Artículo de método

De células enteras grabaciones de la Luz evocados excitatorios de las corrientes sinápticas en la porción de retina

DOI:

10.3791/771

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2 de julio de 2008

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1Program in Neuroscience, Boston University, 2Department of Biology, Boston University, 3Department of Biomedical Engineering, Boston University

En este artículo

Resumen

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Este vídeo muestra el proceso de células enteras grabaciones pinza de voltaje en la porción de retina de la salamandra tigre acuático. Se demuestra la preparación de la corte, así como la forma de realizar grabaciones de patch clamp durante la estimulación visual de la retina.

Resumen

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Utilizamos la técnica de patch clamp de célula entera para estudiar los circuitos sinápticos que subyace en el procesamiento de información visual en la retina. En este vídeo, le guía a través del proceso de desarrollo de células enteras grabaciones de la luz corrientes evocadas de células individuales en la preparación rebanada de la retina. Usamos el medio ambiente acuático salamandra tigre como un modelo animal. Comenzamos con la descripción de la disección de los ojos y mostrar cómo se montan las rebanadas de registros electrofisiológicos. Una vez que el corte se coloca en la cámara de grabación, que muestran cómo realizar grabaciones de células enteras de fijación de voltaje. A continuación, los proyectos de estímulos visuales en los fotorreceptores en el corte de luz para obtener respuestas evocadas actual. Durante la grabación que perfundir en el sector con agentes farmacológicos, por un sistema de perfusión de 8 canales que nos permite cambiar rápidamente entre los diferentes agentes. La preparación rebanada de retina es ampliamente utilizado para las grabaciones de patch clamp en la retina, en particular para estudiar amacrinas o células bipolares, que no son accesibles en una preparación de todo el montaje.

Protocolo

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Soluciones

  • Solución intracelular de las células ganglionares (en mM): 100 K-gluconato, 8 KCl, 1 MgCl 2, 1 EGTA, 10 HEPES, 4 ATP, GTP 0,5, 90 mM sulforodamina B (para la tinción), ajustada a pH = 7,4 con KOH
  • Solución intracelular de las células bipolares (en mm): 90 K-gluconato, 8 KCl, 1 MgCl 2, 10 BAPTA, 10 HEPES, 4 ATP, GTP 0,5, 90 mM sulforodamina B (para la tinción), ajustada a pH = 7,4 con KOH
  • Ringer extracelular de solución (en mM): 112 NaCl, 5 de glucosa, HEPES 5, 2 KCl, CaCl2 2, 1 MgCl 2, ajustada a pH = 7,75 con NaOH. La oxigenación de la solución, no es necesario.

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Discusión

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Beneficios:

  1. Todos los tipos de células son accesibles
  2. Fácil identificación de los tipos de células, en particular si un tinte fluorescente se añade a la solución de electrodos
  3. Agentes farmacológicos pueden llegar fácilmente a las células diana
  4. La técnica de patch clamp permite investigar el papel de los diferentes canales iónicos en los cálculos de la retina. La misma información no se puede obtener a través de grabaciones extracelulares pico o grabaciones con electrodos afilados........

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Multiclamp 700AAmplificador de parche de membranaMolecular Devices
SZX9Micróscopio de disecciónOlympus Corporation
BX50WIMicróscopio verticalOlympus CorporationEquipado con objetivos de inmersión en agua de 40x y 10x, filtros fluorescentes y lámpara de mercurio
P-97Extractor de micropipetasSutter Instrument Co.
LucividInyector de imagen para microscopioMBF Bioscience
Sistema de perfusión de 8 canalesMicroperfusiónParker Hannifin Corporation
Bits++Procesador de video digitalCambridge Research Systems
Oculares infrarrojosOtrosITT Visual Information Solutions
Recipiente adhesivo de siliconaOtrosMolecular Probes, Life Technologies20 mm de diámetro, 1,0 mm de profundidad
Filtros de membranaFiltroEMD MilliporeHAWPO1300.45μm HA
Capilares de vidrio borosilicatadoVidrio para electrodosWorld Precision Instruments, Inc.1B150-4
Filtros de jeringaFiltroWhatman, GE Healthcare6789-0402Filtros de 4 mm, membrana de nailon de .2 µm, carcasa de polipropileno
Cámara de infrarrojosCámara montada en microscopioSony CorporationSPT-M324Cámara de video Extrawave HAD, B7W
PicrotoxinaReactivoSigma-AldrichP1675
EstricninaReactivoSigma-AldrichS0532
Sal sódica del ácido imidazol-4-acéticoReactivoSigma-AldrichI7013
Larvas de salamandra tigreAnimalCharles E. Sullivan

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cook, P. B., Lukasiewicz, P. D., McReynnolds, J. S. GABA(C) receptors control adaptive changes in a glycinergic inhibitory pathway in salamander retina. Journal of Neuroscience. 20, 806-812 (2000).
  2. Heflin, S. J., Cook, P. B.

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