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Artículo de método

Evaluación guiada por redes del β-sitosterol en modelos de células mesangiales inflamatorias y profibróticas relevantes para la glomerulonefritis crónica

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DOI:

10.3791/73000

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28 de agosto de 2026

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1Hemodialysis Room, Hospital of Traditional Chinese Medicine of Qiqihar, 2Department of Nephrology, Ezhou Central Hospital, 3Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, The First Hospital of Qiqihar, 4Department of Nephrology, Shanghai Minhang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este estudio integra la farmacología de redes, el acoplamiento molecular validado y experimentos in vitro para evaluar las relaciones candidatas entre compuestos y dianas entre los constituyentes de Cordyceps sinensis y los procesos relacionados con la glomerulonefritis crónica. Se seleccionó el β-sitosterol para la validación a nivel de compuesto y se encontró que atenúa la activación inflamatoria y profibrótica en modelos de células mesangiales.

Resumen

La nefritis glomerular crónica (NGC) se caracteriza por una lesión inflamatoria persistente y una remodelación fibrosa progresiva, aunque las relaciones compuesto-diana subyacentes a las intervenciones basadas en productos naturales aún no están completamente definidas. Este estudio integró farmacología de redes, acoplamiento molecular validado y experimentos in vitro para evaluar los constituyentes candidatos de Cordyceps sinensis (C. sinensis) en procesos patológicos relacionados con la NGC. Se seleccionaron los constituyentes candidatos de C. sinensis, y los blancos asociados a compuestos derivados de la Base de Datos y Plataforma de Análisis de Farmacología Sistémica de la Medicina Tradicional China se intersectaron con genes asociados a NGC. Se utilizaron análisis de enriquecimiento funcional e interacción proteína-proteína para priorizar procesos biológicos y blancos centrales. Se identificó PTGS2 como un blanco superpuesto clave. Se realizó el acoplamiento molecular utilizando una estructura de COX-2 ligada a celecoxib. La reubicación del ligando celecoxib co-cristalizado reprodujo la conformación cristalográfica con una RMSD de 0,876 Å, lo que respalda el protocolo de acoplamiento. El β-sitosterol y el acetato de linoleilo mostraron compatibilidad predicha con la región de acoplamiento de COX-2, con afinidades de unión de −7,2 y −7,5 kcal/mol, respectivamente. Se seleccionó el β-sitosterol para la validación a nivel de compuesto en células mesangiales glomerulares de rata HBZY-1. A concentraciones de 0,5–10 µM, el β-sitosterol no redujo notablemente la viabilidad celular. En células estimuladas con lipopolisacárido (LPS), el β-sitosterol redujo la expresión de Tnf, Il6 y Ptgs2, disminuyó la producción de prostaglandina E2 (PGE2) y redujo la abundancia proteica de ciclooxigenasa-2 (COX-2). En células tratadas con factor de crecimiento transformante β1 (TGF-β1), el β-sitosterol redujo la expresión de Col1a1 y Acta2 y disminuyó la abundancia proteica de actina alfa del músculo liso (α-SMA). Estos hallazgos proporcionan evidencia generadora de hipótesis de que el β-sitosterol modula la activación inflamatoria y profibrotica en modelos de células mesangiales, aunque no establecen la inhibición enzimática directa de COX-2 ni la eficacia terapéutica en la NGC.

Introducción

La glomerulonefritis crónica (GNC) comprende un grupo heterogéneo de trastornos glomerulares que pueden progresar hacia enfermedad renal crónica y enfermedad renal en etapa terminal1. Se caracteriza por lesión glomerular persistente, activación inflamatoria y remodelación fibrosa progresiva2,3. Aunque se utilizan corticosteroides y agentes inmunosupresores en pacientes seleccionados, el control a largo plazo de la enfermedad sigue siendo difícil en muchos casos, y los efectos adversos relacionados con el tratamiento son frecuentes1,4,5. La progresión de la GNC implica procesos patológicos interrelacionados, incluyendo activación inmunitaria, disfunción endotelial, estrés oxidativo y acumulación de matriz extracelular3,6,7. Por lo tanto, identificar nodos moleculares que conecten respuestas inflamatorias y profibróticas podría ayudar a generar hipótesis comprobables para estrategias de intervención relevantes para la enfermedad.

