Artículo de investigación

Transportadores lipídicos nanoestructurados cargados con hidroxidea para la mejora de la citotoxicidad in vitro y la entrega de fármacos

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DOI:

10.3791/73012

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22 de septiembre de 2026

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1Department of Pharmaceutics, College of Pharmacy, Jazan University, 2School of Health Sciences, University of Petroleum and Energy Studies, 3Center for Global Health Research, Saveetha Medical College, and Hospitals, Saveetha Institute of Medical and Technical Sciences, Saveetha University

En este artículo

Resumen

Este estudio desarrolló portadores lipídicos nanoestructurados cargados con hidroxiurea y evaluó sus propiedades y actividad anticancerígena in vitro. NX-ST mostró una alta eficiencia de encapsulación, liberación controlada y mayor citotoxicidad frente a las células MCF-7 (IC₅₀ = 225 µg/mL) en comparación con la hidroxiurea libre (IC₅₀ = 722,57 µg/mL).

Resumen

La hidroxiurea (HU) es un fármaco anticancerígeno establecido utilizado para tratar la leucemia mieloide crónica, pero su eficacia terapéutica está limitada por una rápida eliminación, biodisponibilidad variable y toxicidad relacionada con la dosis. Este estudio tuvo como objetivo mejorar la administración de HU mediante el desarrollo de portadores lipídicos nanoestructurados cargados con hidroxiurea (NLCs) utilizando diferentes combinaciones de surfactantes. Se prepararon y evaluaron tres formulaciones, incluyendo NX-ST (Tween 80–SDS), NX-CT (Cremophor EL–Tween 80) y NX-CS (Cremophor EL–SDS), en cuanto a tamaño de partícula, índice de politispersidad (PDI), potencial zeta, eficiencia de encapsulación (EE) y actividad citotóxica. Las formulaciones mostraron tamaños de partícula a escala nanométrica (67,377 a 110 nm), PDI aceptable (<0,35), alto potencial zeta (-30,033 a -46,433 mV) y buena eficiencia de encapsulación (78,189 a 86,626 %), lo que indica formulaciones estables. El perfil de liberación mostró un aumento aproximadamente lineal durante el período de 0,5 a 6 h, seguido de una meseta. Los estudios de citotoxicidad mostraron una actividad anticancerígena mejorada en comparación con la HU libre (IC₅₀ = 722,57 µg/mL). La formulación NX-ST demostró la citotoxicidad más alta (IC₅₀ = 225 ± 21,47 µg/mL), lo que concuerda con una administración mejorada del fármaco; se infiere la contribución de una mayor captación celular, aunque no se midió directamente en este estudio. Las formulaciones de NLCs estudiadas, particularmente NX-ST, mejoraron eficazmente el desempeño terapéutico de la HU al aumentar su estabilidad, eficiencia de administración y actividad anticancerígena.

Introducción

El cáncer sigue siendo una de las principales causas de muerte en todo el mundo, con casi 20 millones de nuevos casos y 9,7 millones de muertes relacionadas con el cáncer registradas en 2022. Para 2040, se proyecta que estos números aumenten significativamente, alcanzando 29,9 millones de nuevos casos y 15,3 millones de muertes relacionadas con el cáncer anualmente1,2. La mayoría de los regímenes actuales de fármacos anticancerígenos dependen de compuestos altamente tóxicos, pero su toxicidad sistémica limita las concentraciones terapéuticas que pueden llegar eficazmente a los tejidos cancerosos3. Para superar este desafío, los investigadores han estado explorando nuevos enfoques de administración de fármacos para mejorar la localización tumoral y aumentar el índice terapéutico de la quimioterapia.

Un área crucial de la investigación en oncología es el desarrollo de sistemas avanzados de administración de fármacos para aumentar la eficacia terapéutica mientras se minimizan los efectos secundarios de los medicamentos anticancerígenos. La hidroxiurea (HU), un agente quimioterapéutico y antineoplásico bien establecido, ha sido fundamental en el tratamiento de la enfermedad de células falciformes, la leucemia mielógena crónica y ciertos tumores sólidos debido a su capacidad para incrementar la producción de hemoglobina fetal e inhibir la síntesis de ADN al actuar sobre la ribonucleótido reductasa4,5. A pesar de su eficacia clínica, el potencial terapéutico de la HU se ve limitado por desafíos como la eliminación rápida, la biodisponibilidad variable y un índice terapéutico estrecho, lo que frecuentemente conduce a farmacocinética variable y toxicidades dependientes de la dosis, incluyendo mielosupresión, trastornos gastrointestinales y posibles malignidades secundarias6,7. Para abordar estas limitaciones, los sistemas avanzados de administración de fármacos, incluyendo los transportadores lipídicos nanoestructurados (NLC), han surgido como estrategias prometedoras para mejorar la estabilidad, solubilidad y liberación controlada de la hidroxiurea, mejorando así su perfil de seguridad y eficacia8.

Las NLC son un tipo de nanopartícula basada en lípidos que ofrece varias ventajas frente a los sistemas tradicionales de administración de fármacos. Consisten en una matriz de lípidos sólidos estabilizada por agentes tensioactivos y pueden encapsular fármacos tanto hidrófilos como lipófilos. Esta estructura única permite una mayor capacidad de carga del fármaco, liberación controlada y estabilidad mejorada9,10. La preparación de las NLC generalmente implica técnicas como la homogeneización a alta presión y la sonicación, que facilitan la formación de nanopartículas con una distribución de tamaño estrecha y alta eficiencia de encapsulación11,12. El encapsulamiento del fármaco en NLC no solo mejora su solubilidad y estabilidad, sino que también facilita la administración dirigida a células cancerosas, minimizando así los efectos fuera del blanco. Estudios recientes han demostrado el potencial de las NLC cargadas con fármacos para mejorar el índice terapéutico y los perfiles de liberación sostenida del fármaco13,9. Este mecanismo de liberación controlada es crucial para mantener concentraciones terapéuticas del fármaco durante períodos prolongados, reduciendo así la frecuencia de administración y mejorando la adherencia del paciente14. Los estudios han demostrado que las NLC cargadas con fármacos anticancerígenos como gefitinib15, capecitabina16 e imatinib14 mejoran significativamente la eficacia del fármaco al aumentar la absorción celular y la acumulación en células cancerosas. Por ejemplo, las NLC cargadas con gefitinib han mostrado un aumento de 4,5 veces en la citotoxicidad frente a células cancerosas en comparación con el fármaco libre, destacando el potencial de las NLC para mejorar el índice terapéutico de los inhibidores de tirosina quinasa utilizados en el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas y del cáncer colorrectal. De manera similar, las NLC cargadas con capecitabina mejoran la estabilidad del fármaco y su liberación controlada, lo cual es fundamental para mantener concentraciones terapéuticas y reducir la toxicidad sistémica. Las NLC cargadas con imatinib también se benefician de una administración dirigida mejorada, lo que reduce los efectos fuera del blanco y mejora los resultados en pacientes tratados de leucemia mieloide crónica. Estos atributos convierten a las NLC en candidatas sólidas para ensayos clínicos y para posibles aplicaciones en medicina personalizada mediante la adaptación de los tratamientos a los perfiles individuales de los pacientes. La evaluación de la estabilidad de las NLC cargadas con fármacos es otro aspecto importante que influye en su aplicabilidad clínica. Los estudios de estabilidad suelen implicar someter las formulaciones a diversas condiciones ambientales para evaluar su integridad física a lo largo del tiempo.

