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Artículo de investigación
Este estudio exploratorio en seis pacientes con enfermedad de Parkinson que se sometieron a un trasplante de microbiota fecal observó cambios temporales en la diversidad microbiana intestinal, la composición taxonómica y los perfiles funcionales predichos, junto con mejoras en los síntomas motores y no motores. Estos hallazgos proporcionan evidencia preliminar que respalda la realización de investigaciones adicionales sobre intervenciones basadas en la microbiota.
Se ha asociado alteraciones en la microbiota intestinal con la enfermedad de Parkinson (EP), pero los cambios microbianos longitudinales tras el trasplante de microbiota fecal (TMF) y sus correlaciones clínicas siguen siendo poco comprendidos. Este estudio observacional retrospectivo de un solo centro incluyó a 6 pacientes con EP, estratificados en subgrupos de alta y baja gravedad según la duración de la enfermedad (>6 años frente a ≤6 años). Se recolectaron 36 muestras fecales antes del TMF y mensualmente durante cinco meses posteriores. La diversidad microbiana, la estructura comunitaria, la composición taxonómica y los perfiles funcionales predichos se evaluaron mediante secuenciación del gen del ARNr 16S. Los análisis incluyeron diversidad alfa y beta, abundancia taxonómica, tamaño del efecto del análisis discriminante lineal, predicción funcional basada en Tax4Fun2 y correlaciones de rango de Spearman entre características microbianas e indicadores clínicos. Los análisis descriptivos indicaron diferencias en la riqueza microbiana, diversidad, estructura comunitaria y funciones predichas entre los subgrupos de gravedad y a lo largo de los puntos temporales posteriores al TMF. En la línea base, el subgrupo de baja gravedad presentó mayor riqueza y diversidad microbiana que el subgrupo de alta gravedad, con abundancias relativamente más altas de taxones como Bifidobacterium y Lactobacillus. Un mes después del TMF, la riqueza y diversidad aumentaron respecto a la línea base en el subgrupo de alta gravedad, acompañadas de cambios en la composición taxonómica. Ambos subgrupos mostraron variación asociada al tiempo en la diversidad microbiana y en el enriquecimiento de vías predichas del Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes tras el TMF. Las funciones predichas incluyeron metabolismo de carbohidratos y aminoácidos, biosíntesis de metabolitos secundarios, transporte de membrana y transducción de señales. Varias unidades taxonómicas operativas se correlacionaron con indicadores de deterioro motor, estreñimiento, calidad del sueño, estado funcional y síntomas neuropsiquiátricos. Por lo tanto, el TMF se asoció con cambios longitudinales en la diversidad, composición y funciones predichas de la microbiota intestinal, y ciertas características microbianas se asociaron con indicadores motores y no motores. Dado el pequeño tamaño del cohorte retrospectivo, estos hallazgos son preliminares y requieren confirmación en estudios controlados más amplios. Estudios futuros deberían determinar si estas alteraciones microbianas son reproducibles, persisten más allá de cinco meses, reflejan el enraizamiento del donante y se corresponden con una mejora clínica medible tras el trasplante en la EP.
La enfermedad de Parkinson (EP) es un trastorno neurodegenerativo progresivo común, caracterizado por bradicinesia, rigidez, temblor de reposo e inestabilidad postural1. Aunque su patogénesis no se ha elucidado por completo, se ha implicado a múltiples factores, incluyendo la neuroinflamación, exposiciones ambientales y la susceptibilidad genética, en el inicio y progresión de la enfermedad2. La evidencia epidemiológica indica que la EP es uno de los trastornos neurológicos más comunes en adultos mayores y está asociada con una carga sustancial de discapacidad, con una prevalencia que aumenta con la edad3. Los tratamientos actuales, particularmente la terapia de reemplazo de dopamina, pueden aliviar los síntomas motores hasta cierto punto, pero sus efectos sobre la progresión de la enfermedad y muchos de los síntomas no motores siguen siendo limitados, y las respuestas al tratamiento varían entre individuos4. Por lo tanto, la investigación adicional sobre los cambios biológicos relacionados con la EP y los posibles objetivos terapéuticos sigue siendo clínicamente importante.
