Efectos nefroprotectores del etanol y el fomepizol en un modelo de rata de intoxicación por metanol pretratada con metotrexato

Resumen

Este estudio compara los efectos nefroprotectores del etanol y la fomepizol en un modelo de rata pretratada con metotrexato de intoxicación por metanol diseñado para reducir la eliminación de formiato dependiente de folato. Los resultados renales se evaluaron mediante mediciones de la función renal, biomarcadores de lesión renal, marcadores inflamatorios, biomarcadores relacionados con el estado redox y hallazgos histopatológicos.

Resumen

La intoxicación por metanol provoca acidosis metabólica, lesión orgánica y muerte; la lesión renal predice resultados adversos. Se compararon el etanol y la fomepizol en un modelo de ratas tratadas previamente con metotrexato para intoxicación por metanol. Treinta ratas Wistar macho se distribuyeron en cinco grupos: Control, metotrexato (MTX), MTX + metanol, MTX + metanol + fomepizol y MTX + metanol + etanol (n = 6 por grupo). Se administró MTX por sonda orogástrica a una dosis de 0,3 mg/kg/día durante los días 1 a 7. Los tres grupos expuestos al metanol recibieron 3 g/kg de metanol por sonda orogástrica el día 8. La fomepizol se administró por vía intraperitoneal a una dosis de 15 mg/kg, 4 h después de la administración de metanol, seguida de 10 mg/kg a las 12, 24 y 36 h. El etanol se administró una sola vez por sonda orogástrica a una dosis de 0,5 g/kg, 4 h después de la administración de metanol. Las muestras se recogieron el día 10. No se designó prospectivamente ningún resultado principal. Se evaluaron la función renal, la lesión en homogeneizado de riñón, biomarcadores inflamatorios, biomarcadores relacionados con el estado redox derivados de sangre y hallazgos histopatológicos. El análisis de varianza (ANOVA) reveló diferencias significativas entre los grupos en la cistatina C en homogeneizado de riñón (p = 0,003), interleucina-6 (IL-6; p = 0,013), molécula-1 de lesión renal (KIM-1; p = 0,017), urea sérica (p = 0,017) y creatinina sérica (p < 0,001). Las pruebas post hoc de Duncan mostraron valores más bajos de estos parámetros en ambos grupos con antídotos en comparación con el grupo MTX + metanol. No se identificaron diferencias bioquímicas significativas entre los dos grupos con antídotos. Las puntuaciones histopatológicas fueron menores en los grupos con antídotos. Aunque la fomepizol mostró un patrón descriptivo más favorable, los hallazgos no establecen su superioridad frente al etanol. La heterogeneidad de varianzas, las pruebas múltiples, los regímenes de antídotos desiguales, la ausencia de mediciones toxicocinéticas y del equilibrio ácido-base, y el breve periodo de seguimiento limitan la interpretación. Estudios futuros deberían incluir mediciones directas de metanol y formiato, actividad de la alcohol deshidrogenasa citosólica renal, correlaciones con resultados bioquímicos renales, periodos de seguimiento más largos y regímenes de antídotos comparables.

Introducción

La intoxicación por alcohol metílico (metanol) es una emergencia toxicológica importante asociada con una morbilidad y mortalidad significativas a nivel mundial, particularmente tras el consumo de bebidas alcohólicas ilegales o producidas ilegalmente. Aunque el metanol en sí tiene una toxicidad relativamente baja, se metaboliza principalmente en el hígado mediante la alcohol deshidrogenasa (ADH) en formaldehído y posteriormente en ácido fórmico; la acumulación resultante de formiato puede provocar una acidosis metabólica con brecha aniónica elevada, neuropatía óptica y lesión multiorgánica.^1,2El formaldehído es un intermediario de vida corta, mientras que la acumulación de formiato se considera el principal factor responsable de la toxicidad mediante la inhibición de la citocromo oxidasa mitocondrial, la hipoxia celular y el estrés oxidativo³. El diagnóstico precoz, la corrección de la acidosis metabólica, el tratamiento con antídotos y la hemodiálisis son los principales enfoques terapéuticos para reducir la mortalidad.².

En la intoxicación por metanol, las manifestaciones clínicas suelen hacerse evidentes tras un período latente. Pueden presentarse náuseas, vómitos, dolor abdominal y una leve depresión del sistema nervioso central, seguidos posteriormente por acidosis metabólica con brecha aniónica elevada, disnea, alteración del estado mental y síntomas visuales^1,2. La visión borrosa, fotofobia, midriasis, edema del disco óptico y, en casos graves, ceguera permanente son algunos de los efectos tóxicos más característicos asociados con la inhibición mediada por ácido fórmico de la citocromo oxidasa mitocondrial^1,2. Las estrategias terapéuticas actuales incluyen medidas de soporte; corrección de la acidosis metabólica con bicarbonato de sodio; suplementación con ácido folínico o ácido fólico; inhibición de la alcohol deshidrogenasa con etanol o fomepizol; y, en casos graves seleccionados, hemodiálisis para acelerar la eliminación de metanol y formiato^3,4. El fomepizol es cada vez más considerado como antídoto de primera línea debido a su farmacocinética más predecible, dosificación más sencilla y menor riesgo de efectos adversos; sin embargo, el etanol sigue siendo una alternativa importante por su disponibilidad y menor costo^4,5,6,7.

Aunque tradicionalmente se ha considerado que las lesiones del nervio óptico y del sistema nervioso central son las manifestaciones predominantes de la toxicidad del metanol, el riñón ha sido reconocido cada vez más como un órgano diana clínicamente relevante^8,9,10. En cohortes específicas de metanol, la lesión renal aguda (LRA) se ha asociado con acidosis metabólica más grave, insuficiencia respiratoria, fallo multiorgánico, ventilación mecánica, tratamiento extracorpóreo, hospitalización prolongada y mayor mortalidad intrahospitalaria; también se han identificado como factores asociados al desarrollo de LRA la depleción de volumen, la sepsis, la rabdomiólisis y la pancreatitis aguda^8,10. En la cohorte informada por Chang et al., la LRA permaneció independientemente asociada con mortalidad intrahospitalaria en un análisis multivariable; sin embargo, el diseño observacional retrospectivo no establece que la LRA en sí misma haya causado la mortalidad⁸. Por consiguiente, la LRA debe interpretarse como un marcador de mayor gravedad de la enfermedad y de un peor pronóstico en la intoxicación por metanol. Por el contrario, la revisión sistemática de Wang et al. evaluó los resultados renales tras envenenamiento por alcoholes tóxicos de forma más amplia, principalmente metanol y etilenglicol; por lo tanto, sus conclusiones no son exclusivas del metanol⁹. Dicha revisión identificó una mortalidad a corto plazo considerable y importantes lagunas de evidencia respecto a la recuperación renal a largo plazo, la diálisis continua y la notificación estandarizada de resultados renales⁹.

La relación entre la toxicidad del metanol y la IRA probablemente sea multifactorial. La acumulación de metabolitos tóxicos puede contribuir mediante la inhibición mitocondrial, la hipoxia celular, la acidosis metabólica grave y el desequilibrio redox, mientras que factores sistémicos documentados en cohortes clínicas—como la depleción de volumen, el compromiso hemodinámico, la rabdomiólisis, la sepsis, la insuficiencia respiratoria y la disfunción de múltiples órganos—pueden provocar lesiones renales adicionales^1,2,3,8,10. Estas vías proporcionan vínculos biológica y clínicamente plausibles entre la intoxicación por metanol y el daño renal. Las alteraciones metabólicas renales pueden resultar de la exposición al formiato circulante, la inhibición mitocondrial, la acidosis metabólica y el estrés hemodinámico sistémico. Sin embargo, la contribución específica del metabolismo del alcohol y del aldehído en el tejido renal sigue siendo incierta, ya que en el presente estudio no se evaluaron directamente las concentraciones de metanol, formaldehído y formiato, la actividad renal de la ADH ni la función mitocondrial.

Un desafío metodológico importante en los estudios experimentales de la toxicidad del metanol es que las ratas metabolizan el ácido fórmico más rápidamente que los humanos. Aunque la acumulación de ácido fórmico es un determinante principal de la toxicidad del metanol en humanos, lograr una acumulación comparable y la consiguiente lesión orgánica en ratas es más difícil debido a su metabolismo del formato altamente eficiente y dependiente del folato. Por lo tanto, los agentes que suprimen el metabolismo del folato se utilizan frecuentemente en modelos experimentales de toxicidad por metanol^11,12. Se empleó un tratamiento previo con metotrexato (MTX) para reducir la eliminación del formato dependiente del folato en ratas, aumentando así la susceptibilidad a la toxicidad del metanol^11,12. El metotrexato no induce por sí mismo la toxicidad del metanol, y el modelo resultante no reproduce todos los aspectos del envenenamiento humano por metanol. Dado que el metotrexato puede influir independientemente en los resultados renales, oxidativos e inflamatorios, se incluyó un grupo con solo MTX para caracterizar los cambios asociados con el tratamiento previo. Dentro de estas limitaciones, el modelo proporciona una plataforma preclínica controlada para comparar los patrones de resultados renales entre grupos experimentales que reciben el mismo protocolo de tratamiento previo con metotrexato y exposición al metanol, y para evaluar estos resultados a niveles bioquímicos, inflamatorios, oxidativos e histopatológicos.

La inhibición de la alcohol deshidrogenasa constituye la piedra angular del tratamiento antidótico para la intoxicación por metanol. Los dos agentes más comúnmente utilizados con este fin en la práctica clínica son el etanol y la fomepizol (4-metilpirazol). El etanol suprime competitivamente la formación de metabolitos tóxicos debido a su mayor afinidad por la ADH que el metanol, mientras que el fomepizol, un inhibidor potente y selectivo de la ADH, impide directamente la conversión del metanol en formaldehído y ácido fórmico^5,6. Sin embargo, no existe un consenso completo respecto a la eficacia clínica comparativa, la seguridad, la facilidad de administración y los efectos protectorios sobre órganos de estos dos antídotos. El fomepizol se considera ventajoso en muchos centros debido a su régimen de dosificación estandarizado, la ausencia de necesidad de monitoreo de niveles séricos, la falta de depresión del sistema nervioso central y sus propiedades farmacocinéticas más predecibles, mientras que la terapia con etanol se asocia con posibles desventajas, como hipoglucemia, hepatotoxicidad, alteración del estado mental y la necesidad de monitoreo intensivo^6,7. Por el contrario, comparaciones clínicas a gran escala han sugerido que los efectos de los dos antídotos sobre la mortalidad y los resultados clínicos podrían ser similares. En el estudio de Zakharov et al., que evaluó casos de intoxicación masiva, no se observó diferencia significativa en la supervivencia entre el fomepizol y el etanol⁵.