Las pruebas de estabilidad acelerada han demostrado que estas NLC mantienen su integridad estructural y contenido de fármaco durante períodos prolongados, destacando su potencial para almacenamiento y uso a largo plazo4,17.

A pesar de estas ventajas, la selección de tensioactivos influye significativamente en las propiedades fisicoquímicas y el rendimiento de los portadores lipídicos nanoestructurados (NLC). Los sistemas lípido-tensioactivos desempeñan un papel importante en la mejora de la estabilidad de las nanopartículas, la encapsulación del fármaco y la biodisponibilidad18,19,20. Sin embargo, hay estudios limitados que hayan investigado cómo diferentes combinaciones de tensioactivos afectan las características fisicoquímicas y la actividad citotóxica de NLC cargados con hidroxiurea. Por lo tanto, este estudio se realizó con el fin de desarrollar NLC cargados con hidroxiurea (NANOXURIA) utilizando diferentes sistemas de tensioactivos y evaluar sistemáticamente cómo estas variaciones influyen en la estabilidad fisicoquímica, el comportamiento durante el almacenamiento y la actividad anticancerígena. Al establecer una relación clara entre el diseño de la formulación y el rendimiento terapéutico, este trabajo tiene como objetivo proporcionar un sistema disperso basado en nanocarrieres (dispersión coloidal) eficaz para caracterizar formulaciones de NLC cargados con hidroxiurea y evaluar su liberación in vitro del fármaco, citotoxicidad y estabilidad durante almacenamiento a corto plazo, generando datos fundamentales sobre propiedades fisicoquímicas y rendimiento in vitro que permitan orientar futuros desarrollos en la administración de HU, sin alterar la molécula del fármaco.

Protocolo

Este estudio no involucró participantes humanos, tejidos de origen humano ni animales vivos. Todas las evaluaciones biológicas se realizaron in vitro utilizando la línea celular de cáncer de mama humano MCF-7 disponible comercialmente, obtenida de la Colección Americana de Tipos de Cultivo (ATCC). Por lo tanto, no fue necesario obtener la aprobación del comité de revisión institucional (IRB) ni de un comité de ética para este trabajo.

Materiales

Se utilizaron tal cual se recibieron hidroxirrea (HU) (ensayo ≥99%), dodecilsulfato de sodio (SDS) (aniónico, ensayo 90%), Tween-80 (T80) (no iónico, ácido oleico ≥58%), Cremophor EL (no iónico, derivado del aceite de ricino, ensayo ≥98%), ácido esteárico (ensayo 95–106%) y aceite de sésamo. Todos los demás productos químicos y reactivos utilizados eran de grado analítico. En la Tabla de Materiales se proporcionan los detalles completos del proveedor y catálogo para todos los materiales y equipos.

Preparación de NLC cargadas con hidroxiurea (NANOXURIA)

La preparación de NANOXURIA incluye tres pasos: la preparación de la fase lipídica, la incorporación del fármaco y la preparación de la fase acuosa. La fase lipídica se obtuvo como una mezcla fundida de ácido esteárico (500 mg) y aceite de sésamo (250 µl). La fusión se llevó a cabo en un vaso de precipitados sobre una placa calefactora. La cantidad exactamente pesada de HU (150 mg) se mezcló con la fase lipídica. La fase acuosa se preparó disolviendo los tensioactivos (Tabla 1) en agua (Millipore) (25 mL). La solución de tensioactivos se calentó hasta alcanzar la misma temperatura que la fase lipídica (70 °C) para evitar la solidificación prematura. La fase acuosa caliente se añadió gradualmente a la fase lipídica fundida bajo agitación a alta velocidad con un homogeneizador. La mezcla se homogeneizó a alta velocidad (6000 rpm) durante 20 min para formar una emulsión caliente estable. La emulsión caliente se enfrió hasta temperatura ambiente con agitación continua. Durante el enfriamiento, la fase lipídica se solidifica, formando las NLC. Las NLC cargadas con HU preparadas se almacenaron para su posterior caracterización y aplicación.

Caracterización y evaluación

Tamaño de partícula, potencial zeta (ZP) e índice de politispersión (PDI)

El análisis del tamaño de partícula y el índice de politispersión (PDI) de NANOXURIA se determinaron utilizando un Zetasizer Nano ZS90. Este dispositivo funciona según el principio de dispersión dinámica de la luz (DLS), que mide el movimiento browniano de las partículas en una suspensión y lo correlaciona con su diámetro hidrodinámico mediante la ecuación de Stokes-Einstein. Además del tamaño y el PDI, se evaluó la carga superficial de NANOXURIA midiendo el potencial zeta (ZP) con el mismo instrumento. El potencial zeta se determinó mediante dispersión electroforética de la luz (ELS), en la cual se analiza la velocidad de las partículas en un campo eléctrico aplicado para calcular su carga superficial. Este parámetro es crucial para evaluar la estabilidad coloidal de NANOXURIA. Las mediciones se realizaron en un entorno controlado, colocando las muestras diluidas en cubetas para garantizar compatibilidad con los requisitos ópticos y eléctricos del instrumento. Para mejorar la solidez y la reproducibilidad de los resultados, todas las mediciones se realizaron por triplicado.

Morfología

La morfología de NANOXURIA se estudió mediante un microscopio electrónico que operaba en modos de transmisión y de barrido. Se utilizó microscopía electrónica de transmisión (TEM) para observar la estructura interna y la forma de las partículas, mientras que microscopía electrónica de barrido con emisión de campo (FE-SEM) se empleó para examinar la morfología de la superficie y la distribución de partículas. Las muestras se prepararon adecuadamente y se analizaron a voltajes de aceleración apropiados para obtener imágenes de alta resolución. Para la preparación de las muestras, las dispersiones de NANOXURIA se diluyeron con agua purificada; para TEM, se colocó una gota de la dispersión diluida sobre una rejilla de cobre recubierta con carbono, se eliminó el exceso por absorción y la película se secó al aire a temperatura ambiente antes de la observación bajo alto vacío a un voltaje de aceleración de 60-80 kV. Para FE-SEM, se colocó una gota de la dispersión diluida sobre un soporte de aluminio, se secó al aire y se recubrió mediante pulverización catódica con una capa conductora delgada antes de la observación a (1–3 kV). Se obtuvieron micrografías representativas a diferentes aumentos.

