Aislamiento y análisis de las células madre hematopoyéticas de la placenta

Resumen

Hemos identificado la placenta como un órgano principal hematopoyéticas durante el desarrollo. Encontramos que las células madre hematopoyéticas (HSC), son generados y ampliado en la placenta en el único nichos microambientales. A continuación, describimos las técnicas experimentales necesarias para el aislamiento y la visualización de la CMH en la placenta del ratón.

Resumen

Las células madre hematopoyéticas (HSC) tienen la capacidad de auto-renovación y generar todos los tipos celulares de los linajes de sangre durante toda la vida de un individuo. Todos los HSCs surgir durante el desarrollo embrionario, después de que su tamaño de la agrupación se mantiene gracias a la auto-renovación de las divisiones celulares. Identificar el origen anatómico de las CMH y los acontecimientos de desarrollo fundamental que regula el proceso de desarrollo de HSC se ha complicado ya que muchos sitios anatómicos participar durante la hematopoyesis fetal. Recientemente, hemos identificado la placenta como un órgano principal hematopoyéticas en HSCs se generan y se amplió en exclusiva nichos microambientales (Gekas, et al 2005, Rodas, et al 2008). En consecuencia, la placenta es una fuente importante de HSC durante su surgimiento y la expansión inicial.

En este artículo se muestran las técnicas de disección para el aislamiento de los murinos placenta de E10.5 E12.5 y embriones, correspondientes a las etapas de desarrollo de la iniciación de las CMH y el pico en el tamaño de la piscina HSC en la placenta, respectivamente. Además, presentamos un protocolo optimizado para la disociación enzimática y mecánica de tejido de la placenta en una sola célula de suspensión para su uso en citometría de flujo o ensayos funcionales. Hemos encontrado que el uso de colagenasa por una sola célula de suspensión de la placenta produce rendimientos suficientes de las CMH. Un factor importante que afecta el rendimiento HSC de la placenta es el grado de disociación mecánica antes, y la duración de, tratamiento enzimático.

Disponemos también de un protocolo para la preparación de las secciones fijas congeladas de tejido placentario para la visualización del desarrollo de HSC por inmunohistoquímica en sus nichos celulares precisos. Como hematopoyéticas antígenos específicos no se conservan durante la preparación de las secciones incluidas en parafina, que utilizan habitualmente fija las secciones congeladas para la localización de la placenta y HSCs progenitores.

Protocolo

1. La eliminación del embrión y la placenta disección

1. Para empezar, los embriones debe ser aislado de las presas embarazadas.
2. Los animales son sacrificados de acuerdo con los procedimientos aprobados - en nuestro caso vamos a usar una dosis letal del anestésico isoflurano
3. En primer lugar, rocíe el vientre con etanol y hacer una pequeña incisión con un par de tijeras.
4. Arranca la piel con las dos manos para descubrir el abdomen y se abre el peritoneo.
5. Con unas pinzas, recoja los cuernos uterinos y recogerlos con unas tijeras en cada extremo distal. Colocar los cuernos uterinos en una placa de Petri llena de PBS y el lugar en el hielo. También, recuerde lavar varias veces con PBS antes de aislar a la placenta. Ahora podemos aislar de la placenta.
6. Con dos pinzas, comience cuidadosamente pelar el tejido endometrial que rodea el embrión conceptuses. Hay que tener cuidado de no perforar o no causar daños estructurales a los embriones, ya que esto va a complicar la disección de los pasos posteriores.
7. Coloque el conceptuses aislado en una nueva placa de Petri con PBS en hielo y continuará hasta que todos conceptuses han sido liberados a partir del endometrio.
8. La transferencia de un embrión de una nueva placa de Petri con PBS colocado bajo el microscopio y con dos pinzas de pelar la decidua lejos de la placenta. Eliminar la mayor cantidad de la decidua posible, ya que las células de la decidua puede interferir con una sola suspensión celular y citometría de flujo. Un suave movimiento continuo peeling se recomienda para lograr los mejores resultados.
9. Corte el saco vitelino de distancia de la placenta en el cruce entre los dos órganos y tire del saco vitelino y los vasos vitelino fuera de la placenta. Se debe tener cuidado de no alterar la placa coriónica de la placenta, especialmente con los embriones tempranos.
10. Cuidadosamente la celebración de la placa coriónica de la placenta con un par de pinzas y el cordón umbilical con otro, tirar el cordón umbilical y el embrión conectado fuera de la placenta.
11. Retire el exceso de tejido de células gigantes en los bordes de la placenta con el fin de minimizar la célula aglutinación durante la preparación de una sola célula de la suspensión.
12. Recoger la placenta en un recipiente adecuado, como por ejemplo un tubo Falcon de 15 ml, con PBS 5% de FCS y sobre hielo. Hacer esto para todas las placentas disecados.
13. En este punto, usted puede proceder con la preparación de una suspensión de una sola célula de la citometría de flujo, ensayos funcionales, tales como el cultivo in vitro o el trasplante, o preparar la placenta entera para la fijación del tejido y de bloque fijo congelados incorporación eventual de inmunohistoquímica.