A pesar de la importancia pronóstica de la IRA en la intoxicación por metanol^8,9,10, la lesión renal ha recibido considerablemente menos atención que la toxicidad ocular y neurológica, y los efectos renales comparativos del etanol y la fomepizol siguen estando insuficientemente caracterizados. Por lo tanto, se justifica una evaluación centrada en el riñón que incluya pruebas convencionales de función renal, biomarcadores tempranos de lesión tubular, citocinas inflamatorias, parámetros relacionados con el estado redox y estudios histopatológicos, con el fin de determinar si las dos estrategias antidóticas se asocian con patrones diferentes de resultados renales. Además, este modelo controlado de ratas pretatadas con metotrexato podría facilitar la evaluación preclínica de intervenciones antidóticas candidatas, dirigidas al riñón y de apoyo, bajo condiciones experimentales definidas. El valor investigativo de este modelo radica en la evaluación comparativa dentro de un entorno experimental agudo, más que en la réplica directa de la complejidad clínica y metabólica de la intoxicación humana por metanol.

Las diferencias en el metabolismo del metanol entre roedores y humanos, junto con el uso de un tratamiento farmacológico previo para reducir la eliminación del formiato dependiente del folato, siguen siendo limitaciones metodológicas importantes. Además, la toxicidad aguda inducida en condiciones experimentales puede no reflejar completamente las distintas duraciones de exposición y las condiciones comórbidas que se presentan en la práctica clínica. Por consiguiente, los hallazgos obtenidos en este modelo animal deben considerarse como evidencia preclínica preliminar y no deben utilizarse directamente para respaldar decisiones terapéuticas en humanos. Se requiere confirmación en estudios clínicos adecuadamente diseñados antes de poder extraer conclusiones clínicas. En este contexto, la principal brecha de conocimiento es si el etanol y la fomepizol se asocian con diferentes patrones de resultados renales en medidas convencionales de función renal, biomarcadores de lesión tubular, citocinas inflamatorias, parámetros relacionados con el estado redox y hallazgos histopatológicos en un modelo de rata tratada previamente con metotrexato. La hipótesis del estudio fue que la inhibición de la alcohol deshidrogenasa mediante etanol o fomepizol se asociaría con una atenuación de la lesión renal, con posibles diferencias entre los tratamientos en los dominios evaluados. La nefroprotección se definió operativamente como un patrón más favorable de resultados renales en comparación con el grupo MTX + Metanol. Este patrón incluyó concentraciones más bajas de urea y creatinina en suero; niveles renales más bajos de la molécula de lesión renal-1 (KIM-1), cistatina C, factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-α), interleucina-6 (IL-6) e interleucina-1 beta (IL-1β); concentraciones séricas más bajas de malondialdehído (MDA); mayor actividad sérica de la enzima superóxido dismutasa (SOD), niveles sanguíneos más altos de glutatión reducido (GSH) y mayor actividad sanguínea de la catalasa (CAT); y puntuaciones histopatológicas más bajas para degeneración tubular, necrosis tubular, lesión glomerular, congestión vascular, inflamación intersticial y fibrosis. La nefroprotección no se calculó como una puntuación compuesta única; en cambio, los resultados individuales se evaluaron colectivamente a través de estos dominios complementarios. Por lo tanto, el estudio tuvo como objetivo comparar los efectos del etanol y la fomepizol sobre la función renal, la lesión tubular, la inflamación, el estado redox y la histopatología renal en este modelo.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Local de Ética en Experimentación Animal de la Universidad Kırşehir Ahi Evran (número de decisión de aprobación: 1, número de reunión: 12, fecha de aprobación: 12 de junio de 2025) y se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices nacionales e internacionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Durante todo el estudio se tomaron medidas para minimizar el dolor y el malestar, así como para utilizar el menor número posible de animales.

Preparación de productos químicos
Se utilizó metotrexato como agente de pretratamiento para facilitar el establecimiento del modelo experimental de toxicidad por metanol. Dado que la oxidación de formiato dependiente del folato es más eficiente en ratas que en humanos, se empleó el pretratamiento con metotrexato para reducir la eliminación del formiato y aumentar la susceptibilidad a la toxicidad por metanol; se usó como una intervención para sensibilizar el modelo, y no como sustituto de la exposición al metanol^11,12. El metotrexato se suministró en una formulación de 500 mg/5 mL, lo que corresponde a una concentración stock de 100 mg/mL. La formulación se diluyó con solución estéril de cloruro de sodio al 0,9 % para obtener una concentración de trabajo final de 0,06 mg/mL. La solución de trabajo se administró por gavaje oral a una dosis de 5 mL/kg, lo que corresponde a una dosis de MTX de 0,3 mg/kg. Para ratas con un peso corporal de 200–220 g al inicio del estudio, el volumen diario administrado osciló entre 1,00 y 1,10 mL por animal y se calculó individualmente utilizando el peso corporal registrado al inicio del estudio. El peso corporal no se volvió a medir durante el período de pretratamiento con MTX de 7 días. El metotrexato se administró una vez al día durante 7 días consecutivos (días del estudio 1–7), y el metanol se administró el día 8 del estudio, tras completar el protocolo de pretratamiento con MTX. Este régimen fue consistente con modelos publicados previamente de pretratamiento oral por gavaje con MTX¹³.

El metanol (pureza ≥99,8 %) se preparó recién el día de la administración como una solución de trabajo acuosa al 20 % (v/v) mediante dilución con agua destilada estéril. La solución de trabajo se preparó mezclando 1 volumen de metanol con 4 volúmenes de agua destilada estéril. De acuerdo con modelos previamente descritos de ratas tratadas con metotrexato para intoxicación por metanol, se administró una dosis única de metanol a los grupos 3–5 el día 8 del estudio a 3 g/kg mediante sonda oral. No se impusieron restricciones de alimento ni de agua antes de la administración del metanol. El volumen requerido para la administración se calculó individualmente según el peso corporal de cada animal y fue aproximadamente de 18,9 mL/kg para la solución de metanol al 20 %. Para una rata que pesa aproximadamente 220 g, esta dosis correspondió a 0,66 g de metanol y un volumen final de sonda oral de aproximadamente 4,2 mL. Este régimen de exposición al metanol se seleccionó para mantener la comparabilidad con modelos previamente publicados de ratas tratadas con metotrexato para toxicidad aguda por metanol^13,14,15.

La solución de trabajo de fomepizol se preparó en solución estéril de cloruro de sodio al 0,9 % con una concentración final de 10 mg/mL. Se administró una dosis de carga intraperitoneal de 15 mg/kg 4 h después de la administración de metanol, seguida de dosis de mantenimiento intraperitoneales de 10 mg/kg a las 12, 24 y 36 h. A la concentración de trabajo de 10 mg/mL, los volúmenes de administración fueron de 1,5 mL/kg para la dosis de carga y de 1,0 mL/kg para cada dosis de mantenimiento. Para una rata con un peso corporal al inicio del estudio de aproximadamente 220 g, estas dosis correspondieron aproximadamente a 0,33 mL para la dosis de carga y a 0,22 mL para cada dosis de mantenimiento. Todos los volúmenes de administración se calcularon utilizando el peso corporal registrado al inicio del estudio. Las dosis de carga y de mantenimiento de fomepizol se seleccionaron en referencia a recomendaciones establecidas para el tratamiento del envenenamiento por metanol^1,6.

Se utilizó etanol como tratamiento comparador antidótico. El etanol absoluto (pureza ≥99,8 %) se diluyó con agua destilada estéril mezclando 1 volumen de etanol absoluto con 4 volúmenes de agua destilada estéril para obtener una solución acuosa de trabajo final al 20 % (v/v). Se administró una dosis única de etanol por gavaje oral a 0,5 g/kg, 4 h después de la administración de metanol; no se administraron dosis de mantenimiento de etanol. El volumen de administración fue aproximadamente 3,2 mL/kg. Para una rata con un peso corporal al inicio del estudio de aproximadamente 220 g, esto correspondió a un volumen final de gavaje de aproximadamente 0,70 mL. El volumen de administración se calculó utilizando el peso corporal registrado al inicio del estudio. La concentración de etanol, la dosis, la vía y el momento de la administración se seleccionaron en base a modelos previamente publicados de ratas pretratadas con metotrexato que utilizaron etanol como comparador antidótico^13,14.

Todas las soluciones se prepararon recién el día de la administración y se inspeccionaron para verificar su apariencia homogénea y la ausencia de materia particulada visible. Las administraciones orales se realizaron utilizando una cánula de gavaje de acero inoxidable. Durante el gavaje, la cánula se avanzó cuidadosamente desde la cavidad oral hacia el esófago, evitándose la regurgitación, la fuga oral, la aspiración y la dificultad respiratoria. Las inyecciones intraperitoneales se realizaron en condiciones asépticas utilizando jeringas y agujas desechables estériles. Todos los procedimientos relacionados con la preparación y administración de productos químicos se llevaron a cabo de acuerdo con las regulaciones institucionales de seguridad en el laboratorio.

Animales experimentales, condiciones de alojamiento y aleatorización
Un total de 30 ratas albinas macho de la cepa Wistar, con una edad de 8 a 12 semanas y un peso de 220 ± 20 g, se obtuvieron del Laboratorio de Investigación con Animales Experimentales de la Universidad Ahi Evran, Kırşehir, Türkiye. Se seleccionaron ratas Wistar porque se han utilizado ampliamente en estudios experimentales de toxicidad y nefroprotección, lo que permite comparar los resultados con estudios previamente publicados. Los animales se mantuvieron a 24 ± 2 °C bajo un ciclo de 12 h de luz y 12 h de oscuridad. Se proporcionó alimento estándar en raciones y agua del grifo ad libitum durante todo el período experimental de 10 días. Antes de los procedimientos experimentales, todos los animales pasaron por un período de aclimatación de 7 días.