Análisis de eficiencia de encapsulación para formulaciones NANOXURIA

La eficiencia de encapsulación (EE) de NANOXURIA se evaluó utilizando la técnica de ultrafiltración-centrifugación con un filtro centrífugo Amicon Ultra-2 mL (corte molecular de 3 kDa). Este método separó la HU no encapsulada (aproximadamente 6 mg en 1 mL de NANOXURIA) de la fracción encapsulada mediante centrifugación a 4.000 x g durante 20 min a 25 °C, asegurando un aislamiento eficaz. El filtrado, que contenía HU libre, se diluyó con agua purificada y se analizó mediante un espectrofotómetro UV-visible a 213 nm para cuantificar el fármaco no encapsulado, utilizando una curva de calibración basada en la ley de Beer-Lambert. El porcentaje de EE se calculó como;

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Estudio de liberación in vitro

El perfil de liberación in vitro de HU a partir de NANOXURIA se evaluó utilizando la técnica de difusión en bolsa de diálisis, un método ampliamente adoptado para evaluar la liberación controlada de fármacos. Las bolsas de diálisis (12–14 kDa de MWCO) se preinundaron en agua destilada durante 12 h para garantizar una hidratación adecuada y la eliminación de conservantes. Un extremo de la bolsa de diálisis se selló firmemente y se introdujeron cuidadosamente 2 mL de la formulación de NANOXURIA, equivalentes a 12 mg de HU, dentro de la bolsa. El otro extremo se ató luego firmemente para evitar fugas. La bolsa de diálisis se sumergió en un vaso de precipitados que contenía agua (50 mL) como medio de liberación. El sistema se mantuvo a 37 ± 0,5 °C para simular la temperatura corporal y se agitó a 50 rpm con un agitador magnético para asegurar una mezcla uniforme y minimizar los efectos de la capa límite. En intervalos de tiempo predeterminados (0,5; 1; 2; 4; 6; 12 y 24 h), se retiraron alícuotas de 2 mL del medio de liberación y se reemplazaron inmediatamente con un volumen igual de agua fresca y precalentada para mantener condiciones de sumidero. Las muestras recogidas se filtraron a través de un filtro de jeringa de 0,45 µm para eliminar cualquier materia particulada, asegurando la claridad para el análisis. El filtro de membrana retiene las partículas mientras permite el paso del HU disuelto. Dado que el HU es libremente soluble en agua, el fármaco libre permaneció en el filtrado, asegurando que el material retenido representara partículas y no fármaco libre. Las muestras filtradas se analizaron posteriormente para determinar el contenido de HU mediante un espectrofotómetro UV-visible a una longitud de onda de 213 nm, correspondiente a la máxima absorción del HU (λmax). Se estableció una curva de calibración para cuantificar con precisión las concentraciones de HU.

Cultivo celular

El estudio se realizó utilizando la línea celular de cáncer de mama humano metastásico MCF-7, obtenida de la Colección Estadounidense de Tipos Celulares (ATCC). Las células se mantuvieron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) para favorecer el crecimiento y la viabilidad celular, y con 1% de solución de penicilina-estreptomicina para prevenir la contaminación microbiana durante el cultivo. A continuación, las células se incubaron en condiciones fisiológicas estándar a 37 °C en una incubadora de CO₂ humedecida, manteniendo el medio de cultivo a un pH de 7,4. Estas condiciones se seleccionaron para garantizar un crecimiento celular óptimo, la proliferación y la fiabilidad experimental durante los estudios de citotoxicidad.

Ensayo de viabilidad celular (MTT)

Se realizó el ensayo MTT para evaluar la capacidad inductora de muerte celular de diferentes formulaciones de NANOXURIA16,21. En resumen, las células MCF-7 se sembraron en placas de 96 pozos a una densidad de 1 x 104 células/mL y se incubaron durante 24 h en un incubador con CO₂ para permitir la adecuada adhesión y crecimiento celular. Las células no tratadas sirvieron como control negativo, mientras que los pozos que contenían solo medio de cultivo se utilizaron como controles en blanco. Tras la incubación, el medio de cultivo se reemplazó con medio fresco que contenía diferentes concentraciones de las formulaciones en prueba, hasta 200 µg/mL. Las placas tratadas se incubaron adicionalmente durante 72 h en condiciones estándar de cultivo. Después del tratamiento, se agregaron 20 µL del reactivo MTT (5 mg/mL) a cada pozo y se incubaron durante 4 h más para permitir la formación de cristales de formazán en las células metabólicamente activas. Posteriormente, se añadieron 100 µL de dimetilsulfóxido (DMSO) para disolver los cristales, obteniéndose una solución violeta. La absorbancia se midió a 570 nm utilizando un lector de microplacas (SpectroStar Nano). La viabilidad celular (%) se calculó en relación con el grupo control no tratado, utilizando los valores de absorbancia obtenidos.

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Estudio de estabilidad

La estabilidad de NANOXURIA se evaluó sistemáticamente durante un período de 3 meses bajo condiciones controladas de almacenamiento para valorar su idoneidad para uso a largo plazo. Cada formulación de NANOXURIA se fraccionó en recipientes de vidrio ámbar herméticos para minimizar la exposición a la luz y a la humedad. Los recipientes se almacenaron a una temperatura constante ambiente de 25 ± 2 °C y a una temperatura refrigerada de 4 ± 2 °C. Las muestras se evaluaron periódicamente en intervalos predeterminados (1, 2 y 3 meses) para determinar la estabilidad física y fisicoquímica. Se realizó una medición basal inmediatamente después de la preparación y antes del almacenamiento, considerándose como 0 meses (inicial). Las evaluaciones físicas incluyeron inspección visual de cambios en el aspecto, incluyendo signos de aglomeración, sedimentación, separación de fases, alteración del color (por ejemplo, de blanco amarillento a amarillo), cambios en la consistencia (por ejemplo, viscosidad o textura) y olor (por ejemplo, rancidez debida a la oxidación lipídica). Para la estabilidad fisicoquímica, se midieron parámetros clave de caracterización, incluyendo tamaño de partícula, índice de politispersión (PDI) y potencial zeta (ZP).

Análisis estadístico

En este estudio, todos los resultados experimentales se expresan como valores medios ± desviación estándar (DE) (n = 3) para reflejar la tendencia central y la variabilidad de los datos. Se realizaron análisis estadísticos para evaluar la formulación mediante una prueba t pareada y para comparar las diferencias entre formulaciones mediante un análisis de varianza de un solo factor (ANOVA) seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey. Se consideró estadísticamente significativo un valor de p < 0,05. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism versión 10.

Resultados

Propiedades fisicoquímicas

Las propiedades fisicoquímicas de las formulaciones NANOXURIA, incluyendo el tamaño de partícula, el índice de politispersión (PDI), el potencial zeta (ZP), la morfología y la eficiencia de encapsulación (EE), se muestran en la Tabla 2. La evaluación morfológica mediante TEM y SEM, complementada con gráficos de distribución del tamaño de partícula y del potencial zeta, se presenta en las Figuras 1, 2 y 3. Se muestra una comparación del PDI para diferentes combinaciones de tensioactivos en la Figura 4.

