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Diseción de Aedes albopictus y Extracción de ARN Total de los Tejidos Obtenidos Tras la Diseción

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DOI:

10.3791/72811

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30 de octubre de 2026

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1School of Public Health, Nanjing Medical University, 2School of Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, 3National Health Commission Key Laboratory on Parasitic Disease Prevention and Control, Jiangsu Provincial Key Laboratory on Parasites and Vector Control Technology, Jiangsu Institute of Parasitic Diseases

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para diseccionar el intestino medio, los ovarios y las glándulas salivales de Aedes albopictus, seguido de la extracción de ARN total para la caracterización molecular de tejidos vectores en estudios de transmisión de virus transmitidos por mosquitos.

Resumen

En Foshan, provincia de Guangdong, China, en julio de 2025, se produjo un brote de dengue y chikunguña. Ae. albopictus es un vector principal de estos virus. Este protocolo describe un método sencillo y estandarizado para la disección del intestino medio, las glándulas salivales y los ovarios de Ae. albopictus, y la extracción de ARN total a partir de los tejidos disecados. Mosquitos hembras de tres días de edad y sin alimentarse con sangre fueron anestesiados mediante congelación a −20 °C durante 2 min, tras lo cual se realizaron las disecciones de los tejidos objetivo. El ARN total se extrajo utilizando un kit de extracción de ARN de tejidos, se cuantificó mediante un espectrofotómetro de microvolumen y se utilizó para el análisis de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (RT-qPCR). Los resultados muestran que el método de disección separa rápidamente y por completo los tejidos, y que el ARN de los tejidos separados puede alcanzar una pureza relativamente alta. La RT-qPCR demostró los patrones de expresión y la estabilidad relativa de tres genes de referencia (GAPDH, β-actin y RPS6). El método es directo, validado y proporciona un soporte técnico estandarizado para investigaciones relacionadas con Ae. albopictus.

Introducción

Aedes albopictus (Ae. albopictus) es un vector de varios patógenos, incluido el virus del dengue (DENV) y el virus de chikunguña (CHIKV)1,2,3. Está ampliamente distribuido y ha provocado brotes de enfermedades transmitidas por mosquitos en muchas regiones4,5. La capacidad de Ae. albopictus para transmitir patógenos, conocida como competencia vectorial, varía entre poblaciones y está relacionada con la expresión específica de genes en intestinos medios, ovarios y glándulas salivales6. Comprender la estructura de estos tejidos y extraer ARN de alta calidad son pasos cruciales para entender la replicación, diseminación y transmisión de virus transmitidos por vectores7.

La detección de la expresión génica relativa mediante PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) depende de la disección precisa de los tejidos de Ae. albopictus y de la extracción de ARN de alta calidad8,9. Hasta la fecha, los protocolos en video publicados para la disección del intestino medio, los ovarios y las glándulas salivales se han centrado principalmente en Aedes aegypti10. Por lo tanto, este protocolo demuestra la disección del intestino medio, los ovarios y las glándulas salivales de Ae. albopictus, en el que los tejidos diseccionados se colocan directamente en tubos de molienda que contienen solución de preservación de ARN, evitando los pasos de transferencia de tejidos y minimizando la pérdida durante la transferencia. El ARN total se extrae de los tejidos diseccionados mediante un método basado en columnas, que requiere menos manipulaciones y menos tiempo que el método convencional con TRIzol11. Esta extracción suele producir entre 0,1 y 0,3 µg de ARN total a partir de las glándulas salivales de cinco ejemplares de Ae. albopictus, con relaciones A260/A280 de entre 1,8 y 2,0, cumpliendo así los requisitos de pureza necesarios para la RT-qPCR posterior. Se realiza RT-qPCR para medir la expresión de tres genes de referencia en los tejidos de Ae. albopictus, evaluando así la calidad del ARN extraído de cada tejido.

Cabe señalar que este protocolo fue validado únicamente para el intestino medio, los ovarios y las glándulas salivales de hembras de Ae. albopictus de 3 días de edad y que no se han alimentado de sangre, y no es adecuado para la extracción de ARN del cuerpo graso. Obtener tejidos intactos y separados es la base para los análisis posteriores. A través de la disección sistemática de los tejidos de Ae. albopictus y la extracción de ARN de alta calidad, este protocolo brinda apoyo técnico para la detección subsiguiente de expresión génica, la evaluación del nivel poblacional de competencia vectorial y el control de la transmisión de arbovirus.

