Este protocolo describe un modelo ex vivo de infarto de miocardio en el corazón aislado de ratón perfundido con cristaloide. Este enfoque evita las variables sistémicas, permitiendo a los investigadores evaluar directamente los efectos cardíacos en ausencia de factores extrínsecos que podrían alterar la supervivencia de los cardiomiocitos, y probar intervenciones farmacéuticas localizadas.
Artículo de método
Ex Vivo Modelo de Infarto de Miocardio en el Corazón de Ratón Perfundido con Cristaloides
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
La infarto de miocardio (IM) experimental se modela comúnmente en animales mediante la oclusión transitoria de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD) o, a nivel celular, mediante protocolos de hipoxia-reoxigenación. Como modelo alternativo a nivel orgánico de isquemia, el corazón perfundido según Langendorff ha permanecido como una herramienta fundamental para investigar los efectos de perturbaciones fisiológicas e intervenciones farmacológicas sobre la cardioprotección. A continuación, presentamos la metodología básica y las reglas fundamentales necesarias para establecer un modelo de isquemia/reperfusión miocárdica regional en el corazón aislado de ratón. En resumen, tras la parada cardiopléjica, la arteria LAD fue ligada tras un breve lavado con PBS frío. Luego, el corazón fue montado en un aparato de Langendorff y perfundido con un tampón oxigenado rico en nutrientes a 37°C bajo una presión de perfusión constante de 110 cmH₂O₂O. La isquemia miocárdica se indujo durante 30, 45, 60, 90 y 120 minutos, seguidos de 90 minutos de reperfusión. La viabilidad de los cardiomiocitos y el tamaño del infarto se evaluaron mediante la técnica microscópica de tinción con cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio (TTC). Demostramos que el modelo de IM ex vivo producía de forma confiable una lesión miocárdica reproducible, caracterizada por una pérdida progresiva de cardiomiocitos viables dentro de la región infartada a medida que aumentaba la duración de la isquemia. Además, se requirió al menos 30 minutos de reperfusión para lograr una delimitación clara del miocardio infartado mediante TTC. Este enfoque evita las variables sistémicas, permitiendo a los investigadores evaluar directamente los efectos cardíacos en ausencia de influencias regulatorias extrínsecas, como factores humorales circulantes e infiltración de células inmunitarias, que podrían interferir en la progresión del IM, y probar intervenciones farmacéuticas localizadas. Por lo tanto, el modelo de IM ex vivo representa una plataforma útil para investigar los mecanismos cardioprotectores que actúan directamente sobre los cardiomiocitos.
Introducción
Un infarto de miocardio (IM) ocurre cuando se detiene el flujo sanguíneo coronario, lo que provoca la muerte del tejido y un deterioro funcional grave. Aunque normalmente se estudia en organismos completos, el término puede referirse a un IM regional restringido a estructuras cardíacas específicas, o a modelos de laboratorio ex vivo de corazón aislado (por ejemplo, perfusión Langendorff) utilizados para estudiar infartos en ausencia de influencia sistémica1. Por ello, el corazón perfundido mediante la técnica de Langendorff ha servido como un modelo experimental sólido y bien establecido para el estudio de lesiones isquémicas miocárdicas durante más de 50 años2.
El modelo de IAM ex vivo en el corazón aislado ofrece varias ventajas, incluyendo un control preciso del entorno experimental y la capacidad de evaluar los efectos directos de intervenciones, como agentes farmacológicos, sobre el miocardio independientemente de las influencias sistémicas, incluyendo factores humorales circulantes, componentes sanguíneos y regulación neurohumoral3. Al minimizar estos factores de confusión, el modelo ex vivo proporciona un enfoque más predecible y reproducible que los modelos in vivo y, por lo tanto, facilita una investigación rigurosa de los procesos de la enfermedad y las vías moleculares implicadas en el IAM4.
En corazones aislados, la isquemia miocárdica puede inducirse de forma global o regional5. En el modelo de IAM global, se interrumpe por completo el flujo del perfusato a través de toda la circulación coronaria, mientras que en el modelo de IAM regional, solo la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD) se ocluye transitoriamente mediante ligadura, lo que provoca una lesión isquémica limitada al miocardio distal al sitio de ligadura. Aunque el modelo de IAM global es técnicamente sencillo de realizar, presenta varias limitaciones que restringen su aplicación en estudios de cardioprotección6. Una limitación importante es que la duración de la isquemia está restringida por la tolerancia duradera del corazón completo, lo que dificulta inducir una isquemia prolongada y hace probable una infartación transmural comparable a situaciones in vivo7. Además, aunque los modelos ex vivo generalmente ofrecen una excelente reproducibilidad cuando las duraciones de isquemia y reperfusión se controlan cuidadosamente, estos protocolos varían considerablemente entre laboratorios. Esta variabilidad subraya la necesidad de una mejor estandarización y caracterización del corazón aislado de ratón, particularmente porque muchos detalles metodológicos críticos aún están insuficientemente descritos en la literatura8.
