaron con los anticuerpos primarios correspondientes durante la noche a 4 °C. Tras lavados, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP anti-conejo o anti-ratón en una dilución de 1:10,000. Finalmente, las bandas proteicas se visualizaron y analizaron mediante imágenes de quimioluminiscencia. Durante la visualización y el procesamiento de datos, se recortaron horizontalmente las membranas para eliminar regiones irrelevantes de peso molecular, y se conservaron todas las carreras de muestras sin eliminar áreas intermedias entre carreras. Puede ocurrir una ligera distorsión en los bordes durante el recorte para eliminar regiones irrelevantes del gel.

Detección de la microbiota intestinal mediante análisis de secuenciación del ADNr 16S

Se recolectaron muestras fecales frescas de cada ratón antes de los procedimientos terminales. Los ratones se colocaron individualmente en jaulas estériles durante 10–15 min para permitir la defecación espontánea. Los pellets fecales se recolectaron inmediatamente con pinzas estériles, se transfirieron a tubos estériles de 1,5 mL, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta la extracción de ADN. Todos los procedimientos se realizaron bajo condiciones estériles para minimizar la contaminación cruzada. El intervalo entre la defecación y el congelamiento se mantuvo dentro de los 10 min para asegurar la integridad microbiana. Las muestras de ADN genómico fecal (ADNg) se purificaron utilizando el kit de extracción de ADNg fecal, seguido de la amplificación completa del gen 16S de ARNr mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con los cebadores universales 8F (5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’) y 1492R (5’-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3’). Los productos de PCR se analizaron posteriormente mediante electroforesis en gel de agarosa, se purificaron y cuantificaron para aplicaciones posteriores. La secuenciación de alto rendimiento se realizó en el secuenciador Nanopore GridION. El proceso de análisis de datos incluyó llamada de bases, control de calidad de los datos, anotación de especies, construcción de árboles filogenéticos, análisis de la comunidad, análisis de diversidad alfa y beta, y análisis de especies diferencialmente abundantes y predicción de la función comunitaria. Durante el análisis se utilizaron diversas herramientas y bases de datos, como NanoFilt, Usearch, el lenguaje de programación R, Python y la base de datos SILVA.

Análisis de correlación del eje intestino-retina con inflamación sistémica y microbiota intestinal en múltiples niveles

Para explorar las posibles asociaciones entre la microbiota intestinal multiescalar y las citocinas inflamatorias séricas y las proteínas reguladoras clave, se realizó un análisis de correlación utilizando la plataforma Luoning Bio-Cloud. En primer lugar, se extrajeron del resultado del secuenciamiento los datos de abundancia de especies a nivel de Reino, Filo, Clase, Orden, Familia, Género y Especie. Los factores fisicoquímicos, incluidas las citocinas inflamatorias séricas y los niveles de expresión proteica, se compilaron en un archivo de factores ambientales. Para garantizar la fiabilidad y la visualización de las correlaciones, los datos se normalizaron con el fin de eliminar las diferencias de escala entre la abundancia microbiana y las unidades de medición clínica. Se calcularon los coeficientes de correlación (valores R) y los niveles de significancia correspondientes (valores P). Los resultados se visualizaron mediante un mapa de calor de correlación, en el que los gradientes de color indican la intensidad y dirección de la correlación (rojo representa correlación positiva, azul representa correlación negativa), y los asteriscos (**) indican significancia estadística (P < 0,01).

Métodos estadísticos

Todos los análisis estadísticos y visualizaciones se realizaron utilizando GraphPad Prism. Se empleó la prueba t para comparar medias en datos que seguían una distribución normal. En los casos en que los datos se desviaban de la normalidad, se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis. Se realizaron correlaciones de Spearman o de Pearson para evaluar las relaciones entre variables. Todas las pruebas estadísticas se realizaron como pruebas bilaterales, con una significancia estadística establecida en 0,05.

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Resultados

General situation of experimental animals

Blood glucose levels were significantly elevated in the model group (27.21 ± 6.03 mmol/L) compared with the blank group (P < 0.001), indicating the successful induction of the DM model. During the study period, the experimental animals showed stable body weight, continuous water and food intake, normal urine output, body temperature, healthy fur and skin condition, and normal behavior during the experiment.

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Discusión

La retinopatía diabética (DR) es una complicación neurovascular compleja provocada por hiperglucemia crónica, inflamación y desregulación metabólica22. La Academia Americana de Oftalmología clasifica la DR en retinopatía diabética no proliferativa y retinopatía diabética proliferativa, caracterizada por el inicio de la neovascularización23. Dadas las limitaciones de las estrategias terapéuticas actuales, explorar mecanismos novedosos se ha convertido en una dirección promet...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros competitivos conocidos ni relaciones personales que pudieran haber parecido influir en el trabajo descrito en este artículo.

Agradecimientos

El autor desea reconocer a todos los miembros de su equipo que brindaron un gran apoyo y asistencia para llevar a cabo esta investigación.

Esta investigación fue financiada por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (número de beca: 82474580) y por el Proyecto de Exploración Libre de la Fundación del Hospital del Hospital de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu (n.º 23ZYTS1601).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Anticuerpo monoclonal AP-1Proteintech66313-1-IG1:5000
Anticuerpo policlonal CMKLR1AffinityAF52911:1000
Anticuerpo policlonal GAPDHAffinityAF70211:5000
GoatAnti-Mouse IgG(H+L) HRPMULTI SCIENCESGAM00721:10000
GoatAnti-Rabbit IgG(H+L) HRPMULTI SCIENCESGAR00721:10000
GraphPad Prism/versión 9.5
Image-Pro PlusMedia Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USAversión 6.0
Plataforma Luoning Bio-Cloud http://www.biomediv.cn/login.html
Kit ELISA de IL-1β (interleucina 1 beta) de ratónElabscienceE-EL-M0037Detección de citocinas en suero
Kit ELISA de IL-6 (interleucina-6) de ratónElabscienceE-EL-M0044Detección de citocinas en suero
Kit ELISA de TNF-α (factor de necrosis tumoral alfa) de ratónElabscienceE-EL-M3063Detección de citocinas en suero
NanoFilt/versión 2.7.1
Secuenciador Nanopore GridIONOxford Nanopore Technologieshttps://store.nanoporetech.com/gridion.html
Pannoramic SCAN IIEscáner 3DHISTECH Pannoramic SCAN https://www.3dhistech.com/scanners/pannoramic-scan-ii-digital-scanner/
Anticuerpo policlonal PPAR gamma (PPAR-γ) ImmunoWaybs-0530R1:1000
Python/versión 3.7.4
Granulado QimingZhejiang Sansheng Mandi Pharmaceutical Co., Ltd.Número de aprobación nacional chino de medicamento Z200900360,9 g/kg, por gavaje oral
Lenguaje de programación R/versión 4.0.3
Base de datos SILVA/versión 138
Estreptozotocina (STZ)Sigma-AldrichS013035 mg/kg, i.p.
Anticuerpo policlonal TP53Abcamab1314421:1000
Usearch/versión 10.0.240
Anticuerpo policlonal Wnt5aProteintech55184-1-AP1:1000
Kit Zymo Research BIOMICS DNA MicroprepZymo ResearchD4301Extracción de ADN genómico fecal

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