Estudio de liberación

El estudio de liberación in vitro de las formulaciones NANOXURIA se realizó para evaluar cómo las diferencias en la formulación afectan el perfil de liberación del fármaco durante 24 h (Figura 5). NX-CS mostró la liberación más rápida, comenzando en 55,90 % a las 0,5 h y alcanzando el 104,05 % a las 24 h (valores >100 % pueden reflejar variabilidad experimental o liberación completa con una ligera sobreestimación). El perfil de liberación mostró un aumento casi lineal entre 0,5 y 6 h, seguido de una meseta. NX-CT presentó la liberación más lenta y más controlada, comenzando en 46,18 % a las 0,5 h y alcanzando el 82,99 % a las 24 h, con una meseta entre 2 y 12 h (54,51 % a 59,38 %) seguida de un aumento posterior. NX-ST mostró un perfil de liberación intermedio, comenzando en 54,05 % a las 0,5 h, alcanzando un pico del 90,63 % a las 12 h y disminuyendo ligeramente al 86,23 % a las 24 h. En general, la liberación acumulada siguió el orden: NX-CS > NX-ST > NX-CT. NX-CS y NX-ST mostraron una liberación inicial más intensa, mientras que NX-CT presentó una liberación retardada. La cinética de liberación indicó una liberación rápida para NX-CS, una liberación sostenida para NX-CT y una liberación bifásica para NX-ST.

Ensayo de citotoxicidad

El in vitro citotoxicidad de NANOXURIA formulaciones se evaluó frente a células de cáncer de mama MCF-7 mediante el ensayo MTT, con Tabla 3 detallando el IC₅₀ valores. NX-ST demostró la citotoxicidad más alta, con una IC estimada₅₀ de 225 ± 21.47 µg/mL (extrapolado), lo que indica una actividad anticancerígena superior. En contraste, NX-CS y NX-CT exhibieron una citotoxicidad menor, con IC₅₀ valores que exceden 300 µg/mL. La hidroxiurea (HU) libre mostró la citotoxicidad más baja, con una IC₅₀ de 722.57 µg/mL. Debido a que la IC₅₀ los valores para NX-CS y NX-CT se informaron únicamente como superiores a 300 µg/mL, su citotoxicidad relativa entre sí y con respecto a la HU libre (722.57 µg/mL) no pueden establecerse a partir de los datos actuales; solo NX-ST pudo clasificarse firmemente como más citotóxico que la HU libre. Estos resultados indican que las formulaciones de NLC mejoran significativamente la actividad anticancerígena de la HU en comparación con el fármaco libre.

Correlación estadística entre parámetros fisicoquímicos y citotoxicidad

Todos los parámetros estudiados están correlacionados y se muestran en la Figura 6. Los análisis estadísticos revelaron diferencias significativas entre las NLC cargadas con HU (NX-ST, NX-CT, NX-CS) en el potencial zeta, la eficiencia de encapsulación (EE) y la citotoxicidad (IC₅₀) [F(2,12) = 6.45, p = 0.014], pero no en el tamaño de partícula ni en el PDI [F(2,12) = 1.27, p = 0.31]. La formulación NX-ST mostró una citotoxicidad óptima con una EE moderada, mientras que NX-CS y NX-CT exhibieron una EE más alta pero una citotoxicidad más débil. A los valores de IC50 que excedieron el límite superior del rango de concentración ensayado (>300 µg/mL) se les asignó un valor de 300 µg/mL para el análisis exploratorio de correlación. El análisis exploratorio de correlación de Spearman mostró una asociación positiva entre el potencial zeta y el IC₅₀ (ρ = 0.866, p = 0.333). Por lo tanto, las formulaciones con un potencial zeta menos negativo tendieron a presentar valores más altos de IC₅₀, mientras que la formulación NX-ST, con carga más negativa, mostró una mayor actividad citotóxica.

Estudio de estabilidad

Estabilidad del tamaño de las partículas

A 25 °C, el tamaño de partícula de todas las formulaciones NANOXURIA aumentó durante el período de almacenamiento de tres meses, mostrando tendencias distintas (Figura 7). NX-ST, 110 nm (1 mes), permaneció relativamente estable durante los primeros dos meses (106,4 nm), pero aumentó a 150,6 nm en el tercer mes. NX-CT, que comenzó en 91,9 nm, mostró un aumento gradual hasta 102,2 nm en dos meses, seguido de un fuerte incremento a 168,3 nm a los tres meses. NX-CS presentó el mayor cambio, aumentando desde 67,3 nm inicialmente hasta 171,06 nm en el tercer mes. En general, todas las formulaciones mostraron un crecimiento del tamaño de partícula a 25 °C, con una magnitud de aumento en el siguiente orden: NX-CS > NX-CT > NX-ST.

A 4 °C, las formulaciones de NANOXURIA mostraron una mayor estabilidad en comparación con 25 °C, con aumentos más pequeños en el tamaño de las partículas durante el período de almacenamiento de tres meses (Figura 7). NX-ST mantuvo una estabilidad relativa, con tamaños de partícula de 110 nm a un mes, 102 nm a dos meses y 120,96 nm a tres meses. NX-CT mostró un aumento gradual en el tamaño de las partículas, desde 91,9 nm a un mes hasta 116,7 nm a dos meses y 128,5 nm a tres meses. NX-CS presentó la menor variación, aumentando desde 67,3 nm inicialmente hasta 74,75 nm a dos meses y 89,3 nm a tres meses. En general, el crecimiento del tamaño de las partículas a 4 °C siguió la tendencia: NX-CT > NX-ST > NX-CS, lo que indica una mayor estabilidad bajo condiciones refrigeradas.

Estabilidad del PDI

A 25 °C, el PDI de las formulaciones NANOXURIA mostró diferentes tendencias durante el período de almacenamiento de tres meses (Figura 8). NX-ST mantuvo valores de PDI relativamente estables a lo largo del estudio, lo que indica una distribución de tamaño de partícula constante. NX-CT presentó un aumento en el PDI en el segundo mes (0,342), seguido de una disminución a 0,248 en el tercer mes. NX-CS mostró un aumento progresivo del PDI con el tiempo, lo que indica una pérdida gradual de la uniformidad en el tamaño de las partículas. En general, NX-ST demostró la distribución más estable, NX-CT mostró una variabilidad transitoria y NX-CS exhibió una heterogeneidad creciente.

A 4 °C, el PDI de las formulaciones NANOXURIA mostró diferentes tendencias durante el período de almacenamiento de tres meses (Figura 8). NX-ST exhibió valores de PDI relativamente estables, que disminuyeron de 0,347 a un mes a 0,269 a dos meses, seguidos de un ligero aumento a 0,349 a los tres meses. NX-CT mostró un aumento progresivo del PDI de 0,221 a un mes a 0,331 a tres meses, lo que indica una pérdida gradual de la uniformidad de las partículas. NX-CS también mostró una tendencia ascendente en el PDI con el tiempo, lo que indica una menor homogeneidad. En general, NX-ST mantuvo la distribución más estable, mientras que NX-CT y NX-CS mostraron una heterogeneidad creciente.

Estabilidad del potencial zeta

A 25 °C, el potencial zeta (ZP) de las formulaciones NANOXURIA mostró tendencias distintas durante el período de almacenamiento de tres meses (Figura 9). NX-ST presentó un ZP inicial de −46,43 mV a un mes, que disminuyó a −39,37 mV a los dos meses y aumentó a −52,33 mV al tercer mes. NX-CT mostró un aumento gradual en la negatividad, pasando de −30,76 mV a un mes a −35,66 mV a los dos meses y −37,13 mV a los tres meses. NX-CS demostró un aumento en la negatividad del ZP, desde −30,03 mV inicialmente hasta −39,6 mV a los dos meses y −52,47 mV a los tres meses. En general, todas las formulaciones presentaron valores decrecientes de ZP con el tiempo, siendo las magnitudes mayores en NX-ST y NX-CS en comparación con NX-CT.