Por otro lado, el modelo regional de IM es técnicamente más difícil de establecer. Aquí presentamos varias modificaciones y estrategias prácticas para optimizar la inducción de una IM ex vivo confiable en el corazón aislado de ratón, particularmente para evaluar intervenciones farmacológicas destinadas a la cardioprotección9,10. Así, este protocolo ex vivo modificado de IM utilizando el corazón de ratón perfundido mediante Langendorff proporciona una plataforma eficaz para evaluar directamente la supervivencia miocárdica tras intervenciones terapéuticas.
Protocolo
El modelo de corazón perfundido aislado descrito aquí es un experimento agudo, no superviviente, y fue aprobado por las autoridades locales (O1019/25, LANUV de Renania del Norte-Westfalia, Alemania). Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices ARRIVE y la Guía del NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio. El equipo y los productos químicos necesarios para los experimentos se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Configuración de un sistema de retroperfusión de Langendorff para el corazón aislado de ratón
NOTA: Se diseñó un sistema no recirculante impulsado por gravedad para suministrar un perfusado cristaloide oxigenado (buffer de Krebs-Henseleit, KHB) al corazón aislado de ratón a una presión constante de 110 cmH2O (Figura 1A).
- Limpie el material de vidrio de Langendorff con HCl 0,1 M/L, etanol al 100 % y enjuague posteriormente con agua destilada antes de armar el sistema.
- Pese todos los productos químicos necesarios para la preparación de 2 L de KHB modificado según las siguientes concentraciones finales (mM): 116,02 NaCl, 4,63 KCl, 1,10 MgSO4·7H2O, 1,21 KH2PO4, 2,52 CaCl2·2H2O, 24,88 NaHCO3, 8,30 D-glucosa, 2,0 piruvato de sodio.
- Disuelva todos los productos químicos excepto el CaCl₂ en agua doblemente destilada en un matraz de 2 L, burbujeando continuamente con Carbógeno (95 % O₂/5 % CO₂) durante al menos 10 min para equilibrar el pH a 7,4.
- Agregue posteriormente el CaCl₂ a la solución para evitar la precipitación.
- Continúe burbujeando la solución con Carbógeno durante 10 min adicionales.
- Filtre la solución de KHB al vacío a través de un filtro de membrana de 0,2 µm para eliminar partículas pequeñas que puedan obstruir la microvasculatura coronaria.
- Transfiera la solución de KHB filtrada a un recipiente de vidrio de 2 L colocado en un baño de agua precalentado mantenido a 37 °C.
- Conecte el recipiente de KHB a la columna de presión de vidrio, permitiendo que el KHB oxigenado llene continuamente la columna mediante la presión generada por el gas Carbógeno en el recipiente.
- Asegúrese de que el sistema de tubos de salida esté libre de burbujas de aire.
- Equilibre la solución de KHB con Carbógeno durante 30 min adicionales antes de comenzar el experimento.
2. Aislamiento y canulación del corazón
NOTA: En los experimentos presentes se utilizaron ratones macho C57BL/6J que pesaban entre 20 y 25 g. Todos los procedimientos experimentales deben documentarse adecuadamente de acuerdo con las regulaciones locales, incluyendo la justificación, la fecha y el método de eutanasia.
- Coloque suavemente el ratón en una cámara de inducción que contenga 5% de isoflurano (v/v) para la inducción de la anestesia.
- Confirme la profundidad anestésica mediante la ausencia completa de respuesta a un apretón firme en el dedo del pie, y luego transfiera al tablero quirúrgico. Eutanasie inmediatamente al ratón mediante dislocación cervical, indicada por la ausencia de respiración y la pérdida del tono muscular en la parte inferior del cuerpo.
- Corte la caja torácica bilateralmente hacia el esternón para exponer completamente el corazón y la aorta ascendente.
- Sujete el tejido extracardiaco con pinzas y extirpe el corazón.
- Coloque el corazón en un pequeño vaso de precipitados previamente enfriado que contenga 50 mL de solución KHB fría con hielo durante al menos 30 s para inducir un arresto cardiopléjico.
NOTA: Debido a que la actividad cardíaca es altamente sensible a la temperatura, el corazón queda completamente detenido por inmersión en solución KHB fría con hielo. - Transfiera el corazón a una almohadilla de algodón previamente enfriada y humedecida con KHB, colocada en un recipiente metálico, donde se ha montado un sistema de cánula conectado a una llave de tres vías. (Figura 1B).
NOTA: El sistema de perfusión debe estar libre de burbujas de aire. - Coloque previamente un nudo suelto de medio cuadrado utilizando un hilo de seda 5-0 en el extremo distal de la cánula.
- Disecque cuidadosamente el timo, el tejido conectivo y los tejidos extracardíacos residuales (incluyendo los pulmones y el esófago) para exponer y recortar la raíz aórtica.
NOTA: Asegúrese de tener una longitud adecuada de la aorta ascendente para una canulación exitosa. - Monte el corazón en la cánula y fíjelo con una sutura previamente colocada.
- Lave el corazón con 5 mL de PBS frío con hielo para eliminar la sangre residual de la circulación coronaria.