Treinta ratas se asignaron a cinco grupos experimentales mediante un procedimiento de asignación aleatoria asistido por computadora, con un objetivo de seis animales por grupo. Para cada rata, se generó un número entero aleatorio entre 1 y 5, y el animal se asignó al grupo experimental correspondiente. Una vez que un grupo contenía seis animales, cualquier selección posterior que identificara ese grupo se descartaba, y se generaba un nuevo número aleatorio hasta que se seleccionaba un grupo con una posición disponible. Este procedimiento continuó hasta que se hubieran asignado las 30 ratas, resultando en 6 animales por grupo. El mismo investigador generó las asignaciones aleatorias y realizó la asignación; no se utilizó un operador de asignación independiente. Al grupo 1 (Control) no se le administró tratamiento experimental con fármacos, y los animales se sometieron al mismo muestreo programado en el punto final que los otros grupos. Al grupo 2 (MTX) se le administró metotrexato por gavaje oral a 0,3 mg/kg durante 7 días. Al grupo 3 (MTX + Metanol) se le administró metotrexato durante 7 días, seguido de metanol a 3 g/kg en el día 8 del estudio. Al grupo 4 (MTX + Metanol + Fomepizol) se le administró un tratamiento previo con metotrexato seguido de metanol, iniciándose el tratamiento con 4-metilpirazol 4 h después. Al grupo 5 (MTX + Metanol + Etanol) se le administró un tratamiento previo con metotrexato seguido de metanol, administrándose etanol 4 h después.

Los tres grupos expuestos al metanol recibieron el mismo pretratamiento con MTX y el mismo protocolo de administración de metanol, y solo difirieron respecto al tratamiento antidótico posterior a la exposición. La asignación experimental de los grupos, el protocolo de administración, el momento del tratamiento antidótico y el proceso de recogida de muestras se resumieron en la Figura 1. Se realizó un análisis de potencia a priori para un ANOVA unifactorial de efectos fijos con cinco grupos independientes. Suponiendo un tamaño del efecto estandarizado grande (f de Cohen = 0,70), un nivel de significación de 0,05 y una potencia estadística del 80 %, el tamaño mínimo total de la muestra requerido se calculó en 30 animales, lo que corresponde a seis animales por grupo. La potencia calculada para un tamaño total de muestra de 30 fue aproximadamente del 80,9 %. El tamaño del efecto supuesto (f de Cohen = 0,70) se especificó antes del experimento, basándose en la expectativa de los investigadores de un efecto general grande entre grupos en este modelo de toxicidad aguda. Esta suposición se basó en el criterio de los investigadores, y no en una estimación derivada de datos piloto o de un estudio previo específico. No se designó prospectivamente un único resultado primario para este estudio; el cálculo del tamaño de la muestra se basó en un efecto general grande supuesto en una comparación global entre los cinco grupos experimentales. Un resultado primario no puede designarse retrospectivamente como un punto final especificado prospectivamente. Por consiguiente, el cálculo del tamaño de la muestra no proporciona una potencia adecuada para cada resultado individual ni para comparaciones por pares.

Protocolo de intoxicación por metanol y tratamiento antidótico
Después del período de aclimatación, los animales de los grupos 2 a 5 recibieron metotrexato una vez al día durante 7 días consecutivos (días del estudio 1 al 7). En el día 8 del estudio, los animales de los grupos 3 a 5 recibieron una dosis única de solución de metanol al 20 % a 3 g/kg por sonda oral. No se impuso ayuno ni otras restricciones de alimento o agua antes de la administración de metanol.

En el grupo MTX + Metanol + Fomepizol, se administró una dosis de carga intraperitoneal de 15 mg/kg 4 h después de la administración de metanol, seguida de dosis de mantenimiento intraperitoneales de 10 mg/kg a las 12, 24 y 36 h tras la administración de metanol. En el grupo MTX + Metanol + Etanol, se administró una dosis única de etanol mediante sonda orogástrica a 0,5 g/kg 4 h después de la administración de metanol; no se administraron dosis de mantenimiento de etanol. Los dos regímenes antidóticos se seleccionaron para reflejar las recomendaciones establecidas de dosificación de fomepizol y protocolos comparadores de etanol publicados previamente^1,6,13,14. Los regímenes no fueron diseñados para proporcionar un tratamiento equiparado en dosis, vía o exposición. Por lo tanto, el régimen repetido de fomepizol intraperitoneal y la dosis única oral de etanol constituyeron una comparación farmacológica desigual. Se confirmó una administración exitosa por sonda mediante la ausencia de regurgitación, fugas orales o dificultad respiratoria durante el procedimiento. Se confirmó una administración intraperitoneal exitosa mediante la ausencia de fugas, sangrado o hinchazón marcada en el sitio de inyección.

Después de la administración, los animales fueron monitoreados regularmente en cuanto a su estado de salud general, movilidad, ingesta de alimento, postura, apariencia del pelaje y signos de toxicidad. El esquema de tratamiento fue diseñado para permitir el inicio de la formación de metabolitos tóxicos a partir del metanol, a la vez que posibilitaba la evaluación de los efectos protectores y terapéuticos de los agentes antidóticos.

Eutanasia, puntos finales humanos y recogida de muestras
Durante todo el experimento, todos los animales fueron evaluados diariamente en cuanto a su estado general de salud, ingesta de alimento y agua, movilidad y cambios en el comportamiento. Los criterios para los puntos finales humanos se definieron previamente como letargo marcado, incapacidad para ingerir alimento o agua, pérdida severa de peso, movilidad restringida, postura anormal, erización persistente del pelo o signos evidentes de angustia. Se planeó que los animales que cumplieran cualquiera de estos criterios fueran sometidos a eutanasia humanitaria. Sin embargo, ningún animal alcanzó los criterios predefinidos de punto final humano durante el estudio.

Todos los animales en los cinco grupos experimentales fueron sacrificados el día 10 del estudio. Para los grupos MTX + Metanol, MTX + Metanol + Fomepizol y MTX + Metanol + Etanol, este punto final correspondió a 48 h después de la administración única de metanol el día 8 del estudio. El grupo Control permaneció sin tratamiento hasta el día 10 del estudio, mientras que el grupo solo con MTX fue monitoreado hasta el día 10 tras completar el protocolo de administración de MTX de 7 días. Por lo tanto, los cinco grupos tuvieron la misma duración total del estudio y se sometieron a eutanasia y recolección de muestras en el mismo día del estudio.

Se utilizaron ketamina y xilacina para inducir anestesia profunda. La profundidad de la anestesia se confirmó por la pérdida del reflejo de retirada plantar. Una vez alcanzada la anestesia profunda, se recolectaron muestras de sangre mediante punción intracardiaca. Se obtuvieron aproximadamente 3–5 mL de sangre utilizando una jeringa y aguja adecuadas. La sangre recolectada para la medición de las concentraciones séricas de urea y creatinina, la actividad sérica de SOD y la concentración sérica de MDA se transfirió a tubos sin anticoagulante y se dejó coagular completamente. La sangre destinada a la medición del nivel de GSH y la actividad de CAT se recolectó por separado en tubos que contenían ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y se procesó sin paso de coagulación. Tras la formación completa del coágulo, las muestras séricas se centrifugaron a 3.000 × g durante 10–15 min a 4 °C. El suero separado se almacenó a −80 °C hasta su análisis. La correcta separación del suero se confirmó por una apariencia clara y no hemolizada. Tras la recolección de sangre, la eutanasia se completó mediante exsanguinación bajo anestesia profunda. A continuación, se realizó una laparotomía mediana y ambos riñones se extrajeron cuidadosamente. Después de eliminar la grasa y los tejidos conectivos circundantes, los riñones se enjuagaron con solución salina fisiológica fría. Las muestras de tejido se dividieron para análisis histopatológicos y bioquímicos. Las muestras destinadas al examen histopatológico se colocaron en formaldehído al 10 % tamponado y neutro. Las muestras destinadas a los análisis bioquímicos se etiquetaron adecuadamente y se almacenaron a −80 °C.

La recolección de muestras, los análisis bioquímicos y las evaluaciones de los resultados fueron realizados por investigadores ciegos respecto a los grupos experimentales. No se excluyó ningún animal de los análisis.

Análisis bioquímicos
La concentración sérica de urea se midió mediante un ensayo cinético enzimático de ureasa–glutamato deshidrogenasa en un analizador bioquímico automatizado. La urea fue hidrolizada por la ureasa para producir amoníaco, que posteriormente reaccionó con el 2-oxoglutarato y el dinucleótido de nicotinamida adenina reducido (NADH) en presencia de glutamato deshidrogenasa. La disminución de la absorbancia resultante del consumo de NADH se midió de forma cinética. La concentración sérica de creatinina se determinó colorimétricamente utilizando el mismo analizador bioquímico automatizado.

La actividad de la superóxido dismutasa (SOD) en suero se determinó mediante un ensayo colorimétrico basado en la generación de radicales superóxido por el sistema xantina–xantina oxidasa y su reacción con cloruro de 2-(4-yodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-feniltetrazolio para formar un producto coloreado de formazán. La absorbancia final se midió a 505 nm. La concentración de malondialdehído (MDA) en suero se determinó mediante la reacción con ácido tiobarbitúrico. Las muestras de suero se mezclaron con ácido tricloroacético frío para precipitar las proteínas y se centrifugaron a 7.500 × g durante 5 min a 4 °C. El sobrenadante resultante se mezcló con un volumen igual de ácido tiobarbitúrico y se incubó a 90 °C durante 60 min. Los tubos de reacción luego se enfriaron en un baño de agua fría durante 10 min, y se midió la absorbancia a 532 nm. Las concentraciones de MDA se calcularon a partir de la curva de calibración correspondiente. Se midió el glutatión reducido (GSH) en sangre anticoagulada con EDTA mediante un método modificado de Ellman. Tras la precipitación proteica con ácido tricloroacético, las muestras desproteinizadas se hicieron reaccionar con ácido 5,5′-ditiobis(2-nitrobenzoico) en tampón Tris 500 mM a pH 8,2, y se midió la absorbancia a 412 nm. La actividad de la catalasa (CAT) se midió en sangre anticoagulada con EDTA mediante un ensayo colorimétrico de dos pasos. Las muestras se incubaron con una cantidad conocida de peróxido de hidrógeno, y tras finalizar la reacción enzimática, se midió el peróxido de hidrógeno residual utilizando un reactivo cromogénico a 405 nm.