Protocolo

Este estudio utilizó únicamente organismos criados en laboratorio Ae. albopictus mosquitos. Por lo tanto, no se requirió aprobación ética institucional para este estudio. La Ae. albopictus la cepa utilizada en este experimento fue proporcionada por el Laboratorio Clave para el Control y la Prevención de Enfermedades Parasitarias de la Comisión Nacional de Salud de China (Jiangsu). Esta colonia fue originalmente recolectada en la ciudad de Wuxi en la década de 1980 y se ha mantenido en el insectario en Instituto de Enfermedades Parasitarias de Jiangsu en condiciones estándar. La colonia de mosquitos se mantuvo en una cámara climática artificial a 25 °C ± 1 °C, 75% ± 5% de humedad relativa, con un fotoperiodo de 10 h de luz y 14 h de oscuridad. Las larvas se criaron en agua ultrapura y se alimentaron con una mezcla de polvo de hígado de cerdo y extracto de levadura (Shanghai Brewery) en una proporción de 2:1. Los mosquitos adultos se mantuvieron con una solución de glucosa al 5%. Los reactivos y el equipo utilizados se enumeran en el Tabla de materiales.

1. Preparación de materiales

  1. Preparación de soluciones
    1. Preparación del tampón PBS 1x: Pese 8,0 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4 y 0,24 g de KH2PO4. Disuelva en 800 mL de agua ultrapura con agitación. Ajuste el pH a 7,4. Lleve el volumen final a 1 L. Autoclave a 121 °C durante 20 min.
    2. Preparación de la solución de DEPC: Añada 1 mL de solución stock de DEPC a 1 L de agua ultrapura. Agite vigorosamente en un agitador magnético durante 12–16 h. Autoclave a 121 °C durante 20 min.
      ADVERTENCIA: El DEPC es altamente tóxico y carcinogénico. Use guantes y gafas de seguridad, y manipúlelo en una campana extractora.
      NOTA: Cubra el vaso de precipitados con papel de aluminio durante la agitación vigorosa. Ali-cuote la solución de DEPC y almacénela a -20 °C durante hasta 6 meses.
  2. Preparación de materiales desechables
    1. Esterilice las herramientas de disección: Coloque agujas de disección de 1 mm y pinzas de punta fina en un recipiente de aluminio y autoclave a 121 °C durante 20 min.
    2. Prepare tubos de molienda de 2 mL que contengan perlas de sílice de 0,5–1,0 mm. Colóquelos en un recipiente de aluminio y autoclave a 121 °C durante 20 min.
    3. Añada 200 µL de la solución de preservación de ARN proporcionada en el kit a cada tubo de molienda.
      NOTA: La calidad del ARN en los tejidos disminuye significativamente en menos de 1 min después de la extracción del organismo. Prepare con antelación los tubos de molienda con la solución de preservación.

2. Recolección de Ae. albopictus

NOTA: Use batas blancas de laboratorio y guantes. No use ropa oscura, ya que los colores oscuros atraen a los mosquitos.

  1. Cierre todas las puertas, ventanas y sistemas de ventilación en la habitación que contiene la jaula de mosquitos para evitar la fuga de Ae. albopictus.
  2. Encienda el aspirador eléctrico e insértelo en la jaula de mosquitos. Dirija el aspirador hacia Ae. albopictus posados en las paredes internas de la jaula y recolecte los mosquitos.
  3. Mantenga el aspirador encendido mientras lo retira lentamente de la jaula. Selle inmediatamente la jaula y cierre la tapa del aspirador.
  4. Retire la cámara de recolección y colóquela a -20 °C durante 2 min para la inmovilización por frío de Ae. albopictus.
  5. Coloque un recipiente de vidrio de 10 cm sobre hielo para pre-enfriarlo. Transfiera los ejemplares inmovilizados de Ae. albopictus desde la cámara de recolección al recipiente de vidrio.
    NOTA: Controle estrictamente el tiempo de inmovilización por frío para prevenir daños en los tejidos.