3 Isquemia y reperfusión miocárdica ex vivo
NOTA: La isquemia miocárdica global se indujo simplemente deteniendo la perfusión del corazón, mientras que la isquemia miocárdica regional se creó mediante ligadura transitoria de la arteria descendente anterior izquierda (LAD) bajo un microscopio estereoscópico.
- Coloque la arteria descendente anterior (LAD) en el centro del campo de visión rotando suavemente el corazón mediante el ajuste de la almohadilla de algodón subyacente. La LAD se volvió transparente y claramente distinguible del miocardio circundante durante la perfusión con PBS.
- Pase una aguja cónica que lleve un hilo de polipropileno 8–0 por debajo de la LAD, 1 mm por debajo del margen inferior de la aurícula izquierda.
NOTA: Asegúrese de que la LAD se sitúe en medio de los dos puntos de punción para evitar lesiones vasculares provocadas por la ligadura. - Coloque un trozo de taponcillo blando sobre la LAD.
- Ajuste firmemente el hilo para detener la perfusión distal al sitio de ligadura.
- Transfiera el corazón canulado al aparato de Langendorff e inicie una perfusión retrógrada.
- Sumerja el corazón en el baño de órganos con camisa de agua para mantener una temperatura constante (37 °C) durante todo el período experimental.
- Monitoree el flujo coronario pico y en estado estable (Tabla 1).
- En los puntos de tiempo designados de isquemia miocárdica (véase la sección de resultados), detenga la perfusión y retire el corazón canulado del aparato de perfusión.
- Sumerja inmediatamente el corazón en KHB frío con hielo (4 °C) para detener completamente la contracción cardíaca.
- Coloque nuevamente el corazón sobre la almohadilla de algodón en el recipiente metálico previamente enfriado y libere la ligadura de la LAD.
- Para estudios de intervención farmacológica, inyecte 5 µL de interleucina-6 (IL-6, 0.1 mg/mL) en la pared anterior infartada utilizando una jeringa de insulina de 30 G en esta etapa.
- Vuelva a montar el corazón canulado en el aparato de perfusión y reanude la perfusión cardíaca (reperfusión).
4. Evaluación de la lesión miocárdica y supervivencia
NOTA: La tinción con cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) marca el miocardio viable con un color rojo intenso, mientras que el tejido infartado o necrótico aparece beige tras la fijación con solución de Zamboni.
PRECAUCIÓN: El TTC generalmente se considera peligroso y requiere un manejo cuidadoso, ya que puede causar irritación leve de la piel, irritación grave de los ojos y es perjudicial si se inhala. Deseche los residuos y desechos de acuerdo con los requisitos de la autoridad local.
- Deje de perfundir 90 min después de la reperfusión e inmerja inmediatamente el corazón en KHB frío con hielo para detener la contracción cardíaca.
- Conecte la cánula a una jeringa de 3 mL precargada con solución de tinción de TTC (TTC al 1 % disuelto en PBS) mediante una llave de tres vías
- Infundir 1 mL de solución de TTC en el corazón, repetir la infusión tres veces y administrar un volumen total de 3 mL durante 15 min.
- Cubra el corazón con papel de tejido húmedo para evitar el secado de la superficie.
- Coloque el corazón en un tubo de centrífuga que contenga 3 mL de solución de TTC a 4 °C durante la noche
- Haga un bloque de tejido con compuesto de temperatura óptima para corte (OCT).
NOTA: El bloque de tejido puede almacenarse a −80 °C durante varios meses hasta su posterior análisis. - Monte el bloque de tejido en un portamuestras de criostato utilizando el compuesto OCT.
- Seccionar sucesivamente el corazón en criostato con un espesor de 50 µm y recoger cada 10th sección; generalmente se obtienen alrededor de 8 cortes de tejido por corazón.
- Alinee todos los 8 cortes sobre un portaobjetos de microscopio y séquelos con un secador de pelo durante 2–3 min.
- Sumerja los cortes en una cámara de tinción que contenga solución de Zamboni (un fijador que contiene 2% de paraformaldehído y 0,4% de ácido pícrico, p/v) durante la noche a 4 °C.
PRECAUCIÓN: El fijador de Zamboni puede provocar una reacción alérgica de la piel y se sospecha que causa defectos genéticos y carcinogénesis. Deseche los residuos y desechos de acuerdo con la normativa de las autoridades locales. - Lave las secciones 3 veces con PBS y cubra los cortes con medio de montaje.
NOTA: La muestra de corazón teñida con TTC puede almacenarse a temperatura ambiente durante varios meses. - Adquiera imágenes del corazón utilizando un microscopio óptico con un objetivo de 1,25x mediante el software CellSens.
- Para la cuantificación del tamaño del infarto, importe los archivos de imagen a la plataforma ImageJ.
- Desde el menú de ImageJ, seleccione Imagen -> Ajustar -> Umbral de color para abrir la ventana Umbral de Color (Figura 2B).
- Seleccione una pequeña región de interés (ROI) dentro de la sección del corazón y utilice el miocardio viable de color rojo oscuro y el tejido infartado/necrótico de color beige como referencias cromáticas.