A 4 °C, el potencial zeta (ZP) de las formulaciones NANOXURIA mostró tendencias distintas durante el período de almacenamiento de tres meses (Figura 9). NX-ST mantuvo valores de ZP negativos consistentemente altos a lo largo del estudio. NX-CT exhibió un aumento gradual en la negatividad del ZP, comenzando en −30,76 mV y volviéndose ligeramente más negativo al tercer mes. NX-CS mostró una ligera disminución en la negatividad del ZP, desde −30,03 mV inicialmente hasta −28,8 mV en tres meses.

Disponibilidad de datos:

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles dentro del artículo. Los conjuntos de datos brutos generados y analizados durante el presente estudio están disponibles en el Archivo Suplementario

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Figura 1: Caracterización morfológica y fisicoquímica de NX-ST. (A) Imagen de microscopía electrónica de barrido (SEM). (B) Imagen de microscopía electrónica de transmisión (TEM). (C) Distribución del tamaño de partículas (108,3 nm; PDI = 0,336) (n = 1). (D) Distribución del potencial zeta (−48,8 mV) (n = 1). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Caracterización morfológica y fisicoquímica de NX-CT. (A) Imagen de SEM. (B) Imagen de TEM. (C) Distribución del tamaño de partículas (91,87 nm; PDI = 0,235) (n = 1). (D) Distribución del potencial zeta (−31,3 mV) (n = 1). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Caracterización morfológica y fisicoquímica de NX-CS. (A) Imagen de MEB. (B) Imagen de MET. (C) Distribución del tamaño de partículas (74,72 nm; PDI = 0,244) (n = 1). (D) Distribución del potencial zeta (−36,8 mV) (n = 1). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Comparación del PDI entre formulaciones NANOXURIA con diferentes combinaciones de tensioactivos. Se muestran los valores de PDI para las formulaciones NX-ST, NX-CT y NX-CS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Liberación in vitro de hidroxiurea a partir de formulaciones NANOXURIA. Se muestra la liberación acumulada de hidroxiurea a partir de NX-CS, NX-CT y NX-ST durante 24 h. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Comparación de parámetros fisicoquímicos y citotoxicidad entre las formulaciones NANOXURIA. Gráfico radar que compara el tamaño de partícula, PDI, potencial zeta (ZP), eficiencia de encapsulación (EE) y la IC₅₀ para NX-ST, NX-CS y NX-CT. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7: Efecto de la temperatura y duración del almacenamiento sobre el tamaño de las partículas de NANOXURIA. (A) Tamaño de las partículas durante el almacenamiento a 25 °C. (B) Tamaño de las partículas durante el almacenamiento a 4 °C. (C) Comparación del tamaño de las partículas entre 4 °C y 25 °C a los 2 y 3 meses. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 8: Efecto de la temperatura y duración del almacenamiento en el PDI de NANOXURIA. (A) PDI durante el almacenamiento a 25 °C. (B) PDI durante el almacenamiento a 4 °C. (C) Comparación del PDI entre 4 °C y 25 °C a los 2 y 3 meses. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 9: Efecto de la temperatura y duración del almacenamiento sobre el potencial zeta de NANOXURIA. (A) Potencial zeta durante el almacenamiento a 25 °C. (B) Potencial zeta durante el almacenamiento a 4 °C. (C) Comparación del potencial zeta entre 4 °C y 25 °C a los 2 y 3 meses. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

FormulacionesTween-80 (µL)*Dodecilsulfato de sodio (SDS) (mg)Cremophor EL (µL)#
NX-ST50100-
NX-CT50-100
NX-CS-50100
Densidad (g/ml) = (1.07*, 1.05#)

Tabla 1: Composición de tensioactivos de las formulaciones NANOXURIA. Se utilizaron cantidades de Tween-80, dodecilsulfato de sodio (SDS) y Cremophor EL para preparar las formulaciones NX-ST, NX-CT y NX-CS.

FormulacionesTamaño de partícula (d.nm) (n = 3) (± DE)PDI (n = 3) (± DE)PZ (mV) (n = 3) (± DE) RE (%) (n = 3) (± DE)
NX-ST110 ± 1.9970.347 ± 0.011-46.433 ± 8.40478.189 ± 3.49
NX-CT91.947 ± 0.2150.221 ± 0.015-30.767 ± 0.47384.638 ± 5.0
NX-CS67.377 ± 7.1580.302 ± 0.091-30.033 ± 5.86286.626 ± 4.676

Tabla 2: Caracterización fisicoquímica de las formulaciones NANOXURIA. Tamaño de partícula, índice de politispersión (PDI), potencial zeta (ZP) y eficiencia de encapsulación (EE) de NX-ST, NX-CT y NX-CS a 25 °C. Los datos se presentan como media ± DE (n = 3).

FormulacionesCI50 (µg/mL)CI50 (µM)
NX-ST225 ± 21.472960
NX-CS>300-
NX-CT>300-
HU722.579500

Tabla 3: Citotoxicidad in vitro de las formulaciones NANOXURIA y de la hidroxiurea libre. Valores de IC₅₀ de NX-ST, NX-CS, NX-CT y hidroxiurea libre (HU) frente a células MCF-7, expresados en µg/mL y µM.

Archivo Suplementario 1: Datos brutos y cálculos para la caracterización de los portadores lipídicos nanoestructurados cargados con hidroxiurea. El archivo contiene los datos experimentales y cálculos subyacentes para las formulaciones NX-ST, NX-CT y NX-CS, incluyendo tamaño de partícula, índice de polidispersidad, potencial zeta, eficiencia de encapsulación, mediciones de liberación del fármaco y análisis comparativos de formulaciones.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Enfoque propuesto y hallazgos principales

El presente estudio desarrolló NANOXURIA mediante un enfoque de homogenización en caliente. Se utilizó ácido esteárico como lípido sólido, y la temperatura de preparación se mantuvo aproximadamente a 70 °C, lo cual se ajusta estrechamente al punto de fusión del ácido esteárico (~69,3 °C), para garantizar la fusión completa del lípido y una homogenización eficiente, al mismo tiempo que se minimiza la exposición térmica innecesaria de HU y los tensioactivos22. Los sistemas de tensioactivos se seleccionaron en función de su valor de equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB), biocompatibilidad y adecuación para la preparación de NLC. Se realizaron ensayos preliminares de formulación para identificar concentraciones de tensioactivos que produzcan nano dispersiones estables con tamaño de partícula pequeño y bajo PDI, evitando al mismo tiempo concentraciones excesivas que podrían afectar negativamente la estabilidad o la citocompatibilidad. Las formulaciones se diluyeron adecuadamente con agua de alta pureza antes del análisis del tamaño de partícula para minimizar los efectos de dispersión múltiple que podrían interferir con la determinación precisa del tamaño de partícula y la distribución de tamaños23.

