El estudio de biogénesis de la membrana con un ensayo de luciferasa basado en genes

Cultivo de células

1. Las cepas de riñón embrionario humano 293 (HEK293) células se cultivan en 10 cm de placas de cultivo en el "medio A ', que consiste en Dulbecco Modificado Medio Eagle (DMEM) complementado con un cóctel de antibióticos (100 unidades por ml de penicilina y g 100 por ml de sulfato de estreptomicina) y el 10% de suero fetal bovino (FBS).
2. Para configurar las células de un experimento, el medio se aspira y se lavan las células dos veces con 5 ml de tampón fosfato salino (PBS).
3. El PBS se retira y se reemplaza con 0,6 ml de una solución que contiene 0,25% de tripsina.
4. El plato se incuba a 37 ˚ C durante unos 2 minutos hasta que las células han comenzado a separar.
5. 5,5 ml de medio de A es para neutralizar la tripsina y las células se contó con un hemocitómetro.
6. Las células se diluyen a 320.000 células por ml y se distribuye a 0,1 ml por pocillo en una polilisina recubiertos de 96 y placa de cultivo.
7. Coloque el plato en un cultivo de tejidos incubadora a 37 ˚ C con una atmósfera con CO2 un 8,8% y crecer durante 24 horas.

Transfecciones

1. En la preparación para la transfección, se debe considerar el número de repeticiones se van a realizar por las condiciones experimentales y qué cantidades de plásmido se transfectadas ser. En forma rutinaria realizar todas las condiciones, por triplicado, y transfectar un total de 50 a 100 ng de ADN de plásmido por pozo. Mezcla plásmido debe incluir al menos un reportero construir expresar luciferasa de luciérnaga y un plásmido de control luciferasa Renilla expresión de un promotor constitutivo.
2. Soluciones de plásmido se pipeta en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y se complementa con 10 l por muestra de suero libre de antibióticos y de libre DMEM. Por ejemplo, si 20 pozos son cada uno para ser transfectadas con el ADN de 50 mg, añadir 200 l DMEM al ADN mg 1.
3. A la solución de DMEM / ADN añadir 3 l 'Transit 293 reactivos (Mirus) por ADN mg. Mezclar pipeteando arriba y abajo y dejar que las muestras a temperatura ambiente durante al menos 10 min.
4. Durante este período, retire el soporte de la placa de 96 pocillos cultura y reemplazar con 90 l de medio fresco A.
5. A cada pocillo añadir 10 l de la DMEM / ADN / Tránsito 293 mezcla.
6. Coloque el plato en un cultivo de tejidos incubadora a 37 ˚ C con una atmósfera con CO2 un 8,8% y crecer durante 24 horas.

Fagocitosis

1. Preparar las suspensiones que contienen medio B (una mezcla 1:1 de DMEM y Ham F12 más antibióticos y un 10% FBS) más de 0,75 m perlas de látex en el cero a 1 mg por ml.
2. Retire el papel de la placa de 96 pocillos cultura y reemplazar con 0,1 ml de suspensiones de cuentas en el medio B.
3. Girar la placa durante 2 min a 1000 x g.
4. Las células se cultivaron a 37 ˚ C durante 6 a 16 hrs. Dependiendo de las condiciones y el promotor utilizado para dirigir la expresión de luciferasa, el aumento de gen reportero puede ser detectada después de 1 a 3 horas.
5. En los mismos casos puede ser necesario para la incubación de las células con perlas de 30 a 60 minutos, y luego hacer dos lavados con PBS para eliminar las perlas no incorporadas, y añadir medio fresco antes de incubar las células durante períodos de tiempo adicional.

Doble GloTM ensayo Luciferase

1. Nota: el protocolo para el uso de este kit es diferente en algunos aspectos de la recomendada por el fabricante. Se ha modificado para reducir la cantidad de reactivos necesarios por muestra.
2. Prepare una solución de 1 M de TDT, se dividen en varias pequeñas alícuotas y guardar a -20 ˚ C.
3. Prepare una solución amortiguadora de lisis que contiene 20 mM Tris-HCl (pH 7,8), el 10% (v / v) de glicerol, y el 0,5% (v / v) de Triton X-100. Antes de su uso, una parte alícuota de la cantidad necesaria para el experimento y añadir 1 l por ml de 1 M de TDT más cóctel inhibidor de la proteasa a una concentración final de 0,5 a 1x. No vuelva a utilizar la solución remanente de la TDT.
4. Cuando se utiliza el kit de doble GloTM por primera vez, preparar el reactivo (luciérnaga) luciferasa mediante la transferencia de todo el contenido de un frasco de tampón luciferasa Dual-GloTM (suministrado con el kit) a una botella de sustrato luciferasa Dual-GloTM (siempre con el kit). Divide el reactivo utilizado luciferasa en 10 ml de alícuotas y guardar a -20 ˚ C.
5. Retire la placa de 96 pozos de la incubadora de cultivo de tejido y colocarlo sobre hielo. Retire el papel por aspiración, añadir 40 l por pocillo de tampón de lisis, y luego dejar la placa en hielo durante 30 min.
6. En un color blanco opaco, placa de 96 pocillos (OptiplateTM-96, Perkin Elmer número de catálogo 6005290) alícuota de 15 l por pocillo de reactivo de luciferasa, a continuación, añadir 15 l de lisado celular.
7. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego leer la luminiscencia en un lector de microplacas.
8. Inmediatamente antes de su uso, prepare una cantidad apropiada de solución de sustrato de luciferasa Renilla mediante la adición de una parte de doble GloTM Stop & Glo ®; Reactivo (suministrado con el kit) a 100 partes de doble GloTM Stop & Glo ® Buffer (suministrado con el kit).
9. A cada pocillo añadir 15 l por pocillo de la solución de sustrato de luciferasa Renilla, incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego medir la luminiscencia de nuevo.