- Haga clic en Muestra en el Umbral de color ajuste la ventana y refine el rango de saturación hasta que la región seleccionada coincida exactamente con el área de color objetivo.
- Haga clic en Selección delimitar el área correspondiente al color seleccionado.
- Desde el menú de ImageJ, seleccione Analizar -> MedirEl área de la región seleccionada, expresada en píxeles, se mostrará en la ventana de Resultados.
- Exporte los datos de medición a una hoja de cálculo de Excel para el cálculo del tamaño del infarto planimétrico.
- Para cuantificar el miocardio viable dentro de la región infartada, delinee la región de interés (ROI), principalmente en la pared ventricular anterior infartada, donde se inyectó la IL-6.
- Abrir el Administrador de ROI del menú de ImageJ y haga clic en Añadir para guardar la ROI seleccionada en la lista de ROI (Figura 2C).
- Utilice las funciones «Muestra» y «Selección» descritas anteriormente para delimitar el miocardio viable (rojo oscuro).
- Agregue el área viable seleccionada a la lista del "Administrador de ROI", luego seleccione Y para obtener la superposición entre la ROI y el miocardio viable.
- Mida el área de miocardio viable y calcule la tasa de supervivencia de los cardiomiocitos dentro de la ROI seleccionada.
NOTA: Los detalles metodológicos para la tinción con TTC y la cuantificación del tamaño del infarto ya han sido descritos previamente11.
Resultados
En la plataforma de IM ex vivo, se evaluaron dos protocolos isquémicos en el corazón aislado de ratón. La isquemia global, que se ha utilizado ampliamente en estudios de IM ex vivo, provocó una lesión isquémica heterogénea en todo el corazón. Mediante un enfoque de detección microscópica confiable y de alta resolución basado en el TTC12, se demostró que el miocardio auricular y la región apical eran relativamente resistentes a la isquemia y permanecían viables tras 45 minutos de isquemia global sin flujo (Figura 2A, panel superior). En contraste, el IM regional indujo una lesión isquémica localizada en el miocardio distal al sitio de ligadura de la ADA. Bajo estas condiciones, algunas porciones del miocardio subepicárdico permanecieron positivas al TTC, lo que indica la preservación de tejido viable (Figura 2A, panel inferior). Estos hallazgos revelan patrones distintos de supervivencia miocárdica entre los dos protocolos isquémicos.
Se investigó más a fondo la duración mínima de isquemia y reperfusión necesaria para inducir de manera confiable y reproducible un infarto de miocardio en el corazón de ratón aislado. La lesión miocárdica aumentó progresivamente a medida que se extendió la duración de la isquemia de 30 min a 120 min (Figura 3A). Notablemente, el tamaño del infarto se más que duplicó entre 30 min (n = 3) y 45 min (n = 5) de isquemia y aparentemente alcanzó una meseta al extenderse la duración isquémica a 60 min (n = 5), 90 min (n = 4) y 120 min (n = 3) (Figura 3B). Estos hallazgos indican que la viabilidad miocárdica es altamente sensible a la duración de la isquemia más allá de los 30 min. En comparación con el modelo de infarto de miocardio in vivo (ivMI, n = 5), el modelo de infarto de miocardio ex vivo (evMI, n = 8) produjo tamaños de infarto casi idénticos bajo duraciones isquémicas y de reperfusión comparables (36,88% ± 3,91% frente a 37,8% ± 2,17%, p = 0,27), lo que sugiere que la lesión miocárdica no se vio sustancialmente afectada por la perfusión con cristaloides. Sin embargo, los corazones evMI presentaron paredes ventriculares más gruesas y una luz ventricular reducida, probablemente debido al edema miocárdico asociado con la perfusión con cristaloides (Figura 3C).
Aprovechando el entorno relativamente controlado, libre de influencias extracardíacas, se evaluaron los efectos cardioprotectores de la administración intramiocárdica de IL-6. En corazones control tratados con PBS, se detectaron cardiomiocitos viables dispersos pero medibles (CMs viables; rojo intenso) dentro de la región infartada/necrótica (beige), incluso después de 45 minutos de isquemia (Figura 4; 1,05% ± 0,44%, EE, n = 4). Destacablemente, la administración intramiocárdica de IL-6 (i.m.; flechas) aumentó significativamente la cantidad de CMs viables, que se localizaron predominantemente alrededor del sitio de inyección dentro de la región de interés (ROI; 4,08% ± 0,99%, EE, n = 6; p = 0,005, prueba t de Student). Estos hallazgos sugieren que la IL-6 podría mejorar la supervivencia de los cardiomiocitos tras una lesión isquémica.
Finalmente, el modelo actual de IM ex vivo tiene varias dificultades potenciales que pueden afectar la reproducibilidad de los resultados experimentales. Como se muestra en la Figura 5, el deslizamiento de la ligadura puede provocar una oclusión inadecuada de la ADA y una supervivencia miocárdica extensa (4/168), y, al mismo tiempo, puede producirse una reperfusión incompleta cuando se dañan ramas de la ADA (12/168). Además, la embolización aérea durante la cánulación aórtica también puede causar lesión miocárdica (flechas, 7/168), lo que dificulta distinguir la lesión isquémica de la lesión embólica para su cuantificación. Finalmente, puede ocurrir una tinción inadecuada con TTC cuando el corazón se perfunde en exceso (11/168), lo que dificulta considerablemente la delimitación del área de infarto.