3. Identificación de hembras de Ae. albopictus antes del disección

  1. Seleccione ejemplares morfológicamente intactos y anestesiados por frío de Ae. albopictus del recipiente de vidrio y transfiéralos a una lámina de vidrio. Examine bajo un microscopio estereoscópico con una ampliación de 80x.
  2. Identifique la franja longitudinal blanca en el mesonoto.
  3. Confirme las bandas blancas en la base de los segmentos tarsales y en la base de los tergitos abdominales II-VI12.
  4. Examine las antenas con una ampliación de 80x. Distinga entre antenas filiformes (hembra) y antenas pinnadas (macho) para identificar las hembras.

4. Disección abdominal de Ae. albopictus

  1. Coloque tres gotas de PBS 1x estéril de izquierda a derecha sobre un portaobjetos esterilizado, colocando cada gota aproximadamente 20 µL en volumen y espaciados aproximadamente 5 mm entre sí.
    NOTA: Las gotas de PBS deben ser lo suficientemente grandes como para sumergir por completo el Ae. albopictus.
  2. Utilice fórceps finos para sujetar las alas de Ae. albopictus y coloque el mosquito en la gota de PBS más a la izquierda.
  3. Oriente el Ae. albopictus con el lado ventral orientado hacia arriba. Utilice la mano izquierda para sostener una aguja de disección y presione sobre el segundo segmento abdominal para inmovilizar el Ae. albopictus.
  4. Con la mano derecha, inserte una aguja de disección de 1 mm en el punto medio del sexto segmento abdominal. Realice una incisión transversal, semicircular, para abrir la cavidad abdominal.
  5. Mueva la aguja de disección sostenida con la mano derecha aproximadamente 2 mm hacia posterior y presione en la región media de los segmentos abdominales VI-VIII para fijar el abdomen.
    NOTA: Los ovarios se encuentran ubicados dorsalmente dentro de los segmentos abdominales II-VI. No mueva la aguja aleatoriamente al presionar los segmentos VI-VIII para evitar dañar la morfología intacta de los ovarios.
  6. Utilice la mano izquierda para sujetar el segundo segmento abdominal con la aguja de disección y tire suavemente hacia afuera para separar el abdomen en el sexto segmento. Durante la separación, se expondrán por completo el intestino anterior, el intestino medio y los tubos de Malpighian.
    NOTA: Los túbulos de Malpighian son blancos y delgados. El intestino medio es semitranslúcido y fusiforme.
  7. Separe el intestino medio del intestino anterior y del intestino posterior. Enjuague el intestino medio dos veces en la gota central de PBS.
  8. Trasférilo a un tubo de molienda que contiene 200 µL de la solución de preservación de ARN incluida en el kit comercial de extracción de ARN.
  9. Presione en el medio del octavo segmento abdominal con la aguja de disección para exponer los pares de ovarios en ambos lados. Retire los ovarios, enjuáguelos dos veces en la gota central de PBS y transfiéralos a un tubo de molienda que contiene 200 µL Solución para la conservación de ARN.
    NOTA: Los ovarios apareados son simétricos, de forma alargada semejante a un grano de arroz y de color blanco lechoso. Manipúlense con cuidado para garantizar la integridad estructural de los ovarios durante su recuperación.

5. Disección de glándulas salivales de Ae. albopictus

  1. Aumente el aumento del microscopio a 400x. Transfiera el abdomen diseccionado de Ae. albopictus a la gota de PBS más a la derecha.
  2. Aplique presión suave sobre el mesotórax con la aguja de disección de la mano izquierda hasta que la cabeza se eleve ligeramente.
  3. Use la mano derecha para levantar la cabeza en la región del cuello (cervix) con la aguja de disección y tire lentamente hacia afuera. Observe cómo las glándulas salivales (estructura trilobulada) se separan del tórax junto con la cabeza.
    NOTA: Las glándulas salivales se encuentran en la parte anterior del tórax y se conectan con la cabeza mediante el conducto salival. Aplicar presión constante sobre el tórax evita la ruptura del conducto salival y permite que las glándulas salivales se separen intactas del tórax junto con la cabeza. El control de la fuerza en este paso requiere práctica repetida.
  4. Separe las glándulas salivales de la cabeza. Enjuáguelas dos veces en la gota central de PBS y transfiéralas a un tubo de molienda preparado.
    NOTA: Las glándulas salivales tienen aproximadamente 1 mm de tamaño. Trasládelas a un tubo de molienda que contenga 200 µL de solución de preservación de ARN y obsérvelas frente a una fuente de luz blanca para confirmar la presencia de pequeños puntos blancos flotando en la solución.