Dado que la actividad de SOD y la concentración de MDA se midieron en suero, y el nivel de GSH y la actividad de CAT se midieron en sangre anticoagulada con EDTA en lugar de homogenizados de tejido renal, no fue aplicable la normalización de estos parámetros relacionados con el estado redox respecto a la concentración de proteína total del tejido. Para la interpretación del perfil de biomarcadores relacionados con el estado redox, se consideró que concentraciones más altas de MDA en suero eran consistentes con una mayor peroxidación lipídica, mientras que actividades más bajas de SOD en suero, niveles de GSH en sangre y actividad de CAT en sangre se consideraron indicativas de una capacidad antioxidante reducida; los cambios en la dirección opuesta se interpretaron como un perfil más favorable en relación con el estado redox.

Para las mediciones de ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) en tejido renal, aproximadamente 50 mg de tejido de riñón almacenado a −80 °C se homogenizaron en hielo en 500 µL de tampón de homogenización que contenía una mezcla de inhibidores de proteasas, lo que corresponde a una relación fija tejido:tampón de 1:10 (p/v). Se preparó un homogenado de tejido renal específico para cada animal. Las muestras de diferentes animales se procesaron de forma independiente y no se agruparon en ninguna etapa. Los homogenados se centrifugaron a 14.000 × g durante 10 min a 4 °C, y los sobrenadantes obtenidos de cada animal se recogieron por separado y dividieron en alícuotas para los análisis planeados del tejido renal. No se midió por separado la concentración total de proteína; por lo tanto, los resultados del ELISA en tejido no se normalizaron respecto a esta. Las concentraciones finales calculadas a partir de las curvas estándar específicas para cada ensayo se expresaron como ng/L para TNF-α e IL-6 y como ng/mL para IL-1β, KIM-1 y cistatina C.

Se evaluaron la molécula-1 de lesión renal (KIM-1) y la cistatina C como biomarcadores de lesión renal, mientras que el factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), la interleucina-6 (IL-6) y la interleucina-1β (IL-1β) se evaluaron como marcadores inflamatorios renales. Los cinco analitos se midieron en homogeneizados de tejido renal utilizando kits de ELISA específicos para rata, según los protocolos de los fabricantes. Para los respectivos ensayos, las sensibilidades analíticas y los rangos de medición fueron 2,51 ng/L y 5–1.000 ng/L para TNF-α, 0,052 ng/L y 0,1–40 ng/L para IL-6, 0,08 ng/mL y 0,2–60 ng/mL para IL-1β, 0,01 ng/mL y 0,05–10 ng/mL para KIM-1, y 0,25 ng/mL y 0,5–100 ng/mL para cistatina C, respectivamente. Antes del análisis, todos los reactivos, estándares y sobrenadantes de tejido renal se llevaron a temperatura ambiente. Se generaron curvas estándar por separado para cada corrida de ensayo según las recomendaciones del fabricante. Se agregaron estándares y sobrenadantes de tejido renal a pozos recubiertos con anticuerpos, seguidos por el anticuerpo de detección biotinilado correspondiente y el conjugado de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante. Las muestras y los reactivos de ELISA se incubaron durante 1 h a 37 °C. Después de cinco ciclos de lavado utilizando un lavador automático de microplacas, se añadieron las soluciones de sustrato A y B y se incubaron durante 10 min a 37 °C. La reacción de color se detuvo usando una solución ácida de paro, y se midió la absorbancia a 450 nm. Para cada analito, los valores de absorbancia corregidos respecto al blanco se convirtieron en concentraciones utilizando la curva estándar específica del ensayo correspondiente.

Todos los análisis bioquímicos se realizaron bajo condiciones estandarizadas, y todas las muestras se procesaron utilizando los mismos procedimientos. Las mediciones de ELISA en tejido renal se realizaron por duplicado. Para cada analito, se calculó la media de los dos pocillos con réplicas técnicas para obtener un único valor por animal. Los pocillos con réplicas técnicas y las alícuotas separadas obtenidas del mismo homogenado específico de animal no se consideraron observaciones independientes. El animal individual fue considerado la unidad experimental, y un resultado por animal para cada parámetro se incluyó en el análisis estadístico.

Procesamiento histopatológico y puntuación de lesión renal
Las muestras de tejido se procesaron para evaluación microscópica mediante procedimientos histopatológicos estándar. Los tejidos renales se fijaron en formaldehído al 10 % tamponado y neutro a temperatura ambiente durante 72 h. Después de la fijación, los tejidos se deshidrataron mediante concentraciones crecientes de etanol del 50 %, 70 %, 80 %, 96 % y 100 %, manteniendo cada concentración durante 1 h. Posteriormente, los tejidos se aclararon mediante un procedimiento en dos pasos con xileno e incluyeron en bloques de parafina. Se obtuvieron secciones de 5 µm de grosor a partir de los bloques de parafina utilizando un microtomo rotatorio.

Para la tinción con hematoxilina y eosina, los cortes se desparafinizaron y rehidrataron, se tiñeron con hematoxilina durante 5 min y se lavaron bajo agua corriente durante 5 min. La diferenciación se realizó utilizando alcohol ácido, tras lo cual los cortes se mantuvieron en agua amoniacal durante 1 min. Luego, los cortes se contratiñeron con eosina durante 2 min. Posteriormente, los cortes se deshidrataron mediante una serie ascendente de alcohol, se aclararon en xileno y se montaron con un medio de montaje adecuado.

Para la tinción tricrómica de Masson, los cortes se desparafinizaron y rehidrataron, luego se incubaron en una solución mordiente a 56 °C durante 60 min y se lavaron con agua corriente durante 10 min. A continuación, los cortes se trataron secuencialmente con hematoxilina férrica de Weigert durante 10 min, escarlata Biebrich-fucsina ácida durante 15 min, ácido fosfotúngstico durante 10 min y azul de anilina durante 10 min. Finalmente, los cortes se mantuvieron en ácido acético al 1% durante 5 min, se deshidrataron, aclararon en xileno y se montaron.

La tinción exitosa se confirmó mediante una tinción nuclear clara, contraste citoplasmático preservado, mantenimiento de la arquitectura renal y visualización nítida de las estructuras del tejido conectivo. Todas las muestras teñidas se evaluaron en condiciones estandarizadas utilizando un microscopio óptico equipado con un sistema de imagen digital.

Las evaluaciones histopatológicas fueron realizadas por un único patólogo experimentado que desconocía la asignación a los grupos experimentales. La puntuación histopatológica se realizó con un aumento de 200×. Para cada animal y cada parámetro histopatológico, se examinaron 10 campos microscópicos seleccionados al azar. El campo que mostraba la alteración más grave para el parámetro evaluado se utilizó para asignar al animal una puntuación entera única en una escala de 0 a 4. La lesión tubular se evaluó según la dilatación tubular, la acumulación de material proteínico en la luz tubular, la degeneración del epitelio tubular y la necrosis tubular. La lesión glomerular se evaluó según la degeneración o atrofia glomerular, el agrandamiento del espacio de Bowman y la congestión vascular. La lesión intersticial se evaluó en función de la inflamación y la fibrosis intersticiales. Se utilizaron secciones renales teñidas con hematoxilina y eosina y tricrómica de Masson de cinco micrómetros de grosor de cada animal para la evaluación histopatológica. Se obtuvieron fotomicrografías representativas con un aumento de 200×, con barras de escala que representan 100 µm. El número de secciones histológicas separadas examinadas por animal no pudo recuperarse de los registros del estudio y, por lo tanto, no puede informarse.

Los hallazgos de la tinción tricrómica de Masson se interpretaron histomorfológicamente, considerando la localización y el patrón morfológico del depósito de colágeno, más que la intensidad de la tinción azul por sí sola. La puntuación semicuantitativa de fibrosis intersticial se basó en esta evaluación histomorfológica, y no se cuantificó el porcentaje de área positiva para colágeno. La puntuación histopatológica se realizó de forma semicuantitativa utilizando criterios de evaluación de lesión renal descritos previamente^16,17. A cada animal se le asignó una puntuación entera para cada parámetro histopatológico en una escala de 0 a 4, donde 0 = ausente, 1 = mínima, 2 = leve, 3 = moderada y 4 = grave. Las categorías de calificación representaban la evaluación global del patólogo enmascarado sobre la severidad morfológica de cada lesión, más que una medición morfométrica continua.

Precauciones de seguridad y manejo de desechos
Se utilizó equipo de protección personal adecuado al manipular metanol, formaldehído, xileno, muestras biológicas y tejidos animales. Se usaron batas de laboratorio, guantes y protección ocular. Debido a la toxicidad sistémica y volatilidad del metanol, todos los procedimientos se realizaron con precaución. Los procedimientos que involucraban formaldehído y xileno se llevaron a cabo bajo una campana extractora de gases químicos siempre que fue posible. Los objetos punzocortantes se recogieron en contenedores adecuados para su eliminación. Los desechos químicos y materiales biológicos se eliminaron de acuerdo con los procedimientos institucionales de bioseguridad y manejo de desechos peligrosos.

Análisis estadístico
Las variables continuas de índole bioquímica, biomarcadores de lesión renal, inflamatorias, de función renal y relacionadas con el estado redox se expresaron como media ± desviación estándar (media ± DE). La normalidad de la distribución de los datos se evaluó mediante la prueba de Shapiro-Wilk, y la homogeneidad de varianzas se analizó usando la prueba de Levene. Las comparaciones entre grupos para los resultados bioquímicos se realizaron mediante un análisis de varianza unidireccional (ANOVA). Los controles de supuestos revelaron desviaciones respecto a la normalidad en un grupo para la creatinina sérica y heterogeneidad de varianzas en varios resultados bioquímicos. Se mantuvo el enfoque original de ANOVA; sin embargo, estas desviaciones podrían haber afectado la fiabilidad de los valores p obtenidos, por lo que los hallazgos se interpretaron con cautela.