Figura 1: Esquema del montaje experimental. El sistema Langendorff de presión constante impulsado por gravedad y no recirculante fue diseñado para suministrar un tampón de Krebs-Henseleit (KHB) rico en nutrientes y oxigenado a una presión hidrostática constante de 110 cmH₂O₂O. KHB se calentó previamente por primera vez a 37 °C en un depósito y se dirige hacia una columna de presión con camisa de agua, donde se mantiene una presión hidrostática constante de 110 cmH₂O2O se mantuvo mediante un regulador de presión. El corazón perfundido se sumergió en un baño de órganos con camisa de agua y altura ajustable para mantener una temperatura constante de 37 °C durante todo el período experimental (A). El infarto de miocardio se indujo mediante la ligadura transitoria de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD), tras el arresto cardiopléjico sobre una almohadilla de algodón dentro de un recipiente metálico previamente enfriado (B). El procedimiento se realizó bajo un microscopio estereoscópico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Infarto miocárdico (IM) regional frente a global y determinación del tamaño del infarto. El IM global induce una lesión isquémica en todo el corazón, como se indica por la tinción amarilla en las imágenes microscópicas con TTC. El miocardio auricular y la región apical parecieron ser más resistentes a la isquemia y permanecieron viables tras 45 min de isquemia global sin flujo (panel superior en A). El IM regional induce una lesión isquémica en el miocardio distal al sitio de ligadura de la arteria descendente anterior (LAD). En este caso, algunas porciones del miocardio subepicárdico presentan tinción roja, lo que sugiere la preservación de tejido viable (panel inferior en A). El tamaño del infarto se cuantificó utilizando ImageJ, delimitando el área infartada/necrótica y el miocardio viable según sus colores de tinción distintos (B). La supervivencia de los cardiomiocitos dentro de la región de interés (ROI) se calculó determinando el porcentaje de tinción intensamente roja en la ROI seleccionada (C). Barras de escala: 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Impacto de la duración de la isquemia en el tamaño del infarto. La lesión miocárdica empeoró progresivamente a medida que la duración de la isquemia se extendió de 30 min a 120 min (A). El tamaño del infarto más que se duplicó entre los 30 min (n = 3) y los 45 min (n = 5) de isquemia y aparentemente alcanzó una meseta al prolongar la duración isquémica hasta 60 min (n = 5), 90 min (n = 4) y 120 min (n = 3) (B). En comparación con el in vivo modelo de IM (IMiv, n = 5), el ex vivo MI (evMI, n = 8) produjo tamaños de infarto casi idénticos bajo duraciones isquémicas comparables (36,88 %) ± 3.91% vs. 37.8% ± 2.17%, p = 0,27, prueba t de Student t-Prueba). Los corazones evMI presentaron una pared ventricular más gruesa y un lumen ventricular reducido, probablemente debido al edema miocárdico asociado con la perfusión con cristaloides (C). Las barras de error representan la desviación estándar de la media (DEM). Barras de escala: 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: La IL-6 mejoró la supervivencia de los cardiomiocitos tras una lesión isquémica. La administración intramiocárdica (i.m.) de IL-6 en el modelo de evMI produjo un número medible de cardiomiocitos viables (CMs viables; rojo intenso) dentro de la región infartada/necrótica (beige), localizados principalmente alrededor del sitio de inyección de IL-6 (flechas, panel izquierdo). La cuantificación de los CMs viables dentro de la región de interés (ROI, indicada por líneas discontinuas) reveló que la inyección de PBS dio como resultado solo una pequeña fracción de miocardio viable (1,05 % ± 0,44 %, EE, n = 4), mientras que la inyección de IL-6 aumentó significativamente la cantidad de CMs viables dentro de la ROI (4,08 % ± 0,99 %, EE, n = 6; p = 0,005, prueba t de Student). Las barras de error representan la desviación estándar de la media (DME). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Resultados insatisfactorios o fallidos causados por fallos técnicos. Como se ilustra mediante la lesión miocárdica representativa en el modelo de IAM ex vivo (izquierda), el miocardio viable y el necrótico generalmente pueden distinguirse claramente en la tinción típica con TTC. Sin embargo, varios fallos técnicos pueden dar lugar a resultados insatisfactorios o no interpretables. Una ligadura inadecuada de la AD puede deberse al deslizamiento de la sutura y provocar una supervivencia miocárdica extensa a pesar de una isquemia prolongada. Una reperfusión incompleta puede ocurrir cuando las ramas de la AD se dañan durante la ligadura y posteriormente quedan mal perfundidas, produciendo un patrón que se asemeja al fenómeno de “no reflujo” observado clínicamente. Tales regiones pueden presentar una coloración rosada (flechas). La embolización microvascular por burbujas de aire que ingresan a la circulación coronaria durante el procedimiento de canulación también puede causar lesión miocárdica (flechas), dificultando la diferenciación entre lesión isquémica y lesión embólica para su cuantificación. Finalmente, puede ocurrir una tinción inadecuada con TTC cuando el corazón se perfunde en exceso, lo cual puede provocar lesión miocárdica independiente de la isquemia. Barras de escala: 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
| Pico F (n = 19) | Estacionario F (n = 19) | Pico RF (n = 19) | Estacionario RF (n = 19) | |
| Medias (mL/min) | 2.54 | 0.78 | 2 | 0.99 |
| DE | 0.59 | 0.29 | 0.56 | 0.53 |
Tabla 1: Flujo coronario en los niveles máximos (F-pico) y de estado estacionario (F-estable) durante la isquemia y la reperfusión (RF-pico y RF-estable).