6. Extracción de ARN de Ae. albopictus y sus glándulas salivales, ovarios e intestino medio

NOTA: Todos los pasos de extracción de ARN se realizaron según las instrucciones del fabricante del kit comercial de extracción de ARN de tejidos, sin modificaciones.

  1. Enfríe previamente el molino de tejidos a 4 °C. Establezca los parámetros en 30 Hz, 30 s de tiempo de molienda, 10 ciclos y 8 s de tiempo de pausa.
  2. Coloque los tubos de molienda que contienen las muestras de tejido en el molino y ejecute el programa.
    NOTA: Después de la molienda, verifique si el tejido está completamente disperso en la solución de preservación de ARN. Si la molienda no está completa, realice 5 ciclos adicionales.
  3. Transfiera el homogenizado a un tubo centrífugo estéril de 1,5 mL. Centrifugue a 12.000 x g a 4 °C durante 5 min.
  4. Transfiera el sobrenadante a un tubo centrífugo estéril nuevo de 1,5 mL. Añada 30 µL de cloroformo.
    ADVERTENCIA: El cloroformo es tóxico y carcinogénico. Use guantes y gafas de seguridad, y manipúlelo en una campana extractora.
  5. Agite vigorosamente en vórtex durante 20 s. Incube a temperatura ambiente durante 15 min y luego centrifugue a 12.000 x g a 4 °C durante 15 min.
    NOTA: Aspire cuidadosamente la fase acuosa superior, evitando la capa blanca intermedia para prevenir la contaminación por proteínas.
  6. Transfiera la fase acuosa superior a un tubo centrífugo estéril nuevo de 1,5 mL. Añada 75 µL de isopropanol.
  7. Mezcle mediante inversión y transfiera toda la mezcla a una columna de sílice tipo spin. Centrifugue a 12.000 x g durante 1 min.
  8. Añada 600 µL de tampón de lavado a la columna. Centrifugue a 12.000 x g durante 30 s. Deseche el flujo atravesado.
  9. Añada 600 µL de etanol al 80 % a la columna. Centrifugue a 12.000 x g durante 30 s. Deseche el flujo atravesado. Repita este paso de lavado una vez más, para un total de dos lavados.
  10. Añada 30 µL de agua DEPC al centro de la membrana de la columna. Incube a temperatura ambiente durante 1 min.
  11. Coloque la columna en un tubo centrífugo estéril de 1,5 mL. Centrifugue a 12.000 x g durante 1 min para eluir el ARN.
  12. Tome 1 µL del ARN eluido y mida la concentración y pureza utilizando un espectrofotómetro de microvolumen.

7. Transcripción inversa del ARN

  1. Preparación del sistema de reacción
    1. Descongele sobre hielo la mezcla maestra de transcripción inversa 4x, el agua libre de nucleasas y la plantilla de ARN.
    2. En un tubo de PCR de 200 µL, prepare un sistema de reacción de 20 µL añadiendo 5 µL de mezcla maestra de transcripción inversa 4x, 10 µL de plantilla total de ARN y 5 µL de agua libre de nucleasas.
    3. Centrifugue brevemente a 1.000 x g durante 1 min para recoger la mezcla de reacción en el fondo del tubo.
    4. Coloque el tubo de PCR en un termociclador y ejecute el programa de transcripción inversa: 50 °C durante 5 min; 85 °C durante 5 s.
      NOTA: Diluya el producto de transcripción inversa 20 veces antes de usarlo para reducir el efecto de posibles inhibidores en la RT-qPCR.

8. PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR)

  1. Preparación del sistema de reacción de RT-qPCR
    1. Descongele la mezcla maestra 2x SYBR Green qPCR, la plantilla de ADNc y los cebadores directo e inverso de 10 µM en hielo, protegidos de la luz durante todo el proceso.
    2. En una placa PCR de 96 pocillos, prepare un sistema de reacción de 20 µL por pocillo añadiendo 10 µL de mezcla maestra 2x SYBR Green qPCR, 0,8 µL de cada cebador (directo e inverso) de 10 µM (concentración final de 400 nM), 2 µL de plantilla de ADNc diluida 20 veces y 6,4 µL de agua libre de nucleasas.
    3. Selle la placa de 96 pocillos con una película adhesiva óptica, asegurándose de que todos los pocillos queden completamente sellados.
    4. Centrifugue a 1.000 x g durante 1 minuto para recoger la mezcla de reacción en el fondo de los pocillos.
    5. Coloque la placa PCR en un sistema de detección en tiempo real y ejecute el programa de ciclado térmico.
      NOTA: Programa de ciclado térmico: pre-desnaturalización a 95 °C durante 30 s (1 ciclo); amplificación: 95 °C durante 30 s, 60 °C durante 30 s (40 ciclos); análisis de curva de disociación: 95 °C durante 15 s, 60 °C durante 1 min, rampa hasta 95 °C a 0,15 °C/s. Cada muestra de ARN de tejido se somete a qPCR en cuadruplicado de réplicas técnicas. Cada muestra de tejido consiste en tejidos agrupados de 5 Ae. albopictus. Las secuencias de los cebadores utilizados para RT-qPCR se listan en Tabla 1.
  2. Análisis de datos
    1. Revise la curva de disociación de cada par de cebadores para confirmar un único pico de disociación bien definido.
    2. Exporte los valores de Ct del software del instrumento. El graficado y el análisis de datos se realizan utilizando software estadístico y de graficación.
Nombre de los cebadoresSecuencias de los cebadores (5'-3')
Ae. albopictus β-actina Cebador directo GGAGAAGATCTGGCATCACA
Ae. albopictus β-actin Secuencia inversaTGTCATCTTCTCGCGGTTAG
Ae. albopictus Cebador directo de GAPDHCTGCCAAGGCTGTCGGTAA
Ae. albopictus Primer inverso de GAPDHTCATAGGAGGCAGGCTTGGA
Ae. albopictus Cebador directo RPS6ACAAGCTGCGTCACTTCTACGACA
Ae. albopictus Cebador inverso de RPS6CTTGTCGTTTCCACCGGCAATCTT

Tabla 1: Secuencias de cebadores de Ae. albopictus utilizadas en RT-qPCR.

Resultados

Este estudio consta de dos partes: la disección de Ae. albopictus y la extracción de ARN a partir de los tejidos obtenidos tras la disección. El flujo de trabajo general se muestra en Figura 1, donde Figura 1A ilustra la disección de Ae. albopictus y Figura 1B muestra la extracción de ARN y la detección subsiguiente de los niveles de expresión de los genes de referencia.

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Figura 1: Esquema de la disección de Ae. albopictus y extracción de ARN total a partir de tejidos tras la disección. (A) Recolección, anestesia y disección de Ae. albopictus. (B) Extracción de ARN a partir de tejidos tras la disección, identificación de pureza y detección de los niveles de expresión de genes de referencia. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Se disectaron cinco ejemplares de Ae. albopictus criados en laboratorio para aislar el intestino medio, las glándulas salivales y los ovarios. Con un aumento de 80×, eran claramente visibles el intestino anterior transparente, el intestino medio y el intestino posterior de Ae. albopictus, con los ovarios de aspecto granular situados a ambos lados y cubiertos por los túbulos de Malpighi de color blanco (Figura 2A). Cuando el campo se ajustó a 400×, las glándulas salivales translúcidas de Ae. albopictus se volvieron claramente observables (Figura 2B). Figura 2C,D ilustran los tejidos intestinales medios y ováricos aislados. Los resultados indicaron que los tejidos aislados mediante este método de disección conservaron su integridad estructural, lo cual es esencial para la posterior extracción de ARN total a partir de las muestras postdisección.