Cordyceps sinensis (C. sinensis) se ha utilizado en contextos clínicos y experimentales relacionados con el riñón y se ha informado que ejerce efectos antiinflamatorios, antiapoptóticos y citoprotectores en varios modelos de enfermedades8,9,10. Sin embargo, la base molecular mediante la cual sus constituyentes candidatos podrían interactuar con dianas relevantes para la glomerulonefritis aún no está suficientemente definida11. Dada la naturaleza multicomponente de C. sinensis y la heterogeneidad mecanicista de la CGN, la farmacología de redes proporciona un marco útil para priorizar las relaciones candidatas entre compuestos, dianas y vías12,13.

En este estudio, se integraron la selección de compuestos, la recuperación de dianas terapéuticas, el análisis de intersección gen-enfermedad, el enriquecimiento funcional, el análisis de redes de interacción proteína-proteína, el acoplamiento molecular y la validación in vitro para explorar posibles relaciones moleculares entre los constituyentes candidatos de C. sinensis y los procesos patológicos relacionados con la NCG. La prostaglandina-endoperoxido sintasa 2 (PTGS2) se priorizó como una diana central en la red compuesto-enfermedad y se evaluó mediante acoplamiento molecular utilizando una estructura de ciclooxigenasa-2 (COX-2) unida a celecoxib, con validación por reacoplamiento. Con base en los resultados de la red, el análisis de acoplamiento y evidencia previa sobre actividad antiinflamatoria y antifibrótica, el β-sitosterol se seleccionó como un compuesto candidato representativo para la validación posterior14,15,16. Se utilizaron células mesangiales estimuladas con lipopolisacárido (LPS) para evaluar la activación inflamatoria y la respuesta asociada con COX-2/prostaglandina E2 (PGE2), mientras que se incluyó un modelo inducido por factor de crecimiento transformante β1 (TGF-β1) para evaluar la expresión de marcadores profibróticos.

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Protocolo

Los análisis de farmacología de redes y bioinformática se basaron en bases de datos de acceso público y no involucraron participantes humanos ni animales. Los experimentos in vitro se realizaron utilizando una línea celular establecida y no requirieron aprobación ética de acuerdo con los requisitos institucionales.

Selección de componentes candidatos y recuperación de objetivos

Los constituyentes candidatos y sus dianas correspondientes se recuperaron de la Base de Datos y Plataforma de Análisis de Farmacología de la Medicina Tradicional China (TCMSP, por sus siglas en inglés) utilizando el término de búsqueda «dongchongxiacao» el 13 de julio de 2025. Se conservaron los compuestos con una biodisponibilidad oral predicha de al menos 30 % y similitud con fármacos de al menos 0,18. Siete constituyentes candidatos cumplieron ambos criterios de selección. Se registraron desde TCMSP el peso molecular, la biodisponibilidad oral, la similitud con fármacos y otros descriptores farmacocinéticos disponibles para su comparación descriptiva.

La información compuesto-diana asociada con los constituyentes retenidos se descargó directamente de TCMSP. Las entradas duplicadas de dianas se eliminaron manualmente al construir el conjunto de dianas no redundante, mientras que las relaciones originales compuesto-diana se conservaron para la construcción posterior de la red. Dado que TCMSP proporcionaba los nombres de las dianas en su forma completa en lugar de símbolos genéticos estandarizados, cada diana se buscó en la base de datos UniProt (acceso el 14 de julio de 2025). Se seleccionó la entrada correspondiente humana, y el nombre de la diana se convirtió al símbolo génico oficial. El conjunto de datos estandarizado compuesto-diana se utilizó para el análisis de intersección diana-enfermedad y para el análisis de la red compuesto-diana.