Discusión
El modelo actual de IAM ex vivo se basa principalmente en sofisticados sistemas cardíacos perfundidos mediante la técnica de Langendorff2. Una dificultad común durante la preparación es la introducción de burbujas de aire en la circulación coronaria, lo cual puede provocar lesión embólica y dificultar la evaluación de la lesión isquémica. Para prevenir este problema, es esencial una inspección minuciosa del sistema de perfusión inmediatamente antes de cada experimento. Si quedan atrapadas burbujas de aire pequeñas dentro del sistema de tubos, una perfusión retrógrada con KHB para desplazar las burbujas de regreso hacia la columna de presión puede ayudar a resolver el problema.
El paso fundamental de este protocolo es la ligadura de la arteria coronaria descendente anterior (LAD). En primer lugar, por lo tanto, es fundamental la identificación visual precisa de la LAD. En la mayoría de los casos, los vasos coronarios se vuelven translúcidos después de que el corazón se lava con PBS frío, lo que hace que la LAD sea claramente distinguible del miocardio circundante. Además, una técnica de ligadura adecuada y hábil es igualmente importante, ya que una tensión excesiva en la sutura de polipropileno 8-0 podría seccionar la LAD, haciendo imposible la posterior reperfusión. Para minimizar este riesgo, se debe colocar una férula blanda de tamaño adecuado entre la sutura y el vaso para distribuir la fuerza de ligadura y proteger la arteria coronaria de lesiones mecánicas. No obstante, la lesión miocárdica inducida por la ligadura es inevitable en menor medida, pero generalmente no compromete la perfusión coronaria ni afecta el resultado del experimento. Finalmente, dado que la lesión miocárdica es altamente sensible a la temperatura13, es críticamente importante mantener una temperatura constante durante todo el experimento. Particularmente bajo condiciones de perfusión a presión constante, es probable que ocurra pérdida de calor entre la columna de perfusión y el corazón, lo cual varía dinámicamente según el flujo coronario14. Por lo tanto, las fluctuaciones podrían provocar cambios en la temperatura miocárdica. En este contexto, es muy recomendable utilizar un baño de órganos con camisa de agua para mantener condiciones térmicas estables (Figura 1A).
Una vez superados estos desafíos técnicos, el modelo de IAM ex vivo proporciona una plataforma confiable y reproducible para inducir lesión miocárdica en el corazón aislado de ratón (Figura 3A). Por lo tanto, representa un sistema experimental valioso para investigar la supervivencia miocárdica post-IAM, evaluar intervenciones terapéuticas administradas localmente y realizar imágenes de alta resolución sin interferencias por movimiento respiratorio o cardíaco. Aunque el protocolo de IAM global es técnicamente sencillo y ha sido ampliamente utilizado en estudios previos4, su limitación principal es que la duración de la isquemia global generalmente se limita a menos de 45 min3. En consecuencia, a diferencia del modelo de IAM regional, rara vez produce una infartación transmural (Figura 2).
Una característica única del modelo de IM ex vivo es la ausencia de influencias sistémicas, incluyendo la regulación neural y los componentes circulantes de la sangre, lo que permite a los investigadores evaluar los efectos locales directos de las intervenciones terapéuticas sobre el miocardio8. Esto es particularmente relevante para citocinas como la IL-6 y la señalización downstream PI3K/AKT, que se ha demostrado que son cardioprotectoras en cardiomiocitos aislados15. In vivo, sin embargo, los efectos cardíacos de la IL-6 suelen ser inconsistentes o incluso contradictorios porque la IL-6 activa simultáneamente células inmunitarias y promueve respuestas inflamatorias que pueden contrarrestar sus acciones cardioprotectoras directas16. En consonancia con este concepto, nuestro modelo ex vivo demostró convincentemente que la administración intramiocárdica local de IL-6 preservó significativamente la viabilidad miocárdica tras una lesión isquémica17,18, lo que respalda un efecto cardioprotector directo de la IL-6 sobre los cardiomiocitos (Figura 4).