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Figura 2: Análisis postdisección de los tejidos de Ae. albopictus. (A) Los tejidos se aíslan del abdomen de Ae. albopictus. (B) Glándulas salivales translúcidas y trilobuladas de Ae. albopictus. (C) Anteintestino e intestino medio de Ae. albopictus. (D) Ovarios pareados con forma de grano de arroz de Ae. albopictus. I: anteintestino; II: intestino medio; III: intestino posterior; IV: túbulos de Malpighi; V: ovarios. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Se extrajo ARN total de tejidos diseccionados de Ae. albopictus. Las muestras de tejido (glándulas salivales, intestino medio y ovarios) se molieron completamente antes de la extracción. Las concentraciones de ARN variaron según el tipo de tejido: las glándulas salivales presentaron 7,8 ng/µL, mientras que el intestino medio, los ovarios y los homogeneizados de cuerpo entero de hembras de Ae. albopictus mostraron 55,3, 45,7 y 42,7 ng/µL, respectivamente. Todas las muestras exhibieron alta pureza, con relaciones A260/A280 de 1,87–2,10 y relaciones A260/A230 de 1,73–2,13 (Tabla 2). Los niveles de expresión de tres genes de referencia candidatos (GAPDH, β-actin y RPS6) se evaluaron mediante RT-qPCR en todos los tejidos. Aunque su expresión varió ligeramente con la concentración de ARN, los tres genes permanecieron relativamente estables en diferentes tipos de tejido (Figura 3). GAPDH, β-actin y RPS6 son adecuados como genes de referencia estables para normalizar la expresión génica en diferentes tejidos de Ae. albopictus.

TejidoNúmero de muestrasConc. de ARN (ng/μL)A260/A280A260/A230
Glándula salival57.81.871.73
Intestino medio555.31.941.98
Ovario545.72.102.13
Hembra142.72.041.92

Tabla 2: Concentración y pureza de ARN extraído de tejido de Ae. albopictus.

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Figura 3: Valores de Ct de los genes de referencia (GAPDH, β-actin y RPS6) detectados mediante RT-qPCR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Ae. albopictus se distribuye ampliamente en regiones templadas, subtropicales y tropicales de todos los continentes excepto la Antártida13,14. Como vector importante de arbovirus como el virus del dengue (DENV), el virus Zika (ZIKV) y el virus de la chikunguña (CHIKV), ha provocado repetidamente brotes de enfermedades transmitidas por mosquitos en Guangdong, China15.

Para facilitar la investigación sobre virus relacionados con Ae. albopictus y su transmisión, desarrollamos un método sencillo para la disección de tejidos de Ae. albopictus. En los protocolos convencionales de disección, cuando se separa la cabeza del tórax durante la extracción de las glándulas salivales, estas pueden permanecer adheridas al tórax o a la cabeza, dependiendo de la fuerza aplicada; dado que las glándulas salivales miden aproximadamente 1 mm, localizarlas dentro del tórax resulta difícil16. Este método se basa en protocolos estándar de aislamiento de órganos de mosquitos y optimiza la separación de las glándulas salivales ubicadas debajo de los esternitos prosternales y mesosternales, que deben observarse bajo un aumento de 400×17. Para realizar la disección, se presiona suavemente el mesotórax con una aguja mientras se utiliza otra para aplicar presión y separar la cabeza, permitiendo que las glándulas salivales se desprendan intactas. Este enfoque evita la necesidad de buscar las glándulas salivales dentro del tórax, previene la contaminación y el daño a las glándulas, y reduce el tiempo total de disección. Los ovarios se encuentran cerca de los segmentos abdominales VI–VIII y se conservan comenzando la disección desde el sexto segmento abdominal y extrayendo cuidadosamente el intestino medio, los túbulos de Malpighian y los ovarios del abdomen18. Este método produce glándulas salivales intactas, formas ováricas típicas sin adherencias y un intestino medio sin rupturas (Figura 2). Esta técnica de disección proporciona una guía valiosa para estudios sobre Ae. albopictus y la replicación, diseminación y transmisión de virus transmitidos por vectores.