Cuando se detectó una diferencia estadísticamente significativa mediante ANOVA, se realizaron comparaciones por pares entre los grupos utilizando la prueba múltiple a posteriori de Duncan. Los valores que compartían la misma letra superíndice dentro de cada fila no eran significativamente diferentes según la prueba a posteriori de Duncan. No se aplicó ningún ajuste adicional por multiplicidad en los resultados bioquímicos. El procedimiento de Duncan no proporcionó un control riguroso de la tasa de error tipo I por familia, y la evaluación de múltiples resultados aumentó aún más el riesgo de hallazgos falsos positivos. Por lo tanto, las comparaciones significativas individuales se interpretaron con cautela.

Los tamaños del efecto global para los resultados bioquímicos se estimaron utilizando eta al cuadrado (η²), calculado como (F × df_between)/(F × df_between + df_error), donde df_between = 4 y df_error = 25. Los intervalos de confianza bilaterales del 95 % se calcularon invirtiendo la distribución F no central y transformando los límites de no centralidad (λ) mediante λ/(λ + N), donde N = 30. Estos cálculos complementarios se realizaron utilizando un entorno de computación científica. Las estimaciones se derivaron de las estadísticas F redondeadas obtenidas del análisis estadístico primario y, por lo tanto, fueron aproximadas. Los intervalos de confianza dependieron de los supuestos de normalidad e igualdad de varianzas del modelo ANOVA y no se ajustaron por múltiples resultados.

Los puntajes histopatológicos eran observaciones ordinales y semicuantitativas, resumidos descriptivamente como media ± DE para mostrar la carga promedio de lesiones a nivel grupal y la variabilidad entre animales. No se realizó ninguna prueba inferencial de hipótesis ni comparaciones pareadas post hoc para los puntajes histopatológicos. Por lo tanto, el ANOVA, la prueba post hoc de Duncan y la presentación del valor p se aplicaron únicamente a los resultados bioquímicos, biomarcadores de lesión renal, inflamatorios, de función renal y relacionados con el estado redox. Un valor p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados

All 30 animals were included in the analyses, with six animals in each of the five experimental groups. All animals in the five groups were euthanized and sampled on study day 10. For the three methanol-exposed groups, this endpoint corresponded to 48 h after methanol administration. Therefore, the total study duration and sample collection time were consistent across all experimental groups. Renal injury and inflammatory biomarkers, renal function and redox-related parameters, and histopathological findings were evaluated as described below.

Biochemical findings: renal injury and inflammatory biomarkers
The findings for renal injury and inflammatory biomarkers measured in kidney tissue homogenates are presented in Table 1. One-way ANOVA indicated significant overall differences among the five groups in cystatin C [F(4,25) = 5.329, p = 0.003], IL-6 [F(4,25) = 3.907, p = 0.013], KIM-1 [F(4,25) = 3.673, p = 0.017], TNF-α [F(4,25) = 7.660, p < 0.001], and IL-1β [F(4,25) = 11.584, p < 0.001]. Post hoc group comparisons were performed using Duncan’s multiple range test, with group assignments indicated by superscript letters in Table 1. Kidney tissue homogenate levels of cystatin C, IL-6, and KIM-1 were highest in the MTX + Methanol group, whereas no significant differences were observed among the Control, MTX-only, MTX + Methanol + Fomepizole, and MTX + Methanol + Ethanol groups for these variables. Kidney tissue homogenate levels of TNF-α and IL-1β were also highest in the MTX + Methanol group. The MTX-only group showed higher levels of TNF-α and IL-1β in kidney tissue homogenates than the Control group, whereas the antidote-treated groups showed intermediate values (Table 1).

Renal function and redox-related parameters
Serum renal function indices and blood-derived redox-related parameters were presented in Table 2. One-way ANOVA indicated significant overall differences among the five groups in serum urea [F(4,25) = 3.694, p = 0.017], serum creatinine [F(4,25) = 12.988, p < 0.001], serum SOD activity [F(4,25) = 11.621, p < 0.001], blood GSH level [F(4,25) = 10.164, p < 0.001], blood CAT activity [F(4,25) = 10.631, p < 0.001], and serum MDA concentration [F(4,25) = 8.814, p < 0.001]. Post hoc group comparisons were performed using Duncan’s multiple range test, with group assignments indicated by superscript letters in Table 2.

Serum urea, serum creatinine, and serum MDA concentrations were highest in the MTX + Methanol group. Serum urea and serum MDA concentrations did not differ significantly among the Control, MTX-only, MTX + Methanol + Fomepizole, and MTX + Methanol + Ethanol groups, whereas serum creatinine was lowest in the Control group (Table 2).

The MTX + Methanol group also showed the lowest serum SOD activity, blood GSH level, and blood CAT activity. Compared with the MTX + Methanol group, the fomepizole-treated group showed significantly higher serum SOD and blood CAT activities, whereas the corresponding increases in the ethanol-treated group were not statistically significant. Blood GSH levels did not differ significantly among the MTX-only, MTX + Methanol, and two antidote-treated groups (Table 2).

Compared with the Control group, the MTX-only group showed higher kidney tissue homogenate levels of TNF-α and IL-1β and lower serum SOD activity, blood GSH level, and blood CAT activity but did not differ significantly in kidney tissue homogenate levels of cystatin C, IL-6, or KIM-1 or in serum urea, serum creatinine, or serum MDA concentration.

Histopathological findings and renal injury scores
The results of the histopathological evaluation of renal tissues were presented in Table 3. Descriptive variation among the groups was observed in tubular dilatation, accumulation of proteinaceous material, tubular epithelial degeneration, tubular necrosis, glomerular degeneration, enlargement of Bowman’s space, vascular congestion, interstitial inflammation, and interstitial fibrosis.

In the Control group, renal tissue preserved normal histological architecture, with no evident pathological alterations in the glomerular or tubular structures. In the MTX group, mild tubular degeneration, vascular congestion, and interstitial inflammation were observed.

The MTX + Methanol group showed the highest observed injury scores across the evaluated tubular, glomerular, vascular, and interstitial parameters. Both antidote-treated groups showed descriptively lower observed scores than the MTX + Methanol group. In descriptive comparisons, the fomepizole-treated group showed lower observed scores than the ethanol-treated group for most parameters, particularly tubular dilatation, tubular necrosis, glomerular degeneration, enlargement of Bowman’s space, vascular congestion, and interstitial fibrosis (Table 3). These comparisons were descriptive, and no inferential statistical tests were performed on the histopathological scores. Representative renal histopathological images obtained using hematoxylin and eosin and Masson’s trichrome staining are shown in Figure 2.

Overall, the MTX + Methanol group showed the highest renal injury and inflammatory biomarker values, the least favorable renal function and redox profiles, and the highest histopathological injury scores. Both antidote-treated groups showed more favorable renal outcome patterns than the MTX + Methanol group, with the fomepizole-treated group showing a more consistently favorable pattern across the evaluated domains. The MTX-only group also showed changes in selected inflammatory and redox-related parameters relative to the Control group.

DATA AVAILABILITY:
The animal-level raw data supporting the biochemical, renal injury biomarker, inflammatory, renal function, and redox-related analyses are provided in Supplementary File 1.

Figure 1: Experimental design and treatment timeline. Schematic representation of the experimental rat model of methanol intoxication. Adult male Wistar albino rats were assigned to five groups: Control, methotrexate (MTX) only, MTX + Methanol, MTX + Methanol + Fomepizole, and MTX + Methanol + Ethanol (n = 6/group). Standard pellet chow and tap water were available ad libitum throughout the 10-day study, and no fasting or other food or water restrictions were imposed before or after methanol administration. The Control group received no experimental treatment. Animals in Groups 2–5 received MTX by oral gavage at 0.3 mg/kg once daily for seven consecutive days (study days 1–7). Animals in Groups 3–5 received a single dose of methanol at 3 g/kg by oral gavage on study day 8. In the MTX + Methanol + Fomepizole group, an intraperitoneal loading dose of fomepizole at 15 mg/kg was administered 4 h after methanol administration, followed by maintenance doses of 10 mg/kg at 12, 24, and 36 h. In the MTX + Methanol + Ethanol group, ethanol was administered as a single dose of 0.5 g/kg by oral gavage 4 h after methanol administration. All animals were euthanized on study day 10. For Groups 3–5, this endpoint corresponded to 48 h after methanol administration. Blood and kidney samples were collected for analyses of renal function, renal injury biomarkers, inflammatory cytokines, redox-related biomarkers, and renal histopathology. Abbreviations: MTX = methotrexate. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 2: Representative histopathological findings in renal tissue from experimental groups. Representative kidney sections from the Control, MTX, MTX + Methanol, MTX + Methanol + Fomepizole, and MTX + Methanol + Ethanol groups are shown. The upper row presents hematoxylin and eosin (H&E) staining, whereas the lower row presents Masson’s trichrome staining. The Control group exhibited preserved renal architecture with normal glomerular and tubular morphology. The blue-stained collagen observed in the glomerular and tubular basement membranes, vascular walls, and interstitial connective tissue of the Control group was considered physiological collagen rather than evidence of pathological fibrosis. The MTX group showed mild tubular degeneration, vascular congestion, and inflammatory changes. The MTX + Methanol group exhibited more pronounced renal injury, characterized by tubular degeneration (*), vascular congestion (+), widening of Bowman’s space (x), tubular necrosis (↑), interstitial inflammation (↕), and periglomerular collagen accumulation consistent with a histomorphological fibrotic change (‡), as observed in the Masson’s trichrome-stained section. The Fomepizole-treated group showed lower histopathological injury scores than the MTX + Methanol group, with relatively preserved tubular and glomerular structures and less extensive necrosis, inflammation, vascular congestion, and collagen-associated changes. The Ethanol-treated group also showed lower histopathological injury scores than the MTX + Methanol group; however, residual tubular, glomerular, and vascular alterations were more apparent than in the Fomepizole-treated group. Photomicrographs were obtained at 200× magnification, and scale bars represent 100 µm. Masson’s trichrome staining was evaluated as supportive histomorphological evidence; differences in the intensity of blue staining among the panels were not used as a quantitative measure for intergroup comparison of fibrosis. Symbols: * tubular degeneration; + vascular congestion; x widening of Bowman’s space; ↑ tubular necrosis; ↕ interstitial inflammation; ‡ periglomerular collagen accumulation consistent with a histomorphological fibrotic change. MTX, methotrexate. Please click here to view a larger version of this figure.