Recopilación de genes asociados a la glomerulonefritis e intersección de dianas

Los genes asociados con la enfermedad se recuperaron de GeneCards, DisGeNET, PharmGKB y la Therapeutic Target Database utilizando el término de búsqueda «glomerulonefritis» el 14 de julio de 2025. Para GeneCards, se conservaron las entradas con puntuaciones de relevancia superiores a la puntuación mediana de 10. Se incluyeron las entradas elegibles de las otras bases de datos según sus anotaciones curadas de enfermedad-diana. Los nombres de los genes se estandarizaron a los símbolos oficiales de genes humanos, y se eliminaron las entradas duplicadas. Este procedimiento produjo 1.134 genes únicos asociados con la glomerulonefritis. Dado que la búsqueda utilizó el término más amplio «glomerulonefritis», se consideró que el conjunto de datos resultante era relevante para los procesos moleculares asociados con la glomerulonefritis crónica, y no específico de un solo subtipo histopatológico.

Los objetivos asociados con los compuestos derivados de TCMSP se intersectaron con el conjunto de genes asociados con la enfermedad utilizando R. Se identificaron 23 objetivos superpuestos. Los diagramas de Venn se generaron utilizando el paquete de R venn, y la red de objetivos superpuestos de compuestos se construyó y visualizó utilizando Cytoscape. Las relaciones entre los constituyentes candidatos y los objetivos superpuestos se resumen en Tabla 1.

Análisis de enriquecimiento funcional y de interacciones proteína-proteína

Se realizaron análisis de enriquecimiento de Gene Ontology (GO) y Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) en R utilizando los paquetes clusterProfiler y org.Hs.eg.db. Los términos de Gene Ontology se analizaron en las categorías de proceso biológico, componente celular y función molecular. Los valores de P se ajustaron para comparaciones múltiples mediante el método de Benjamini-Hochberg, y se conservaron los términos o vías con valores de P ajustados inferiores a 0,05. Los términos y vías enriquecidos se representaron mediante gráficos de barras y gráficos de puntos generados independientemente.

Los 23 objetivos superpuestos se enviaron a STRING, seleccionando Homo sapiens como el organismo y un puntaje mínimo de interacción mayor a 0,4. La red resultante de interacciones proteína-proteína se importó a Cytoscape. La topología de la red se evaluó utilizando CytoNCA según el grado, la centralidad de intermediación, la centralidad de cercanía, la centralidad de vector propio, la conectividad promedio local y la centralidad de la red. Los objetivos centrales se definieron como nodos cuyos valores de grado, centralidad de intermediación, centralidad de cercanía, centralidad de vector propio, conectividad promedio local y centralidad de la red fueron todos mayores que los valores medianos correspondientes de la red. Este análisis priorizó nueve objetivos centrales para la interpretación posterior.

Alineamiento molecular y validación de re-alineamiento

Se realizó un acoplamiento molecular utilizando la estructura de la ciclooxigenasa-2 unida al celecoxib con el identificador PDB 3LN1. Se conservó la cadena A y su grupo hemo asociado como receptor, mientras que durante la preparación del receptor se eliminaron las moléculas de agua cristalográficas y el ligando de celecoxib co-cristalizado. La conformación nativa del celecoxib se extrajo por separado de la cadena A para la validación mediante reacoplamiento. Se añadieron átomos de hidrógeno polares y cargas de Gasteiger utilizando AutoDockTools, y el receptor se guardó en formato PDBQT. El identificador PDB 3LN1 corresponde a una estructura de 2,40 Å de COX-2 murino unido al celecoxib. Las estructuras del β-sitosterol y del acetato de linoleilo se obtuvieron de PubChem y se prepararon utilizando Open Babel. Se añadieron átomos de hidrógeno y cargas parciales de Gasteiger, se asignaron enlaces rotables y cada ligando se convirtió al formato PDBQT. El celecoxib, el β-sitosterol y el acetato de linoleilo se acoplaron utilizando AutoDock Vina con los mismos parámetros del receptor y del espacio de búsqueda.