La extracción de ARN a partir de tejidos de Ae. albopictus es fundamental para detectar virus transmitidos por mosquitos. El método convencional con TRIzol es lento y técnicamente exigente, pero normalmente proporciona altos rendimientos de ARN y puede producir ARN de alta calidad si se realiza correctamente. En contraste, el método basado en columnas ofrece una mejor reproducibilidad y es más fácil de realizar, aunque puede resultar en una recuperación menor de ARN y presenta un rendimiento deficiente cuando se aplica al cuerpo graso19,20. En este estudio, los tejidos diseccionados se conservaron inmediatamente en un estabilizador de ácidos nucleicos, se homogenizaron completamente y se procesaron mediante el método de columna giratoria para extraer ARN destinado a la síntesis de ADNc21. Para garantizar una normalización precisa de los datos de RT-qPCR a pesar de las variaciones en la calidad del ADNc, son necesarios genes de referencia estables22. Aunque ya se han establecido genes de referencia para diversas etapas de desarrollo de Ae. albopictus, los genes de referencia específicos para tejidos requieren una validación adicional23,24. El análisis mediante RT-qPCR del ARN retrotranscrito a partir de todos los tejidos diseccionados mostró una amplificación constante de GAPDH, β-actin y RPS6, lo que confirma que la calidad de ARN obtenida mediante este protocolo de disección es suficiente para realizar estudios posteriores de expresión génica específicos para cada tejido en Ae. albopictus.

Durante la disección de tejidos de Ae. albopictus con este protocolo, puede ocurrir ocasionalmente que las glándulas salivales no se separen junto con la cabeza. Esto generalmente se debe a una presión insuficiente aplicada al tórax combinada con una separación excesivamente rápida de la cabeza. Para resolverlo, aplique presión constante sobre el mesotórax y tire lentamente de la cabeza hacia afuera, permitiendo que las glándulas salivales se separen intactas junto con la cabeza. Al transferir las glándulas salivales a un tubo de molienda que contiene solución de preservación de ARN, examine cuidadosamente la solución frente a una fuente de luz en busca de pequeñas partículas blancas flotantes. Si no se pueden localizar las glándulas salivales en el tubo, verifique inmediatamente si permanecen adheridas a la aguja de disección. Durante la extracción de ARN, siga estrictamente el protocolo del fabricante del kit. Si la concentración de ARN obtenida es baja, se puede realizar una segunda elución con el tampón de elución. En la RT-qPCR, pueden aparecer múltiples picos en la curva de fusión; en este caso, primero verifique la especificidad de los cebadores. Si los valores de Ct son altos, ajuste la temperatura de hibridación del programa según la temperatura de fusión de los cebadores. En general, la temperatura de hibridación en el programa debe establecerse 1–2 °C por debajo de la temperatura de fusión de los cebadores25.

Este estudio tiene algunas limitaciones. El alcance de la muestra es relativamente estrecho, centrándose únicamente en el intestino medio, las glándulas salivales y los tejidos ováricos, sin investigar otros tejidos como los túbulos de Malpighi y el cuerpo graso26. Además, el análisis se limitó a hembras de mosquito criadas en laboratorio de 3 días de edad, excluyéndose individuos alimentados con sangre o infectados con virus27. Las mejoras futuras deberían incluir la ampliación del alcance de la muestra para abarcar tejidos como los túbulos de Malpighi y considerar individuos de Ae. albopictus en diferentes estados fisiológicos.

En resumen, la disección del intestino medio, los ovarios y las glándulas salivales de Ae. albopictus, seguida de la extracción de ARN total, proporciona una base técnica para evaluaciones posteriores de la competencia vectorial y estudios de transmisión de arbovirus.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Pipeta Pasteur extra larga de 3 mLWHBWHB-S43 mL
ChamQ Universal SYBR qPCR Master MixVazymeQ711-02500 rxns
Kit HiScript IV All-in-One Ultra RT SuperMix para qPCRVazymeR433-01100 rxns
Kit de extracción de ARN total microMedTechMDT-CFR07100T/caja
Micropipetas 0,5-10μLEppendorf4043444
Portaobjetos para microscopioCITOTEST80302-210475 mm×25 mm
MicroespectrofotómetroKAIAOK5600C
Tampón de extracción de ácidos nucleicosMedTechMDT-TP01100 mL
Solución salina tamponada con fosfato PBS (estéril)ServicebioG4202500 ML
Ciclador térmico para PCREppendorfMastercycler X50s
Sistema de PCR en tiempo real QuantStudioTM 7 ProApplied biosystemsEN61326-1
Conjunto de microscopio Stemi 305 LABZEISS435063-9010-000

Referencias

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