Variable	Control (n = 6)	MTX (n = 6)	MTX + Methanol (n = 6)	MTX + Methanol + Fomepizole (n = 6)	MTX + Methanol + Ethanol (n = 6)	p	η² (95% CI)
Cystatin C (ng/mL)	26.07 ± 12.05a	32.01 ± 1.86a	45.23 ± 10.51b	32.49 ± 1.60a	31.27 ± 4.60a	0.003	0.460 (0.084 – 0.597)
IL-6 (ng/L)	7.66 ± 1.38a	8.72 ± 2.45a	11.02 ± 0.83b	7.96 ± 1.54a	8.12 ± 1.77a	0.013	0.385 (0.023 – 0.535)
KIM-1 (ng/mL)	2.21 ± 1.00a	2.47 ± 0.24a	3.45 ± 0.81b	2.28 ± 0.58a	2.32 ± 0.37a	0.017	0.370 (0.013 – 0.522)
TNF-α (ng/L)	118.66 ± 22.95a	190.51 ± 5.84b	238.29 ± 34.68c	147.10 ± 24.31ab	168.41 ± 75.41ab	<0.001	0.551 (0.181 – 0.668)
IL-1β (ng/mL)	8.43 ± 0.59a	12.53 ± 1.05c	15.26 ± 1.46d	10.05 ± 2.86ab	11.17 ± 2.37bc	<0.001	0.650 (0.316 – 0.743)

Table 1: Renal injury and inflammatory biomarkers in experimental groups. Data are presented as mean ± standard deviation (SD), with six animals per group. All biomarkers were measured in kidney tissue homogenates. Cystatin C, KIM-1, and IL-1β concentrations are expressed in ng/mL; IL-6 and TNF-α concentrations are expressed in ng/L. Reported p values are from omnibus one-way analysis of variance (ANOVA) across the five groups. Following a significant omnibus test, post hoc comparisons were performed using Duncan’s multiple range test. Within each row, groups sharing at least one superscript letter do not differ significantly, whereas groups with no letter in common differ significantly at the 0.05 level. No additional multiplicity adjustment was applied across biomarkers. Variance heterogeneity was identified among some biomarkers; therefore, the ANOVA and Duncan results should be interpreted with caution. Abbreviations: MTX = methotrexate; KIM-1 = kidney injury molecule-1; IL-6 = interleukin-6; TNF-α = tumor necrosis factor-alpha; IL-1β = interleukin-1 beta; SD = standard deviation; ANOVA = analysis of variance; CI = confidence interval. η² represents the overall effect size across the five groups. The two-sided 95% confidence intervals are model-based, assume normally distributed errors with equal variances, and are not adjusted for multiple outcomes. Therefore, the confidence intervals should be interpreted cautiously where these assumptions are violated.

Variable	Control	MTX	MTX + Methanol	MTX + Methanol + Fomepizole	MTX + Methanol + Ethanol	p	η² (95% CI)
Serum urea (mg/dL)	39.64 ± 13.69a	46.88 ± 9.49a	98.75 ± 59.24b	48.03 ± 19.64a	60.44 ± 18.53a	0.017	0.371 (0.014–0.523)
Serum creatinine (mg/dL)	0.50 ± 0.10a	0.54 ± 0.05ab	0.72 ± 0.03c	0.54 ± 0.03ab	0.60 ± 0.05b	<0.001	0.675 (0.356–0.762)
Serum SOD activity (U/mL)	470.40 ± 40.49d	371.16 ± 17.64c	219.29 ± 85.06a	319.38 ± 107.20bc	256.22 ± 67.89ab	<0.001	0.650 (0.317–0.743)
Blood GSH (mmol/L)	58.74 ± 31.90b	26.36 ± 5.92a	11.10 ± 3.73a	19.56 ± 1.66a	13.66 ± 5.32a	<0.001	0.619 (0.272–0.720)
Blood CAT activity (U/mL)	220.82 ± 74.08c	160.88 ± 55.18b	68.90 ± 13.41a	129.45 ± 7.49b	110.14 ± 20.18ab	<0.001	0.630 (0.287–0.728)
Serum MDA (nmol/mL)	13.17 ± 2.03a	17.29 ± 6.36a	31.83 ± 9.94b	17.93 ± 2.04a	19.34 ± 4.65a	<0.001	0.585 (0.225–0.694)

Table 2: Renal function and redox-related parameters in experimental groups. Data are presented as mean ± standard deviation (SD), with six animals per group. Serum urea, serum creatinine, superoxide dismutase (SOD) activity, and malondialdehyde (MDA) concentration were measured in serum, whereas reduced glutathione (GSH) level and catalase (CAT) activity were measured in blood anticoagulated with ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). Serum urea and creatinine concentrations are expressed in mg/dL, SOD and CAT activities in U/mL, GSH levels in mmol/L, and MDA concentrations in nmol/mL. Reported p values are from omnibus one-way analysis of variance (ANOVA) across the five groups. Following a significant omnibus test, post hoc comparisons were performed using Duncan’s multiple range test. Within each row, groups sharing at least one superscript letter do not differ significantly, whereas groups with no letter in common differ significantly at the 0.05 level. No additional multiplicity adjustment was applied across biomarkers. Variance heterogeneity was identified for some outcomes; therefore, the ANOVA and Duncan results should be interpreted cautiously. The redox-related biomarkers are indirect indicators and do not constitute direct measurements of mitochondrial function or molecular mechanisms of injury. η² represents the overall effect size across the five groups. The two-sided 95% confidence intervals are model-based, assume normally distributed errors with equal variances, and are not adjusted for multiple outcomes. Therefore, the confidence intervals should be interpreted cautiously where these assumptions are violated. Abbreviations: MTX = methotrexate; SOD = superoxide dismutase; GSH = reduced glutathione; CAT = catalase; MDA = malondialdehyde; EDTA = ethylenediaminetetraacetic acid; SD = standard deviation; ANOVA = analysis of variance; CI = confidence interval.

Variable	Control	MTX	MTX + Methanol	MTX + Methanol  + Fomepizole	MTX + Methanol + Ethanol
Tubular dilatation	0.16 ± 0.40	1.50 ± 0.54	3.50 ± 0.54	0.83 ± 0.40	1.66 ± 0.51
Proteinaceous material accumulation	0.00 ± 0.00	1.33 ± 0.51	3.16 ± 0.40	0.66 ± 0.51	1.33 ± 0.51
Tubular epithelial degeneration	0.16 ± 0.40	1.83 ± 0.40	3.83 ± 0.40	1.00 ± 0.00	2.00 ± 0.00
Tubular necrosis	0.00 ± 0.00	1.00 ± 0.00	3.33 ± 0.51	0.83 ± 0.40	1.33 ± 0.51
Glomerular degeneration	0.16 ± 0.40	1.33 ± 0.51	3.33 ± 0.51	1.00 ± 0.00	1.66 ± 0.51
Bowman's space enlargement	0.00 ± 0.00	1.16 ± 0.40	3.00 ± 0.00	0.83 ± 0.40	1.66 ± 0.51
Vascular congestion	0.00 ± 0.00	1.33 ± 0.51	3.16 ± 0.40	0.83 ± 0.40	1.66 ± 0.51
Interstitial inflammation	0.00 ± 0.00	1.00 ± 0.00	3.00 ± 0.63	0.83 ± 0.40	1.16 ± 0.40
Interstitial fibrosis	0.00 ± 0.00	1.00 ± 0.00	2.83 ± 0.40	0.66 ± 0.51	1.16 ± 0.40

Table 3: Descriptive histopathological scores in experimental groups. Data are presented descriptively as mean ± standard deviation (SD), with six animals per group. Histopathological scores were obtained from kidney sections stained with hematoxylin and eosin (H&E) and Masson’s trichrome; the scores are dimensionless. Each animal was assigned one integer score for each histopathological parameter on a scale of 0–4, where 0 = absent, 1 = minimal, 2 = mild, 3 = moderate, and 4 = severe. The decimal values presented in the table represent the arithmetic means of the individual integer scores obtained from the six animals in each experimental group and do not represent scores assigned to individual animals or a continuous scoring system. The standard deviations represent between-animal variability within each group. No inferential statistical testing or post hoc pairwise comparisons were performed on the histopathological scores; therefore, the observed between-group patterns should be interpreted descriptively rather than as statistically significant differences. Histopathological evaluation included tubular dilatation, proteinaceous material accumulation, tubular epithelial degeneration, tubular necrosis, glomerular degeneration, enlargement of Bowman’s space, vascular congestion, interstitial inflammation, and interstitial fibrosis.

Supplementary File 1: Raw data supporting the biochemical analyses. This spreadsheet contains the animal-level raw values used for the biochemical, renal injury biomarker, inflammatory, and redox-related analyses reported in the manuscript. Please click here to download this file.

Discusión

El hallazgo principal de este estudio fue que el grupo MTX + Metanol presentó el perfil de lesión renal más adverso en los resultados funcionales, inflamatorios, relacionados con el estado redox y histopatológicos. Este grupo presentó los valores más altos de urea sérica, creatinina sérica, cistatina C renal, KIM-1, TNF-α, IL-6, IL-1β y MDA, y las actividades más bajas de SOD, niveles de GSH y actividad de CAT, junto con las puntuaciones de lesión histopatológica más elevadas observadas. Ambos grupos tratados con antídotos mostraron patrones de resultados renales más favorables que el grupo MTX + Metanol, siendo el grupo tratado con fomepizol el que presentó un patrón más consistentemente favorable en los dominios evaluados. Sin embargo, estos hallazgos se obtuvieron en un modelo agudo de ratas pretratadas con MTX utilizando regímenes de antídotos desiguales: administración intraperitoneal repetida de fomepizol frente a una única dosis oral de etanol. Estas diferencias en la vía y frecuencia de dosificación limitan la comparación directa de la eficacia nefroprotectora, y los patrones de resultados observados no establecen la superioridad del fomepizol frente al etanol. El grupo solo con MTX mostró niveles más altos de TNF-α e IL-1β y actividades más bajas de SOD, niveles de GSH y actividad de CAT que el grupo Control, mientras que la cistatina C renal, IL-6, KIM-1, urea sérica, creatinina sérica y niveles de MDA permanecieron estadísticamente comparables entre los grupos. Este patrón indicó que el pretratamiento con MTX contribuyó al perfil inflamatorio y relacionado con el estado redox de base. Por consiguiente, las alteraciones adicionales observadas en el grupo MTX + Metanol ocurrieron sobre una base de pretratamiento con MTX y no pudieron atribuirse únicamente al metanol. Dado que no se incluyó un grupo con solo metanol, no fue posible separar completamente la contribución independiente del metanol ni las posibles interacciones entre MTX y metanol.

