Dissection de SNC larvaire chez Drosophila melanogaster

Summary

Dans cet article, nous démontrons comment disséquer le système nerveux central du troisième stade drosophile larves.

Abstract

Le système nerveux central (SNC) des larves de drosophile est complexe et mal comprise. Une façon d'enquêter sur le système nerveux central est d'utiliser l'immunohistochimie pour examiner l'expression du roman de diverses protéines marqueurs. Coloration des larves ensemble est impraticable parce que la cuticule dure empêche les anticorps de pénétrer à l'intérieur de la cavité corporelle. Afin de colorer ces tissus, il est nécessaire de disséquer l'animal avant fixation et coloration. Dans cet article, nous démontrons comment disséquer larves de drosophile, sans endommager le système nerveux central. Commencez par déchirer la larve de moitié avec une paire de pinces fines, puis tournez la cuticule «inside-out" pour exposer le système nerveux central. Si la dissection est effectuée avec soin la SNC restera attaché à la cuticule. Nous conservons généralement le SNC attaché à la cuticule au long des étapes de fixation et de coloration, et seulement de supprimer complètement le SNC de la cuticule, juste avant le montage des échantillons sur des lames de verre. Nous montrons aussi quelques images représentatives d'une SNC larvaires colorés avec Eve, un facteur de transcription exprimé dans un sous-ensemble de neurones dans le SNC. L'article conclut par une discussion de quelques-unes des utilisations pratiques de cette technique et les difficultés qui pourraient surgir.

Protocol

1. Disséquer 3 ^e stade larvaire, laissant SNC attaché à la cuticule. Placer dans un tube de 1,5 ml.
2. Fixer dans du PBS (1x) contenant du formaldéhyde à 2% pendant 40 min avec bascule. ; Utilisation 250ul pour chaque SNC 50-10 disséqués.
3. Retirez le formaldéhyde et brièvement laver 3 fois avec du PBS + 0,1% Triton X-100 (PBST). Utiliser une pipette Pasteur finement tiré pour éviter la perte de tissu.
4. Blocage des sites de protéines de liaison non spécifiques et de perméabiliser les membranes cellulaires des tissus en incubant 1-8 heures dans le PBST + 5% de SAB, bascule à 4 ° C.
5. Incuber dans l'anticorps primaire dilué dans du PBST + 5% à bascule BSA à 4 ° C pendant la nuit. Dilution d'anticorps optimal varie d'anticorps différents.
6. Rincez 3x dans le PBST suivi par deux lavages 30min à 4 ° C.
7. Incuber dans anticorps secondaire dilué dans du PBST + BSA 5% pour les heures 1-3 bascule à 4 ° C. Rincez 3x dans le PBST suivi par deux lavages 30min à 4 ° C. Si le secondaire est conjugué à un composé sensible à la lumière, enveloppez le tube dans du papier aluminium.
8. Disséquer les tissus supplémentaires (si nécessaire) et monter sur des lames.

Discussion

Cette vidéo montre comment disséquer le système nerveux central du troisième stade drosophile larves. Après dissection, le CNS peut être teint en utilisant un protocole d'immunohistochimie standard. Actuellement, il reste encore beaucoup à découvrir sur la façon dont le système nerveux adulte est généré ainsi que la façon dont il stocke et transmet des informations. Les études sur le développement des larves du SNC chez la drosophile devrait améliorer nos connaissances sur le câblage du système nerveux et la fonction.

Larves de drosophile présentent un certain nombre de comportements stereotpyed, comme une réponse aux signaux environnementaux. Comment ces comportements appris et stocké dans le système nerveux? Les études sur le système nerveux durant le développement larvaire va aider à répondre à cette question.

A ce stade de développement chez la drosophile, l'organisme se prépare à subir les changements morphologiques vastes qui se produisent pendant la nymphose. Pendant ce temps, le remodelage massive du système neuromusculaire que les transitions d'un organsim ramper mouche dans une mouche adulte. Il sera intéressant de déterminer comment les neurones changer pendant cette phase de développement et si le même type de comportements peuvent être observés dans les neurones des animaux supérieurs.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Forceps	fine tipped
9-well Watch glass
Plastic Petri dish