La caja de acoplamiento se centró en la región de unión nativa de celecoxib utilizando las siguientes coordenadas: center_x = 30.9886 center_y = -22.2836 center_z = -16.5072 size_x = 26 Å size_y = 26 Å size_z = 26 Å. El valor de exhaustividad se estableció en 16, el número de modos de salida en 10 y el rango de energía en 3 kcal/mol. Se conservó la conformación mejor clasificada según la energía de unión predicha más baja para su visualización. Para la validación del protocolo, se realizó nuevamente el acoplamiento de la celecoxib nativa bajo las mismas condiciones, y se calculó la desviación cuadrática media de los átomos pesados entre las conformaciones cristalográfica y reacoplada utilizando PyMOL. Una desviación cuadrática media inferior a 2 Å se consideró una reproducción aceptable de la conformación de referencia. Se identificaron en PyMOL los residuos ubicados dentro de 4 Å de cada ligando acoplado. Las puntuaciones y conformaciones de acoplamiento se interpretaron como estimaciones de compatibilidad estructural y no como evidencia directa de unión al blanco o inhibición enzimática.

Cultivo celular y preparación del compuesto

Las células mesangiales glomerulares de rata HBZY-1 se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco con alta concentración de glucosa, suplementado con 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina-estreptomicina, a 37 °C en condiciones húmedas con 5% de CO₂. Se utilizaron células en los pasajes 2–7 para todos los experimentos, y se verificó la ausencia de micoplasma antes del uso. El β-sitosterol y la celecoxib se utilizaron como compuestos químicamente definidos. El β-sitosterol se disolvió en etanol absoluto para obtener una solución madre de 10 mM (aproximadamente 4,15 mg/mL). Cuando fue necesario, se realizó una breve sonicación y calentamiento a 50–60 °C para lograr una solución visualmente clara. La celecoxib se disolvió en dimetilsulfóxido para preparar una solución madre de 10 mM (aproximadamente 3,81 mg/mL). Las soluciones madre se fraccionaron y almacenaron a −20 °C. Antes del tratamiento, las soluciones madre se diluyeron directamente en medio de cultivo previamente calentado y se mezclaron inmediatamente.

Las concentraciones del vehículo se igualaron dentro de cada experimento. En el ensayo de viabilidad celular, la concentración final de etanol se ajustó al 0,2% v/v en todos los grupos, ya que la concentración más alta de β-sitosterol probada fue de 20 µM. En el experimento inflamatorio inducido por LPS, las concentraciones finales de etanol y dimetilsulfóxido se ajustaron al 0,1% y 0,01% v/v, respectivamente, en todos los grupos. En el experimento profibrótico inducido por TGF-β1, la concentración final de etanol se ajustó al 0,1% v/v en todos los grupos. Se añadieron volúmenes equivalentes de los vehículos correspondientes a los grupos Control, LPS y TGF-β1.

Ensayo de viabilidad celular

Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 5 × 103 células por pocillo en 100 µL de medio completo y se dejaron adherir durante 24 h. Para evaluar el rango de concentración de β-sitosterol, las células se incubaron con 0,5, 1, 5, 10 o 20 µM de β-sitosterol durante 24 h. Para el ensayo de viabilidad celular relacionado con LPS, las células se pretrataron con β-sitosterol a 1, 5 o 10 µM durante 2 h, seguido de exposición a 1 µg/mL de lipopolisacárido durante 24 h adicionales.

Los grupos de tratamiento fueron Control, β-sitosterol a 0,5 µM, β-sitosterol a 1 µM, β-sitosterol a 5 µM, β-sitosterol a 10 µM, β-sitosterol a 20 µM, LPS, LPS más β-sitosterol a 1 µM, LPS más β-sitosterol a 5 µM y LPS más β-sitosterol a 10 µM. Se agregó el reactivo del Kit de Conteo de Células-8 a 10 µL por pocillo y las placas se incubaron durante 2 h. Luego se registró la absorbancia a 450 nm. La viabilidad celular se determinó tras restar el blanco sin células y se expresó en relación con el grupo Control. Cada condición incluyó seis pocillos técnicos en cada uno de seis experimentos biológicos independientes. Los valores de los pocillos técnicos de cada experimento se promediaron para generar un valor por réplica biológica para el análisis estadístico.