La comunidad microbiana intestinal desempeña un papel importante en el mantenimiento de la integridad de la barrera intestinal, la regulación de las respuestas inmunitarias y el apoyo a la homeostasis metabólica5. El trasplante de microbiota fecal (FMT) implica la transferencia de microbiota fecal de un donante sano a un receptor para restaurar el equilibrio microbiano intestinal6,7. Varios estudios en animales han sugerido que el trasplante de microbiota intestinal puede influir en fenotipos neuroconductuales8,9. Dado que la microbiota de pacientes con depresión o ansiedad puede inducir cambios conductuales correspondientes en ratones, la microbiota de donantes sanos podría mejorar los resultados conductuales10. Además, observaciones clínicas preliminares han reportado mejoría de los síntomas tras el FMT en algunos pacientes con enfermedad de Parkinson (PD) y autismo, lo que sugiere que las intervenciones basadas en la microbiota podrían tener relevancia potencial en trastornos neurológicos y neuropsiquiátricos11,12. No obstante, los mecanismos subyacentes a estos efectos aún no están claros, y se requieren estudios clínicos para establecer la seguridad y eficacia del FMT en la enfermedad de Parkinson.
Aunque estudios previos han sugerido una relación entre la microbiota intestinal y la EP, los cambios longitudinales en la composición microbiana intestinal tras el TFM y sus asociaciones con las características clínicas aún no se comprenden bien. Aún no está claro si los pacientes con diferentes grados de gravedad clínica presentan respuestas microbianas distintas tras el TFM.
En este estudio observacional retrospectivo de un solo centro, revisamos a pacientes con EP que se sometieron a TFM en la práctica clínica habitual. Se analizaron las puntuaciones clínicas antes y después de la TFM, y las muestras fecales disponibles se analizaron adicionalmente mediante secuenciación del gen 16S rRNA para explorar la diversidad microbiana intestinal, la composición taxonómica, los perfiles funcionales predichos y las correlaciones con indicadores clínicos. El objetivo de este estudio fue caracterizar los resultados clínicos y los perfiles de la microbiota intestinal tras la TFM en la EP y proporcionar evidencia preliminar para futuros estudios controlados prospectivos.
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El estudio se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki, y el protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Segundo Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Nanjing (número de aprobación: 2021-KY-100-01). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes.
Este estudio observacional retrospectivo de un solo centro se realizó en el Departamento de Neurología del Segundo Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Nanjing. Entre enero de 2022 y diciembre de 2023, se incluyó un total de 32 pacientes con EP primaria que cumplían con los Criterios Diagnósticos para la Enfermedad de Parkinson (edición 2020). En última instancia, se incluyó en el análisis subsiguiente a seis pacientes que cumplían criterios estrictos de selección y completaron todos los procedimientos del estudio. Los detalles sobre la selección, exclusión y seguimiento se muestran en la Figura Suplementaria 1.
Recolección de muestras fecales y análisis de la comunidad microbiana
El microbiota fecal se obtuvo de voluntarios sanos. El proceso de selección de donantes se realizó estrictamente de acuerdo con el Consenso de Expertos Chinos sobre la Aplicación Clínica del Trasplante de Microbiota Fecal. Criterios de inclusión de donantes: Edad entre 18 y 40 años, sin antecedentes de enfermedades crónicas; sin antecedentes de enfermedades gastrointestinales, trastornos metabólicos, enfermedades autoinmunes o trastornos psiquiátricos; sin uso de antibióticos, probióticos, inmunosupresores o inhibidores de la bomba de protones en los últimos 3 meses; sin viajes a zonas epidémicas, transfusiones sanguíneas ni antecedentes quirúrgicos en los últimos 6 meses. El cribado sanguíneo y fecal para descartar enfermedades infecciosas y patógenos incluye: virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis B (VHB), virus de la hepatitis C (VHC), Treponema pallidum, Clostridium difficile, Salmonella, Shigella, Campylobacter, patógeno Escherichia coli, virus entéricos y parásitos. El volumen de una sola muestra válida de heces debe ser de al menos 50 g. Utilizando un sistema automatizado de purificación de microbiota fecal (ver Tabla de materiales), se añadieron 500 mL de solución salina estéril por cada 100 g de materia fecal fresca, seguidos de tres ciclos de centrifugación y lavado estandarizados (700 × g, 3 min), e inmediatamente inoculados tras preparar una suspensión con solución salina estéril en una proporción de volumen 1:2. Los sujetos recibieron una única inyección de 150 mL de la suspensión que contenía aproximadamente 5 × 10^13 bacterias viables13.
