A continuación se describe la técnica de preparación y mantenimiento de cámaras de compartimentos de las neuronas sensoriales de cultivo de los ganglios de la raíz dorsal.
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Artículo de método
Preparación y mantenimiento de las neuronas dorsales ganglios de raíz en las culturas con compartimientos
En este artículo
Resumen
Resumen
Las neuronas se extienden axones que están muy lejos del cuerpo celular para inervar los tejidos diana, donde objetivo de factores de crecimiento derivados son necesarios para la supervivencia neuronal y la función. Las neurotrofinas son especialmente necesarias para mantener la supervivencia y la diferenciación de las neuronas sensoriales que inervan pero la pregunta de cómo estas neurotrofinas derivadas de objetivos comunicar al cuerpo celular de las neuronas que inervan ha sido un área de investigación activa por más de 30 años. El modelo más comúnmente aceptada de cómo las señales de neurotrofinas llegar al cuerpo de la célula se propone que la señalización endosomas llevar a esta señal de forma retrógrada a lo largo del axón. A fin de estudiar el transporte retrógrado, un sistema de cultivo fue concebido originalmente por Robert Campenot, en el que los cuerpos celulares están aislados de sus axones. La técnica de preparación de estas cámaras de compartimentos para el cultivo de neuronas sensoriales recapitula la estimulación selectiva de terminales de las neuronas que se produce la liberación in vivo de los siguientes derivados de objetivos neurotrofinas. Retrógrada eventos de señalización que requieren transporte a larga distancia microtúbulos retrógrada dependientes tienen importantes implicaciones para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.
Protocolo
Preparación de los reactivos
- Revestimiento de colágeno: el colágeno capa p35 placas de cultivo de tejidos y colocar en un horno a 37 ° C durante 2 días antes de engrasar los divisores. La concentración final de colágeno debe estar en 0,71 mg / ml diluida en 0,001 N HCl. A continuación, añadir 1 ml de la mezcla por placa.
- Cargadores de grasa: A fin de llenar el cargador de grasa, una jeringa de 60 ml debe ser llenado con grasa de vacío Corning. Use la jeringa para llenar el cargador de grasa, lo envuelve en papel de aluminio y luego autoclave durante 45 minutos.
- Separadores de teflón: los separadores se pueden v....
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Discusión
En este video, nos han demostrado cómo preparar y mantener cámaras de compartimentos para su uso en el cultivo de neuronas DRG. Hecho correctamente, este sistema permite la separación del cuerpo celular del axón con el fin de estudiar los mecanismos por los cuales las neurotrofinas señal a través de los axones largos. Dado que no es el aislamiento de fluidos entre los compartimientos, permite la estimulación selectiva o el tratamiento de un compartimiento sin los otros compartimientos se vean afectados. Culturas compartimentados cámara pued.......
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Agradecimientos
Nos gustaría dar las gracias a Katharina Cosker Courchesne y Stephanie útil para los debates.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |
|---|---|---|---|---|
| colágeno | Reactivo | BD Biosciences | 354249 | |
| metilcelulosa N2 400CPS | Reactivo | Sel-Win Chemicals | ||
| divisor de teflón | Otro | Tyler Research | CAMP10 | existen muchos otros tipos de divisores disponibles |
| rastillo de alfileres | Herramienta | Tyler Research | Camp-PR | |
| cargador de grasa | Herramienta | Tyler Research | Camp-GLSS | |
| DMEM | Reactivo | Fisher Scientific | MT10017CV | |
| NGF | Reactivo | PeproTech Inc | 450-01 | |
| BDNF | Reactivo | PeproTech Inc | 450-02 | |
| grasa de alto vacío | Reactivo | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| AraC | Reactivo | Sigma-Aldrich | C-1768 | |
| adaptador luer de 23 gauge | Herramienta | Fisher Scientific | 427565 | |
| hemostatos en ángulo de 90° | Herramienta | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-7035 |
Referencias
- Campenot, R. B. Independent Control of the Local Environment of Somas and Neurites. Methods in Enzymology. 58, 302-307 (1979).
- Watson, F. L., et al. Neurotrophins use the Erk5 pathway to mediate a retrograde survival response. Nature Neurosci....
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Reimpresiones y permisos