Activación inflamatoria inducida por LPS

Para los experimentos de activación inflamatoria, las células HBZY-1 se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 2 × 105 células por pocillo y se trataron tras alcanzar aproximadamente un 70 %–80 % de confluencia. Las células se mantuvieron en medio suplementado con 1 % de suero bovino fetal durante 12 h antes del tratamiento. Se administró β-sitosterol o celecoxib 2 h antes de la estimulación con LPS. Posteriormente, las células se expusieron a 1 µg/mL de LPS durante 24 h.

Los grupos experimentales fueron Control, β-sitosterol a 10 µM, LPS, LPS más β-sitosterol a 1 µM, LPS más β-sitosterol a 5 µM, LPS más β-sitosterol a 10 µM, y LPS más celecoxib a 1 µM. Se incluyó celecoxib como control positivo funcional para la inhibición de la producción de prostaglandinas dependiente de COX-2. Al final del tratamiento, se recogieron los sobrenadantes del cultivo para la medición de PGE2. Las células se recogieron por separado para el análisis cuantitativo por PCR en tiempo real de Tnf, Il6 y Ptgs2, y para el análisis por inmunotransferencia de COX-2.

Activación profibrótica inducida por TGF-β1

Se utilizó un modelo independiente inducido por TGF-β1 para evaluar la activación profibrótica. Las células HBZY-1 se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 2 × 105 células por pocillo y se mantuvieron en medio suplementado con 1 % de suero bovino fetal durante 12 h antes del tratamiento. Las células fueron pretratadas con β-sitosterol durante 2 h, seguido de estimulación con 10 ng/mL de TGF-β1 recombinante durante 48 h.

Los grupos de tratamiento incluyeron Control, β-sitosterol (10 µM), TGF-β1, TGF-β1 + β-sitosterol (5 µM) y TGF-β1 + β-sitosterol (10 µM). Al final del período de tratamiento, las células se recolectaron para el análisis cuantitativo por PCR en tiempo real de Col1a1 y Acta2 y para el análisis por inmunotransferencia de la actina alfa de músculo liso (α-SMA).

PCR cuantitativo en tiempo real

Se aisló ARN total de las células tratadas utilizando un reactivo de extracción de ARN basado en fenol-guanidinio, según el protocolo del fabricante. Se determinó la concentración y pureza del ARN utilizando un espectrofotómetro. Solo se utilizaron muestras con una relación A260/A280 de 1,8 a 2,0 para la transcripción inversa. Para cada muestra, 1 µg de ARN total se transcribió inversamente en ADN complementario en un volumen final de reacción de 20 µL. El ADN complementario resultante se diluyó cinco veces con agua libre de nucleasas antes de la PCR cuantitativa. La PCR cuantitativa se realizó en un volumen total de 20 µL que contenía 10 µL de mezcla maestra 2× SYBR Green, 0,4 µL de cada cebador (directo e inverso) a 10 µM, 2 µL de ADN complementario diluido y 7,2 µL de agua libre de nucleasas. Las condiciones de amplificación consistieron en un paso inicial de desnaturalización a 95 °C durante 30 s, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 5 s y hibridación-extensión a 60 °C durante 30 s. Posteriormente, se realizó un análisis de curva de fusión desde 65 °C hasta 95 °C para verificar la especificidad de la amplificación.

Los genes medidos fueron Tnf, Il6, Ptgs2, Col1a1, Acta2 y Gapdh. Gapdh sirvió como gen de referencia interno. La expresión génica relativa se determinó utilizando el método 2−ΔΔCt, utilizando al grupo Control como calibrador. Las secuencias de los cebadores se proporcionan en la Tabla Suplementaria 1. Cada muestra se analizó por triplicado técnico y se realizaron seis experimentos biológicos independientes. Los valores obtenidos de los réplicas técnicas se promediaron antes del análisis estadístico.