Todos los receptores recibieron la MTF mediante colonoscopia, con el endoscopio avanzado hasta el ciego y el colon ascendente; la suspensión se infundió lentamente y de forma uniforme a través del canal de biopsia para favorecer la colonización preferencial del colon derecho. Después de la infusión, los pacientes permanecieron en posición decúbito lateral derecho durante al menos 2 h. Previamente al procedimiento, se siguió una dieta baja en residuos durante 3 días, seguida de una dieta líquida completa durante 24 h antes del procedimiento, con ayuno de sólidos durante 6 h y de líquidos durante 2 h previas a la infusión. La noche anterior al trasplante, se realizó una limpieza estándar de todo el intestino con solución electrolítica de polietilenglicol hasta obtener un efluente claro y libre de heces. Las restricciones medicamentosas incluyeron la suspensión de antibióticos sistémicos al menos 72 h antes de la MTF y su evitación durante 1 semana posterior al procedimiento. Los inhibidores de la bomba de protones (IBP) se suspenden entre 24 y 48 h antes del procedimiento, y los laxantes y probióticos se interrumpen el día del trasplante.
Durante el procedimiento, se monitorearon continuamente la frecuencia cardíaca, la presión arterial y la saturación de oxígeno, y se observaron cualquier síntoma, como distensión abdominal, dolor o náuseas; la infusión se detuvo inmediatamente si ocurría dolor abdominal severo o hipotensión. Durante los primeros 7 días posteriores al trasplante, se realizó un seguimiento diario para registrar la frecuencia de movimientos intestinales, la consistencia de las heces y todos los eventos adversos, incluyendo dolor abdominal, diarrea, fiebre y hematoquecia. El seguimiento a largo plazo se extendió hasta 5 meses, con muestreos programados de heces para análisis de la microbiota intestinal y evaluaciones clínicas mediante la Escala Unificada de Evaluación de la Enfermedad de Parkinson (UPDRS) y la Puntuación de Constipación de Wexner, junto con la documentación de cambios en los síntomas y del uso de medicamentos concomitantes, con el fin de evaluar de manera integral tanto la eficacia como la seguridad.
Se recogieron muestras fecales en seis puntos temporales: antes del TFM y a los 1, 2, 3, 4 y 5 meses después del TFM. Todos los participantes recibieron instrucciones estandarizadas para la recolección de muestras de heces. Aproximadamente de 10 a 20 g de la porción media de la muestra fecal se recogieron utilizando fórceps estériles y se colocaron en recipientes estériles para recolección. Las muestras se transportaron al laboratorio dentro de las 2–3 h posteriores a la recolección y se dividieron en alícuotas en tubos estériles de microcentrifugado de 1,5 mL (véase Tabla de materiales) por investigadores capacitados bajo condiciones asépticas. Todas las alícuotas se almacenaron inmediatamente a −80 °C hasta su posterior análisis.
