El protocolo de texto completo de este enfoque experimental está disponible en <a href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471143031/cp/cpcb/article/cb1110/current/abstract ">protocolos actuales en Biología Celular</a> .

Los autores no tienen nada que revelar.

en la asamblea vitro nucleares utilizando fraccionado extractos de huevo xenopus

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Ensamblaje membrana nuclear es un paso esencial en el ciclo de división celular, proceso que puede ser replicado en el tubo de ensayo por la combinación de la cromatina espermática de Xenopus, el citosol y la membrana fracciones ligeras. Núcleos completos están formados, incluyendo las membranas nucleares con los complejos de los poros, y estos núcleos son capaces de reconstituir el proceso normal nuclear.

En la Asamblea Vitro nucleares utilizando fraccionado extractos de huevo Xenopus

El ensamblaje de la membrana nuclear es un paso esencial en el ciclo de división celular; este proceso puede replicarse en el tubo de ensayo combinando esperma de Xenopus...

Los extractos de óvulos de Xip Labus son útiles como material citoplasmático y de orgánulos para la reconstrucción in vitro de eventos celulares, como el ensamblaje nuclear y la importación de proteínas nucleares. Cuando se añade ADN de cromatina espermática a extractos de óvulos XUS crudos o fraccionados, las vesículas de membrana presentes en el extracto se unen a la superficie de la cromatina, se fusionan e incorporan componentes de los poros nucleares para formar núcleos sintéticos completamente funcionales. La caracterización de la base molecular de estos procesos es posible entonces mediante inmunodepleción de los extractos y mediante edición de proteínas.Hola, mi nombre es Marie Cross y soy estudiante de posgrado en el laboratorio de la Dra. Maureen Power, del Departamento de Biología Celular de la Universidad de Emory en Atlanta, Georgia. Hoy les mostraremos cómo formar núcleos in vitro utilizando extractos de huevo de xenopus fraccionados. Este procedimiento incluye los siguientes pasos: realizar la reacción de ensamblaje nuclear y evaluar la formación de núcleos.Entonces, comencemos. Para iniciar el ensamblaje nuclear, tome una alícuota de citosol fraccionado y agregue fosfocreatina de un stock 0,2 molar hasta una concentración final de 20 milimolares. Luego, agregue creatina quinasa de un stock de cinco miligramos por mililitro hasta una concentración final de 50 microgramos por mililitro.Finalmente, añada 20 micromolares de ATP utilizando un stock de 0,2 molares. A continuación, añada membranas ligeras al citosol en una dilución de uno a 10. Esto aproxima la cantidad de membrana presente en el extracto crudo original.Mezcle todos los componentes mediante pipeteo ascendente y descendente para dispersar las membranas en el extracto. Esto debe hacerse antes de añadir la cromatina espermática. A continuación, añada cromatina espermática al extracto fraccionado en la concentración deseada y mezcle inmediatamente el extracto y la cromatina mediante pipeteo suave hacia arriba y hacia abajo utilizando una punta cortada.Cuando se añade la cromatina espermática al extracto, inmediatamente comienza a descondensarse, condensarse nuevamente y volverse susceptible al cizallamiento. Por lo general, estas reacciones se preparan en tubos de centrífuga de 500 microlitros con un volumen total inferior a cien microlitros. Los extractos de huevo permitirán la formación de hasta 8.000 a 9.000.Incube la mezcla durante una a dos horas a temperatura ambiente para permitir la formación de núcleos por microlitro. Los núcleos se visualizan mediante tinción. Después de aproximadamente 30 minutos, los núcleos recién formados tendrán forma pequeña y ovalada.El ADN aún está bastante condensado y el núcleo debe aparecer como un azul claro sólido desde el gancho en espiral cuando se observa en el canal UV a medida que el ADN se condensa. Además, la tinción azul será menos homogénea, apareciendo finalmente espacios negros. La formación de la membrana nuclear puede visualizarse añadiendo un microgramo por macho de tres tres diaa carboxilamina o DHCC en el fijador.DHCC es un colorante lipofílico fluorescente que se visualiza en el canal de fluoresceína. En las primeras etapas del ensamblaje de los núcleos, las vesículas de membrana se unen a la superficie de la cromatina y comienzan a fusionarse en parches. Esto da lugar a una apariencia irregular y discontinua de la membrana en formación.Una vez que la membrana está completa, se alisa sobre la superficie nuclear y aparecerá como un borde uniforme y continuo alrededor del ADN. Habrá una cantidad considerable de fluorescencia de fondo en el citosol circundante debido a las vesículas de membrana que no se han incorporado a los núcleos. Acabamos de mostrarles la reconstrucción nuclear in vitro utilizando fracciones solubles y ligeras de membrana del extracto de huevo de Xenopus.Es importante recordar que el extracto crudo se puede usar para la ensamblaje nuclear, pero no después de congelarlo y descongelarlo. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Emory University.  Ensamblaje membrana nuclear es un paso esencial en el ciclo de división celular, proceso que puede ser replicado en el tubo de ensayo por la combinación de la cromatina espermática de Xenopus, el citosol y la membrana fracciones ligeras. Núcleos completos están formados, incluyendo las membranas nucleares con los complejos de los poros, y estos núcleos son capaces de reconstituir el proceso normal nuclear.

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