Medición de PGE2 mediante ensayo inmunoenzimático

Los sobrenadantes de cultivo se recogieron tras 24 h de estimulación con LPS y se centrifugaron a 1.000 ×g durante 10 min a 4 °C para eliminar los restos celulares. Las concentraciones de PGE2 se determinaron utilizando un kit comercial de ensayo inmunoenzimático según las instrucciones del fabricante.

Se cargaron estándares y muestras en la placa de ensayo por duplicado. Después de completar los pasos de unión del anticuerpo y desarrollo del color, se registró la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas. Las concentraciones de PGE2 se determinaron a partir de una curva estándar logística de cuatro parámetros y se expresaron en pg/mL. Se analizaron sobrenadantes de seis experimentos celulares independientes. Las mediciones por duplicado de cada muestra biológica se promediaron antes del análisis estadístico.

Transferencia Western

Las células tratadas se lisaron en tampón de ensayo de radioinmunoensayo (RIPA) suplementado con una mezcla de inhibidores de proteasas. Los lisados se incubaron en hielo durante 30 min y se centrifugaron a 12.000 × g durante 15 min a 4 °C. Las concentraciones de proteína en los sobrenadantes se determinaron mediante un ensayo de proteína con ácido bicinconínico. Se mezclaron cantidades iguales de proteína (30 µg por pocillo) con tampón de carga y se desnaturalizaron a 95 °C durante 5 min. Las proteínas de los experimentos con LPS se separaron en geles de poliacrilamida al 10 % con dodecilsulfato de sodio, mientras que las de los experimentos con TGF-β1 se separaron en geles al 12 %. Las proteínas separadas se transfirieron posteriormente a membranas de fluoruro de polivinilideno.

Las membranas se bloquearon con leche descremada al 5 % en solución salina tamponada con Tris que contenía Tween 20 al 0,1 % durante 1 h a temperatura ambiente y luego se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra COX-2 (1:1000), α-SMA (1:1000) y GAPDH (1:5000). COX-2 se analizó en muestras del experimento con LPS, mientras que α-SMA se analizó en muestras del experimento con TGF-β1. Después del lavado, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (1:5000) durante 1 h a temperatura ambiente. Las bandas proteicas se visualizaron utilizando un sustrato de quimioluminiscencia mejorado y se capturaron con un sistema de imagen de quimioluminiscencia. Los tiempos de exposición fueron aproximadamente 10 s para COX-2, 10 s para α-SMA y 2 s para GAPDH.

Las intensidades de las bandas se cuantificaron utilizando ImageJ. Las señales de COX-2 y α-SMA se normalizaron respecto a la señal correspondiente de GAPDH. Se realizó inmunotransferencia por Western utilizando muestras proteicas obtenidas de seis experimentos independientes de cultivo celular y tratamiento.

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar. Se llevaron a cabo seis experimentos independientes de cultivo celular y tratamiento para cada análisis cuantitativo, siendo cada experimento independiente un réplica biológica. Las mediciones de réplicas técnicas obtenidas del mismo experimento biológico se promediaron antes del análisis estadístico y no se consideraron observaciones independientes.

Para el ensayo de viabilidad celular, cada experimento biológico incluyó seis pocillos técnicos por condición. Las reacciones de PCR cuantitativa se realizaron por triplicado técnico para cada muestra biológica, y las mediciones de PGE2 se realizaron por duplicado. La cuantificación mediante inmunotransferencia se basó en seis muestras proteicas preparadas independientemente. Por lo tanto, cada barra cuantitativa contiene seis valores individuales de réplicas biológicas.

Las diferencias entre múltiples grupos se analizaron mediante un análisis de varianza unifactorial seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey. Se consideró estadísticamente significativo un valor de P bilateral < 0,05. Los valores individuales de los réplicas biológicos se mostraron junto con la media y la desviación estándar.