Las tres formulaciones, NX-ST, NX-CT y NX-CS, diferían principalmente en su composición de tensioactivos. NX-ST contenía T80 y SDS, NX-CT contenía Cremophor EL y T80, y NX-CS contenía Cremophor EL y SDS. Esta estrategia de formulación permitió evaluar los efectos de los tensioactivos no iónicos e iónicos, así como de sus concentraciones, sobre las características fisicoquímicas de las NLC cargadas con HU. Los resultados demostraron diferencias claras en el tamaño de partícula, PDI, ZP, EE, comportamiento de liberación del fármaco y citotoxicidad entre las formulaciones, lo que indica que la selección del tensioactivo es un determinante importante del rendimiento de las NLC.

El tamaño de las partículas difirió significativamente entre las formulaciones (p < 0,05), siguiendo el orden NX-CS < NX-CT < NX-ST. El tamaño de las partículas es un determinante importante del rendimiento del nanocarrier, ya que las partículas más pequeñas pueden proporcionar un área superficial mayor e influir en la estabilidad de la dispersión, las interacciones celulares, la biodistribución y el comportamiento de liberación del fármaco24,25. NX-CS produjo las partículas más pequeñas, lo cual podría estar asociado con la alta eficiencia de emulsificación de Cremophor EL combinada con la concentración moderada de SDS. Cremophor EL puede facilitar la formación de gotas más pequeñas al reducir la tensión interfacial, mientras que el SDS contribuye a la estabilización electrostática. La menor concentración de SDS utilizada en NX-CS en comparación con NX-ST podría haber proporcionado una estabilización interfacial suficiente sin producir los efectos interfaciales excesivos asociados con la concentración más alta de SDS26,27,28.

NX-CT produjo un tamaño de partícula intermedio. La combinación de Cremophor EL y T80 proporciona dos tensioactivos no iónicos con propiedades complementarias de estabilización interfacial y estérica. Cremophor EL aporta una fuerte emulsificación, mientras que T80 puede formar una barrera estérica alrededor de las partículas y reducir la coalescencia29,30,31. La ausencia de un tensioactivo iónico también evita interacciones fuertes mediadas por cargas durante la formación de partículas. En contraste, NX-ST exhibió el tamaño de partícula más grande. Aunque el SDS es un tensioactivo emulsionante potente, su concentración relativamente alta en NX-ST pudo haber alterado el entorno interfacial y el comportamiento de crecimiento de las partículas. T80 proporciona estabilización estérica, pero el efecto combinado de T80 y la concentración más alta de SDS pudo haber generado un equilibrio menos favorable entre emulsificación y estabilización que el logrado en NX-CS.

Los estudios de morfología respaldaron aún más la formación de portadores lipídicos a escala nanométrica. El MEB y el MET mostraron partículas predominantemente esféricas o casi esféricas, cuya morfología observada fue ampliamente coherente con los tamaños de partícula determinados por DLS. Se esperan diferencias entre las mediciones microscópicas y las de DLS porque el MEB examina partículas secas, mientras que el DLS mide el diámetro hidrodinámico de las partículas junto con sus capas asociadas de hidratación y tensioactivos. Por lo tanto, los hallazgos combinados de microscopía y DLS respaldan la formación exitosa de sistemas de NLC a escala nanométrica.

El PDI proporcionó información adicional sobre la uniformidad de las poblaciones de partículas. NX-CT mostró la distribución de tamaño de partícula más estrecha, mientras que NX-ST presentó el PDI medio más alto. NX-CS tuvo un PDI medio intermedio pero mayor variabilidad entre mediciones replicadas. En particular, los valores replicados para NX-CS indican que la formulación exhibió mayor variabilidad que las de NX-ST y NX-CT. La tendencia general del PDI fue NX-CT < NX-CS < NX-ST, aunque la diferencia reportada no fue estadísticamente significativa (p > 0,05). El PDI relativamente bajo de NX-CT podría estar relacionado con la estabilización estérica combinada proporcionada por Cremophor EL y T80. Ambos surfactantes son no iónicos y pueden estabilizar la interfase de las partículas sin introducir interacciones electrostáticas fuertes. Cremophor EL facilita la emulsificación, mientras que T80 proporciona protección estérica, lo que potencialmente promueve una población de partículas más homogénea32,33. El PDI más alto de NX-ST podría reflejar la influencia de su mayor concentración de SDS. El SDS proporciona repulsión electrostática, pero los cambios en la concentración del surfactante también pueden alterar la micelización y la organización interfacial, lo que potencialmente contribuye a la heterogeneidad del tamaño de las partículas34,35,36. NX-CS mostró un comportamiento intermedio de PDI, consistente con los efectos combinados de Cremophor EL y una concentración más baja de SDS37.

Las formulaciones también diferían en la carga superficial. NX-ST presentó el potencial zeta (ZP) más negativo, lo cual es consistente con la presencia de una concentración más alta de SDS, seguido por NX-CT y NX-CS. Se espera que los sistemas que contienen SDS tengan una carga superficial más negativa, ya que el SDS es un surfactante aniónico. Por lo tanto, los valores de ZP indican que el SDS contribuyó significativamente a la carga superficial de las NLC, mientras que los surfactantes no iónicos contribuyeron principalmente a la estabilización estérica. La tendencia en ZP fue NX-ST > NX-CT > NX-CS (p < 0,05). Sin embargo, estas diferencias no deben atribuirse exclusivamente a la composición de los surfactantes, ya que el surfactante libre residual, la fuerza iónica y los cambios en la organización lípido-surfactante también pueden influir en el ZP medido38,39,40.

La eficiencia de encapsulación demostró además la influencia de la composición en la retención de HU. Todas las formulaciones presentaron una EE relativamente alta (>75%), lo que indica una incorporación exitosa de HU en los sistemas de NLC. NX-CS mostró la EE más alta, seguido por NX-CT y NX-ST, con una diferencia significativa entre las formulaciones (p < 0,05). Cremophor EL podría haber contribuido a una estabilización interfacial eficiente y a la retención del fármaco, mientras que la concentración moderada de SDS en NX-CS podría haber proporcionado una estabilización adicional sin los efectos potencialmente disruptivos asociados con la concentración más alta de SDS en NX-ST41,42,43. Sin embargo, dado que HU es hidrofílico, es poco probable que se disuelva completamente dentro de la matriz lipídica. En su lugar, HU podría estar presente como un fármaco finamente disperso, asociado a la interfase lípido-agua, o alojado dentro de la matriz lipídica imperfecta y la región interfacial rica en tensioactivos.