Basándose en la toxicología establecida del metanol, la acumulación de metabolitos tóxicos representaba un factor plausible que contribuye al daño renal. El metanol se metaboliza predominantemente en el hígado por la ADH en formaldehído y posteriormente en ácido fórmico^1,3,18,19,20. Por lo tanto, el riñón podría haber sido afectado principalmente por el formiato circulante y las alteraciones metabólicas sistémicas resultantes, más que por un metabolismo local extenso del metanol. Sin embargo, no se pudo excluir una contribución del metabolismo del alcohol o del aldehído en el tejido renal, ya que no se midieron las concentraciones de metanol, formaldehído y formiato, ni la actividad de la ADH renal. El ácido fórmico inhibe la citocromo c oxidasa mitocondrial, alterando así la fosforilación oxidativa, reduciendo la producción de ATP e induciendo hipoxia histotóxica; este proceso puede culminar en acidosis láctica, aumento en la generación de especies reactivas de oxígeno y daño de membrana^1,2,3,19,20. En comparación con el hígado, que es el sitio principal del metabolismo del metanol, el riñón puede ser particularmente susceptible a los efectos secundarios del formiato y de las alteraciones metabólicas sistémicas. Las células epiteliales tubulares proximales tienen altas demandas energéticas y son especialmente vulnerables a la disfunción mitocondrial, al estrés oxidativo y al deterioro de la microcirculación. En consecuencia, la hipoxia mediada por formiato, la acidosis metabólica y la inflamación pueden contribuir al daño renal^{2,8,9,21,22,23}. Estudios clínicos que muestran asociaciones entre la lesión renal aguda y la acidosis metabólica, insuficiencia respiratoria, rabdomiólisis, sepsis y disfunción de múltiples órganos sugirieron que el daño renal puede reflejar la carga tóxica sistémica^8,9,10,21. La oxidación dependiente de folato del formiato más rápida en ratas que en humanos representó una limitación importante de los modelos experimentales^1,11,12. Por consiguiente, se utilizó el tratamiento previo con metotrexato para reducir la eliminación del formiato y aumentar la susceptibilidad a la toxicidad del metanol, en lugar de reproducir las características clínicas y metabólicas completas del envenenamiento por metanol en humanos.

La disfunción renal se demostró mediante la evaluación combinada de parámetros bioquímicos convencionales y biomarcadores de lesión renal. Las concentraciones elevadas de urea y creatinina en suero en el grupo MTX + Metanol respaldaron una capacidad de filtración y excreción renal comprometida. El aumento de los niveles de cistatina C y KIM-1 en riñón sugirió que la lesión tubular acompañó al deterioro funcional. Dada la asociación de KIM-1 con la lesión del túbulo proximal, este incremento fue consistente con degeneración epitelial tubular, dilatación y necrosis^24,25. Los niveles elevados de cistatina C también respaldaron la presencia de una función renal deteriorada^26,27. Los niveles más bajos de estos biomarcadores en los grupos tratados con fomepizol y etanol sugirieron una atenuación de la lesión renal, con un patrón más consistente observado en el grupo tratado con fomepizol. El patrón de biomarcadores relacionados con el estado redox fue consistente con el estrés oxidativo como un posible contribuyente a la lesión renal, más que como evidencia de un mecanismo confirmado. El MDA se utiliza comúnmente como un índice de peroxidación lipídica, mientras que el GSH contribuye al mantenimiento de la homeostasis redox celular^28,29. En modelos experimentales de intoxicación por metanol y neuropatía óptica asociada al metanol, el estrés oxidativo, la peroxidación lipídica y la capacidad antioxidante reducida también se han asociado con lesión tisular^10,15,20. La actividad sérica reducida de SOD, concentraciones séricas más altas de MDA y niveles sanguíneos más bajos de GSH y actividad de CAT en el grupo MTX + Metanol fueron consistentes con una capacidad antioxidante reducida y una peroxidación lipídica aumentada; sin embargo, estas mediciones no establecieron un mecanismo mitocondrial o molecular subyacente. Las concentraciones séricas más bajas de MDA y la recuperación parcial de la actividad sérica de SOD y sanguínea de CAT en los grupos tratados con antídotos fueron compatibles con un perfil más favorable de biomarcadores relacionados con el estado redox, con un patrón más consistentemente favorable observado en el grupo tratado con fomepizol.

Valores más altos de TNF-α, IL-6 e IL-1β en el grupo MTX + Metanol fueron consistentes con un perfil renal proinflamatorio. Dado que estas citocinas no eran específicas de una vía determinada y el propio MTX se asoció con cambios en marcadores inflamatorios seleccionados, los hallazgos respaldaron la inflamación como un posible contribuyente, más que como un mecanismo confirmado, de la lesión renal. La disfunción mitocondrial mediada por ácido fórmico, la hipoxia celular y el estrés oxidativo podrían proporcionar una base para la activación de vías inflamatorias; por lo tanto, el estrés oxidativo y la inflamación podrían progresar como procesos mutuamente refuerzos en la toxicidad del metanol^1,2,3,15. Modelos experimentales de intoxicación por metanol han reportado asociaciones entre la exposición al metanol y la infiltración de células inflamatorias, daño histopatológico y niveles elevados de marcadores proinflamatorios como IL-1β y TNF-α^13,15. Estos hallazgos fueron consistentes con los niveles aumentados de citocinas proinflamatorias y las puntuaciones elevadas para inflamación intersticial, degeneración tubular y necrosis tubular observadas en el grupo MTX + Metanol. En conjunto, los hallazgos fueron compatibles con un proceso multifactorial que involucra efectos de metabolitos tóxicos, estrés oxidativo, inflamación, deterioro de la microcirculación y carga tóxica sistémica; sin embargo, estas vías no se evaluaron directamente. Niveles más bajos de TNF-α, IL-6 e IL-1β en los grupos tratados con antídoto sugirieron que la inhibición de la formación de metabolitos tóxicos también podría haber limitado la respuesta inflamatoria. Los hallazgos histopatológicos proporcionaron correlatos a nivel tisular de la lesión renal, con el grupo MTX + Metanol mostrando las puntuaciones de lesión más altas observadas en los parámetros tubulares, glomerulares, vasculares e intersticiales. Ambos grupos tratados con antídoto mostraron puntuaciones histopatológicas descriptivamente más bajas, y el grupo tratado con fomepizol mostró puntuaciones descriptivamente más bajas que el grupo tratado con etanol en la mayoría de los parámetros. Sin embargo, dado que no se realizó ninguna prueba estadística inferencial sobre las puntuaciones histopatológicas, estas observaciones no establecieron una protección histopatológica ni una superioridad estadísticamente significativa para ninguno de los antídotos^16,17.

Los efectos antídotos del etanol y la fomepizol en la intoxicación por metanol se basan en la supresión del metabolismo mediado por la alcohol deshidrogenasa, reduciendo así la formación de formaldehído y ácido fórmico. El etanol actúa como sustrato competitivo, mientras que la fomepizol funciona como un inhibidor directo y potente de la alcohol deshidrogenasa^{1,3,4,6,7,30,31,32}. Los patrones de resultado renal más favorables observados en ambos grupos tratados con antídotos fueron compatibles con los efectos esperados de la inhibición de la alcohol deshidrogenasa. Sin embargo, la literatura actual no demuestra una superioridad clínica definitiva de la fomepizol frente al etanol. Aunque la fomepizol suele ser preferida debido a una dosificación más sencilla, farmacocinética predecible y un perfil de efectos adversos más bajo, el etanol sigue siendo una alternativa eficaz^{1,3,4,6,7,30,32}. En los datos de intoxicación masiva por metanol reportados por Zakharov et al., no se observó una diferencia clara entre los dos antídotos en cuanto a mortalidad, duración de la unidad de cuidados intensivos o necesidad de diálisis; por lo tanto, las interpretaciones sobre la superioridad clínica deben hacerse con cautela⁵. No se identificaron diferencias directas estadísticamente significativas entre los grupos tratados con fomepizol y con etanol para los resultados bioquímicos mediante la prueba post hoc de Duncan. Además, la fomepizol se administró en dosis repetidas, mientras que el etanol se administró en una sola dosis. Los regímenes no fueron equiparables en cuanto a vía de administración, frecuencia de dosificación o exposición sistémica. En consecuencia, el patrón descriptivamente más favorable asociado con la fomepizol podría haber reflejado diferencias en el esquema de dosificación, vía de administración o exposición al fármaco, además de diferencias entre los agentes antídotos, y no estableció una mayor eficacia bioquímica, superioridad clínica ni preferencia terapéutica clínica^5,6,30,32. Una fortaleza importante del estudio fue la evaluación integrada de la urea y la creatinina séricas, la cistatina C, la KIM-1, las citocinas proinflamatorias, los biomarcadores relacionados con el estado redox y las puntuaciones histopatológicas en dominios funcionales, tubulares, inflamatorios, relacionados con el estado redox y estructurales complementarios. Este modelo centrado en la lesión renal puede proporcionar un marco preclínico útil para evaluar regímenes antídotos, intervenciones nefroprotectoras adyuvantes y biomarcadores de lesión renal en condiciones de reducción de la eliminación de formiato dependiente de folatos^8,9,10,21.