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Resultados

Selección de Constituyentes Candidatos, Recuperación de Blancos y Superposición de Blancos

El flujo de trabajo para la identificación de dianas superpuestas candidatas entre compuestos y enfermedades se resume en la Figura 1A. Siete compuestos candidatos de C. sinensis cumplieron con los criterios predefinidos de cribado de OA ≥30% y BD ≥0,18, incluyendo ácido araquidónico, acetato de linoleilo, β-sitosterol, peroxiergosterol, cerevistero...

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Discusión

Este estudio integró la farmacología de redes, el acoplamiento molecular validado con ligandos de referencia y experimentos a nivel de compuestos para examinar una hipótesis asociada a PTGS2 derivada de los constituyentes candidatos de C. sinensis. Siete constituyentes cumplieron con los criterios predefinidos de cribado en TCMSP, y 23 dianas se superpusieron con el conjunto de genes asociados a glomerulonefritis. El análisis de interacción proteica priorizó nueve dianas centrales, entre las cuales se s...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto. Se utilizaron herramientas basadas en inteligencia artificial (ChatGPT, OpenAI) para ayudar en la edición del lenguaje y en el diseño preliminar de figuras esquemáticas. La inteligencia artificial generativa se empleó para ayudar en la elaboración de borradores gráficos preliminares de las Figuras 1A y 7, que posteriormente fueron revisadas y modificadas por los autores para garantizar su coherencia con los métodos y resultados descritos. Todos los productos generados con asistencia de IA fueron evaluados críticamente y aprobados por los autores. Los autores verificaron el contenido final de las figuras y asumieron toda responsabilidad por la integridad y exactitud del manuscrito.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por la Especialidad Característica de Nefropatía con Medicina Tradicional China y Medicina Occidental Integrada (ZYTSZK2-3) y por el Estudio sobre la Estrategia de Intervención de la Medicina Tradicional China en la Enfermedad Renal Crónica desde la Perspectiva de la Gestión de Enfermedades Crónicas (202240169).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Etanol absolutoSigma-Aldrich/MerckE7023Etanol grado biología molecular no desnaturalizado, 200 pruebas; disolvente para el stock de β-sitosterol.
AutoDock VinaScripps ResearchVersion 1.1.2Simulación de acoplamiento molecular
Cabina de seguridad biológicaThermo Fisher Scientific1300 Series A2Operaciones estériles de cultivo celular
CelecoxibMedChemExpressHY-14398Inhibidor selectivo de COX-2 utilizado como control positivo; stock de 10 mM en DMSO. 
Kit de conteo celular-8Dojindo Molecular Technologies, Inc.CK04Ensayo colorimétrico WST-8 para viabilidad celular; absorbancia medida a 450 nm.
Sistema de imagen quimioluminiscenteBio-Rad LaboratoriesChemiDoc MPAdquisición de imágenes de inmunotransferencia (Western blot)
Paquete R clusterProfilerBioconductorVersion 4.10.0Análisis de enriquecimiento GO y KEGG
Incubadora de cultivo celular con CO2Thermo Fisher ScientificForma Series II 3111Incubación de cultivos celulares a 37 °C y 5 % de CO2
Anticuerpo monoclonal de conejo COX-2 (D5H5)Cell Signaling Technology12282Validado para inmunotransferencia (Western blot) en COX-2 humano, de ratón y de rata; utilizado a 1:1.000.
Complemento CytoNCATienda de aplicaciones de CytoscapeVersion 2.1.6Análisis topológico de objetivos centrales
Software CytoscapeConsortium CytoscapeVersion 3.8.0Visualización y análisis de redes
DMSO (dimetilsulfóxido)Sigma-Aldrich/MerckD2650Reagente BioReagent filtrado estéril, ≥99,7 %; disolvente para el stock de celecoxib.