Después de la recolección de las muestras fecales, todos los especímenes fueron transportados en hielo seco a un proveedor comercial de secuenciación (ver Tabla de Materiales) para la secuenciación del gen del ARNr 16S. La preparación de bibliotecas, la secuenciación y el control de calidad inicial se realizaron según el protocolo estándar del proveedor. Se extrajo ADN genómico de cada muestra fecal, y las regiones hipervariables V3-V4 del gen bacteriano del ARNr 16S se amplificaron mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los cebadores 341F y 805R. La secuenciación se llevó a cabo en una plataforma de secuenciación de lectura corta de escritorio (ver Tabla de Materiales) utilizando química de lectura apareada 2 × 300 pb para caracterizar los perfiles microbianos intestinales de los pacientes antes del TFM y en diferentes puntos temporales de seguimiento posteriores al TFM. Después de la secuenciación, las lecturas crudas se procesaron para obtener secuencias de alta calidad para el análisis microbiano posterior. La clasificación taxonómica se realizó utilizando un paquete comercial de asignación taxonómica de 16S y su base de datos asociada de identificación microbiana (ver Tabla de Materiales). Los perfiles taxonómicos resultantes se utilizaron para análisis posteriores de diversidad microbiana, composición de la comunidad, abundancia diferencial y función microbiana predicha.
Evaluaciones clínicas y etiquetas analíticas
Los pacientes con EP se estratificaron en dos grupos según la gravedad de la enfermedad basada en la duración: un grupo de alta gravedad (>6 años, designado como “_H”) y un grupo de baja gravedad (≤6 años, designado como “_L”). Las muestras fecales recolectadas antes del TFM se definieron como muestras basales y se etiquetaron como FB_H o FB_L según el grupo de gravedad correspondiente. Las muestras recolectadas a los 1, 2, 3, 4 y 5 meses después del TFM se etiquetaron como FP1M_H, FP2M_H, FP3M_H, FP4M_H y FP5M_H para el grupo de alta gravedad, y como FP1M_L, FP2M_L, FP3M_L, FP4M_L y FP5M_L para el grupo de baja gravedad. Los parámetros clínicos evaluados incluyeron el puntaje de constipación de Wexner, la Escala de Síntomas No Motores (NMSS), el Cuestionario de Síntomas No Motores (NMSQ), el Inventario Neuropsiquiátrico (NPI), la etapa de Hoehn–Yahr, la Escala de Actividades de la Vida Diaria (ADL), el Índice de Calidad del Sueño de Pittsburgh (PSQI), la Escala Unificada de Evaluación de la Enfermedad de Parkinson (UPDRS I–VI) y el puntaje total de la UPDRS. Se utilizó una combinación de métodos estadísticos descriptivos e inferenciales para analizar los cambios en los indicadores clínicos de los pacientes con EP en el grupo de alta gravedad (grupo _H) y en el grupo de baja gravedad (grupo _L) en seis puntos temporales. Para explorar preliminarmente las diferencias entre grupos en todos los puntos temporales, se compararon las distribuciones de los indicadores entre los grupos _H y _L en cada punto temporal mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon, y se aplicó un modelo mixto lineal (LMM) más riguroso con interceptos aleatorios específicos por paciente. Debido al tamaño limitado de la muestra, los resultados del modelo de efectos mixtos se proporcionan únicamente como referencias exploratorias. El punto final primario de este estudio exploratorio fue el cambio en la diversidad y composición microbiana intestinal desde el punto basal hasta los tiempos posteriores al trasplante de microbiota fecal, mientras que los cambios clínicos se evaluaron como puntos finales secundarios.
Agrupamiento de OTU, análisis de diversidad y abundancia taxonómica
Se utilizaron unidades taxonómicas operativas (OTU) para resumir la composición de la comunidad microbiana, y las secuencias con una similitud ≥97% se agruparon en la misma OTU. La profundidad de secuenciación se evaluó mediante curvas de rarefacción basadas en Shannon, cuyos tramos de meseta indican una cobertura generalmente suficiente para los análisis posteriores de diversidad.