Varias limitaciones afectaron la interpretación. La generalización directa a la intoxicación clínica por metanol se vio limitada por el modelo animal experimental y las diferencias metabólicas entre especies. El metotrexato puede influir independientemente en los resultados renales, inflamatorios y oxidativos.³³, y la ausencia de un grupo con solo metanol impidió la separación completa de los efectos del metanol de las posibles interacciones entre MTX y metanol. No se midieron las concentraciones séricas o tisulares de metanol, formaldehído, formiato, etanol ni fomepizol, y no se evaluó la actividad de la ADH en la fracción citosólica renal cruda; por lo tanto, no pudo verificarse directamente la sensibilización metabólica, la formación de metabolitos tóxicos, la exposición al antídoto ni la inhibición del metabolismo del metanol, y no se pudieron realizar análisis de correlación con los resultados bioquímicos renales. No se midieron las variables del equilibrio ácido-base, incluyendo pH, bicarbonato, exceso de base y brecha aniónica. El seguimiento de 48 horas permitió evaluar únicamente los resultados renales agudos y no estableció la recuperación, persistencia o reversibilidad de la lesión, ni cambios estructurales crónicos. La tinción de tricrómica de Masson se evaluó histomorfológicamente sin medición cuantitativa del área positiva para colágeno, ni marcadores moleculares o bioquímicos de fibrosis, incluyendo α-la expresión de actina del músculo liso, el contenido de colágeno y la concentración de 4-hidroxiprolina no fueron evaluados. La evaluación histopatológica realizada por un único patólogo cegado impidió la valoración del acuerdo entre observadores, y la clasificación semicuantitativa de las lesiones siguió siendo potencialmente susceptible a la clasificación dependiente del observador. Los regímenes de antídotos no eran farmacológicamente equivalentes; las concentraciones de ELISA en tejido renal no se normalizaron respecto a la concentración total de proteína; no se realizaron análisis moleculares de la función mitocondrial ni de las vías de muerte celular; el tamaño de la muestra fue limitado; y solo se incluyeron ratas macho. Estudios futuros deberían incorporar grupos con solo metanol y con solo metotrexato, regímenes de antídotos comparables, mediciones seriadas de las concentraciones de metanol, formiato y antídotos, actividad renal de la alcohol deshidrogenasa (ADH), mediciones del equilibrio ácido-base, evaluación cuantitativa de la fibrosis, un seguimiento más prolongado y una validación clínica adecuadamente diseñada. En conclusión, la exposición al metanol en este modelo de rata pretatada con metotrexato se asoció con alteración de la función renal, aumento de los biomarcadores de lesión renal e inflamación, un perfil desfavorable relacionado con el estado redox y lesión histopatológica. Ambos grupos tratados con antídotos mostraron patrones de resultado renal más favorables que el grupo MTX + Metanol. El fomepizol mostró un patrón descriptivo más consistentemente favorable en todos los dominios evaluados; sin embargo, la ausencia de diferencias bioquímicas directas significativas entre los grupos de antídotos, el carácter descriptivo de las comparaciones histopatológicas, los regímenes de antídotos no equivalentes y la falta de mediciones toxicocinéticas impidieron llegar a conclusiones sobre su superioridad frente al etanol. Estos hallazgos están restringidos al modelo de rata pretatada con metotrexato y no establecen los efectos renales de ninguno de los antídotos tras la exposición al metanol sin pretatamiento con metotrexato ni en el envenenamiento por metanol en humanos. Se necesitan estudios adicionales que incluyan mediciones toxicocinéticas directas, evaluaciones mecanicistas, regímenes de dosificación de antídotos comparables y un seguimiento más prolongado para evaluar la reproducibilidad y la aplicabilidad más amplia de estos hallazgos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Formol tamponado neutro al 10%	Merck	No registrado	Fijación de tejidos para procesamiento histopatológico.
Etileno absoluto (≥99,8 %)	Sigma-Aldrich, USA	No registrado	Diluido con agua destilada estéril para obtener una solución final al 20 % (v/v); administrado como una dosis única por sonda oral de 0,5 g/kg, 4 h después de la administración de metanol.
Centrífuga de banco	Nüve	NF048	Preparación de muestras y centrifugación.
Anticuerpo conjugado con biotina	Componentes del kit ELISA BT Lab	Incluido en el kit	Anticuerpo de detección
Kit CAT (catalasa)	Otto Scientific	Otto3051	Medición colorimétrica de la actividad de catalasa (CAT) en sangre anticoagulada con EDTA.
Cóctel inhibidor de proteasas cOmplete Mini sin EDTA	Roche / Sigma-Aldrich	11836170001	Se añadió al tampón de homogenización durante la preparación de homogeneizados de tejido renal para análisis por ELISA.
Kit de creatinina	Otto Scientific	OttoBC139	Evaluación de los niveles séricos de creatinina.
Homogeneizador digital	Daihan Scientific	HG-15D	Homogenización de tejidos
Lavadora automática de tiras ELx50	Bio-Tek Instruments, USA	ELx50	Lavado en ELISA
Lector de microplacas ELx800	Bio-Tek Instruments, USA	ELx800	Medición de absorbancia para ensayos ELISA y colorimétricos; la absorbancia en ELISA se leyó a 450 nm.
Eosina Y (amarillenta)	Merck	1.15935.0025	Tinción histopatológica
Fomepizol (4-metilpirazol)	Hüsnü Arsan A.., Ankara, Türkiye	No registrado	Preparado en solución estéril de cloruro sódico al 0,9 % a una concentración final de 10 mg/mL; administrado por vía intraperitoneal como dosis de carga de 15 mg/kg, 4 h después de la administración de metanol, seguido de dosis de mantenimiento de 10 mg/kg a las 12, 24 y 36 h tras la administración de metanol.
Kit GSH (glutatión)	Otto Scientific	Otto3053	Medición colorimétrica de los niveles de glutatión reducido (GSH) en sangre anticoagulada con EDTA.
Solución de hematoxilina de Harris	BSLAB	BS-002	Tinción histopatológica
Ácido clorhídrico (HCl)	Merck	7647-01-0	Ajuste de pH
IBM SPSS Statistics	IBM Corp.	IBM SPSS Statistics Version 29.0	Análisis estadístico; RRID:SCR_016479.
Clorhidrato de ketamina (Ketalar)	Pfizer, USA	No registrado	Anestesia general antes de la recolección de sangre y tejido renal.
Microscopio óptico	Nikon Eclipse	Ni-U	Examen histopatológico
Kit de tinción tricrómica de Masson	MOSLAB (Medical Olympus Sanayi Tic. Ltd. ti., Türkiye)	BKMTO001	Tinción histopatológica
Kit MDA (malondialdehído)	Otto Scientific	Otto1001	Medición colorimétrica de los niveles de malondialdehído (MDA) en suero como índice de peroxidación lipídica.
Metanol (≥99,8 %)	Sigma-Aldrich, USA	322415	Administrado por vía oral (3 g/kg) para inducir intoxicación experimental por metanol.
Metotrexato (Emthexate 500 mg/5 mL)	Teva Pharma Belgium	No registrado	Formulación comercial de 100 mg/mL diluida con solución estéril de cloruro sódico al 0,9 % para obtener una concentración de trabajo final de 0,06 mg/mL; administrado por sonda oral a 5 mL/kg, lo que equivale a 0,3 mg/kg, una vez al día durante 7 días consecutivos.
Analizador de química Mindray	Mindray	BS-400	Medición de urea y creatinina séricas.
Cera de parafina, grado histológico	No registrado	No registrado	Inclusión de tejidos.
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Merck	P4417	Lavado/enjuague de tejidos
Kit ELISA de cistatina C de rata	BT Lab, China	E0145Ra	Cuantificación de niveles de cistatina C en homogeneizados de tejido renal; sensibilidad analítica, 0,25 ng/mL; rango de detección, 0,5–100 ng/mL.
Kit ELISA de IL-1β de rata	BT Lab, China	E0119Ra	Cuantificación de niveles de IL-1β en homogeneizados de tejido renal; sensibilidad analítica, 0,08 ng/mL; rango de detección, 0,2–60 ng/mL.
Kit ELISA de IL-6 de rata	BT Lab, China	E0135Ra	Cuantificación de niveles de IL-6 en homogeneizados de tejido renal; sensibilidad analítica, 0,052 ng/L; rango de detección, 0,1–40 ng/L.
Kit ELISA de KIM-1 de rata	BT Lab, China	E0549Ra	Cuantificación de niveles de KIM-1 en homogeneizados de tejido renal; sensibilidad analítica, 0,01 ng/mL; rango de detección, 0,05–10 ng/mL.
Kit ELISA de TNF-α de rata	BT Lab, China	E0764Ra	Cuantificación de niveles de TNF-α en homogeneizados de tejido renal; sensibilidad analítica, 2,51 ng/L; rango de detección, 5–1.000 ng/L.
Tampón de lisis y extracción RIPA	Thermo Scientific	89900	Homogenización y lisis de tejido renal para análisis por ELISA.
Kit SOD (superóxido dismutasa)	Otto Scientific	Otto3047	Medición colorimétrica de la actividad de superóxido dismutasa (SOD) en suero.
Citrato sódico	Merck	03-04-6132	Preparación de tampón
Hidróxido sódico (NaOH)	Merck	1310-73-2	Ajuste de pH
Aguja de alimentación de acero inoxidable (cánula de sonda oral 22 G)	Instech Laboratories, USA	No registrado	Cánula reutilizable de acero inoxidable utilizada para la administración por sonda oral en ratas.
Solución de parada	Componentes del kit ELISA BT Lab	Incluido en el kit	Terminación de la reacción en ELISA
Peroxidasa de estreptavidina	Thermo Scientific	SHRP248-B	Sistema de detección en ELISA
Solución sustrato TMB	Componentes del kit ELISA BT Lab	Incluido en el kit	Sustrato cromogénico
Tris-HCl	Thermo Scientific	1185-53-1	Preparación de tampón
Kit de urea	Otto Scientific	OttoBC157	Medición de los niveles séricos de urea.
Concentrado de tampón de lavado	Componentes del kit ELISA BT Lab	Incluido en el kit	Lavado de placas
Ratas albinas Wistar	Laboratorio de Investigación con Animales Experimentales de la Universidad Ahi Evran, , Türkiye	Licencia de cría/producción n.º 184	Machos; 8–12 semanas de edad; peso corporal, 220 ± 20 g
Clorhidrato de xilazina (Rompun)	Bayer, Alemania	No registrado	Anestesia general antes de la recolección de sangre y tejido renal.
Xileno, grado histológico	No registrado	No registrado	Procesamiento y desengrasado de tejidos histológicos.