Los perfiles de liberación mostraron un comportamiento dependiente de la formulación, con la liberación acumulativa de HU siguiendo el orden NX-CS > NX-ST > NX-CT a las 24 h. NX-CS mostró una liberación relativamente rápida con un estallido inicial seguido de una meseta, consistente con cinética de primer orden, mientras que NX-CT mostró la liberación más lenta y más controlada, aproximando cinética tipo orden cero; NX-ST exhibió un comportamiento intermedio perfil de liberación bifásico La liberación probablemente está regulada por la difusión de HU desde la superficie de la partícula y la región interfacial rica en surfactante, seguida de una difusión más lenta del fármaco atrapado a través de la matriz lipídica. La liberación más rápida desde NX-CS podría estar relacionada con su menor tamaño de partícula, mayor área superficial y los efectos combinados de Cremophor EL y SDS, donde SDS aumenta la hidrofilicidad interfacial y Cremophor EL facilita la solubilización del fármaco. En contraste, la combinación de Cremophor EL y T80 en NX-CT podría proporcionar una barrera interfacial más estable, limitando la difusión inicial del fármaco y produciendo una liberación más sostenida, mientras que NX-ST mostró un patrón bifásico intermedio atribuible a las influencias opuestas de la liberación facilitada por SDS y la estabilización mediada por T80. Estas interpretaciones son coherentes con el papel propuesto de los tensioactivos en la modulación de las interacciones entre la matriz lipídica y el medio de liberación.41,44,45,46,47,48. Se utilizó agua como medio de liberación para establecer el comportamiento básico de difusión, pero no replica la composición iónica ni las condiciones fisiológicas de los fluidos biológicos. Los electrolitos presentes en los tampones fisiológicos pueden alterar la doble capa eléctrica, la organización del surfactante, la agregación de partículas y la permeabilidad de la membrana, lo que podría modificar la cinética de liberación.

Los resultados de citotoxicidad mostraron una diferencia clara entre la hidroxiurea libre y las formulaciones de NLC, con HU libre que muestra el IC más alto₅₀ y NX-ST que exhibe la mayor actividad citotóxica. La IC inferior₅₀ los valores observados para las formulaciones de NLC indican que la incorporación de HU en el vehículo lipídico alteró su actividad in vitro frente a células MCF-7. La respuesta particularmente intensa de NX-ST podría reflejar la contribución combinada de su sistema de surfactante SDS/T80, un ZP negativo relativamente alto y un perfil de liberación bifásico intermedio, que en conjunto podrían influir en la disponibilidad del fármaco en la interfase celular y en la exposición temporal de las células a la HU liberada49,50Curiosamente, el menor tamaño de las partículas y la mayor eficiencia de encapsulación de NX-CS no se tradujeron en una citotoxicidad mayor, lo que subraya que el tamaño de las partículas y el atrapamiento del fármaco por sí solos no determinan la actividad biológica; más bien, las interacciones celulares, el comportamiento de liberación del fármaco, los efectos de los tensioactivos y la disponibilidad del fármaco pueden influir colectivamente en la respuesta.51,52,53. La menor citotoxicidad de NX-CT y NX-CS en comparación con NX-ST, por lo tanto, no debe interpretarse simplemente como un desempeño inferior de la formulación, especialmente porque NX-CT demostró la liberación más controlada.

El estudio de almacenamiento demostró una buena estabilidad física, ya que no se observó aglomeración visible, sedimentación, separación de fases, decoloración, cambio en la viscosidad o textura, ni olor anormal o rancio en ninguna formulación durante todo el periodo de almacenamiento. Sin embargo, los datos de estabilidad fisicoquímica ofrecieron una imagen más diferenciada. A 25 °C, un aumento en el tamaño de partícula y/o en el PDI indicó cambios progresivos en los sistemas coloidales, con una magnitud y significancia estadística variables entre las formulaciones. NX-ST se benefició de la fuerte contribución electrostática del SDS, mientras que NX-CT, que dependía predominantemente de la estabilización estérica proporcionada por Cremophor EL y T80, mostró una mayor susceptibilidad a cambios en las características de las partículas. NX-CS, a pesar de combinar estabilización electrostática y estérica, también mostró cambios durante el almacenamiento, lo que indica que la presencia de dos mecanismos de estabilización no previene completamente la reestructuración dependiente del tiempo del sistema NLC. El almacenamiento a 4 °C proporcionó generalmente una mejor preservación fisicoquímica, lo cual es consistente con una menor movilidad molecular y cambios estructurales lipídicos más lentos; NX-CS mostró una estabilidad del tamaño de partícula comparativamente mejorada, mientras que NX-ST mantuvo características relativamente constantes. No obstante, NX-CT continuó mostrando cambios progresivos en el PDI, lo que sugiere que la estabilización estérica por sí sola podría no ser suficiente para un almacenamiento prolongado. Los cambios en el potencial zeta durante el almacenamiento sugieren además una reorganización dependiente del tiempo en la interfase lípido-tensioactivo, posiblemente relacionada con la desorción del tensioactivo, la recristalización lipídica y cambios estructurales asociados a HU, los cuales no se establecieron directamente47,48,54. 

Avance del campo

Las formulaciones de NLC de otros agentes anticancerígenos, incluyendo gefitinib, capecitabina e imatinib, han demostrado previamente una entrega mejorada en comparación con el fármaco libre14,15,16, pero los datos comparativos sobre cómo diferentes combinaciones de tensioactivos moldean el perfil fisicoquímico y citotóxico de NLC cargadas con hidroxiurea específicamente han sido limitados43,44,55. Al comparar sistemáticamente tres sistemas de tensioactivos dentro de una única plataforma de NLC, este estudio proporciona una comparación directa y controlada internamente que aclara cómo la naturaleza iónica y la concentración del tensioactivo influyen conjuntamente en el tamaño de partícula, estabilidad coloidal, retención del fármaco y actividad anticancerígena in vitro para un fármaco pequeño y altamente hidrofílico, una combinación menos representada en la literatura de NLC que cargas lipofílicas51,54,56,57. Estos resultados amplían los informes previos sobre la encapsulación de HU en nanocarriers basados en lípidos y albúmina53,58 al identificar una combinación de tensioactivos (T80–SDS) asociada con la mayor potenciación citotóxica in vitro.

Limitaciones del estudio

Este estudio tiene varias limitaciones que deben considerarse al interpretar los hallazgos. En primer lugar, la evaluación biológica se limitó a un único ensayo in vitro de MTT en células de cáncer de mama MCF-7; aunque la HU se utiliza clínicamente en la leucemia mieloide crónica y la enfermedad de células falciformes, los datos actuales no respaldan conclusiones específicas para estas afecciones, y se requiere confirmación en un modelo relevante de leucemia (por ejemplo, células K562) y en estudios in vivo. En segundo lugar, las explicaciones mecanicistas propuestas para las diferencias observadas en las propiedades fisicoquímicas y citotóxicas (por ejemplo, desorción del surfactante, recristalización lipídica, absorción celular alterada) no se demostraron directamente y deben considerarse hipótesis; se necesitarían técnicas como DSC, XRD y Cryo-TEM23,41, junto con estudios de absorción celular y cinética de liberación, para sustentarlas. En tercer lugar, la liberación in vitro se evaluó en agua en lugar de un tampón fisiológico, lo cual se considera un paso esencial para predecir el comportamiento in vivo59. En cuarto lugar, no se cuantificó directamente la estabilidad química de la HU durante la preparación, ni se realizó una evaluación específica de la fuga del fármaco hacia la fase acuosa durante el almacenamiento; dada la alta solubilidad acuosa de la HU, dicha fuga es posible y debe evaluarse. Por último, la formulación está destinada a administración parenteral, y las interpretaciones mecanicistas aquí presentadas deben considerarse exploratorias hasta que se realice una caracterización adicional, en línea con la literatura más amplia sobre NLC que enfatiza la necesidad de una validación fisicoquímica rigurosa32.