La diversidad alfa se evaluó utilizando los índices Chao1 y estimador de cobertura basado en abundancia (ACE) para la riqueza microbiana, y los índices de Shannon y Simpson para la diversidad general y el equilibrio. La diversidad beta se evaluó mediante distancias UniFrac ponderadas y no ponderadas, seguidas de un análisis de coordenadas principales (PCoA) para visualizar las diferencias en la composición de la comunidad microbiana entre grupos. Las diferencias entre grupos en diversidad alfa y beta se analizaron usando pruebas no paramétricas y el Análisis Multivariado de Varianza Permutacional (PERMANOVA), respectivamente, como se describe en la sección de análisis estadístico.
La composición taxonómica se resumió a nivel de filo, clase, orden, familia y género basándose en datos de secuenciación del gen del ARNr 16S. Mediante un paquete de análisis de ecología comunitaria para R (véase la Tabla de materiales), identifique y visualice los 10 taxones más abundantes en cada nivel taxonómico. Los perfiles taxonómicos se mostraron mediante gráficos de barras, y se compararon además algunos taxones seleccionados entre grupos utilizando gráficos de caja.
Análisis de abundancia diferencial de taxones microbianos
Los taxa diferencialmente abundantes entre grupos predefinidos se identificaron mediante el análisis del tamaño del efecto mediante el análisis discriminante lineal (LEfSe). LEfSe integra la prueba de Kruskal-Wallis, la prueba de Wilcoxon y el análisis discriminante lineal (LDA) para identificar taxa con significancia estadística y valor discriminatorio. Se consideró que los taxa con P < 0,05 y una puntuación LDA (log10) > 3 presentaban abundancia diferencial. Las abundancias relativas de los taxa discriminatorios se visualizaron mediante gráficos de barras taxonómicos.
Predicción funcional y análisis de correlación clínica
Los perfiles funcionales predichos de la microbiota intestinal se infirieron a partir de datos de secuenciación del gen de ARNr 16S utilizando Tax4Fun2 y se anotaron según la base de datos Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Las vías predichas con enriquecimiento diferencial se identificaron mediante LEfSe, utilizando P < 0,05 y un valor de puntuación LDA (log10) > 3 como umbrales. Dado que estos perfiles funcionales se infirieron en lugar de medirse directamente mediante enfoques metagenómicos o metabolómicos, se interpretaron como diferencias funcionales predichas. Se realizó un análisis de correlación de rangos de Spearman para explorar las asociaciones entre las características microbianas y los indicadores clínicos.
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software R (véase la Tabla de materiales). Las variables clínicas se resumieron como medianas y rangos (mínimo–máximo). Los índices de diversidad alfa se compararon entre grupos mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon, mientras que la diversidad beta se evaluó mediante PERMANOVA con 999 permutaciones. Los taxa y vías funcionales predichas con abundancia diferencial se identificaron mediante LEfSe, utilizando P < 0,05 y una puntuación LDA (log10) > 3 como umbrales de significancia. Para el análisis longitudinal de abundancia diferencial, se aplicó un modelo de efectos mixtos con interceptos aleatorios específicos para cada paciente, seguido de comparaciones por pares post hoc con corrección de la tasa de falsos descubrimientos de Benjamini-Hochberg. Se utilizó el análisis de correlación de rangos de Spearman para evaluar las asociaciones entre las características microbianas intestinales y los indicadores clínicos, aplicando la corrección de la tasa de falsos descubrimientos de Benjamini–Hochberg a los valores de P de correlación. Se consideró estadísticamente significativo un valor de P bilateral < 0,05. Se aplicó corrección por comparaciones múltiples a los análisis de correlación y de abundancia taxonómica. Dado el tamaño pequeño de la muestra y el diseño de muestreo longitudinal repetido, los análisis estadísticos se consideraron exploratorios y los resultados se interpretaron con cautela.
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Selección de pacientes y características basales
Se incluyeron seis pacientes con EP en el análisis final, incluyendo tres hombres y tres mujeres. La edad mediana fue de 69,0 años (rango: 61-75) y el índice de masa corporal mediano fue de 22,6 kg/m2. La cohorte incluyó dos fenotipos clínicos predominantemente rígidos, dos predominantemente temblorosos y dos mixtos. Las características clínicas basales se muestran en la Tabla 1.