2. Preparación de una sola célula de suspensión de tejido de la placenta

1. A continuación se muestra cómo generar una única suspensión de células de la placenta para el análisis de FACS.
2. Para preparar una suspensión de células individuales de la placenta, mecánica y la disociación enzimática es necesario. En primer lugar preparar una solución de colagenasa 0,1% en PBS con 10% de FCS y 1% de solución de penicilina / estreptomicina.
3. Añadir un volumen adecuado de solución de colagenasa a las placentas, dependiendo de la cantidad que usted tiene. Un volumen que es el doble del volumen de la placenta y entre 2 y 5 ml se recomienda.
4. Use una aguja de 16 G montado en una jeringa de 5 ml para romper mecánicamente el tejido de pases de la solución de colagenasa y la placenta a través de la aguja de 3 veces. Repita el procedimiento con una aguja 18-G.
5. Colocar la muestra en un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora durante 45 minutos.
6. Después de la incubación de 45 minutos en la colagenasa, la aprobación de la solución de células a través de una aguja de 20 G, y se incuba durante 45 minutos, en 37 ° C.
7. Después de la incubación total de 1,5 horas en la colagenasa, la aprobación de la solución de células a través de 22 G y las agujas 25-G 3 veces con cada aguja.
8. Filtrar la muestra a través de un filtro de 50 micras, unido a una nueva de 15 ml tubo Falcon, lavar con PBS 5% de FCS y se centrifuga a 4 ° C durante 5 minutos a 300 x g.
9. En este punto, tenemos una suspensión de células individuales para el análisis de FACS o ensayos funcionales.

3. La fijación del tejido de las secciones congeladas

1. Inmediatamente después de aislar a la placenta de cada embrión, que se colocan en frío PBS 1X. Por lo general, una placa de 96 pozos que funciona mejor para placentas jóvenes (E8.5-11.5), pero con mayores placentas, E12.5 y mayores, una placa de 24 y puede ser más conveniente.
2. Cada placenta se transfiere a un nuevo pozo lleno de recién descongelado 4% paraformaldahyde o PFA. Para el E12.5 placentas, el tejido se trasladó a un nuevo pozo a mano, pero para el E10.5 puede quitar la PBS cuidadosamente con una pipeta y se añade la PFA. Es importante que la placenta está totalmente sumergida durante 2-4 horas a 4 ° C, dependiendo de la edad y el tamaño de los tejidos.
3. La transferencia de los tejidos en 30% de sacarosa, o si los tejidos son muy pequeños y frágiles, aspirar la PFA y añadir la sacarosa directamente. En esta etapa, las placentas estarán flotando en la solución. Deje que los tejidos pasar la noche a 4 ° C.
4. Después del paso de la noche en el 30% de sacarosa, en última instancia, los tejidos deben hundirse hasta el fondo del pozo, lo que indica la criopreservación adecuada. Eliminar la mitad de la solución de sacarosa y reemplazar el volumen de octubre y el lugar del tejido de vuelta en 4 ° C durante 1-2 horas. Esto facilita la penetración de octubre
5. La transferencia de los tejidos de 100% octubre durante 1 hora, después de lo cual puede ser embebido.