Reconocemos varias limitaciones del presente modelo ex vivo de IM. En la configuración actual, la función contráctil cardíaca no fue evaluada en el presente protocolo.3. Esto se debió a que el objetivo principal era caracterizar la supervivencia del miocardio en un modelo de infarto regional, y a que la disfunción contráctil refleja un deterioro funcional tras la lesión isquémica, pero no necesariamente indica la muerte de los cardiomiocitos8. Además, el ex vivo El modelo de IM excluye inherentemente los componentes sanguíneos circulantes, las células inmunitarias y las influencias neurohumorales que pueden contribuir sustancialmente a la progresión del IM y al remodelado cardíaco. in vivo. Aunque esta reducción en la complejidad sistémica es una ventaja importante del ex vivo modelo de IM, también limita su uso amplio para imitar las respuestas inflamatorias, vasculares, neuronales y endocrinas que pueden ocurrir in vivoFinalmente, se encontró que la perfusión con cristaloides se asociaba con edema miocárdico, evidenciado por un aumento en el grosor de la pared ventricular y una reducción de la luz ventricular en comparación con in vivo corazones con IM. La notoria aparición de edema puede alterar la arquitectura miocárdica, la difusión tisular y potencialmente la viabilidad celular. Por lo tanto, el presente modelo debe considerarse como una plataforma controlada para investigar lesiones miocárdicas y mecanismos específicos de los cardiomiocitos.
Sin embargo, el modelo de IM ex vivo descrito aquí es una plataforma sencilla y rentable para evaluar la supervivencia miocárdica en ausencia de influencias regulatorias extrínsecas. Dado el uso creciente de modelos de ratones modificados genéticamente, este enfoque podría ser particularmente valioso para investigar mecanismos cardioprotectores mediante técnicas avanzadas de imagen, grabación electrofisiológica y análisis moleculares. Además, el modelo podría adaptarse para probar sistemáticamente intervenciones farmacológicas localizadas o basadas en genes, y para desentrañar mecanismos específicos de los cardiomiocitos sin factores de confusión sistémicos. Por lo tanto, el modelo de IM ex vivo proporciona una plataforma experimental complementaria que facilita la identificación y el estudio mecanicista de vías cardioprotectoras.
Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen conflictos de interés. Los autores declaran que no se utilizaron herramientas de inteligencia artificial (IA) ni tecnologías asistidas por IA generativa en la redacción, el análisis de datos, la generación de figuras ni la validación de este trabajo.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por el Proyecto General de la Sociedad Jiangsu de Geriatría (JGS2026MS019 para WO), la Fundación de Desarrollo Social del Departamento de Ciencia y Tecnología de la Ciudad de Zhenjiang (números de beca SH2023023 para H.Z. y SH2023057 para X.L.), el Programa FoKo (número de beca 23/2013 para ZD) y el Instituto de Investigación Cardiovascular de Düsseldorf (CARID).
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio | Milipore | 1.08380.0100 | Productos químicos |
| Cánula aórtica | BD | 305895 (20 G) | Retroperfusión |
| Aquamount | BDH | 362262H | Sección por criomicrotomía |
| Balanza | Ohaus | - | Pesado de productos químicos |
| Pinzas grandes | AESCULAP | - | Instrumentos quirúrgicos |
| Analizadores de gases sanguíneos | Radiometer | ABL90 FLEX PLUS | Analizador de gases |
| Cloruro de calcio dihidrato | Fluka | 21097 | Productos químicos |
| Carbógeno | Linde | 4040152 | Aparato de Langendorff |
| CellSens | Olympus | Version 3.1.1 | Software de imagen |
| Algodones | BEESana | PZN-1330900 | Instrumentos quirúrgicos |
| Cubreobjetos | Epredia | BB02400500A113MN20 | Sección por criomicrotomía |
| Criostato | Leica | M850 | Sección por criomicrotomía |
| D(+)-Glucosa anhidra | Merck | 8337.1000 | Productos químicos |
| Agua doblemente destilada | Milipore | - | Disolución de productos químicos |
| Ethanol (100%) | Merck | 64-17-5 | Limpieza de tubos |
| Ethanol (70%) | VWR | UN1170 | Limpieza de tubos |
| Membrana de filtro (0.2 µm) | Thermo Scientific | 8-000-230511 | Aparato de Langendorff |
| Flujómetro | Transonic | T4S410 | Aparato de Langendorff |
| Portaobjetos de vidrio | Engelbrecht | 11102 | Sección por criomicrotomía |
| Columna de agua de vidrio | Hecho en casa | - | Aparato de Langendorff |
| Ácido clorhídrico | Roth | P074.1 | Productos químicos |
| ImageJ | NIH | version 1.54g | Software |
| Interleucina-6 | Biolegend | 570804 | Productos químicos |
| Isoflurano | Piramal | 14150097146754 | Productos químicos |
| Microscopio óptico | Olympus | BX61 | Imagen |
| Sulfato de magnesio heptahidratado | Merck | 5886.1000 | Productos químicos |