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La MTF es una intervención basada en la microbiota que transfiere microbiota fecal de un donante sano al intestino del receptor para restaurar el equilibrio microbiano intestinal14. Hay evidencia creciente de que la microbiota intestinal desempeña un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis del sistema nervioso15. Evidencia proveniente del eje bidireccional intestino-cerebro indica que la microbiota intestinal podría influir en la inflamación del sistema nervi...
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Conflicto de intereses: Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Agradecemos a todos los colegas que han ayudado y apoyado esta investigación. Su colaboración y aliento han sido invaluables para nuestro trabajo.
Financiamiento: Esta investigación fue financiada por el Programa Clave Provincial de Jiangsu para la Salud de las Personas Mayores (LKZ2022004).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Sistema MiSeq | Illumina, Inc. | SY-410-1003 | Plataforma de secuenciación de lectura corta de banco utilizada para la secuenciación de amplicones V3–V4 del ARNr 16S con química de lectura apareada 2 × 300 pb. |
| Metagenome@KIN | World Fusion Co., Ltd. | v2.2.1; https://www.w-fusion.com/metagenome | Software comercial utilizado para la asignación taxonómica del ARNr 16S y el análisis de comunidades microbianas. |
| Base de datos de identificación microbiana (bacteriana) | TechnoSuruga Laboratory Co., Ltd. | DB-BA, base de datos v10.0; https://www.tecsrg.co.jp/services/enki/ | Base de datos de referencia de ARNr 16S bacteriano utilizada para la identificación microbiana. |
| Primer 341F | BGI Genomics Co., Ltd. | Oligonucleótido personalizado; sin número de catálogo | Secuencia del cebador directo: 5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′. |
| Primer 805R | BGI Genomics Co., Ltd. | Oligonucleótido personalizado; sin número de catálogo | Secuencia del cebador inverso: 5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′. |
| Servicio de secuenciación del gen del ARNr 16S | BGI Genomics Co., Ltd. (Wuhan, China) | https://www.bgi.com/us/sequencing-services/rna-sequencing-solutions/16s18s-its-sequencing/ | Proveedor comercial de secuenciación; realizó la preparación de bibliotecas, la secuenciación y el control de calidad inicial. |
| Tubos microcentrífugos Eppendorf Safe-Lock, Biopur, 1,5 mL | Eppendorf SE | '0030121589 | Tubos estériles de polipropileno utilizados para alícuotas de muestras fecales destinadas al almacenamiento a −80 °C. |
| LEfSe | Segata Lab/bioBakery | v1.1.2; https://github.com/SegataLab/lefse | Software de tamaño del efecto mediante análisis discriminante lineal utilizado para identificar taxones y vías predichas con abundancia diferencial. |
| Tax4Fun2 | Equipo de desarrollo de Tax4Fun2 | v1.1.5; https://github.com/fjossandon/Tax4Fun2 | Paquete de R utilizado para inferir perfiles funcionales de la Enciclopedia de Kyoto de Genes y Genomas a partir de datos de ARNr 16S. |
| Paquete R microeco | Chi Liu y colaboradores | v1.15.0; https://cran.r-project.org/package=microeco | Paquete para análisis y visualización de ecología comunitaria destinado a estudios de abundancia y diversidad microbianas. |
| Software R | Foundation for Statistical Computing | Versión no reportada; https://www.r-project.org/ | Entorno de computación estadística utilizado para análisis clínicos y del microbioma; se debe confirmar la versión exacta con los autores. |
| Sistema automatizado de purificación de microbiota fecal GenFMTer | Nanjing FMT Medical Co., Ltd. | Modelo: GenFMTer; https://en.fmtmed.com/ | Sistema automatizado utilizado para la centrifugación, lavado y preparación estandarizados de la suspensión de microbiota fecal. |
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