4. Incorporación de los tejidos fijados

1. Etiqueta de moldes de plástico con la identificación de tejido apropiado (molde mostrar ejemplo).
2. Tire el tejido de la solución de octubre y reducir a la mitad de la placenta mediante la orientación de la placenta en forma de disco con el lado del cordón umbilical hacia abajo y cortar cuidadosamente con una cuchilla de afeitar limpia, asegurándose de mover la hoja de ida y vuelta antes de liberar la presión para asegurar un corte parejo. La placenta se reduce a la mitad para conseguir el mejor prientation para visualizar más tarde, el HSCs la placenta.
3. Coloque una placenta media en el fondo del molde con el borde del corte en contacto con la superficie del fondo del molde. Repita el procedimiento con un nuevo molde para la otra mitad. Por E10.5 placentas, las dos mitades se pueden colocar en el mismo molde con la misma técnica.
4. Cuando se vierte en el molde de octubre, puede ser difícil mantener la placenta en la orientación correcta. Asegurar la placenta en su lugar mediante la celebración de la segunda mitad del tejido con una pinza. Verter lentamente la solución octubre en el molde y evitar la producción de las burbujas. Por E10.5 placentas, mantenga la mitad del tejido con las pinzas y el resto de la mitad de otro tejido contra el exterior de la pinza. Verter lentamente la solución octubre como se describe para E12.5 placentas.
5. Una vez que el molde está lleno de octubre, rápidamente coloque el molde sobre el hielo seco, la OCT a su vez, un flash para congelar el tejido
6. Coloque el molde en una pequeña bolsa de plástico que contiene Drierite e inmediatamente guarde en el congelador de -80 º C.

Discusión

Los procedimientos experimentales descritos en este protocolo permitirá que para el aislamiento y la visualización de tejido de la placenta y la madre hematopoyéticas y las células progenitoras. Para un resumen completo sobre el rendimiento esperado y el número de celular de las CMH en la placenta y otros órganos hematopoyéticos fetal durante el desarrollo fetal que se refieren a Gekas, et al. 2005. Para la localización de las CMH en desarrollo y otras células hematopoyéticas de la placenta que se refieren a Rodas, et al. 2008.

Materiales

Lista de Materiales:
La glucosa 100 mM
10 mM NaN3
15 ml tubos cónicos (BD)
16-G, 18 G, 20 G, 22 G y 25-G agujas (BD)
30% de sacarosa solución
35 mm placas de Petri (BD)
Paraformaldehído al 4%
50 - m filtros celular (Celltrics)
Jeringas de 5 ml (BD)
Fosfatasa alcalina sustrato Kit I (Vector Rojo, Vector)
Fosfatasa alcalina sustrato Kit III (Blue Vector, Vector)
Antibióticos (penicilina / estreptomicina, P / S) solución
Colagenasa tipo I (Sigma)
Cryomold Moldes desechables de vinilo de la muestra (10 mm x 10 mm x 5 mm, Tissue-Tek)
Citoqueratina primaria de anticuerpos (DakoCytomation)
Pinzas de disección, de acero inoxidable o de titanio, el número 5 o 55
Drierite
De suero fetal bovino (FBS)
Fisherbrand plástico portaobjetos del microscopio Mailer (Fisher)
Glucosa oxidasa 1000u/ml
Levamisol (Vector)
Montaje de los medios de comunicación, de base acuosa medio de montaje (VectamountTM AQ)
Suero normal de caballo (Vector)
La temperatura óptima de corte (octubre, Tissue-Tek)
Kit de sustrato de peroxidasa DAB (Vector)
Tampón fosfato salino (PBS) con calcio / magnesio (w Ca2 + / Mg2 +)
Tampón fosfato salino (PBS) sin calcio / magnesio (w / o Ca2 + / Mg2 +)
Caja de diapositivas de plástico (capacidad para 100 diapositivas)
Tubería de plástico (Nalgene 180 PVC no tóxico autoclave)
Polipropileno de fondo redondo de tubo de ensayo, 5 ml (12x75 mm, BD Falcon)
Proteinasa K 20mg/ml solución (Amresco)
Investigación de Productos International Corp Súper Pluma de Papanicolaou HT * Marcadores de diapositivas (2,5 mm, Fisher)
De cultivo de tejidos tratados en forma de U (de fondo redondo) placas de 96 pozos, o bien 24 (BD Falcon)
Tween 20, SigmaUltra (Sigma)
Kit de amplificación tiramida (Invitrogen)
Vectastain ABC de fosfatasa alcalina Standard Kit (Vector)
Vectastain ABC Kit estándar Elite (Vector)