Base de datos DisGeNETGrupo de Informática Biomédica IntegradoraNo aplicableRecuperación de genes asociados a glomerulonefritis
Medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)Gibco/Thermo Fisher ScientificC11995500BTMedio basal para el cultivo celular HBZY-1
Sustrato quimioluminiscente mejoradoBeyotime BiotechnologyP0018SVisualización de bandas en inmunotransferencia (Western blot)
Suero bovino fetalGibco/Thermo Fisher Scientific10099-141CSuplemento sérico para cultivo celular
Anticuerpo monoclonal de conejo GAPDH (D16H11)Cell Signaling Technology5174Control de carga en inmunotransferencia (Western blot); reacciona con GAPDH humano, de ratón y de rata; utilizado a 1:5.000 tras optimización interna.
Base de datos GeneCardsInstituto Weizmann de CienciaNARecuperación de genes asociados a glomerulonefritis
GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersion 9.0.0.121Análisis estadístico de datos experimentales in vitro
Anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de conejo conjugado con HRPProteintech GroupSA00001-2Anticuerpo secundario para anticuerpos primarios de conejo
Software ImageJNational Institutes of HealthVersion 1.54Análisis densitométrico de inmunotransferencia (Western blot)
Microscopio invertido de contraste de faseOlympusCKX53Observación de la morfología celular
Paquete R org.Hs.eg.dbBioconductorVersion 3.18.0Anotación genética humana para análisis de enriquecimiento
Solución de penicilina-estreptomicinaGibco/Thermo Fisher Scientific15140122Suplemento antibiótico para cultivo celular
Kit de ensayo de parámetros de PGE2R&D Systems, una marca de Bio-TechneKGE004BELISA competitivo multiespecie para sobrenadantes de cultivo celular; rango del ensayo 39–2.500 pg/mL; detección colorimétrica a 450 nm.
Base de datos PharmGKBPharmacogenomics KnowledgebaseNARecuperación de objetivos relacionados con enfermedades
Base de datos PubChemCentro Nacional de Información BiotecnológicaNARecuperación de estructuras de ligandos
Membrana de PVDFMillipore/MerckIPVH00010Membrana para transferencia proteica en inmunotransferencia (Western blot)
Sistema gráfico molecular PyMOLSchrödinger, LLCVersion 2.6.2Visualización de poses de acoplamiento
Software RR Foundation for Statistical ComputingVersion 4.3.2Análisis de intersección y enriquecimiento de objetivos
Línea celular de mesangio glomerular de rata (HBZY-1)Procell Life Science & Technology Co., Ltd.CL-0117Modelo in vitro para validación en células mesangiales
Banco de datos RCSB de proteínasResearch Collaboratory for Structural BioinformaticsPDB ID: 3LN1Recuperación de la estructura cristalina de PTGS2/COX2
Proteína recombinante humana TGF-β1PeproTech, una marca de Thermo Fisher Scientific100-21-10UGTGF-β1 recombinante humano derivado de HEK293; estimulación profibrótica a 10 ng/mL. 
Sistema de electroforesis SDS-PAGEBio-Rad LaboratoriesMini-PROTEAN TetraSeparación de proteínas mediante SDS-PAGE
Base de datos STRINGELIXIR/STRING ConsortiumVersion 12.0Construcción de red de interacción proteína-proteína
Base de datos TCMSPTraditional Chinese Medicine Systems Pharmacology DatabaseNASelección de compuestos candidatos de Cordyceps sinensis
Base de datos de objetivos terapéuticosGrupo de Investigación de Fármacos Innovadores e Informática BiomédicaNARecuperación de objetivos terapéuticos
Anticuerpo primario α-SMAProteintech Group14395-1-APDetección de expresión proteica de α-SMA
β-Sitosterol (pureza >98 %)MedChemExpressHY-N0171ACAS 83-46-5; compuesto definido utilizado para tratamiento celular; stock de 10 mM en etanol absoluto. 

Referencias

  1. Kidney Disease: Improving Global Outcomes Glomerular Diseases Work G. KDIGO 2021 Clinical Practice Guideline for the Management of Glomerular Diseases. Kidney Int. 2021;100(4S):S1–S276.
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