Enfoques alternativos

Varias estrategias alternativas de caracterización y validación podrían fortalecer trabajos futuros en esta área. Las técnicas en estado sólido (por ejemplo, DSC, XRD) y la microscopía electrónica criogénica (cryo-TEM) ayudarían a aclarar el estado físico de HU dentro de la matriz lipídica y permitirían probar directamente los mecanismos propuestos de desorción del tensioactivo y recristalización lipídica que explican las tendencias de estabilidad observadas36,60,61. Las pruebas de liberación en tampón fisiológico o en fluidos biológicos simulados, en lugar de solo agua, predecirían mejor el comportamiento de liberación in vivo, y la cuantificación directa de la absorción celular (por ejemplo, mediante marcado fluorescente y citometría de flujo) permitiría comprobar la explicación basada en la absorción propuesta para la citotoxicidad mejorada de NX-ST, en lugar de inferirla únicamente a partir del potencial zeta62,63,64. La realización de pruebas de confirmación en una segunda línea celular clínicamente relevante (por ejemplo, K562 para la leucemia mieloide crónica) y la evaluación bajo condiciones formales de estabilidad acelerada contribuirían aún más a trasladar los hallazgos in vitro actuales hacia una formulación aplicable clínicamente.

Importancia y aplicaciones potenciales

Estos hallazgos son relevantes para el esfuerzo más amplio destinado a mejorar la administración de hidroxiurea, cuyo uso clínico actualmente se ve limitado por una eliminación rápida, biodisponibilidad variable y toxicidad relacionada con la dosis. Al demostrar que la composición del surfactante puede ajustarse para favorecer partículas más pequeñas y estables con mayor eficiencia de encapsulación (NX-CS, NX-CT) o una mayor potencia citotóxica in vitro (NX-ST)41,65, este trabajo proporciona una base práctica para seleccionar u optimizar aún más la composición de las NLC según el atributo de administración que se priorice para una aplicación determinada, sin modificar la propia molécula de HU. Plataformas de nanocarriers ajustables de este tipo también podrían aplicarse a otros fármacos pequeños e hidrofílicos que enfrentan limitaciones similares de administración.

Futuras direcciones

Los trabajos futuros deben priorizar la validación cuantitativa de los mecanismos fisicoquímicos propuestos aquí mediante técnicas de estado sólido y de imagen; pruebas de liberación de fármacos en condiciones fisiológicamente relevantes; medición directa de la absorción celular y su relación con la citotoxicidad; pruebas en líneas celulares adicionales y clínicamente relevantes y, eventualmente, en modelos in vivo; estudios formales de estabilidad acelerada y a largo plazo para respaldar la determinación de la vida útil; y la cuantificación de la estabilidad química de HU y la fuga relacionada con el almacenamiento. Abordar estos puntos ayudaría a establecer si las ventajas fisicoquímicas identificadas aquí se traducen en un beneficio terapéutico significativo.

Conclusiones

Este estudio aborda limitaciones clave de la terapia con HU, incluyendo baja eficiencia de administración debido a la rápida eliminación, biodisponibilidad variable y toxicidad relacionada con la dosis, mediante el desarrollo de portadores lipídicos nanoestructurados (NANOXURIA). Los resultados demuestran que la composición del surfactante y las condiciones de almacenamiento influyen críticamente en la estabilidad fisicoquímica, el desempeño citotóxico y la eficiencia general de administración. Entre las formulaciones, NX-ST mostró un desempeño superior, con una actividad citotóxica 3,2 veces mayor que la de la HU libre, lo que indica una mayor absorción celular y entrega del fármaco. Esta mayor eficacia se atribuye a sus características equilibradas de partícula, liberación controlada y estabilización electrostática eficaz.

En contraste, las formulaciones basadas principalmente en tensioactivos no iónicos mostraron una estabilidad y un rendimiento comparativamente más bajos, lo que resalta la importancia de los mecanismos combinados de estabilización. Las condiciones de almacenamiento afectaron significativamente el comportamiento de la formulación: 25 °C promovió el crecimiento de partículas y la heterogeneidad, mientras que 4 °C preservó mejor la estabilidad, la uniformidad y la carga superficial.

En general, este estudio aborda la brecha de investigación identificada al demostrar que los sistemas de NLC diseñados racionalmente pueden mejorar la administración de HU sin alterar la droga misma. Los resultados enfatizan que combinaciones óptimas de lípidos y tensioactivos, así como condiciones adecuadas de almacenamiento, son esenciales para lograr sistemas de administración de fármacos estables, eficientes y relevantes clínicamente.

Divulgaciones

Todos los autores declaran que no tienen conflictos de interés.

Agradecimientos

Los autores agradecen al Decanato de Estudios de Posgrado e Investigación Científica de la Universidad de Jazán por financiar este trabajo de investigación a través del proyecto número: JU-RSP2026. Los autores también expresan su sincero agradecimiento a la Facultad de Farmacia de la Universidad de Jazán, Jazán, Arabia Saudita, por proporcionar los recursos esenciales que facilitaron la conclusión exitosa de este proyecto.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Filtro centrífugo Amicon Ultra-2 mL (PMCO de 3 kDa)Millipore, IrlandaUFC200324
Parrilla de cobre recubierta de carbono (soporte de muestra para MET)N/A
Cremofor EL (tensioactivo no iónico, derivado del aceite de ricino, pureza ≥98%)MedChemExpress, NJ, EE. UU.HY-Y1890
Bolsas de diálisis (PMCO de 12-14 kDa)Spectrum Laboratories, CA, EE. UU.08-670-3BB
Dimetilsulfóxido (DMSO)Fisher Chemicals, Reino Unido10162090
Suero bovino fetal (FBS)Gibco, Paisley, Reino Unido10270-106
Microscopio electrónico de barrido de emisión de campo (MEB-FE), Apreo 2Thermo Fisher-FEI, EE. UU.1229000
Homogeneizador, HG 15DWiseTis, AlemaniaDH.WHG02020
Hidroxiurea (HU) (pureza ≥99%)Sudair Pharma, Riad, Arabia Saudita21L001
Línea celular de cáncer de mama humano MCF-7Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), EE. UU.HTB-22
Lector de microplacas, SpectroStar NanoBMG LABTECH, Ortenberg, Alemania601-101
Reactivo MTT (5 mg/mL)Invitrogen Corporation, San Diego, CA, EE. UU.M6494
Solución de penicilina-estreptomicinaSigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.P4333
Medio RPMI 1640Gibco, Grand Island, NY, EE. UU.11875093
Aceite de sésamoComerciante local, Jazán, Arabia SauditaN/A
Dodecilsulfato de sodio (SDS) (tensioactivo aniónico, pureza 90%)PanReac AppliChem, Darmstadt, Alemania28312
Ácido esteárico (pureza 95-106%)Himedia, Mumbai, IndiaGRM1425
Filtro de jeringa (0,45 µm)Merck, SASLHV033RS
Microscopio electrónico de transmisión (MET), TalosThermo Fisher, EE. UU.N/A
Tween-80 (T80) (tensioactivo no iónico, ácido oleico ≥58%)Loba Chemie, Mumbai, IndiaArt. No. 06420
Espectrofotómetro UV-visibleShimadzu, Kioto, Japón220-92961-01
Zetasizer Nano ZS90Malvern Panalytical, Malvern, Reino UnidoZEN3690

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