| Probador de flujo médico | Transonic | 3PXN | Aparato de Langendorff |
| Bandeja metálica | Hecho en casa | - | Instrumentos quirúrgicos |
| Jeringa Micro-Fine | BD | 30G / 0.3 mL | Aparato de Langendorff |
| Ratón | Janvier | C57BL/6J | Animales |
| Objetivo (x 1.25) | Olympus | PlanApo 1.25X/0.04 | Imagen |
| Compuesto OCT | Sakura | 4583 | Productos químicos |
| Placa de Petri | Thermo Scientific | 172931 | Aparato de Langendorff |
| Solución salina tamponada con fosfato | Roth | 9143.1 | Productos químicos |
| Cloruro de potasio | Merck | 4936.1000 | Productos químicos |
| Fosfato dihidrógeno de potasio | Merck | 4873.1000 | Productos químicos |
| Hilo de sutura de seda | F.S.T | 18020-60 | Instrumentos quirúrgicos |
| Cloruro de sodio | Sigmaaldrich | SZBD0810V | Productos químicos |
| Bicarbonato de sodio | Roth | 6885.2 | Productos químicos |
| Piruvato de sodio | Sigmaaldrich | 113-24-6 | Productos químicos |
| Compresa suave | Deknatel | L-705 | Instrumentos quirúrgicos |
| Pinzas de acero inoxidable (8 mm) | F.S.T | 11052-10 | Instrumentos quirúrgicos |
| Tijeras de acero inoxidable | AESCULAP | BC702R | Instrumentos quirúrgicos |
| Tijeras de acero inoxidable | AESCULAP | BC257R | Instrumentos quirúrgicos |
| Stereo microscopio | Leica | MZ6 | Instrumentos quirúrgicos |
| Sutura (8-0) | Ethicon | TG-108 | Instrumentos quirúrgicos |
| Jeringa (3 mL) | B. Braun | 4617100V | Retroperfusión |
| Llave de tres vías | B. Braun | 16494C | Retroperfusión |
| Tubo | Tygon | T3304-23 | Aparato de Langendorff |
| Baño de agua | HAAKE | DC1/B3 | Aparato de Langendorff |
| Solución de Zamboni | Morphisto | 12773.0050 | Productos químicos |
Referencias
- Pendexter CA, et al. Modified Langendorff perfusion method for extended perfusion times of rodent cardiac grafts. J Vis Exp. 2024;(208):66815.
- Bell RM, Mocanu MM, Yellon DM. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. J Mol Cell Cardiol. 2011;50(6):940-950.
- Rossello X, Hall AR, Bell RM, Yellon DM. Characterization of the Langendorff perfused isolated mouse heart model of global ischemia-reperfusion injury: impact of ischemia and reperfusion length on infarct size and LDH release. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2016;21(3):286-295.
- Yang T, et al. Isolated perfused hearts for cardiovascular research: an old dog with new tricks. J Cardiovasc Transl Res. 2024;17(5):1207-1217.
- Martin TP, et al. Preclinical models of myocardial infarction: from mechanism to translation. Br J Pharmacol. 2022;179(5):770-791.
- Hurt CM, et al. Transient receptor potential vanilloid 1 regulates mitochondrial membrane potential and myocardial reperfusion injury. J Am Heart Assoc. 2016;5(9):3774.
- Herr DJ, Aune SE, Menick DR. Induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in Langendorff-perfused rat hearts. J Vis Exp. 2015;(101):52908.
- Lindsey ML, et al. Guidelines for experimental models of myocardial ischemia and infarction. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2018;314(4):H812-H838.
- Zhu H, et al. Sfrp1 as a pivotal paracrine factor in the trained pericardial stem cells that foster reparative activity. Stem Cells Transl Med. 2023;12(12):137-150.
- Ouyang W, et al. An immunostaining-based approach for assessing myocardial viability in the infarcted mouse hearts. Front Cardiovasc Med. 2025;12:1598314.
- Ding Z, Zhang H, Bouvain P, Ding Z, Flögel U. A microscopic 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride assay for accurate and reliable analysis of myocardial injury. J Vis Exp. 2025;(225):68596.
- Ding Z, et al. A refined TTC assay precisely detects cardiac injury and cellular viability in the infarcted mouse heart. Sci Rep. 2024;14(1):25214.
- El Farissi M, et al. Hypothermia for reduction of myocardial reperfusion injury in acute myocardial infarction: closing the translational gap. Circ Cardiovasc Interv. 2021;14(8):010326.
- Ding Z, Gödecke A, Schrader J. Contribution of cytochrome P450 metabolites to bradykinin-induced vasodilation in endothelial NO synthase deficient mouse hearts. Br J Pharmacol. 2002;135(3):631-638.
- Smart N, et al. IL-6 induces PI 3-kinase and nitric oxide-dependent protection and preserves mitochondrial function in cardiomyocytes. Cardiovasc Res. 2006;69(1):164-177.
- Broch K, et al. Randomized trial of interleukin-6 receptor inhibition in patients with acute ST-segment elevation myocardial infarction. J Am Coll Cardiol. 2021;77(15):1845-1855.
- Fontes JA, Rose NR, Čiháková D. The varying faces of IL-6: from cardiac protection to cardiac failure. Cytokine. 2015;74(1):62-68.
- Preda A, et al. IL-6 in the spotlight: from cardiovascular pathophysiology to therapy. Eur J Clin Invest. 2026;56(1):e70161.
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